一、免疫印迹技术在B病毒与单纯疱疹病毒鉴别中的应用（论文文献综述）
郭琼[1]（2021）在《CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究》文中研究表明人舌鳞状细胞癌（hOTSCC）是口腔癌中发病率和死亡率最高的一种,具有复发风险高、预后差的特点。临床上治疗hOTSCC的手段仍主要以手术、放疗和化疗为主。然而这些治疗手段往往缺乏靶向性,具有较高的毒副作用,对患者的生存质量造成了严重的影响。因此,开发hOTSCC的基因靶向药物成为当下的研究热点。肿瘤的毒素基因治疗通过肿瘤特异性启动子来调控毒素的表达,使毒素基因只在肿瘤细胞中表达,而在正常组织和细胞中不表达,因而使治疗具有更高的安全性和治疗效率。近年来,肿瘤毒素基因治疗受到了越来越多的研究者的青睐。然而,截止目前,关于hOTSCC毒素基因治疗的报道仍然很少。CEACAM6是细胞表面的一种粘附因子,在多种肿瘤中都过表达,糖基化的CEACAM6可以作为早期口腔鳞状细胞癌患者复发的肿瘤标志物。因此,本文拟用CEACAM6启动子来调控假单胞菌外毒素A的表达,构建hOTSCC毒素基因治疗质粒并探索其对hOTSCC的治疗效果。首先,我们通过qRT-PCR检测了CEACAM6在不同细胞中的表达情况。结果表明,CEACAM6在hOTSCC细胞中显着过表达,而在正常细胞中的表达量则很低,表现出了较强的OTSCC表达特异性。然后,利用基因重组技术构建了p CEACAM6-PE38KDEL毒素表达质粒和p CEACAM6-Basic萤火虫荧光素酶表达质粒,并利用萤火虫荧光素酶活性检测的办法测定CEACAM6启动子的表达活性及表达特异性。结果表明,CEACAM6启动子在体外条件下可以特异性地调控萤火虫荧光素酶的表达,同样表现出了较强的OTSCC表达特异性。因为PE38KDEL毒素可以导致真核细胞翻译延长因子（e EF2）失活,我们利用共转染的方法检测毒素质粒对hOTSCC细胞蛋白合成的特异性抑制作用,并分别利用细胞增殖抑制实验、流式细胞术、TUNEL、Western Blotting、Transwell和伤口愈合试验在体外检测毒素质粒对OTSCC细胞的靶向抑制和杀伤作用。和预期的一样,p CEACAM6-PE38KDEL毒素表达质粒可以特异性抑制OTSCC细胞TCA8113的蛋白合成,对其增殖、侵袭和迁移也具有明显的抑制作用,同时还能诱导其发生凋亡和细胞周期阻滞。相反,对正常细胞以及CEACAM6表达阴性的细胞则影响很小。在裸鼠移植瘤模型中,p CEACAM6-PE38KDEL同样表现出了良好的体内治疗效果,对肿瘤的形成以及生长均具有显着的抑制作用。与此同时,通过H&E、免疫组化检测我们发现,该毒素表达质粒不会对机体的正常组织及器官造成明显的损伤,具有较高的生物安全性。本文的研究结果表明,CEACAM6启动子介导的PE38KDEL毒素基因治疗药物能够有效地抑制和杀伤hOTSCC细胞,具有很高的靶向性和安全性,有望成为未来在临床上进行hOTSCC基因靶向治疗的候选药物。
傅雅娟[2]（2020）在《cGAS-STING通路介导OAS-RNaseL系统调控外源基因表达机制的研究》文中进行了进一步梳理外源DNA通过病毒感染或瞬时转染入侵细胞后,经过胞吞、运输、入核等一系列过程,DNA编码的外源蛋白开始在胞内表达。哺乳动物细胞可表达多个DNA传感器来感知入侵的外源DNA,促进I型干扰素（type-I interferons,IFNα/β）的表达和分泌,产生大量的干扰素诱导基因（interferon stimulated genes,ISGs）,是宿主防御的第一道防线。细胞如何通过DNA传感器调控外源基因表达,至今仍未完全阐述清楚。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclicGMP-AMP synthase,cGAS）是一种细胞质DNA传感器,与DNA结合后催化合成内源性第二信使——环化二核苷酸cGAMP（cyclicGMP-AMP,cGAMP）;cGAMP结合并激活接头蛋白STING（stimulator of interferon genes）,STING从内质网转移至高尔基体后刺激TBK1和IKK激酶复合物,从而使转录因子IRF3和NF-κB激活并磷酸化,释放干扰素等其他细胞因子,通过干扰素-α/β受体（interferon-α/βreceptor,IFNAR）将信号传递给下游的JAK/STAT（januskinase/signal transducersand activatorsof transcription）通路,以应对外源DNA的入侵。近期相关研究进展报道外源DNA转入细胞后,多个核酸传感器如DAI（DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors）、p204（interferon activated gene 204 protein,IFI16）、DHX9（DEx H-Box Helicase 9）能迅速结合DNA,核酸传感器DDX41（DEAD-Box Helicase 41）、DAI和p204的表达均有上调。同时有研究表明质粒DNA激活的cGAS-STING信号通路可引发细胞的抗病毒状态。前人对调控dsDNA进入细胞后外源基因表达的机制研究不够深入。因此,本论文以质粒作为外源dsDNA为研究对象,深入研究cGAS-STING通路对外源基因表达的调控机制;使用cGAS信号级联反应的抑制剂提高多种细胞系和原代细胞（包括T细胞）的外源基因表达,得到以下结果:（1）dsDNA进入细胞后,激活cGAS-STING先天免疫通路,产生I型干扰素和ISGs,降低外源DNA转录产生的m RNA,从而降低外源基因的表达。为确认质粒DNA进入细胞后特异性激活cGAS-STING通路,本研究通过比较WT和Cgas-/-L929细胞,或比较WT、Cgas-/-、Stinggt/gt C57BL/6小鼠的胚胎纤维细胞,或比较WT、Cgas-/-、Stinggt/gt C57BL/6小鼠肺成纤维细胞之间的GFP阳性细胞表达、下游ISGs表达和外源基因在胞内的m RNA和DNA水平,发现与WT相比,cGAS或STING的缺失使细胞中CXCL10、IFIT1、ISG15等ISGs表达被抑制,GFP阳性细胞或荧光素酶表达显着增多至少2倍,EGFP m RNA水平显着上升但细胞内EGFP DNA水平无显着差异。为验证RNA通路是否也能影响外源基因在细胞内的表达,通过比较WT或Mavs-/-L929细胞的GFP阳性细胞数量,或比较WT和Mavs-/-MEF细胞之间的GFP阳性细胞数量,发现与WT相比,MAVS缺失细胞中的EGFP的GFP阳性细胞数量无显着差异。这些结果进一步支持了cGAS-STING途径在抑制转基因表达中的特定作用。（2）cGAS-STING通路的激活产生大量IFNβ,其通过自分泌方式结合IFNAR受体产生下游ISGs从而抑制外源基因的表达。通过检测HT-DNA或poly（I:C）转染细胞产生的条件培养基对WT L929细胞外源基因表达的影响,发现HT-DNA或poly（I:C）条件培养基的预处理能强烈抑制EGFP蛋白的表达。接着用IFNβ重组蛋白,anti-IFNβ抗体或两者的组合对L929细胞进行了预处理,质粒p EGFP-N1转染L929细胞。结果表明加入IFNβ重组蛋白后L929细胞的EGFP蛋白表达量在24小时和48小时均显着降低,加入anti-IFNβ抗体后,EGFP蛋白表达量和GFP阳性细胞数量均有大幅度回补。最后,用重组IFNβ蛋白,anti-IFNAR1抗体或两者的组合对L929细胞进行了预处理,质粒p CMV-Renilla转染处理后的L929细胞。结果与之前一致,来自转染质粒的海肾荧光素酶的表达被IFNβ抑制,并被IFNAR1中和抗体增强。这些研究结果说明cGAS-STING通路激活产生IFN反应,其通过自分泌方式结合IFNAR受体产生下游ISGs从而抑制外源基因的表达。（3）cGAS-STING通路激活OAS-RNaseL信号通路,激活RNaseL降解外源基因的m RNA,从而降低外源基因的表达。通过RNA-Seq技术进行基因表达谱分析,锁定了ISGs中的OAS-RNaseL家族在外源基因表达调控中的重要作用。接着构建OAS1-/-、OAS2-/-、OAS3-/-和RNaseL-/-BJ-5ta细胞,通过质粒p EGFP-N1或p LVX-m Cherry转染细胞后发现当BJ-5ta细胞中敲除OAS1或OAS3或RNaseL时,外源基因表达量显着提高约1.5到3倍;通过检测下游ISGs和外源基因m RNA水平,发现OAS-RNaseL的缺失不影响cGAS-STING通路激活的IFN及ISGs的应答;OAS1、OAS3和RNaseL敲除细胞中外源基因m RNA转录水平显着提高。即OAS1,OAS3或RNaseL的激活导致m RNA降解和转基因表达受到抑制。为直接检测RNaseL的活性,通过过表达RNaseL-Flag的方法,发现质粒p CMV-RNaseL-Flag作为外源DNA激活cGAS-STING通路导致RNaseL-Flag产生切割RNA活性;而cGAS或STING的缺失时质粒无法激活cGAS-STING通路,导致其RNaseL活性未被激活。