降钙素基因相关肽阳性神经纤维在大鼠牙周组织中的分布

降钙素基因相关肽阳性神经纤维在大鼠牙周组织中的分布

一、大鼠牙周组织中降钙素基因相关肽阳性神经纤维的分布(论文文献综述)

闫凯娴[1](2020)在《高表达CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞及RAW264.7生物学作用的研究》文中指出背景和目的:牙周炎是由牙菌斑中的微生物引起的慢性感染性疾病,伴有牙周组织破坏如附着丧失和牙槽骨吸收,严重者可发生牙松动脱落。牙周炎的治疗目前主要停滞在控制病变进一步发展,牙周组织再生是亟待解决的重要课题。牙周骨组织再生的难点在于其持续的相对开放的炎症微环境,这决定了牙周骨组织的再生要难于颌骨再生、种植体的骨增量等相对封闭环境下的骨再生。因此,研发具有抗炎和促进成骨双重作用的新技术和策略对于牙周炎相关的骨再生至关重要。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)已广泛应用于组织再生研究,但炎症微环境下干细胞生物学功能受到影响,成骨分化能力下降,难以获得有效骨质再生。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)是牙周炎的主要致病菌,其细胞壁组分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是诱导牙槽骨组织破坏、促进牙周炎发展和进展重要毒力因子。LPS可以直接抑制牙周组织干细胞的分化并增加牙周组织的吸收,另一方面还可以诱导多种细胞分泌白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子 α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子,发挥毒性作用,影响基质的形成、诱导细胞凋亡,进一步增加牙周组织破坏。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一种感觉神经末梢分泌的由37个氨基酸组成的神经多肽,可通过多种途径参与骨组织的形成和修复,此外还有研究表明CGRP可以抑制炎症反应。本课题组前期研究表明高表达CGRP基因显着增强了大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)在正常体外培养条件下的成骨分化能力,在此基础上,本课题使用P.g LPS构建炎性环境研究高表达CGRP基因对炎症环境下rBMSCs的增殖、免疫反应及成骨分化的影响,并建立LPS处理的大鼠牙周骨缺损模型进一步研究高表达CGRP基因的rBMSCs对缺损区炎症浸润与骨修复的作用,旨在减少或排除牙周组织修复及再生过程中炎症微环境的干扰,促进牙周组织再生。为了充分验证CGRP在成骨与破骨分化中的作用,本课题进一步构建高表达CGRP基因的小鼠单核巨噬细胞系264.7(RAW264.7),研究CGRP对体外培养的RAW264.7免疫调节及破骨分化的影响,探讨如何减少牙周炎导致的牙槽骨吸收,促进牙周组织再生,并使再生的牙周组织在结构及功能上恢复到生理状态,为临床治疗中实现牙周组织完全再生提供重要的理论基础。方法:1.rBMSCs的分离培养及鉴定全骨髓贴壁法分离培养Wistar大鼠股骨及胫骨rBMSCs,Flow cytometer检测表面标志抗原,成脂向及成骨向诱导后Oil red O、Alizarin Red染色检测rBMSCs的多向分化潜能。2.高表达CGRP的rBMSCs、RAW264.7的构建1)慢病毒转染rBMSCs,分为c-rBMSCs组(高表达CGRP的rBMSCs)、empty vector组(转染空载体病毒的rBMSCs)、rBMSCs组(正常rBMSCs),检测CGRP mRNA和蛋白的表达水平。2)慢病毒转染RAW264.7,分为c-raw(高表达CGRP的RAW264.7)、empty vector组(转染空载体病毒的RAW264.7)、raw组(正常RAW264.7),检测CGRP mRNA和蛋白的表达水平。3.高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs增殖、免疫调节及成骨分化的影响1)CCK-8法检测高表达CGRP对rBMSCs炎症环境下增殖的影响。2)Realtime PCR检测高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs IL-1β和TNF-α表达水平的影响。3)ELISA试剂盒检测高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs IL-1β和TNF-α分泌水平的影响。4)RealtimePCR、Western Blot检测碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)、核心结合因子-2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)mRNA和蛋白的表达水平;通过Alizarin Red染色测定rBMSCs的成骨分化能力。5)建立LPS处理的大鼠牙周骨缺损模型,分为Control组(只在缺损区植入胶原膜)、rBMSCs组(在缺损区植入负载rBMSCs的胶原膜)、c-rBMSCs组(在缺损区植入负载高表达CGRP的rBMSCs的胶原膜),HE染色及Micro-CT分析高表达CGRP对rBMSCs在LPS处理的大鼠牙周骨缺损区修复作用的影响。4.高表达CGRP对RAW264.7免疫调节及破骨分化的影响1)Realtime PCR检测高表达CGRP对炎症环境下RAW264.7 IL-1β和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA 表达水平的影响;Western Blot检测高表达CGRP对LPS刺激的RAW264.7 NF-κB通路活化的影响。2)Realtime PCR、Western Blot 检测高表达 CGRP 对 RAW264.7 破骨诱导条件下组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、c-FOS、活化T细胞核因子1(Nuclear Factor of Activated T Cells 1,NFATc-1)mRNA 及蛋白表达水平的影响。结果:1.rBMSCs的分离培养及鉴定全骨髓贴壁法分离培养Wistar大鼠股骨及胫骨rBMSCs,细胞大部分呈梭形,放射状排列。Flow cytometer检测rBMSCs的表面标志物CD29、CD44、CD90、CD45、CD1 1b 的表达阳性率分别为 98.9%、98.4%、98.8%、0.20%、0.41%,符合间充质干细胞表面标志物表达的特性。Oil red O、Alizarin Red染色检测rBMSCs成脂及成骨向分化潜能,染色结果均为阳性。2.高表达CGRP基因的rBMSCs和RAW264.7的构建病毒液分别转染rBMSCs、RAW264.7,转染CGRP慢病毒的细胞CGRP mRNA及蛋白的表达水平明显高于相应empty vector组和对照组(P<0.05),而empty vector组和对照组表达较弱且无统计学差异(P>0.05)。3.高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs增殖、免疫调节及成骨作用的影响1)1μg/ml LPS炎症环境下,CCK-8结果显示c-rBMSCs增殖速度大于rBMSCs(P<0.05)。2)加入1μg/ml LPS,24h后提取各组细胞RNA,Realtime PCR检测结果显示,c-rBMSCs 炎症因子 IL-1β、TNF-αmRNA 表达水平低于 rBMSCs(P<0.05);ELISA检测结果显示c-rBMSCs炎症因子IL-1β、TNF-α分泌水平低于rBMSCs(P<0.05)。3)检测各组细胞在1μg/ml LPS的炎症环境下矿化诱导2w、3w后ALP、BSP、RUNX2 mRNA和蛋白的表达水平,结果显示:c-rBMSCs较rBMSCs ALP、BSP和RUNX2mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);矿化诱导3w后Alizarin Red染色c-rBMSCs形成的矿化结节明显多于rBMSCs(P<0.05)。4)高表达CGRP对rBMSCs在LPS处理的大鼠牙周骨缺损区修复作用的影响。HE染色结果示:c-rBMSCs组较Control组、rBMSCs组缺损区炎症浸润明显减轻,且缺损区可见大量新生骨,几乎完全充填了缺损区。Micro-CT结果示:rBMSCs组骨缺损区骨密度高于Control组(P<0.05),c-rBMSCs组缺损区骨密度明显高于Control组与rBMSCs组(P<0.05),且缺损区基本被新骨完全填满。4.高表达CGRP对RAW264.7免疫调节及破骨分化的影响1)加入 1μg/ml LPS 刺激 RAW264.7 细胞 24h,提取 RNA,Realtime PCR 检测结果显示,c-raw炎症因子IL-1β、iNOS mRNA表达水平低于raw(P<0.05);Western Blot结果显示CGRP对LPS诱导的NF-κB通路的活化具有明显的抑制作用。2)30ng/mlRANKL 诱导 RAW264.7 1w,Realtime PCR、Western Blot 检测结果显示:c-raw组的CTSK、c-FOS、NFATc-1 mRNA和蛋白水平均低于raw组(P<0.05)。结论:1.高表达CGRP基因可以促进1μg/ml LPS炎症环境下rBMSCs的增殖、降低1μg/ml LPS诱导的炎症因子IL-1 β和TNF-α的mRNA表达水平和蛋白分泌水平、促进1μg/ml LPS炎症环境下rBMSCs的成骨分化。在LPS处理的大鼠牙周骨缺损模型中,高表达CGRP基因可显着提高rBMSCs在LPS处理的骨缺损区抑制炎症浸润及促进骨修复再生的能力。2.高表达CGRP基因可以通过抑制LPS诱导的NF-κB通路的活化降低RAW264.7中炎症因子IL-1β和iNOS mRNA表达水平,高表达CGRP基因可降低RANKL诱导的RAW264.7的破骨相关因子的表达。

何薇[2](2020)在《植入镁对大鼠牙周炎作用的实验研究》文中研究表明慢性牙周炎是以菌斑为始动因子,牙周组织破坏为临床特征的慢性炎症性疾病,其发病率高,是导致成年人失牙的主要原因。牙槽骨丧失是牙周炎的主要病理表现,是骨吸收增加和骨生成减少的综合结果。骨丧失与牙周组织中炎症因子高表达紧密相关,其中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是导致牙周炎骨丧失的重要因素。现有的牙周炎治疗方法难以在同一步骤兼顾骨再生和炎症抑制,并且普遍具有治疗周期长、花费高等缺点。金属镁具有生物相容性好、可在体内分解、促进成骨、抑制炎症等优点,有望以植入物的形式应用于牙周炎治疗。本实验利用大鼠拔牙后种植联合牙周炎模型,研究了在牙槽窝内植入纯镁对大鼠实验性牙周炎的影响,并利用牙槽骨骨膜干细胞和巨噬细胞体外牙周炎模型,探讨了镁离子对牙周炎的作用机制。本实验首先在大鼠下颌切牙拔牙窝内植入镁棒(以钛棒作为对照组),建立拔牙后种植模型,同时在同侧下颌第一磨牙建立牙周炎模型。建模2周和6周后,用扫描电镜能谱分析检测镁离子渗透情况,以显微电子计算机断层扫描(micro computed tomography,micro CT)和牙周组织学分析评价牙槽骨丧失程度和炎症水平。然后,根据实验组观察到的牙周炎环境中骨膜成骨的现象,从以下两个角度探讨镁植入物对牙周炎的作用机制:(1)成骨角度:用神经示踪、免疫荧光染色、细胞增殖、成骨诱导等实验探索镁植入物促进牙槽骨骨膜成骨的机制;(2)炎症角度:用免疫组化染色和牙周炎细胞模型检测镁离子对牙周炎组织和细胞TNF-α表达的影响,用牙槽骨骨膜干细胞的增殖和成骨诱导实验,研究在TNF-α模拟的牙周炎环境下,镁离子对骨膜成骨的调节作用。实验结果显示:(1)大鼠牙槽窝内的镁植入物降解生成的镁离子可渗透至牙槽骨表面,减少实验性牙周炎的骨丧失,减轻局部炎症反应;(2)镁植入物来源的镁离子可促进非炎症区域以及牙周炎区域的牙槽骨骨膜成骨,原因主要为镁离子直接刺激骨膜干细胞增殖和成骨分化;(3)镁植入物降解生成的镁离子可抑制巨噬细胞分泌TNF-α,降低局部牙周组织中TNF-α的浓度;TNF-α抑制牙槽骨骨膜干细胞的增殖和成骨分化,镁离子可部分逆转TNF-α对骨膜成骨的不利影响。综上所述,我们发现了镁植入物对大鼠实验性牙周炎的抑制作用,并且从镁离子促进骨膜成骨和减弱炎症因子(主要是TNF-α)对骨膜成骨的不利影响两方面解释了作用机制,为镁植入物治疗牙周炎的临床应用建立了前期基础。

晏莺[3](2016)在《慢性牙周炎患者治疗前后血清降钙素基因相关肽水平检测的临床意义》文中研究说明研究背景慢性牙周炎(Chronic periodontitis,CP)的发生和发展是多因素综合作用的结果,牙周病最严重的表现就是深牙周袋、牙槽骨和相关牙周组织的缺失,随着对牙周疾病的深入研究,研究促进和阻碍牙周炎修复破坏的牙周组织是一个牙周医生们共同关注的问题,现阶段骨组织工程和引导性牙周组织再生中亟待解决的问题是神经和血管的再生,神经及神经肽在所有的组织工程中都发挥着至关重要的作用。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在牙周组织中的相关作用的研究也日益受到重视。CGRP是扩张血管和诱导血管生成的最强的内源性神经肽,能增加血液循环,促进新骨形成。牙槽骨的吸收是慢性牙周炎患者的典型临床表现,但现有的再生治疗技术均未能明显的改善患者牙槽骨破坏的状况,尤其是广泛性水平型吸收。因此,牙周医生们提出假设,CGRP是否也能参与调控牙周炎破坏后的牙槽骨改建。目的运用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)检测技术,通过检测慢性牙周炎患者外周血中CGRP的浓度,在牙周基础治疗前后,外周血中CGRP浓度的变化,探讨慢性牙周炎患者治疗前后血清中CGRP水平变化及意义。方法随机选择2014年8月—2015年6月在我院牙周科就诊人群,按照一定纳入标准进行分配,其中健康对照组30人,轻度慢性牙周炎、中度慢性牙周炎、重度慢性牙周炎患者各30人,抽取空腹外周静脉血离心分离上清液,用消毒灭菌后的1.5ml Ep管在超净工作台内进行分装冻存,待所有标本收集完成后,运用酶联免疫吸咐试验试剂盒检测CGRP浓度;慢性牙周炎患者轻度、中度、重度3组分别于基础治疗后3月抽取空腹外周静脉血离心分离上清液,用消毒灭菌后的1.5ml Ep管在超净工作台内进行分装冻存,待所有标本收集完成后,运用酶联免疫吸咐试验试剂盒检测CGRP浓度。结果ELISA检测结果显示:健康组外周血中降钙素基因相关肽的水平为5.73±2.54 ng/L,轻度牙周炎组外周血中CGRP的水平为1.78±0.30 ng/L,中度牙周炎组外周血中CGRP的水平为1.22±0.13 ng/L,重度牙周炎组外周血中CGRP的水平为0.81±0.13 ng/L,健康组显着高于牙周炎患者,随着牙周炎炎症程度加重,静脉血中降钙素基因相关肽的含量依次降低,重度牙周炎患者的检测含量最低,差异有统计学意义(P<0.01);对轻度牙周炎、中度牙周炎、重度牙周炎患者基础治疗3月后,血清中CGRP含量相比同组治疗前明显升高(P〈0.05),治疗后慢性牙周炎患者各组间CGRP浓度差值的比较无统计学意义(P)0.05)。结论外周血中降钙素基因相关肽的含量与慢性牙周炎存在相关性,其含量随慢性牙周炎逐渐加重而降低,推测CGRP可能参与慢性牙周炎的发生、发展过程;慢性牙周炎患者牙周治疗结束后,牙周炎症得到控制,血清中CGRP含量较治疗前明显增长趋势,提示CGRP可能作为慢性牙周炎患者治疗前后的临床检测依据,血液中CGRP的浓度升高有利于牙周炎症的控制。