通过靶向TBK1小分子抑制剂BX795也可充分抑制RNaseL活性。此部分研究阐明了cGAS-STING通路通过分泌IFNβ影响OAS-RNaseL系统从而调控外源基因表达的机制。（4）靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高原代细胞的外源基因表达通过比较靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂预处理后的L929细胞,或BJ-5ta细胞,或WT、Cgas-/-、Stinggt/gtMEF细胞阳性细胞数量、下游ISGs表达及外源基因在胞内的m RNA水平,发现靶向STING蛋白的小分子抑制剂C-176、C-178,靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、Amlexanox、MRT67307和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib分别通过抑制STING、TBK1或者JAK1/2和JAK3的活性,从而阻断cGAS-STING通路及下游ISGs通路,增强外源基因m RNA转录水平,最后提高外源基因在细胞内的表达。（5）靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂增强原代T细胞外源基因表达原代T细胞的转染仍然是基础研究和基因治疗实践中的巨大挑战。在上述研究发现了靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂可增强原代细胞外源基因表达的基础上,将这些靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂预处理激活培养T细胞、新鲜PBMC,发现无论是激活培养T细胞、还是新鲜PBMC、或是na（?）ve静息T细胞,靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂都能显着降低质粒进入细胞后的ISGs的表达,显着增强其外源基因表达,并且培养18天都不影响细胞的生存状态。这些研究结果证明小分子抑制剂的简单预处理可以克服由cGAS-STING途径的激活引起的T细胞转染的困难。综上所述,在本研究中,我们通过探索cGAS-STING介导的DNA传感通路,研究了控制转基因表达的潜在机制。我们发现质粒DNA通过cGAS-STING通路诱导了干扰素反应,其中OAS-RNaseL抗病毒系统的激活是导致m RNA降解和转基因表达受到抑制的主要因素。使用DNA传感通路的信号级联反应的化学抑制剂可有效解除cGAS-STING通路在多种细胞系和包括T细胞在内的原代细胞中转基因表达的抑制作用。本研究初步揭示dsDNA进入细胞后,外源基因受到调控的分子机制,为DNA将来在转染、基因治疗或DNA疫苗的研究及临床应用奠定了坚实的基础。
沈阳坤[3]（2020）在《HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究》文中认为溶瘤病毒疗法（Oncolytic virus therapy,OVT）作为一种前景广阔的肿瘤治疗手段,具有安全、高效和副作用低的特点,已经成为肿瘤治疗研究中的热点。其中,I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）作为研究最为广泛的一类溶瘤病毒,已有几十种候选药物处于临床前或临床研究阶段。然而,多年的临床试验表明,单一的溶瘤病毒疗法只有有限的治疗效果,且具体机制尚不明确。宿主中的一些蛋白质对病毒的侵染、繁殖以及传染至关重要,被称为病毒的宿主依赖因子（Host Dependency Factor,HDF）。已有证据表明,细胞和动物水平HDF的缺陷,会导致病毒的感染失败。然而尽管目前已有针对HSV-1复制周期及HSV-1的免疫机制等方面的深入研究,但对病毒与宿主间的相互作用的理解,特别是涉及病毒感染和裂解复制的细胞质蛋白的作用仍然所知甚少。此外,肿瘤患者体内的HDF突变是否影响HSV-1类溶瘤病毒的治疗尚未见系统研究。本论文研究的目的是探讨HSV-1病毒HDF突变在溶瘤病毒精准治疗中的作用及肿瘤耐受的机制。方法:（1）利用CRISPR/Cas9技术制备ICP34.5基因缺失的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-ΔICP34.5、HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌MC38细胞MC38Nectin1-/-和表达NEO-2/15的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15。（2）制备小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（3）制备小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5和HSV-1-NEO-2/15溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（4）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术筛选HSV-1病毒的HDF。（5）通过统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等方法确定HSV-1病毒HDF的候选基因。（6）利用CRISPR/Cas9技术制备Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6等基因的敲除细胞并通过病毒感染、台盼蓝法、细胞计数法、q PCR和Western Blotting检测HDF缺失对病毒感染的影响。（7）通过HSV-1病毒的膜结合实验评估HSV-1病毒的HDF缺失后病毒和宿主细胞的结合能力。（8）通过共聚焦显微镜追踪HSV-1病毒进入细胞的过程。（9）利用TCGA数据库分析临床肿瘤患者体内HSV-1病毒HDF的突变频率。结果:（1）HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗对小鼠MC38结肠癌治疗效果显着,然而对B16黑色素瘤未见明显效果。接着,我们利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌,结果显示,和对照组相比,Nectin1基因缺失的小鼠肿瘤体积未见明显缩小,证实溶瘤病毒对小鼠MC38-ΔNectin1结肠肿瘤的治疗无效。（2）本研究中,利用CRISPR基因编辑技术,我们成功制备HSV-1-NEO-2/15新型溶瘤病毒。通过对小鼠MC38结肠肿瘤的治疗,我们的研究结果表明,NEO-2/15不仅可以和HSV-1溶瘤病毒同时使用,并且NEO-2/15的整合能够显着增强溶瘤病毒的治疗效果。（3）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术,结合统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等分析方法,我们最终得到了31个HSV-1病毒的候选HDF基因。通个基因敲除验证,我们已经证实细胞水平敲除Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6可以显着增强细胞抵抗HSV-1病毒感染的能力。此外,KEGG分析结果表明EXT1、EXT2、EXTL3和B3GALT6等基因在硫酸乙酰肝素合成通路中扮演重要作用。基因敲除结果表明这些基因的突变不仅能够显着降低HSV-1病毒对宿主的感染水平,而且还能降低病毒与宿主细胞的结合能力。ENTPD1基因的缺失只影响HSV-1病毒进入宿主细胞,并不影响病毒与细胞膜的结合。（4）根据TCGA数据库提供的肿瘤患者基因信息,大部分基因在至少一种肿瘤中存在突变,且部分基因的突变频率高达5%以上,意味着HSV-1溶瘤病毒对这些肿瘤可能得不到很好的治疗效果,暗示HDF的精准检测在溶瘤病毒治疗前的必要性。结论:本研究中,基于HDF突变引起的溶瘤病毒感染失败的现象,我们首次提出溶瘤病毒抵抗（Oncolytic virus resistance）的概念,即当患者体内发生溶瘤病毒HDF的突变,溶瘤病毒的治疗效果就会消失;或者治疗前期溶瘤病毒对肿瘤的效果显着,但是随着肿瘤细胞增殖过程中异质性分化的更加明显,部分肿瘤细胞的HSV-1宿主依赖因子的表达水平降低或者发生基因突变,导致HSV-1病毒的感染减少或者失败,最终影响溶瘤病毒的治疗效果。基于此概念,寻找新的肿瘤治疗药物并用于溶瘤病毒的联合治疗是该治疗领域的一个重要研究方向。因此,我们构建了一种新型HSV-1类溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15,能显着增强肿瘤的治疗效果。此外,利用CRISPR全基因组敲除文库筛选出多个HSV-1的HDF,并深入探讨了部分基因的功能。近年来国内溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多,而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。本研究证实了根据HSV-1病毒HDF的突变与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗,以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。未来,通过对这些蛋白的深入研究,将为开发HSV-1类溶瘤病毒耐药检测试剂盒以及为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据。同时依据这些靶点,可以开发出新的抗HSV-1病毒药物,为溶瘤病毒治疗后因病毒残留带来的潜在感染风险提供新的解决方案,把溶瘤病毒治疗的副作用降到最低。
陈勇[4]（2020）在《基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱及针刺网络调节作用规律的研究》文中研究指明目的:探索针刺潜在的治疗病谱及针刺的网络调节作用规律,为针刺更好地应用于临床提供科学依据。方法:将10只Wistar大鼠右后足跖处注射弗氏佐剂0.1 ml,制备佐剂性关节炎疾病模型。采用随机数字法将造模成功的10只大鼠随机分为模型组和模型+电针组,每组5只。同样的方法将其余12只大鼠随机分为空白对照组和正常+电针组,每组6只。模型电针组和正常电针组大鼠予足三里穴、环跳穴电针刺激,刺激参数为:疏密波,频率2/10Hz,强度5/10/15（0.76/1.53/2.3m A）,各10min,共30min,隔日一次,第27天后各组大鼠取腹主动脉血,并离心提取血清。Exo Quick法提取血清外泌体,通过透射电镜、蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）、浓度粒径检测（NTA）等方法鉴定外泌体,应用非靶标（Label Free）定量蛋白组学技术测量血清外泌体所运载蛋白的种类和含量。筛选组间变化倍数大于1.5,p<0.05的针刺显着差异蛋白,将筛选出的263个正常针刺显着差异蛋白和61个炎症模型针刺显着差异蛋白作为源数据,在人类疾病数据库（MALACARD）查找与显着差异蛋白相关的疾病,通过Gephi软件构建正常针刺显着差异蛋白-疾病网和模型针刺显着差异蛋白-疾病网,将正常针刺显着差异蛋白相关疾病与模型针刺显着差异蛋白相关疾病列入Excel表格中,通过“突出显示单元格规则”下拉菜单中的“重复值”,找出正常针刺显着差异蛋白和模型针刺显着差异蛋白二者皆相关的疾病,并联合应用连入度（Degree）、加权入度（Weight Degree）、Page Rank等运行算法筛选与显着差异蛋白相关度高的疾病,剔除世界卫生组织（World Health Organization,WHO）、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health,NIH）及国内《现代针灸病谱》已推荐的针灸治疗病症,最终确定针刺可能的潜在治疗病症。将实验一中筛选的61个炎症模型针刺显着差异蛋白作为源数据,在Uniprot蛋白数据库、STRING数据库、GO功能数据库、KEGG数据库中查找显着差异蛋白相关的互相作用蛋白、分子功能、信号通路及显着差异蛋白来源的细胞和组织,通过Gephi软件构建显着差异蛋白-互相作用蛋白网、显着差异蛋白-信号通路网、显着差异蛋白-功能网及显着差异蛋白-分泌细胞组织网,联合应用Degree、Weight Degree、Page Rank等运行算法筛选关键的互作蛋白、信号通路、分子功能、分泌细胞组织,探究针刺镇痛抗炎网络调节的作用规律。结果:1.实验结合复杂网络分析挖掘的针刺潜在治疗病症结果显示,针刺在32种肿瘤、15种免疫系统疾病、15种循环系统疾病、6种传染病、5种泌尿生殖系统疾病、4种代谢性疾病、4种骨骼肌肉系统和结缔组织疾病、3种消化系统疾病、2种呼吸系统疾病、2种皮肤疾病、2种神经系统疾病、1种五官疾病以及11种其他疾病中可能存在潜在的治疗效应。2.针刺显着差异蛋白的下游互作蛋白与免疫调节、脂质代谢、糖代谢、信号传导等功能密切相关;针刺显着差异蛋白的分子功能多与生物活性物质的合成代谢、免疫调节、信号传导以及生物活性物质的运输相关;Fox O、Ras、补体和凝血级联、HIF-1、糖酵解/糖异生、PPAR等信号通路可能是针刺整体调节的关键信号通路,这些通路多与免疫调节、糖代谢、脂质代谢等相关;针刺显着差异蛋白可来源于消化、泌尿生殖、呼吸、内分泌、循环、免疫、运动、神经、泌尿、皮肤等各个系统。结论:1.针刺潜在适应病症广泛,涉及多系统疾病,其中免疫系统疾病、肿瘤、代谢性疾病等可能是针刺重要的潜在治疗病症。2.针刺镇痛抗炎作用具有网络调节的特点,可从器官、组织、细胞、蛋白、信号通路等多层次、多维度、多途径发挥整体作用。
杨帆[5]（2020）在《黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究》文中指出国内外一系列研究表明黄酮类化合物对诸多病毒有抗病毒活性,如疱疹病毒（herpes virus,HSV）、登革热病毒（dengue virus,DENV）、寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）等。但是在兽医领域尤其是抗马立克氏病的研究还鲜有报道。近年来随着马立克氏病病毒（marek’s disease virus,MDV）的毒力不断净化,在免疫后的鸡群也零星有MDV发病的报道。目前使用的MDV疫苗能防止肿瘤的发生和免疫抑制,但病毒仍然能在体内复制并向外排毒。因此筛选和研究MDV的抗病毒药物,尤其是中成药对于预防和控制临床中马立克氏病病毒传播有重要意义。本研究根据发表的研究结果,以及不同黄酮类化合物的化学结构选择了两大类黄酮类化合物进行单独和联合用药抗MDV复制的研究,以期为临床抗MDV药物研发与应用提供理论依据。1.黄酮类化合物白杨素（Chrysin）和染料木素（Genistein）对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。以往报道表明黄酮类化合物白杨素和染料木素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗过敏等作用。为探索这两者对马立克氏病病毒复制的影响,从以下几个方面设计实验:药物是否对CEF细胞有毒性及其最大安全浓度;药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用;药物是否在病毒进入细胞前、病毒吸附细胞的过程、病毒吸附进入细胞后有抑制作用;药物是否能直接影响病毒的感染性甚至直接杀灭病毒。以上试验利用Real-time PCR、Western Blot及噬斑计数等方法分析马立克病毒在CEF细胞中的复制情况。结果表明染料木素能较好的抑制马立克病毒在CEF细胞中的复制,抑制作用具有时间和剂量依赖性,噬斑计数试验的结果表明病毒抑制率为87.5%,并且还能够直接影响病毒的感染性。另外,对MDV感染CEF细胞因子的表达进行了检测,结果显示与未加染料木素药物处理组相比,染料木素诱导病毒感染细胞中IRF-7显着,同时IFN-β表达也上调明显,两者呈现正相关关系。这表明染料木素可能通过诱导细胞产生IFN-β从而抑制MDV在CEF细胞中的复制。此外,染料木素药物处理显着增加炎症因子IL-6和IL-1β的表达,提示细胞的炎症反应也与MDV感染相关。与染料木素相比,白杨素几乎没有抑制MDV复制的作用,甚至还能促进MDV在CEF中的复制。2.黄芩苷（baicalin,BA）、表儿茶素没食子酸酯（（-）-Epicatechin gallate,ECG）和柚皮素（（±）-Naringenin）对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。首先检测了不同的药物对CEF细胞的毒性,接着探究药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用,以及具体在病毒复制哪个阶段发挥作用。同时也检测了这三种药物是否能直接影响MDV的感染性。另外对病毒感染CEF细胞中的细胞因子变化也进行了检测分析。实验结果表明黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯对MDV的复制有较强抑制作用,抑制率为90%和91.6%,而柚皮素效果一般,抑制率为41.6%。细胞因子检测结果表明,尽管BA和ECG处理细胞组IRF-7表达明显减少,但抗病毒因子IFN-β的表达没有影响,这一结果表明由MDV感染引起的IFN-β表达增加可能受到其他转录因子的调节。此外,MDV感染的CEF细胞中BA处理后,促炎因子IL-1β和IL-6的表达略有下降,但差异不显着,这可能与BA在不同细胞中具有不同的抗病毒机制相关。而ECG处理组IL-6的表达显着降低,表明ECG可以抑制炎性因子的表达。3.染料木素、黄岑苷和表儿茶素没食子酸酯联合应用对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。与单味中药相比,复方中药可能具有更好的抗病毒作用。将单一黄酮类化合物抑制MDV复制效果较好的黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和染料木素进行两两配伍,分成黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯,黄芩苷和染料木素,表儿茶素没食子酸酯和染料木素以及黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和染料木素三者配伍的这四个组。首先检测了这四组药物对CEF细胞的毒性,接着探究药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用。结果表明:这几组复合药物的抑制效率不如单一药物的高。