蔚一博[4](2016)在《降钙素促进人牙周膜干细胞胶原合成及成骨分化的作用机制研究》文中指出目的牙周炎是由牙菌斑中微生物导致牙周支持组织引发的慢性感染性疾病,发病后能够打破牙槽骨吸收和修复的动态平衡,引起牙槽骨的吸收大于牙槽骨的修复,进而造成牙槽骨高度的降低。牙周病治疗的目的已经远远不是单纯的控制炎症,更是将已经破坏的牙周组织让其再生并形成新的附着。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周膜组织中的定向干细胞,和其他干细胞一样具有多向分化的潜能,在牙周组织的损伤修复过程中发挥重要的作用。研究表明PDLSCs可高表达I型/III型胶原等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)并分泌至胞外,此外PDLSCs可经诱导发生成骨分化促进牙槽骨的再生,是牙槽骨修复的细胞学基础。降钙素家族成员可通过结合同一类降钙素受体进而激活胞内信号途径影响不同细胞的生物学性质。现有研究结果证实降钙素(calcitonin,CT)在骨愈合过程中的作用机制为促进成骨细胞增殖、分泌和合成细胞外基质并促进基质钙化及促进成骨细胞转化为骨细胞,还可通过促进OPG表达,降低RANKL表达,抑制破骨细胞的生成。但迄今为止,对CT调控PDLSCs成骨分化的作用机制,及其在牙槽骨再生过程中的作用尚未见报道。本研究探讨CT对PDLSCs胶原合成和成骨分化的作用及可能的分子机制。方法(一)临床选取60名患者,分为两组:慢性牙周炎组和健康对照组。记录牙龈指数、探诊深度、临床附着水平。采集龈沟液,运用定量酶联免疫吸附法(ELISA)检测龈沟液内CT,TGF-β1,BMPs的含量,比较正常人及牙周炎患者龈沟液中CT,TGF-β1,BMPs的表达水平,统计分析CT与TGF-β1,BMPs表达水平的相关性,以及CT表达与慢性牙周炎患者临床指标的相关性。(二)采集因正畸拔除的前磨牙,采用酶消化联合组织贴附法,行原代培养获得人牙周膜细胞。进而利用免疫磁珠技术对STRO1阳性牙周膜细胞进行分选,获得PDLSCs。通过克隆形成实验检测PDLSCs的克隆形成能力。通过诱导培养基培养,分别通过von kossa染色、油红O染色和番红花精O染色检测PDLSCs的多向分化能力。构建含ct基因阅读框的重组腺病毒ad.ct,感染人pdlscs。通过定量pcr和westernblot的方法,检测人pdlscs中i型/iii型胶原,以及成骨分化标志蛋白alp和ocn的表达水平。探讨表达ct对人pdlscs胶原分泌及成骨分化的的作用。(三)ad.ct感染人pdlscs,通过定量pcr和western-blot测定tgf-β1表达水平,观察过表达ct对人pdlscs中tgf-β1表达水平的影响。合成特异性针对tgf-β1的sirna片段。ad.ct感染人pdlscs同时转染tgf-β1sirna特异性抑制人pdlscs中tgf-β1的表达。通过定量pcr测定和western-blot测定的方法,检测人pdlscs中i型/iii型胶原的表达水平。探讨ct是否通过调控tgf-β1表达的途径进而影响pdlscs的胶原蛋白合成。(四)ad.ct感染人pdlscs,通过定量pcr和western-blot测定bmps表达水平,观察过表达ct对人pdlscs中bmps表达水平的影响。ad.ct感染人pdlscs同时给予bmps途径特异性抑制剂noggin处理。通过定量pcr测定和western-blot测定的方法,检测人pdlscs中成骨分化相关标志ocn/alp的表达水平。探讨ct是否通过调控bmps表达的途径进而影响pdlscs的成骨分化。结果(一)慢性牙周炎患者龈沟液中ct,tgf-β1,bmp2/4/7的表达水平显着高于正常对照。统计分析结果显示,慢性牙周炎患者中ct表达水平与tgf-β1以及bmp2/4/7表达水平呈正相关。ct的表达水平患者的牙龈指数、探诊深度、临床附着水平负相关,与患者的年龄、性别无相关性。(二)成功培养获得人原代牙周膜细胞,通过免疫磁珠分选获得stro1阳性牙周膜干细胞。流式细胞仪检测显示,分选后细胞中stro1+/cd146+细胞比例为96.2%。细胞克隆形成实验结果显示分选获得的stro1+/cd146+细胞克隆形成率为65.7±9.1%,显着高于未分选的牙周膜细胞(27.1±5.2%,p<0.01)。pdlscs成骨诱导培养后,vonkossa染色出现矿化结节。pdlscs成脂诱导培养后,油红o染色可见脂滴。pdlscs成软骨诱导培养后,番红花精o染色阳性。ad.ct感染人pdlscs48hr后,检测发现i型/iii型胶原ocn/alp的mrna及蛋白表达水平均显着升高。(三)Ad.CT感染人PDLSCs 48hr后,检测发现TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平均显着升高。Ad.TGF-β1siRNA转染人PDLSCs 48hr后,可显着抑制TGF-β1 mRNA及蛋白表达。Ad.CT/TGF-β1siRNA共同处理人PDLSCs后,I型/III型胶原的表达水平较Ad.CT单独处理显着降低。(四)Ad.CT感染人PDLSCs 48hr后,检测发现BMP2/4 m RNA及蛋白表达水平均显着升高,但BMP7表达水平未见显着变化。Noggin处理人PDLSCs 48hr后,可显着抑制BMPs活性。Ad.CT/Noggin共同处理人PDLSCs后,OCN/ALP的表达水平较Ad.CT单独处理显着降低。结论(一)CT在牙周炎患者龈沟液中高表达且与患者的牙龈指数、探诊深度、临床附着水平呈负相关,提示CT参与了牙周炎的发生发展,高表达CT可能是牙周炎发病的保护因素,其作用可能与调控牙周组织损伤修复有关。龈沟液中CT表达水平与TGF-β1以及BMP2/4/7表达水平正相关,提示CT可能通过调控TGF-β1及BMPs信号通路促进牙周组织损伤修复。(二)原代培养的人STRO1+牙周膜细胞成克隆能力显着高于牙周膜细胞,此外STRO1+牙周膜细胞具有体外多向诱导分化能力,提示人STRO1+牙周膜细胞具有人PDLSCs性质。过表达CT可显着提高人PDLSCs中I型/III型胶原及OCN/ALP的表达水平,提示CT具有促进人PDLSCs纤维化及成骨分化的作用。(三)过表达CT可显着提高人PDLSCs中TGF-β1的表达水平。抑制TGF-β1表达可显着抑制过表达CT对人PDLSCs I型/III型胶原表达的促进作用,提示CT可能通过上调TGF-β1表达的途径促进PDLSCs纤维化。(四)过表达CT可显着提高人PDLSCs中BMP2/4的表达水平。抑制BMPs活性可显着抑制过表达CT对人PDLSCs OCN/ALP表达的促进作用,提示CT可能通过上调BMP2/4表达的途径促进PDLSCs成骨分化。