张胜南[6]（2020）在《评价抗寨卡病毒药物的体内保护作用并阐明其分子机制》文中进行了进一步梳理寨卡病毒与登革热病毒相似,是一种经蚊媒传播的黄病毒,现已传播至80多个国家和地区。研究表明寨卡病毒感染与成人肌肉无力、麻痹等神经系统疾病病及胎儿小头畸形密切相关。世界卫生组织在2016年2月将寨卡病毒的爆发与传播列为全球突发公共卫生事件。寨卡病毒在南美及东南亚地区等地区持续蔓延,我国地处热带、亚热带及温带适宜伊蚊的生存与繁殖,为寨卡病毒传播提供良好的媒介;沿海省份华侨众多,且与外界经济贸易与人员来往频繁,面临较大输入性及本土传播威胁。此外,寨卡病毒与登革热病毒具有相似的免疫表位,交叉反应抗体可能会通过Fc受体增强病毒的感染,而登革热病毒已在我国广东地区本土化传播。目前尚无获批上市的预防疫苗及特异性抗病毒药物。本论文从临床常用广谱抗病毒药物入手,试图获得可用于临床治疗寨卡病毒感染的药物。本研究从临床常用药物中筛选得到一系列具有抗寨卡病毒活性的药物,包括氯喹、利巴韦林、25-羟基胆固醇与葡萄糖胺等。其中,我们研究证明氯喹具有较好的抗病毒活性。氯喹可被人体肠道快速吸收并广泛分布于机体各器官,尤其是可穿越胎盘及胎脑屏障,经大量临床验证生物安全性好、孕妇用药对胎儿没有明显副作用。因此,本研究主要探究氯喹的抗病毒作用及其分子机制。我们发现在Vero细胞中氯喹剂量依赖性抑制寨卡病毒的复制及减少子代病毒的产生,有效降低Vero细胞的感染率;在Huh7细胞及MEF细胞中同样可减少寨卡病毒的感染。利用免疫缺陷小鼠SCID Beige建立了寨卡病毒乳鼠感染模型和母婴传播模型,应用这些模型评估氯喹在体内的抗病毒作用。研究发现氯喹可以显着提高寨卡病毒感染的SCID Beige乳鼠的生存率、减轻感染乳鼠的神经障碍症状、降低脑和脾脏等组织中的病毒载量。此外,氯喹也可以明显减轻成年SCID Beige小鼠的病毒血症。尤为重要的是,氯喹可有效阻断寨卡病毒的母婴传播,降低孕鼠病毒血症和胎盘病毒载量、避免胎儿小头畸形。上述结果表明,氯喹在体内外均可以有效抑制寨卡病毒的感染,但其作用机制尚不明确。首先我们研究表明氯喹不影响寨卡病毒与细胞表面受体结合进入细胞,进一步探索发现感染早期及中后期添加氯喹均可显着抑制寨卡病毒的感染,说明氯喹可能作用于寨卡病毒生命周期的不同阶段。通过内体分离及荧光定位实验发现,氯喹可以通过阻断早期内体酸化抑制寨卡病毒包膜与内体膜的融合,进而阻断病毒RNA由内体向胞质释放的过程。有研究证明黄病毒可利用自噬体膜系统促进自身复制,我们研究发现寨卡病毒感染会引发细胞自噬的增加,敲除自噬相关基因ATG5及自噬阻断剂氯喹处理均显着降低寨卡病毒复制及子代病毒产生,而自噬诱导剂雷帕霉素处理促进病毒的复制。这些发现表明,氯喹可能通过抑制感染细胞内体中病毒RNA的释放和自噬依赖的RNA复制,从而提高感染乳鼠的生存率、阻断母婴传播。此外,在前期研究中,本实验室通过单细胞PCR技术从寨卡感染康复者体内得到31株针对寨卡病毒E蛋白的单克隆抗体。本研究利用寨卡病毒乳鼠感染模型评估了 5株中和抗体7B3、7F4、8D10、1C11、6A6的保护效果,其中7B3、1C11及6A6可以有效治疗寨卡病毒感染、提高小鼠生存率。进一步研究发现,7B3具有最好的保护效果,并且呈现剂量依赖性。此外,在攻毒前给与抗体,7B3、6A6可有效预防寨卡病毒的感染。这一发现为寨卡病毒的抗体药物研究及疫苗的设计提供了理论支撑。
赵阳[7]（2019）在《水痘-带状疱疹病毒（VZV）感染与细胞自噬的相关研究》文中研究表明背景水痘一带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）具有嗜皮肤、神经、淋巴细胞的特性,感染人体可引起水痘及带状疱疹,目前关于VZV感染机制的阐释尚不明确。自噬是一种细胞内降解途径,研究表明细胞自噬可防御病原体感染,而许多病原体,包括多种人类疱疹病毒进化出多种机制来逃避、抑制甚至利用自噬。信号传导及转录激活因子3（Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）在调节自噬过程中发挥重要作用,并且作为转录因子可调控多种病毒的复制和扩散。目的明确VZV感染与自噬的相互关系,并探讨STAT3信号通路在VZV感染中对自噬和病毒复制的调节作用。方法1.流式细胞术检测35例带状疱疹患者外周血CD4+T淋巴细胞中自噬蛋白LC3B,Beclin-1、p62的表达情况,30例健康成人作为对照组;获取12例带状疱疹患者皮损区标本,免疫组化法检测皮肤组织中相关自噬蛋白的表达,透射电镜观察皮肤细胞内自噬体的生成。2.VZV感染的SHSY5Y细胞中,MDC荧光染色观察自噬体,western-blot检测自噬蛋白LC3B-Ⅱ,Beclin-1、p62的表达。经自噬诱导剂海藻糖和自噬抑制剂3-MA处理感染细胞后,检测VZV滴度,q-PCR检测VZV DNA拷贝值,western-blot 检测 VZV 糖蛋白 E（glycoprotein E,gE）表达的变化。3.VZV感染的SHSY5Y细胞中,western-blot检测STAT3、及其下游因子BNIP3的表达及磷酸化情况;经S3I-201阻断STAT3通路后,检测自噬蛋白及VZV复制的变化;经S3I-201阻断STAT3通路后,应用自噬诱导剂海藻糖,检测自噬蛋白及VZV复制的变化。结果1.带状疱疹患者外周血CD4+T细胞中、皮损区皮肤组织中自噬蛋白LC3B,Beclin-1的表达明显增高（P均<0.05）,p62的表达明显降低（P<0.05）,皮损区皮肤细胞中自噬体数量明显增高（P<0.05）。2.VZV感染的SHSY5Y细胞中,自噬蛋白LC3B-Ⅱ,Beclin-1的表达明显增高（P均<0.05）,p62的表达明显降低（P<0.05）,对自噬进行诱导/抑制后,病毒滴度明显升高/降低,VZV DNA拷贝值明显升高/降低,VZV gE的表达明显升高/降低（P均<0.05）。3.VZV感染的SHSY5Y细胞中,STAT3的表达及磷酸化、其下游因子BNIP3的表达明显升高（P均<0.05）,抑制STAT3后,自噬水平明显下降,VZV复制减弱,而自噬诱导剂海藻糖可逆转这种减弱（P均<0.05）。结论VZV感染后,T淋巴细胞、皮肤组织、神经细胞中自噬水平升高,自噬的发生对病毒复制产生正性影响,此外,在VZV感染中,STAT3-BNIP3通路的活化可通过正性调控自噬的表达而调控VZV复制。探讨病毒感染性疾病中自噬及其调节通路的作用,将为研究病毒复制机制及病原体-宿主相互作用机制提供见解。
苗玉辉[8]（2019）在《BCAP通过双向调节PI3K/AKT和NF-κB信号活化控制树突状细胞的成熟》文中提出树突状细胞（DCs）是一类特殊的天然免疫细胞,在适应性免疫应答的启动中发挥关键的作用。DCs能吞噬和加工多种胞外病原体和胞内病原体来源的抗原,并通过MHC分子将抗原信息提呈给抗原特异性T细胞,从而致敏Naive T细胞,启动抗原特异性的适应性免疫应答应答。DCs刺激T细胞应答的能力受其本身成熟状态的影响,未成熟的DCs—般引起免疫耐受,而识别病原体特定组分后,DCs会发生一系列的表型和功能的改变,成为成熟的DCs。成熟的DCs能引起有效的适应性免疫应答,清除入侵的病原体。BCAP蛋白表达于多种免疫细胞,并发挥不同的调节作用。一方面BCAP对于B细胞的成熟和活化、Th17细胞的分化和CD8 T细胞的活化和记忆是不可或缺的;另一方面,BCAP的表达抑制了巨噬细胞和NK细胞的活化。虽然BCAP在DCs中也有较高水平的表达,然而其功能和发挥作用的机制仍不清楚。为了研究BCAP在DCs中的功能,我们利用DCs中缺失BCAP的条件敲除鼠模型,研究了 BCAP对于DCs抗李斯特菌感染能力的影响,并利用体外骨髓诱导培养的BMDCs和DC2.4细胞系,探究了具体的分子机制。我们的研究发现,BCAP会抑制DCs促进T细胞应答的能力,从而影响小鼠体内抗李斯特菌的适应性免疫应答。进一步的研究发现,BCAP抑制了 Toll样受体诱导的DCs成熟时表面共刺激分子的表达和细胞因子的产生,从而抑制了其刺激T细胞应答的能力。分子机制上,BCAP在DCs中通过其磷酸化状态的改变,动态地与MyD88和PI3K的p85α亚基结合,以一种尚未被报道的双向调节模式,同时控制了 MyD88依赖的Toll样受体下游PI3K/AKT信号和NF-κB信号的活化和关闭,抑制DCs成熟相关基因的转录表达。我们的研究首次揭示了 BCAP在DCs中的抑制性功能,为更全面地梳理BCAP在不同免疫细胞中的功能提供了新的参考。同时,我们的研究也为更深入地了解DCs的成熟相关的调节机制提供了新的参考,对于研究病理性的DCs过度成熟提供的新的思路。另外,我们也首次提出了一种全新的双向双通路的信号调节模式,为研究细胞内复杂信号网络的转导机制提供了可供参考的模型。
朱玉洁[9]（2019）在《表达PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性单纯疱疹病毒的构建及其抗肿瘤疗效的研究》文中研究表明研究背景免疫检查点阻滞剂的应用是肿瘤治疗领域的一大突破,它已在多种肿瘤类型中取得了令人振奋的临床疗效。目前,美国食品药品监督管理局已经批准6种靶向CTLA-4、PD-1或PD-L1的单克隆抗体用于12种临床肿瘤指征。不幸的是,只有10-40%的肿瘤患者能从中获益。PD-1/PD-L1阻滞疗效不佳通常可归因于肿瘤微环境内浸润淋巴细胞有限。溶瘤病毒代表另外一种新兴的肿瘤免疫疗法,它主要通过选择性的裂解肿瘤细胞导致其发生免疫原性死亡,释放大量的肿瘤相关抗原、病原相关分子模式和损伤相关分子模式,从而促进抗原提呈,募集T细胞,使T细胞致敏。此外,溶瘤病毒引起的Ⅰ型干扰素反应,亦可产生趋化因子,募集周围的T细胞。基于免疫检查点阻滞剂和溶瘤病毒治疗不同的作用机制,我们探讨了二者联合使用的新策略及其是否可以产生协同的抗肿瘤效应。方法我们首先利用分子克隆和同源重组技术构建了表达抗人PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒（oHSV2-aPD1）。应用蛋白免疫印迹和共培养实验,我们检测了 oHSV2-aPD1病毒产生PD-1单抗的能力及表达的PD-1单抗的生物学功能。通过病毒感染实验和CCK8细胞增殖实验,我们比较了未经抗体修饰的亲代溶瘤病毒oHSV2和表达抗人PD-1单抗的子代病毒oHSV2-aPD1的感染能力及体外溶瘤活性。应用B16R小鼠黑色素瘤模型,我们探讨了 oHSV2-aPD1病毒的体内抗肿瘤效果。此外,利用流式细胞术和转录组测序技术,我们进一步探索了 oHSV2-aPD1病毒疗法对肿瘤微环境和机体系统免疫状态的影响。结果（1）我们成功构建了表达抗人PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒,oHSV2-aPD1。（2）通过感染真核细胞,oHSV2-aPD1病毒表达出了分子量大小正确的抗人PD-1单克隆抗体,该抗体能识别人源PD-1抗原并与之结合,活化T细胞,促进细胞因子IFN-y和IL-2的合成。（3）oHSV2-aPD1病毒同亲代病毒oHSV2相比,溶瘤谱未发生改变,溶瘤活性亦未被削弱。（4）在小鼠B16R黑色素瘤模型中,oHSV2-aPD1病毒疗法获得了与联合治疗（局部应用oHSV2病毒+系统应用抗人PD-1单抗）相似的抗肿瘤效果,并且这种疗效无论是在抑制肿瘤生长还是延长小鼠生存期方面,都优于单独治疗（单独oHSV2或抗人PD-1单抗治疗）。（5）oHSV2-aPD1病毒治疗激活了机体肿瘤微环境和外周免疫系统内大量的免疫效应细胞和分子,并且减少了免疫抑制性细胞的比例。（6）机体外周免疫状态与肿瘤微环境内免疫状态相比,与肿瘤免疫治疗疗效有更好的相关性。结论我们的研究表明,oHSV2-aPD1病毒疗法在临床前动物肿瘤模型中展现出了良好的抗肿瘤活性和持久的疗效反应,提示表达免疫检查点阻滞剂的溶瘤病毒在肿瘤临床治疗中具有很大潜力。
王润杨[10]（2019）在《溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2联合CAR-T抗胃癌疗效研究》文中研究说明在过去的几年中,来自多个研究机构的临床试验证明,在治疗B细胞恶性肿瘤方面,包括B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、B细胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和霍奇金淋巴瘤（HL）以CD19、CD20或CD30为靶点的CAR-T细胞的临床试验显示出了优异的结果。但是当CAR-T用于实体瘤的治疗时,往往存在靶点的选择,在体内的定位等问题的限制。同时,CAR-T细胞还会受到肿瘤微环境和一些免疫细胞的抑制。溶瘤病毒是一类能选择性感染和损害肿瘤组织但对于正常组织无害的具有成药潜力的病毒,常见的溶瘤病毒包括Ⅰ型单纯疱疹溶瘤病毒、呼肠孤病毒、腺病毒等。由溶瘤病毒造成的肿瘤细胞的裂解会释放出大量的肿瘤相关抗原,这些抗原的释放会进一步被机体的免疫系统所识别,从而激活相关的免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤。目前已有报道,溶瘤腺病毒和CAR-T细胞联合能够对头颈部肿瘤起到更好的疗效。本课题采用的溶瘤病毒是本实验室前期改造的:重组人GM-CSF溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒（Oncolytic herpes simplex virus type 2,oHSV2）是在野生型Ⅱ型单纯疱疹病毒株（herpes simplex virus type 2,HG52）的基础上剔除了免疫抑制基因和神经毒性基因并插入了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）的表达序列。插入了hGM-CSF基因片段的oHSV2可以诱导机体的免疫应答反应。本研究设想针对现有的CAR-T细胞疗法,加入了oHSV2进行联合治疗,通过溶瘤病毒来调节肿瘤微环境,研究oHSV2是否能帮助CAR-T细胞获得更好的针对胃癌的治疗效果。本研究在分子水平上成功的构建了靶向CD19的嵌合抗原受体表达框和重组慢病毒,通过蛋白免疫印迹对CD19-CAR进行了验证。同时制备了靶向CD19的CAR-T细胞,并在细胞水平上验证了CAR-T对Raji细胞的杀伤能力。由于目前还未发现胃癌肿瘤细胞有稳定的抗原,因此我们利用PiggyBac转座子系统,构建了稳定表达CD19的BGC823单克隆细胞系,进一步在细胞水平验证了CAR-T细胞对BGC823-CD19细胞的杀伤能力。结果表明,CAR-T能够对CD19阳性的细胞产生特异性的杀伤,但对CD19为阴性的细胞杀伤水平大大减弱。此外,研究成功建立了NSG小鼠胃癌肿瘤模型,实验中设置了空白对照组,CAR-T细胞单独治疗组,oHSV2溶瘤病毒单独治疗组,CAR-T细胞和oHSV2的联合治疗组。结果表明,与空白对照组相比,CAR-T在体内实验中同样具有抗肿瘤活性,溶瘤病毒oHSV2单独治疗组也能够对肿瘤的生长进行抑制。与单一给药的方式相比,oHSV2联合CAR-T细胞进行治疗能够更好缩小肿瘤的生长。本研究表明oHSV2和CAR-T细胞的联合治疗能对实体瘤起到更好的疗效,为实体瘤的治疗提供了一个新颖的思路。
二、免疫印迹技术在B病毒与单纯疱疹病毒鉴别中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、免疫印迹技术在B病毒与单纯疱疹病毒鉴别中的应用（论文提纲范文）
（1）CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人舌鳞状细胞癌概述 |
| 1.2 人舌鳞状细胞癌的治疗现状 |
| 1.2.1 手术治疗 |
| 1.2.2 放射治疗 |
| 1.2.3 化疗 |
| 1.2.4 分子靶向治疗 |
| 1.3 肿瘤基因治疗概述 |
| 1.3.1 抑癌基因的癌症治疗 |
| 1.3.2 RNA干扰和沉默 |
| 1.3.3 抗肿瘤血管生成以及抗表皮生长因子受体的基因治疗 |
| 1.3.4 免疫基因疗法 |
| 1.3.5 溶瘤疗法 |
| 1.3.6 基因编辑法 |
| 1.3.7 自杀基因疗法 |
| 1.4 假单胞菌外毒素概述 |
| 1.4.1 假单胞菌外毒素的结构及其致毒机理 |
| 1.4.2 假单胞菌外毒素在肿瘤毒素治疗中的应用 |
| 1.5 癌胚抗原相关细胞粘附因子6 概述 |
| 1.5.1 CEACAM6 的结构 |
| 1.5.2 CEACAM6 与肿瘤的转移的关系 |
| 1.5.3 CEACAM6 与肿瘤的凋亡及分化的关系 |
| 1.5.4 CEACAM6 与肿瘤抗药性的关系 |
| 1.5.5 CEACAM6 与肿瘤免疫的关系 |
| 1.6 本论文立题依据和研究内容 |
| 第二章 CEACAM6 启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 |