周燕[5](2016)在《CGRP对Pg-LPS诱导的成骨细胞损伤的调控作用和机制研究》文中提出牙周病(Periodontal disease)是指发生在牙周支持组织的疾病。牙周组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨、牙骨质)在机体内外因素等影响下发生的改变,例如:牙槽骨破坏性吸收,牙周膜充血、水肿、溶解、蜕变,牙骨质沉积受阻,牙齿松动,真性牙周袋形成,牙龈炎症、增生、萎缩等统称为牙周病。其中牙槽骨按解剖部份分为固有牙槽骨、密质骨、松质骨。牙槽骨的破坏性吸收是由于骨重建过程中牙槽骨病理或(和)生理的不平衡引起,是牙周病的主要特征之一。成骨细胞和破骨细胞的数量和比例决定骨组织的重建;同时,炎症因子、细胞活性、细胞凋亡、细胞生命周期性调节等都在骨组织重建过程中起着相当重要的作用。在众多炎症因子中肿瘤坏死因子就是其中研究的较详尽的一组。肿瘤坏死因子家族成员中的肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)是与细胞凋亡关系最为密切的是肿瘤坏死因子,它参与多种细胞的凋亡调控。在局部病损的组织内有高浓度的肿瘤坏死因子-α聚集,TNF-α及其受体在骨吸收过程中起着重要的作用,影响细胞凋亡。牙周炎发生、进展、代谢的整个过程均有成骨细胞参与。牙菌斑(dental plaque)是牙周炎的始动因素。龈上菌斑和龈下菌斑包含大量的致病菌,其中革兰氏阴性厌氧菌是侵蚀性最强的一类。革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的主要成分是脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),具有破坏牙槽骨组织、促使牙周炎发展和恶化的作用。LPS可直接作用于牙周靶细胞,抑制牙周靶细胞的增殖和分化,加速牙周组织的吸收。鉴于上述原因,脂多糖在增加牙周炎发病率和促进牙槽骨吸收这一方面的特性也成为牙周病病因学研究的热点。研究证实,脂多糖和牙周炎病原体的代谢产物可以影响骨基质的形成和细胞凋亡,在这一过程中,成骨细胞的生物学效应尤其重要。牙槽骨的吸收或者骨质疏松是由于脂多糖引起的炎症反应和成骨细胞凋亡异常,从而导致骨吸收和骨形成之间的紊乱引起。现阶段尚无有效治疗由LPS诱导的骨破坏的药物。预防牙槽骨吸收和骨质流失的主要目的是探讨成骨细胞的保护功能和活动的不平衡状态,寻找潜在的药物治疗靶点。降钙素相关基因肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)是1971年首次从甲状腺髓样癌组织中提取的蛋白。CGRP由37个氨基酸组成,包括a-cgrp及b-cgrp两个异构体,最初是在感觉神经末梢被发现,以分泌颗粒的形式储存。随着研究的深入,近年来发现它存在于神经系统中,同时发现在骨组织、呼吸系统、心血管系统、消化系统等组织中均有CGRP的分布。CGRP在各种组织中呈现出多元生理学效应,还可控制相关的免疫应答。骨组织中CGRP的来源不仅仅是由感觉神经纤维末梢分泌,而且可以由成骨细胞以自分泌和旁分泌的形式生成,体外实验已经证实CGRP可促进成骨细胞的增殖、分化、增加细胞体积,同时在成骨细胞的表面发现有CGRP受体的存在。研究发现,CGRP作为神经系统和免疫系统的交叉点,在炎症中还具有潜在的调节作用,它不仅能够直接通过影响CD4+Thelper细胞,也可以通过影响抗原递呈细胞的功能调节适应性免疫反应。此外,CGRP还能够有效的抑制单核巨噬细胞和树突细胞释放炎症因子如TNF-α,IL-1β和CCl4。大量研究提示,让我们比较确定的是,CGRP作为一个潜在炎症调控者,可以抑制促炎因子的释放,且在炎症过程中发挥重要的调节作用,但是对于LPS诱导的成骨细胞损伤的调控机制,还不是十分清楚。在本次研究中,我们通过体外实验观察到牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)可以抑制成骨细胞活性并诱导成骨细胞凋亡;外源性地加入CGRP后,可以减弱这一作用。因此,本实验旨在探讨Pg-LPS对成骨细胞的损伤作用以及CGRP对这一过程的调控作用,进一步探讨炎症因子的调节机制,为牙周病的病因学研究提供理论基础。方法:(一)成骨细胞的原代培养选新生小鼠颅骨采用组织块培养法获取细胞。组织块消化后弃上清,收集组织块和游出的细胞,转入培养基,放致5%CO2孵箱中37℃培养。(二)细胞传代培养待细胞消化到开始收缩脱壁后转移致新的培养瓶进行细胞传代实验。本实验所采用的成骨细胞均是传至第3-4代的。细胞实验前均用无血清的培养液替换之前的含血清的培养液。孵箱中再继续培养成骨细胞24小时,其目的是使实验细胞均处在G0期。(三)成骨细胞鉴定实验组织块法培养的细胞都经相差显微镜行细胞形态学观察鉴定后再用碱性磷酸酶(ALP)染色法鉴定,再行下一步细胞实验。(四)Pg-LPS抑制成骨细胞活性并诱导成骨细胞凋亡1、Pg-LPS抑制成骨细胞活性的实验研究:实验一:以浓度分别为0、25、50、100、500、1000ng/mLPg-LPS进行实验,作用48h后收集细胞进行检测;实验二:用浓度为500ng/mL的Pg-LPS刺激成骨细胞,在不同时间点:0、6、12、24、48、72h后收集细胞进行细胞实验。两组均采用CCK8法检测Pg-LPS对成骨细胞的活性影响。2、Pg-LPS诱导成骨细胞凋亡的实验研究:该实验的分组情况同上述CCK8实验。用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测盒检测Pg-LPS对成骨细胞凋亡的影响。(五)CGRP对Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡的调控作用1、Pg-LPS对CGRP表达的影响:Pg-LPS作用于成骨细胞后分别于0、6、12、24、48h收集细胞进行实验。检测Pg-LPS对成骨细胞CGRP含量的影响。2、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞活性的影响:外源性地加入浓度0、1、10、100、1000n M的CGRP,对同一浓度(500ng/ml)Pg-LPS作用后的成骨细胞进行检测。用CCK8法检测CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的活性影响。3、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞凋亡的影响:实验共4组:对照组、Pg-LPS组、CGRP组、CGRP+Pg-LPS组进行实验检测,用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒流式细胞学检测CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的凋亡影响。4、凋亡因子检测CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞活性的调控:上述细胞共培养48h后进行选用Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3抗体,运用蛋白免疫印迹法检测相关凋亡蛋白。(六)CGRP对Pg-LPS诱导成骨细胞凋亡过程中TNF-a的表达影响1、Pg-LPS对成骨细胞炎症因子的影响:在成骨细胞中加入500 ng/mL Pg-LPS后于0、6、12、24、48h时终止细胞培养,用炎症因子试剂盒检测上清液中Pg-LPS对成骨细胞炎症因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2)的影响。2、CGRP对Pg-LPS作用下的成骨细胞炎症因子的影响:实验分为对照组和Pg-LPS、CGRP、Pg-LPS+CGRP 3个实验组,其中Pg-LPS+CGRP组成骨细胞先用100 n M CGRP作用30min后在加入500 ng/mL Pg-LPS作用48h后终止培养,用炎症因子试剂盒检测上清液中CGRP对Pg-LPS作用下的成骨细胞炎症因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2)的影响。3、CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞肿瘤坏死因子的影响:实验分为对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS 3个实验组,检测CGRP对Pg-LPS作用下的成骨细胞后TNF-α的影响。(七)TNF-α在Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡中的作用1、TNF-α及CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的活性的影响:实验分组:对照组、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α,分别作用于成骨细胞后用CCK8法检测对成骨细胞活性的影响。2、TNF-α及CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞凋亡的影响:实验分组:对照组、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α,分别作用于成骨细胞后用Annexin V-FITC/PI法检测对成骨细胞凋亡的影响。3、凋亡因子检测TNF-α及CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的活性的影响:实验分组:对照组、CGRP、CGRP+Pg-LPS实验组,收集细胞后运用Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3抗体进行蛋白免疫印迹实验。检测TNF-α的表达。结果:(一)原代成骨细胞的形态学观察小鼠颅骨的细小组织块培养24h后,镜下观察:组织块附近可观察到少数细胞游出;继续培养24h后镜下观察:已有部分细胞开始贴壁,且周围发亮,显示其具有活性。以组织块为中心,细胞分布密集处呈铺路石状,胞体膨大,部分细胞胞浆丰富,胞浆伸长,核偏位,突起细长呈平行样或相嵌状排列。细胞形状不规则,多呈三角形及多角形,也有长梭形。(二)ALP法鉴定原代培养细胞采用碱性磷酸酶(ALP)染色所培养细胞。培养的染色细胞,呈块状或灰黑色颗粒状沉淀,胞质为阳性反应。(三)Pg-LPS抑制成骨细胞活性并诱导成骨细胞凋亡1、Pg-LPS对成骨细胞活性的影响:用不同浓度的Pg-LPS作用于成骨细胞并在48h时检测细胞活性,发现当Pg-LPS在浓度为50 ng/mL时活性开始降低,并且在浓度为100 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL时显着降低了成骨细胞的活性(P<0.05);用浓度500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨细胞后,在0、6、12、24、48、72h这6个不同时间点收集成骨细胞进行的实验结果显示:随着作用时间的递增,成骨细胞的活动明显降低(P<0.01)。2、Pg-LPS对成骨细胞凋亡的影响:不同浓度的Pg-LPS作用于成骨细胞并在48h时检测成骨细胞凋亡率,发现Pg-LPS浓度在50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1000ng/mL时成骨细胞凋亡率明显递增(P<0.05),浓度在达到500 ng/mL后递增的趋势减缓趋于平衡;用浓度为500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨细胞后在不同的时间点检测成骨细胞凋亡率,结果显示成骨细胞的凋亡率随着作用时间的增加呈现明显递增趋势,细胞凋亡率与Pg-LPS处理的时间呈正相关性,并且在48h时趋于平衡(P<0.01)。(四)CGRP对Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导成骨细胞凋亡的调控作用1、Pg-LPS对CGRP的调控:Pg-LPS作用于成骨细胞后分别于0、6、12、24、48收集细胞进行实验,最后对CGRP含量数据分析。结果显示:CGRP的表达在6h时出现短暂升高,此后,蛋白质含量逐渐降低,并且随着作用时间的递增,CGRP含量明显下降(P<0.01)。2、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的活性抑制:用不同浓度的CGRP对相同浓度(500ng/ml)Pg-LPS作用下的成骨细胞进行实验。结果显示:CGRP对Pg-LPS有一定的调控作用,当CGRP的浓度为100n M时,CGRP能显着减轻Pg-LPS对成骨细胞活性的抑制(P<0.01)。3、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞凋亡的诱导:本实验用对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS共四个组分别处理成骨细胞后用流式细胞仪检测细胞的凋亡,结果显示100n M的CGRP能够显着减弱Pg-LPS诱导的成骨细胞的凋亡率。这一结果与之前的实验结果是一致的(P<0.05)。4、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的活性的抑制:本实验用对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS四组,作用于成骨细胞后,运用Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3抗体检测细胞凋亡,结果显示:CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的活性的抑制。(五)CGRP对Pg-LPS诱导成骨细胞凋亡过程中TNF-a的表达影响1、Pg-LPS诱导成骨细胞炎症因子的表达:实验分别在0、6、12、24、48h 5个时间点收集细胞,检测TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2炎症因子的表达。结果显示:与对照组比较Pg-LPS促进TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-2的表达,并且呈时间依赖性表达。2、CGRP抑制Pg-LPS对的成骨细胞炎症因子的诱导:本实验检测对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨细胞后,细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2)的表达。结果显示:相同浓度的CGRP作用后只有对TNF-α的生成具有显着的变化,而对IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2没有明显变化。3、CGRP抑制Pg-LPS对成骨细胞TNF-α的诱导:实验将对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨细胞后细胞炎症因子TNF-α表达。结果显示:CGRP抑制Pg-LPS对的成骨细胞TNF-α的诱导。(六)TNF-α在Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡中的作用1、TNF-α及CGRP作用于Pg-LPS对成骨细胞的活性影响:实验分别用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨细胞后检测成骨细胞的活性。结果显示:CGRP能够减弱Pg-LPS作用下对成骨细胞的活性抑制,但在有TNF-a存在的情况下,却无法产生抑制作用。可见,TNF-a在Pg-LPS抑制的成骨细胞活性起着一定的作用。2、TNF-α及CGRP作用于Pg-LPS对成骨细胞的凋亡影响:实验分别用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨细胞后检测成骨细胞的凋亡。结果显示:CGRP能够缓解Pg-LPS作用下细胞的凋亡,但在有TNF-a存在的情况下,却无法产生这种诱导作用。这一结果与之前的实验结果是一致的(P<0.05)。3、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的凋亡的调控:本实验检测细胞活性表达。结果显示:CGRP能抑制Pg-LPS导致的Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3蛋白水平的上调,却无法抑制TNF-a、CGRP、Pg-LPS共培养所上调的Cleaved-Caspase 8和Cleaved-Caspase3的表达。表明:CGRP可以抑制Pg-LPS诱发的凋亡,但这种现象却被TNF-a反转了;推测TNF-a很可能就在CGRP抑制Pg-LPS诱导的成骨细胞凋亡作用中扮演着起逆转作用。结论1:Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导成骨细胞凋亡。2:CGRP减弱Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡的作用。3:CGRP抑制Pg-LPS诱导的成骨细胞TNF-α的表达。4:TNF-α在Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡中起重要的作用,且可以被CGRP逆转。

吕琳琳[6](2014)在《神经因素影响大鼠牙周组织缺损愈合过程的机制探讨》文中研究表明背景和目的:如何使因牙周病造成的病变牙周组织,特别是牙槽骨在“保质”的前提下更有效地“增量”,使已松动的患牙得以再次稳固,并能正常行使牙齿的咀嚼功能是目前牙周病治疗领域的研究重点。以牙槽骨吸收破坏为主要特征的牙周病变组织,同时亦存在该部位的神经血管系统结构与功能的破坏,从发育生物学的观点从发,牙周组织再生过程中神经支配或许起到至关重要的作用。牙周病序列治疗中,以各种基础治疗手段,消除炎症,控制发展这一治疗目标已基本实现。但如何促进牙周组织的再生,特别是有质有量的牙槽骨的再生,不论从临床实践,还是理论研究,都是值得不断深化研究与探索的一个牙周学科领域的重要课题。在现有众多牙周组织再生治疗的策略和相关研究中,以种子细胞、生物支架材料和各种生长因子的研究较为热门,但是由于牙周病病因及相应组织修复机制的复杂性,以及机体调控组织再生的系统性,其所取得的研究结果并没有达到我们所追求牙周组织再生的目标。牙槽骨是全身骨组织中代谢最活跃的骨质,神经血管在牙槽骨改建过程中的作用不容忽视,而现有的研究重点大多集中于如何获得更多的再生组织却忽略了这一过程中神经与血管的再生,其获得的再生牙周组织与天然的生理性牙周组织相比,在组织结构牙槽骨密度及应力方面均有很大的差距。显然这种“简单还原”与组织的“自然形成”相比,忽略了机体生命现象的精确性。探索神经对牙周组织再生过程的影响,在牙周组织再生研究领域中具有重要的意义。目前通过体外相关实验研究证实神经系统可以通过介导成骨细胞以及破骨细胞的活性参与调节骨代谢,在骨的修复改建过程中起着关键性的作用。近年来,随着中枢及周围神经系统对骨折愈合影响研究的深入,发现骨组织也是神经作用的靶器官,周围神经系统在骨折愈合及骨代谢中具有重要作用。并且近期研究发现,其主要是通过肽能神经分泌的神经肽对骨组织起作用的,而降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是骨组织中分布最为广泛的一种神经肽,主要分布于骨代谢活跃的部位,CGRP直接或间接地通过调节成骨细胞和破骨细胞分化及活性来影响骨折愈合。早在Hukkanen研究大鼠骨折模型实验过程中,便发现在新生骨组织中有CGRP免疫组织染色阳性纤维长入,随后CGRP的作用及机制也成为研究骨折愈合改建的热点。研究表明CGRP的阳性神经纤维在颌骨及其骨膜中均有分布,进而推测其参与了生长发育期的颌骨生长形成和后期的修复改建过程。降钙素基因相关肽阳性神经纤维在牙周组织中分布于磨牙牙周组织,牙槽骨以及牙槽骨中的小动脉和小静脉周围均有CGRP阳性神经纤维的环绕,提示CGRP阳性神经纤维在牙周组织再生过程中的神经血管的再生有重要作用。在口腔外科的研究中,针对CGRP在骨折愈合的研究较为广泛,研究显示CGRP可以促进下颌骨骨折的愈合。在正畸医学研究中,CGRP对正畸牙齿移动过程中牙槽骨的改建和重塑具有一定的调节作用。鉴于以上理论基础,我们推测CGRP是牙周组织再生中必不可少的调节因子。本课题组已经通过组织形态学观察证明神经可影响牙周组织再生的质量,并且通过免疫组织化学观察发现CGRP在牙周组织再生过程中的表达变化,本实验在此基础上,通过分子水平检测进一步探讨CGRP在牙周组织再生过程中的作用机制。方法:1、离断下牙槽神经后大鼠牙周组织中CGRP及SP的表达变化建立离断大鼠下牙槽神经的动物模型,左侧离断神经为实验组,右侧保留神经为对照组,实验分为六组即0天、3天、7天、14天、21天、28天。采用Realtime-PCR及Western Blot方法检测大鼠牙周组织中CGRP以及SP的表达变化。2、失下牙槽神经对大鼠牙周组织愈合过程中CGRP、SP及骨改建相关因子表达变化的研究建立离断大鼠下牙槽神经伴牙周缺损模型,左侧切断大鼠下牙槽神经伴牙周缺损为实验组,对侧保留神经仅做牙周缺损为对照组。实验分为五组即1周、2周、4周、6周和8周。采用Realtime-PCR及Western Blot方法检测大鼠牙周组织中神经相关因子CGRP、SP及骨改建相关因子OPG、RANKL的表达变化。结果:1、离断下牙槽神经后大鼠牙周组织中CGRP及SP的的表达变化Realtime-PCR结果显示失神经后牙龈及牙槽骨中的CGRP和SP均呈现先降低后上升至正常水平的趋势。统计分析结果显示3天、7天和14天组与正常组织表达水平有统计学差异(P<0.05),Western Blot检测结果发现,失神经后,大鼠牙周组织中的SP蛋白表达水平总体趋势与SP mRNA的变化基本相同,统计学分析结果显示,术后第3天、7天、14天和21天的表达量与正常对照组相比有统计学差异(P<0.05)。Western Blot检测CGRP蛋白结果为阴性。2、失下牙槽神经对大鼠牙周组织愈合过程中CGRP、SP及骨改建相关因子表达变化的研究通过Realtime-PCR方法检测方法显示牙周组织中实验组的CGRPmNRA水平在前期表现为下降趋势,从第4周开始逐渐升高,直至第八周CGRPmNRA水平的水平仍处于升高的趋势。而在对照组CGRPmNRA的表达水平在前期明显升高(P<0.05),后期逐渐恢复至正常水平。SP的表达变化与CGRP趋势相同。失下牙槽神经导致牙槽骨中OPG持续弱阳性表达而RANKL持续强阳性表达。结论:1、离断下牙槽神经后,影响牙龈及牙槽骨中的CGRP及SP的表达2、失下牙槽神经支配后CGRP及SP的表达变化会影响牙周组织缺损愈合过程中成骨和破骨因子的表达水平,最终影响牙周组织再生。