| 2.2.2 所用质粒的结构及特征图谱 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 RNA提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR |
| 2.3.5 TCA8113 细胞基因组的提取 |
| 2.3.6 CEACAM6 启动子及PE38KDEL片段的扩增 |
| 2.3.7 DNA的回收 |
| 2.3.8 DNA双酶切 |
| 2.3.9 目的基因与质粒载体的连接 |
| 2.3.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.11 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.3.12 质粒提取 |
| 2.3.13 质粒的鉴定 |
| 2.3.14 细胞转染 |
| 2.3.15 荧光素酶测定 |
| 2.3.16 BCA定量 |
| 2.3.17 数据统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同细胞中CEACAM6 基因的表达 |
| 2.4.2 质粒的构建 |
| 2.4.3 质粒的双酶切鉴定 |
| 2.4.4 质粒的测序鉴定 |
| 2.4.5 CEACAM6 启动子在不同细胞中的表达活性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CEACAM6 启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的体外抗肿瘤活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料及试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 荧光素酶合成抑制试验 |
| 3.3.2 细胞增殖抑制试验 |
| 3.3.3 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡试验 |
| 3.3.4 TUNEL细胞凋亡检测试验 |
| 3.3.5 细胞蛋白的提取 |
| 3.3.6 蛋白免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.3.7 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.8 流式细胞术检测细胞周期分布试验 |
| 3.3.9 Transwell实验 |
| 3.3.10 伤口愈合实验 |
| 3.3.11 数据统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pCEACAM6-PE38KDEL对荧光素酶合成的抑制作用 |
| 3.4.2 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4.3 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.4.4 pCEACAM6-PE38KDEL通过线粒体途径诱导细胞凋亡 |
| 3.4.5 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.4.6 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞周期的阻滞作用 |
| 3.4.7 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞迁移能力的影响 |
| 3.4.8 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 CEACAM6启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的体内抗肿瘤活性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器及试剂 |
| 4.2.1 材料及试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 人舌鳞状细胞癌细胞皮下移植瘤动物模型的建立 |
| 4.3.2 人舌鳞状细胞癌细胞皮下移植瘤动物模型的治疗方案 |
| 4.3.3 尾静脉注射法进行小鼠体内转染 |
| 4.3.4 样本采集及切片的制作 |
| 4.3.5 H&E染色 |
| 4.3.6 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 4.3.7 Ki-67 免疫组化 |
| 4.3.8 数据统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 pCEACAM6-PE38KDEL对肿瘤生长及形成的抑制作用 |
| 4.4.2 pCEACAM6-PE38KDEL质粒对肿瘤的体内杀伤作用 |
| 4.4.3 pCEACAM6-PE38KDEL的系统毒性 |
| 4.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）cGAS-STING通路介导OAS-RNaseL系统调控外源基因表达机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1.1 先天免疫信号通路 |
| 1.1.1 Toll样受体 |
| 1.1.2 细胞质RNA识别通路 |
| 1.1.3 细胞质DNA识别通路 |
| 1.2 cGAS-STING通路及下游通路 |
| 1.2.1 OAS-RNaseL家族 |
| 1.2.2 PKR蛋白 |
| 1.3 国内外研究进展及研究意义 |
| 1.3.1 加深DNA受体对调控外源基因表达的机制的理解 |
| 1.3.2 生物研究及基因治疗临床应用 |
| 第1章 cGAS-STING通路的激活抑制外源基因表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料和方法 |
| 1.2.1 菌株和载体 |
| 1.2.2 细胞系 |
| 1.2.3 实验动物 |
| 1.2.4 主要试剂 |
| 1.2.5 主要仪器 |
| 1.2.6 主要溶液配制 |
| 1.2.7 质粒的转化 |
| 1.2.8 质粒的提取(大量提取) |
| 1.2.9 小鼠胚胎纤维细胞(MEF)的分离 |
| 1.2.10 小鼠肺成纤维细胞的分离 |
| 1.2.11 细胞培养、转染 |
| 1.2.12 Mavs~(-/-)L929细胞株的构建 |
| 1.2.13 流式细胞分析细胞转染EGFP-N1效率 |
| 1.2.14 RT-qPCR检测基因mRNA表达水平 |
| 1.2.15 qPCR检测细胞内基因DNA水平 |
| 1.2.16 蛋白免疫印迹检测蛋白表达 |
| 1.2.17 荧光素酶报告基因的检测 |
| 1.2.18 数据统计与分析 |
| 1.3 实验结果与分析 |
| 1.3.1 cGAS或STING敲除完全抑制IFN及下游ISG表达 |
| 1.3.2 cGAS或STING敲除显着提高外源基因在细胞内的表达 |
| 1.3.3 MAVS基因敲除不影响外源基因在细胞内的表达 |
| 1.3.4 抑制cGAS-STING通路提高外源DNA转录的mRNA水平 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 质粒DNA诱导产生的IFN免疫反应抑制外源基因的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 HT-DNA或Poly(I:C)条件培养基刺激L929细胞实验 |
| 2.2.4 IFNβ重组蛋白和anti-IFNβ中和抗体刺激L929细胞实验 |
| 2.2.5 IFNβ重组蛋白和anti-IFNAR1中和抗体刺激L929细胞实验 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 HT-DNA或poly(I:C)产生的条件培养基显着抑制外源基因蛋白表达 |
| 2.3.2 IFNβ重组蛋白显着抑制外源基因蛋白表达,anti-IFNβ抗体可回补IFNβ重组蛋白降低的外源基因表达水平 |
| 2.3.3 IFNβ重组蛋白和anti-IFNβ抗体不影响细胞内EGFP DNA水平,IFNβ显着抑制外源基因mRNA转录水平,该过程可被anti-IFNβ抗体回补 |
| 2.3.4 IFNβ重组蛋白显着抑制外源基因蛋白表达,anti-IFNAR1抗体可回补IFNβ重组蛋白降低的外源基因表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 OAS-RNaseL介导外源质粒的mRNA降解 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 菌株和载体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液配制 |
| 3.2.4 Pkr~(-/-) L929细胞株的构建 |
| 3.2.5 RNA-Seq技术检测L929细胞基因表达谱 |
| 3.2.6 CRISPR/Cas9技术构建OAS1~(-/-)、OAS2~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞株 |
| 3.2.7 荧光素酶报告基因检测或流式细胞技术对比WT、OAS1~(-/-)、OAS2~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞株的外源基因表达情况 |
| 3.2.8 RNaseL蛋白免疫沉淀实验 |
| 3.2.9 RNaseL蛋白切割RNA活性检测 |
| 3.2.10 BX795抑制cGAS-STING激活的RNaseL蛋白活性 |
| 3.2.11 Western blot技术检测预处理条件培养基的WT、RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞株外源基因表达实验 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 PKR敲除不影响外源基因在细胞内的表达 |
| 3.3.2 RNA-Seq检测外源质粒进入细胞后变化表达谱 |
| 3.3.3 OAS1~(-/-)、OAS2~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞的构建 |
| 3.3.4 OAS-RNaseL敲除不影响ISGs的表达 |
| 3.3.5 OAS1~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞外源基因表达量显着提高 |
| 3.3.6 外源质粒激活RNaseL蛋白切割RNA的活性 |
| 3.3.7 BX795抑制cGAS-STING激活的RNaseL蛋白活性 |
| 3.3.8 条件培养基的添加不影响RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞的外源基因表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高原代细胞的转染效率 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要溶液配制 |
| 4.2.3 CCK-8法测定小分子抑制剂对细胞活率影响的实验 |
| 4.2.4 靶向STING蛋白小分子抑制剂C-176、C-178对WT、Cgas~(-/-)、Sting~(gt/gt) MEF细胞外源基因表达影响的实验 |
| 4.2.5 靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、MRT67307、Amlexanox和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib对L929细胞外源基因表达影响的实验 |
| 4.2.6 靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、MRT67307和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib对L929,或BJ-5ta细胞,或WT、Cgas~(-/-)、Sting~(gt/gt) MEF细胞外源基因表达影响的实验 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂细胞毒性的评估 |
| 4.3.2 靶向STING蛋白小分子抑制剂C-176、C-178提高细胞外源基因的表达 |
| 4.3.3 靶向STING蛋白小分子抑制剂C-176、C-178抑制细胞ISGs的表达,增强外源基因的mRNA转录水平 |
| 4.3.4 靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、MRT67307、Amlexanox和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib抑制细胞ISGs的表达,增强外源基因的mRNA转录和表达水平 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂在提高T细胞外源基因表达中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.2.1 细胞系 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 健康人外周血淋巴细胞PBMC的分离及培养 |
| 5.2.5 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂对激活T细胞外源基因表达影响的实验 |
| 5.2.6 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂对新鲜PBMC及其中静息na(?)ve T细胞外源基因表达影响的实验 |
| 5.2.7 检测靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂对CD3+T细胞ISGs表达 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂增强激活培养T细胞外源基因表达 |
| 5.3.2 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂不影响激活CD3+T细胞的细胞活率 |
| 5.3.3 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高激活CD3+T细胞外源基因转录水平,抑制ISGs表达 |
| 5.3.4 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂增强PBMC和na(?)ve静息T细胞外源基因表达 |
| 5.3.5 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高CD3+T细胞外源基因转录水平,抑制ISGs表达 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 附录 1 缩略词表 |
| 附录 2 RNA-Seq 差异基因列表 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 疱疹病毒概述 |
| 1.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.2 单纯疱疹病毒 |
| 2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.1 溶瘤病毒的种类 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统概述 |
| 3.1 CRISPR/Cas9 系统的分子机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在HSV-1 病毒基因改造中的应用 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 HSV-1 溶瘤病毒治疗小鼠恶性肿瘤 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 仪器耗材 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞转染 |
| 1.3.3 HSV-1 病毒的扩增与保存 |
| 1.3.4 HSV-1 对细胞增殖影响的曲线制备 |
| 1.3.5 HSV-1 对细胞存活影响的曲线制备 |
| 1.3.6 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因改造溶瘤病毒 |
| 1.3.7 图像分析和数据统计 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 制备ICP34.5 缺失的HSV-1 溶瘤病毒 |
| 1.4.2 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠黑色素瘤的治疗效果 |
| 1.4.3 多种细胞系对HSV-1-ΔICP34.5 病毒的敏感性分析 |