高艳,王青山[7](2014)在《神经肽类物质与牙周支持组织及口腔骨修复》文中研究指明背景:随着对牙周病病因学和神经内分泌研究的深入,神经内分泌因素在牙周病发病及组织修复中的作用成为当今研究的热点。目的:综述神经肽类物质对牙周支持组织的生物学作用,及神经损伤后牙周组织变化的情况。方法:以"神经肽,降钙素基因相关肽,P物质,舒血管肠肽,神经肽Y和牙周组织"为中文关键词,以"Neuropeptide,Calcitonin gene related peptide,substance P,vasoactive intestinal peptide,neuropeptide Y,periodontal"为英文关键词,采用计算机检索CNKI数据库、万方数据库和PubMed数据库,选择有关各类神经肽对牙周支持组织影响的文章进行分析。结果与结论:降钙素基因相关肽、P物质、舒血管肠肽、神经肽Y等相关阳性神经纤维广泛分布在牙周支持组织中,当感觉神经受到损伤后肽能神经分布及神经肽的释放发生改变,作用到牙周支持组织内的的靶细胞,在牙槽骨的改建、牙周韧带及牙周组织免疫功能等各方面发挥作用,这表明神经内分泌因素与牙周组织的关系非常密切,但是,这些相关研究多集中在对正畸和骨折动物模型的研究方面,神经肽等神经递质对牙周病的影响及其具体的作用机制还需要进一步探索。

黄长智,杨效宁,刘大诚,孙一公,戴醒明[8](2013)在《降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化》文中进行了进一步梳理背景:降钙素基因相关肽已被证实具有诱导成骨细胞分化作用,但其是否可使三维培养下的脂肪干细胞向成骨细胞分化构建组织工程骨的相关报道少见。目的:探讨外源性降钙素基因相关肽诱导兔脂肪干细胞复合藻酸钙凝胶三维培养成骨分化的可行性。方法:取新西兰兔双侧腹股沟区皮下脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化离心贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代与海藻酸钠混合制备凝胶,于24孔板分组培养:对照组加入含10-2mol/Lβ-甘油磷酸钠、10-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12骨诱导培养基,实验组在此基础上再加入1.5μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。于诱导不同时间点MTT法检测细胞增殖,RT-PCR法检测诱导细胞Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达,并检测碱性磷酸酶及钙离子浓度。结果与结论:兔脂肪干细胞的增殖曲线呈"S"型,实验组诱导1,3,5,7,14,21 d的A值高于对照组(P<0.05);诱导2周后两组细胞碱性磷酸酶、茜素红染色均阳性,但实验组钙结节较对照组明显增多。实验组诱导7,14 d的Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均强于对照组。实验组诱导1,2,3,4周的碱性磷酸酶活性及钙离子浓度均高于对照组(P<0.05)。结果表明降钙素基因相关肽能诱导复合藻酸钙凝胶的脂肪干细胞向成骨细胞分化。

戴瑛[9](2013)在《CGRP上调TGF-β/BMP-2表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究》文中指出研究目的:牙周炎发生的初始原因是细菌、毒素因子和机体间的防御功能的平衡被打破所致。越来越多的研究表明与遗传有关的宿主易感性是牙周炎发病过程中的主要决定因素之一。近年来,牙周病易感因素与基因多态性方面的研究越来越受到关注。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)阳性神经纤维广泛分布于牙周炎的起始部位。有研究表明,受到外界刺激后的牙周组织中CGRP含量增高,并通过特定的机制,调节牙周组织中的成骨细胞、骨细胞、成纤维细胞的生理活性。另有研究表明CGRP是骨细胞的活性调节因子,可以促进成骨分化及骨组织的形成。并且一定浓度的CGRP可促进体外培养的牙周膜成纤维细胞的增殖,并对细胞表面黏附分子起促进作用。研究证实,CGRP对人牙周膜成纤维细胞影响主要在于CGRP可促进人牙周膜成纤维细胞的增殖、胶原合成、成骨分化等。但是对于CGRP在人牙周膜成纤维细胞的纤维钙化方面的信号转导通路的研究国内外鲜见报道。本研究试图初步探讨CGRP对人牙周膜细胞细胞增殖、胶原合成、纤维钙化等作用可能涉及的信号通路。研究方法:第一部分:临床采集健康牙齿,采用酶消化+组织贴附法,进行人牙周膜成纤维细胞原代培养。运用sABC法,进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色,对人牙周膜成纤维细胞进行形态学观察和免疫组织化学鉴定。以CGRP-A和CGRP-C基因为目的基因,以腺病毒为载体,采用腺病毒构建技术,构建CGRP基因重组腺病毒(Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C),感染人牙周膜成纤维细胞,并加以鉴定,作为细胞实验的基础。第二部分:通过Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纤维细胞后培养72h,运用细胞流式检测、定量PCR测定和Western-blot测定的方法,检测人牙周膜成纤维细胞增殖、凋亡水平变化、胶原合成分泌水平变化,以及MMP-2、MMP-9、OPN、CAP-3、ALP等效应蛋白的表达水平变化。探讨CGRP-A、CGRP-C基因对感染的人牙周膜成纤维细胞纤维钙化作用的影响。第三部分:在单因素Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纤维细胞后培养72小时,运用定量PCR测定和Western-blot测定的方法,进一步检测BMP-2、BMP-4、BMP-7、TGF-β等细胞因子的变化。在分子水平上探讨CGRP多态性基因作用于人牙周膜成纤维细胞后,对人牙周膜成纤维细胞的细胞增殖、胶原合成纤维化,成骨钙化等作用可能涉及的信号通路。结果:1、原代细胞培养成功,免疫荧光染色鉴定:波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,并选取四个细胞株作为后两部分实验的材料。2、成功构建降钙素基因相关肽的重组腺病毒Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C,并感染人牙周膜成纤维细胞表达降钙素基因相关肽。3、细胞流式检测显示:Ad.CGRP-A处理组处于S/G2/M期的细胞比例显着高于Ad.CGRP-C处理组和空病毒对照组。Ad.CGRP-C处理组处于S/G2/M期的细胞比例显着低于空病毒对照组。4、定量PCR检测和Western-blot测定部分细胞外基质胶原蛋白(COL)、金属蛋白酶(MMP)、成骨分化标志物(ALP)及凋亡蛋白酶-3(CAP-3)基因结果显示:(1) Ad.CGRP-A处理组COLI、III、IV型胶原蛋白表达水平显着高于Ad.CGRP-C处理组和空病毒对照组;Ad.CGRP-C处理组COLI、III、IV型胶原蛋白表达水平显着低于空病毒对照组。(2) Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组MMP-2的相对表达水平显着高于空病毒对照组;且Ad.CGRP-C处理组的相对表达水平显着高于Ad.CGRP-A处理组;MMP-9表达含量较低,没有检测到结果。(3) Ad.CGRP-A处理组蛋白ALP的相对表达水平明显高于空病毒对照组;而Ad.CGRP-C处理组与空病毒对照组无明显差异。(4) Ad.CGRP-A处理组蛋白OPN的相对表达水平明显高于空病毒对照组;而Ad.CGRP-C处理组相对表达水平显着低于Ad.CGRP-A处理组与空病毒对照组。(5) Ad.CGRP-A处理组和Ad.CGRP-C处理组的CAP-3相对表达水平与空病毒对照组CAP-3的相对表达水平无明显差异。5、定量PCR检测和Western-blot测定,TGF及BMP家族基因表达结果显示:(1)在观察促成骨钙化的研究试验中,通过对BMP-2、MBP-4、BMP-7几个细胞因子的定量PCR实验结果显示: Ad.CGRP-A处理组BMP-2表达显着高于空病毒对照组和Ad.CGRP-C处理组;但是Ad.CGRP-C处理组BMP-2表达水平与空病毒对照组无显着差异;BMP-4组中,Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组与空病毒对照组之间的相对表达水平无显着差异;BMP-7表达含量较低,没有检测到结果。(2)在观察促纤维化的研究试验中,Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组TGF-β的相对表达水平均高于空病毒对照组;而Ad.CGRP-A处理组相对表达水平低于Ad.CGRP-C处理组。结论:1、 CGRP-A显着促人牙周膜成纤维细胞高表达BMP-2、OPN及ALP,提示CGRP通过激活BMP-2途径促人牙周膜成纤维细胞成骨分化。CGRP-C可显着抑制人牙周膜成纤维细胞中OPN表达,对BMP-2和ALP表达无显着影响,提示CGRP基因+5247位点的单核甘酸多态性显着影响CGRP促人牙周膜成纤维细胞成骨分化。2、 CGRP-A显着促人牙周膜成纤维细胞高表达TGF-β、COLI型、COLIII型、COLIV型,此外CGRP-A显着提高人牙周膜成纤维细胞中S/G2/M期细胞比例,提示CGRP通过激活TGF-β途径促人牙周膜成纤维细胞增殖及纤维化。值得注意的是,尽管CGRP-C也可显着促人牙周膜成纤维细胞高表达TGF-β,但同时CGRP-C显着上调人牙周膜成纤维细胞中MMP-2表达(表达水平较CGRP-A和对照组分别升高4倍和5倍),提示CGRP-C可能通过上调金属蛋白酶表达的途径抑制人牙周膜成纤维细胞的纤维化及增殖能力,但其相关的具体调控机制方面需要深入探索。

姜威[10](2011)在《即刻种植骨愈合区降钙素基因相关肽表达的研究》文中认为【目的】通过大鼠拔牙后即刻种植体洞型的骨损伤模型,利用组织学和免疫组织化学的方法,结合统计学分析,观察即刻种植窝预备区域早期骨愈合过程中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)的表达特点。探讨降钙素基因相关肽在牙槽骨愈合和改建时的表达规律,为把降钙素基因相关肽引入到牙槽外科和口腔种植基础及临床医学研究中进行初步探索。【方法】16只Wistar成年雄性大鼠随机分到4个组中,每组4只,所有动物在同一天制备即刻种植窝预备牙槽骨损伤模型,1至4组依次分别在模型制备后4、7、14、21天取标本。即刻种植窝预备牙槽骨损伤模型制备:大鼠称重后以0.4%戊巴比妥钠(1ml/100g)通过腹腔注射麻醉大鼠,麻醉成功后用橡皮套将大鼠四肢及上颌下颌固定在实验手术台上,用普通镊子由助手协助显露上颌第一磨牙区域,手术区常规消毒、铺巾,在无菌的条件下用小尖头探针分离牙龈,用牙镊拔出左上颌第一磨牙然后用小螺纹钻预备深度和直径合适的种植体窝,术后用消毒小棉球压迫止血。种植窝制备后满4、7、14、21天后在模型制备区域取一小段牙槽骨组织块,所有标本经10%甲醛溶液固定24小时后取出,中性EDTA脱钙液脱钙,然后脱蜡、包埋,切片,免疫组织化学染色、HE染色(观察骨愈合区组织形态),最后光镜下免疫阳性细胞计数,采集图像,应用Image-Pro plus 6.0图像分析系统测量累积光密度值,统计学分析。【结果】1.模型制备成功:16只动物在试验期间种植洞形制备顺利,术区周围组织未见明显肿胀感染现象。2.HE观察结果显示,4天、7天时,骨损伤修复区纤维性组织较多;整个骨损伤修复区域细胞的增殖在4天,7天时最为活跃,细胞核染色较深,14天,21天时,细胞核小、染色相对较浅;四个时期在骨修复区边缘均可见到前成骨样细胞及破骨细胞,中心区域未曾发现。3.骨组织免疫组织化学染色显示,CGRP免疫组织化学染色阳性的细胞,胞浆着色;CGRP在成熟的骨细胞中未见着色,在骨修复区边缘的类成骨细样细胞着色;在模型建立后第7天取标本组CGRP主要在骨修复改建中心区的成纤维细胞中着色,与其它不同时间段种植区骨愈合组织相比,此期CGRP在骨修复改建中心区域染色阳性细胞数最多,染色强度最强,4组经秩和检验CGRP阳性细胞数和IOD值均是在第七天时最高,具有统计学意义(P<0.01)。【结论】1. CGRP在即刻种植术骨愈合区域存在高表达现象,该现象发生在成骨样细胞高增殖状态(骨细胞形成的关键时期)。CGRP在正常的牙槽骨及颌骨未见明显表达,从相反角度证明了,只有在骨修复改建期细胞功能活跃时CGRP才呈现阳性表达。推测CGRP可能是促进骨愈合和抑制骨吸收的一个重要因子。2. CGRP主要在纤维性骨痂向骨性骨痂过度时呈高峰态表达,而CGRP的表达高峰期也是成纤维细胞被诱导表达其成骨作用的关键时期,提示CGRP有可能是诱导成纤维细胞表达其成骨作用的一个重要因子。3.CGRP主要在前成骨细胞和被诱导表达成骨作用的成纤维细胞胞质中染色呈强阳性,考虑CGRP的表达可能是前成骨细胞形成和增殖活动活跃的一个标志,也可能是成纤维细胞被诱导开始表达成骨作用的一个标志。

二、大鼠牙周组织中降钙素基因相关肽阳性神经纤维的分布(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、大鼠牙周组织中降钙素基因相关肽阳性神经纤维的分布(论文提纲范文)

(1)高表达CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞及RAW264.7生物学作用的研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
缩略词表
前言
实验一 rBMSCs的分离培养与鉴定
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
    四、讨论
实验二 高表达CGRP基因rBMSCs、RAW264.7的构建
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
    四、讨论
实验三 高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs生物学作用的影响
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
    四、讨论
实验四 高表达CGRP对RAW264.7免疫调节和破骨分化的影响
    一、实验材料
    二、实验方法
    三、实验结果
    四、讨论
总结及展望
参考文献
文献综述 降钙素基因相关肽在骨再生中的研究进展
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
学位论文评阅及答辩情况表

(2)植入镁对大鼠牙周炎作用的实验研究(论文提纲范文)

摘要
abstract
中英文缩略词表
第1章 引言
    1.1 牙周炎概述
        1.1.1 牙周炎的表现及影响
        1.1.2 牙周炎和相关骨缺损的治疗方法及缺陷
        1.1.3 牙周组织炎症与骨代谢失调
    1.2 镁对骨形成的作用
    1.3 镁对炎症的调节作用
第2章 镁植入物对大鼠实验性牙周炎的作用
    2.1 背景
    2.2 材料与方法
        2.2.1 材料与试剂
        2.2.2 仪器设备
        2.2.3 植入物的制备
        2.2.4 大鼠植入手术与实验性牙周炎模型的建立
        2.2.5 血清镁离子浓度检测
        2.2.6 大鼠颌骨扫描电镜能谱分析
        2.2.7 大鼠颌骨micro CT扫描及牙周骨组织参数测量
        2.2.8 牙周组织及肝肾组织学检测
        2.2.9 统计分析
    2.4 结果
        2.4.1 镁植入物的生物安全性
        2.4.2 镁离子向周围组织的扩散
        2.4.3 镁植入物对牙周骨组织的影响
        2.4.4 镁植入物对牙周组织炎症的影响
    2.5 讨论
        2.5.1 植入材料的制备
        2.5.2 动物模型的建立方法
        2.5.3 镁的生物安全性
        2.5.4 镁离子向周围组织的扩散
        2.5.5 镁植入物对牙周骨组织的影响
        2.5.6 镁植入物对牙周组织炎症的影响
    2.6 结论
第3章 镁植入物对大鼠牙槽骨的成骨作用及机制研究
    3.1 背景
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料与试剂
        3.2.2 仪器设备
        3.2.3 主要溶液的配制
        3.2.4 镁植入物对牙槽骨的成骨作用的影像学和组织学分析
        3.2.5 CGRP在镁植入物诱导的牙槽骨骨膜成骨中的作用
        3.2.6 大鼠牙槽骨骨膜干细胞的培养和鉴定
        3.2.7 细胞增殖实验
        3.2.8 细胞成骨分化实验
        3.2.9 统计分析
    3.3 结果
        3.3.1 镁离子促进牙槽骨骨膜成骨和骨松质成骨
        3.3.2 镁离子促进三叉神经节中CGRP的表达
        3.3.3 CGRP拮抗剂对牙槽骨骨膜成骨无显着抑制作用
        3.3.4 大鼠牙槽骨骨膜干细胞的培养和鉴定
        3.3.5 CGRP对牙槽骨骨膜干细胞增殖和成骨分化无显着促进作用
        3.3.6 镁离子直接促进骨膜干细胞增殖和成骨分化
    3.4 讨论
        3.4.1 镁植入物来源的镁离子促进牙槽骨骨膜成骨
        3.4.2 CGRP对镁引发的牙槽骨骨膜成骨无显着促进作用
        3.4.3 镁离子直接刺激成骨细胞/间充质干细胞成骨
        3.4.4 镁植入物促进骨膜成骨的其他可能机制
    3.5 结论
第4章 镁离子对牙周炎环境中骨膜干细胞的作用
    4.1 背景
    4.2 材料与方法
        4.2.1 材料与试剂
        4.2.2 仪器设备
        4.2.3 主要溶液的配制
        4.2.4 免疫组化染色及分析
        4.2.5 ELISA检测
        4.2.6 巨噬细胞系的培养和牙周炎症模型的建立
        4.2.7 牙槽骨骨膜干细胞增殖实验
        4.2.8 牙槽骨骨膜干细胞成骨分化实验
        4.2.9 统计分析
    4.3 结果
        4.3.1 镁离子抑制牙周炎环境中TNF-α的表达
        4.3.2 镁离子在TNF-α模拟的牙周炎环境中对骨膜干细胞增殖的影响
        4.3.3 镁离子在TNF-α模拟的牙周炎环境中对骨膜干细胞成骨基因表达的影响
    4.4 讨论
        4.4.1 植入物来源的镁离子抑制实验性牙周炎中TNF-α的表达
        4.4.2 镁离子和TNF-α对骨膜干细胞增殖的作用
        4.4.3 镁离子和TNF-α对骨膜干细胞成骨分化的作用
    4.5 结论
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 进一步工作的方向
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果
综述
    参考文献

(3)慢性牙周炎患者治疗前后血清降钙素基因相关肽水平检测的临床意义(论文提纲范文)

英汉缩略语名词对照
摘要
ABSTRACT
前言
1 材料与方法
2 结果
3 讨论
全文总结
参考文献
文献综述
    参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的论文

(4)降钙素促进人牙周膜干细胞胶原合成及成骨分化的作用机制研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
缩略词表
前言
第一部分:降钙素表达水平与牙周炎的临床相关性研究
    引言
    一、材料
    二、方法
    三、结果
    四、讨论
第二部分:降钙素促进人PDLSCs胶原合成及成骨分化的作用研究
    引言
    一、材料
    二、方法
    三、结果
    四、讨论
第三部分:降钙素上调TGF-β1表达促PDLSCs胶原合成的机制研究
    引言
    一、材料
    二、方法
    三、结果
    四、讨论
第四部分:降钙素上调BMP表达促PDLSCS成骨分化的机制研究
    引言
    一、材料
    二、方法
    三、结果
    四、讨论
全文总结
参考文献
综述:降钙素家族和骨形成
    一、降钙素家族成员
    二、降钙素家族的受体
    三、降钙素家族和骨吸收
    四、降钙素家族和成骨
    五、降钙素家族和牙周组织
    参考文献
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
致谢

(5)CGRP对Pg-LPS诱导的成骨细胞损伤的调控作用和机制研究(论文提纲范文)

英文缩写一览表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 Pg-LPS抑制成骨细胞活性并诱导成骨细胞凋亡
    2.1 材料与方法
    2.2 结果
    2.3 讨论
第三章 CGRP对Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡的调控作用
    3.1 材料与方法
    3.2 结果
    3.3 讨论
第四章 CGRP对Pg-LPS诱导成骨细胞凋亡过程中TNF-α的表达影响
    4.1 材料和方法
    4.2 结果
    4.3 讨论
第五章 TNF-α在Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡中的作用
    5.1 材料和方法
    5.2 结果
    5.3 讨论
全文讨论
全文总结
参考文献
文献综述(一) Pg-LPS对炎症因子表达的影响研究进展
    参考文献
文献综述(二) CGRP抑制炎症的研究进展
    参考文献
攻读博士学位期间发表的文章
致谢

(6)神经因素影响大鼠牙周组织缺损愈合过程的机制探讨(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
英文缩略语说明
前言
实验一 离断下牙槽神经后大鼠牙周组织中CGRP及SP的表达变化
    材料方法
    结果
实验二 失下牙槽神经对大鼠牙周组织愈合过程中CGRP、SP及骨改建相关因子表达变化的研究
    材料方法
    结果
讨论
附图
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
学位论文评阅及答辩情况表

(7)神经肽类物质与牙周支持组织及口腔骨修复(论文提纲范文)

文章亮点:
0 引言Introduction
1 资料和方法Data and methods
    1.1资料来源
    1.2 纳入与排除标准
        纳入标准:
        排除标准:
    1.3资料提取与文献质量评估
2 结果Results
    2.1 与牙周组织密切相关的神经肽
        2.1.1降钙素基因相关肽
        降钙素基因相关肽阳性神经纤维在牙周组织中的分布:
        降钙素基因相关肽的功能:
        2.1.2 P物质
        2.1.3舒血管肠肽
        2.1.4神经肽Y
    2.2神经肽与骨代谢
    2.3神经肽与牙周膜细胞
    2.4神经肽与免疫细胞
    2.5神经肽与胶原纤维
3 讨论Discussion
作者贡献:
利益冲突:
伦理要求:
学术术语:
作者声明:

(8)降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化(论文提纲范文)

文章亮点:
0引言Introduction
1材料和方法Materials and methods
    设计:
    时间及地点:
    材料:
        实验动物:
        降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞向成骨细胞分化实验的主要试剂及仪器:
    实验方法:
        兔脂肪干细胞的分离培养[16-17]:
        兔脂肪干细胞的鉴定[18-19]:
        复合载体的制备及实验分组:
        MTT法检测成骨诱导后脂肪干细胞的增殖活性:
        RT-PCR检测细胞Ⅰ型胶原和骨钙素m RNA的表达:
        细胞碱性磷酸酶活性检测:
        钙离子浓度检测:
    主要观察指标:
    统计学分析:
2结果Results
    2.1脂肪干细胞形态学观察
    2.2脂肪干细胞的成骨分化鉴定
    2.3脂肪干细胞的鉴定
    2.4 MTT法检测成骨诱导后三维培养脂肪干细胞的增殖活性
    2.5 RT-PCR检测成骨诱导后三维培养脂肪干细胞Ⅰ型胶原和骨钙素m RNA的表达
    2.6成骨诱导后三维培养脂肪干细胞碱性磷酸酶活性的测定
    2.7成骨诱导后三维培养脂肪干细胞钙离子浓度的测定
3讨论Discussion
作者贡献:
利益冲突:
伦理要求:
学术术语:
作者声明:

(9)CGRP上调TGF-β/BMP-2表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩略词表
前言
    一、研究背景
    二、研究意义
第一部分:人牙周膜成纤维细胞的原代培养及表达降钙素基因相关肽(CGRP)的重组腺病毒感染
    引言
    一、材料
    二、方法
    三、结果
    四、讨论
第二部分:检测 CGRP-A, CGRP-C 基因对感染的人牙周膜成纤维细胞纤维钙化作用的影响
    引言
    一、材料
    二、方法
    三、结果
    四、讨论
第三部分:探讨 CGRP-A, CGRP-C 基因上调 TGF-β/BMP-2 表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究
    引言
    一、材料
    二、方法
    三、结果
    四、讨论
小结
参考文献
综述
    参考文献
致谢

(10)即刻种植骨愈合区降钙素基因相关肽表达的研究(论文提纲范文)

英文缩略词表
引言
中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
结果
附图
附表
讨论
结论
不足与展望
参考文献
综述
     参考文献
致谢
个人简历

四、大鼠牙周组织中降钙素基因相关肽阳性神经纤维的分布(论文参考文献)

  • [1]高表达CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞及RAW264.7生物学作用的研究[D]. 闫凯娴. 山东大学, 2020(02)
  • [2]植入镁对大鼠牙周炎作用的实验研究[D]. 何薇. 南昌大学, 2020(08)
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降钙素基因相关肽阳性神经纤维在大鼠牙周组织中的分布
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