| 1.4.4 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.4.5 Nectin1 缺失抵抗HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗 |
| 1.4.6 HSV-1-NEO2/15 溶瘤病毒制备 |
| 1.4.7 HSV-1-NEO-2/15 溶瘤病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库进行HSV-1宿主依赖因子的筛选及富集 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 仪器耗材 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 2.3.3 Western Blot验证敲除细胞株 |
| 2.3.4 细胞免疫荧光 |
| 2.3.5 慢病毒包装 |
| 2.3.6 细胞总RNA提取 |
| 2.3.7 cDNA的合成 |
| 2.3.8 cDNA的普通PCR反应 |
| 2.3.9 病毒结合实验 |
| 2.3.10 图像分析和数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 制备L929 全基因组细胞敲除文库 |
| 2.4.2 利用全基因组敲除库筛选抗HSV-1 的细胞 |
| 2.4.3 筛选后抗病毒细胞对HSV-1 病毒的敏感性分析 |
| 2.4.4 筛选过程中sg RNA以及其靶向基因的动力学变化 |
| 2.4.5 PANTHER GO富集度分析 |
| 2.4.6 富集HSV-1 病毒的宿主依赖因子 |
| 2.4.7 临床肿瘤患者体内HSV-1 病毒HDF的突变频率分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 HSV-1 宿主依赖因子候选基因的验证与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仪器耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 3.3.2 利用PANTHER网站分析基因功能 |
| 3.3.3 利用KEGG网站分析目的基因通路关系 |
| 3.3.4 图像分析和数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Nectin1和ENTPD1 基因缺失对病毒的抵抗 |
| 3.4.2 ENTPD1 基因是一个HSV-1 病毒新的宿主依赖因子 |
| 3.4.3 敲除ENTPD1对HSV-1 感染后病毒增殖的影响 |
| 3.4.4 ENTPD1 缺失抵抗HSV-1 感染不依赖I型干扰素通路 |
| 3.4.5 ENTPD1 缺失阻止HSV-1 病毒进入细胞,但不影响病毒和细胞膜结合 |
| 3.4.6 BGC-823 细胞缺失ENTPD1 基因抵抗HSV-1 感染 |
| 3.4.7 其他HSV-1 病毒HDF候选基因验证与分析 |
| 3.4.8 硫酸乙酰肝素合成途径对HSV-1 进入细胞至关重要 |
| 3.4.9 KEGG通路分析 |
| 3.4.10 确定硫酸乙酰肝素合成途径候选基因 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱及针刺网络调节作用规律的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容一 基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 研究内容二 基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺网络调节作用规律研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 计算生物学的研究进展 |
| 1 深度学习在生物医学中的应用 |
| 2 计算学在脑神经科学中的应用 |
| 3 计算学在组学研究中的应用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号缩写 |
| 文献综述 |
| 1.马立克氏病的概述 |
| 1.1 流行病学 |
| 1.2 临床症状 |
| 2.马立克氏病病毒的概述 |
| 2.1 病毒分型 |
| 2.2 病毒形态和理化性质 |
| 2.3 基因组结构 |
| 2.4 基因组编码的蛋白及其功能 |
| 2.5 发病历程 |
| 3.中药抗病毒研究进展 |
| 3.1 抗病毒中药的分类 |
| 3.2 中药抗病毒作用机理 |
| 3.3 筛选抗病毒中药的研究方法 |
| 4.黄酮类化合物的概述 |
| 4.1 黄酮类化合物的结构和分类 |
| 4.2 黄酮类化合物的理化性质 |
| 4.3 黄酮类化合物的生理功能 |
| 5.研究目的和意义 |
| 研究内容一 白杨素和染料木素对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 原代CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 细胞毒性试验 |
| 2.6 白杨素和染料木素抗病毒活性检测试验 |
| 2.7 白杨素和染料木素影响MDV感染性试验 |
| 2.8 白杨素和染料木素抑制病毒复制作用环节的确定 |
| 2.9 细胞总RNA的提取 |
| 2.10 RNA反转录 |
| 2.11 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 |
| 2.13 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 药物成分对CEF的细胞毒性和安全浓度 |
| 3.2 药物对MDV在CEF细胞中复制增殖的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 研究内容二 黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和柚皮素对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 药物最大安全浓度检测 |
| 2.6 药物抗病毒活性检测试验 |
| 2.7 黄酮类化合物影响MDV感染性试验 |
| 2.8 黄酮类化合物抑制病毒复制作用环节的确定 |
| 2.9 细胞总RNA的提取 |
| 2.10 RNA反转录 |
| 2.11 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 |
| 2.13 细胞蛋白的提取 |
| 2.14 免疫蛋白印迹试验 |
| 2.15 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 药物成分对CEF的安全浓度和生长的影响 |
| 3.2 药物对MDV感染CEF细胞的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 研究内容三 染料木素、黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯联合应用对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 黄酮类复合药物的最大安全浓度检测 |
| 2.6 黄酮类复合药物抗病毒活性检测 |
| 2.7 细胞总RNA的提取 |
| 2.8 RNA反转录 |
| 2.9 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.10 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 不同复合药物成分对CEF的安全浓度和生长的影响 |
| 3.2 药物对MDV感染CEF细胞的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）评价抗寨卡病毒药物的体内保护作用并阐明其分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 概述 |
| 2 寨卡病毒起源及传播 |
| 2.1 寨卡病毒起源与流行情况 |
| 2.2 寨卡病毒传播途径 |
| 3 寨卡病毒基因组结构 |
| 4 寨卡病毒生命周期 |
| 5 临床症状及致病机理 |
| 5.1 临床症状 |
| 5.2 致病机制 |
| 5.3 寨卡病毒趋向性与相关受体 |
| 6 寨卡病毒诊断、检测及预防 |
| 6.1 病毒诊断及检测 |
| 6.2 寨卡病毒的预防 |
| 7 寨卡病毒疫苗、抗体及抗病毒药物研究进展 |
| 7.1 寨卡病毒疫苗研究进展 |
| 7.2 寨卡病毒抗体研究进展 |
| 7.3 寨卡病毒药物研究进展 |
| 8 自噬与寨卡病毒复制 |
| 9 研究目标 |
| 第二章 氯喹抗寨卡病毒作用及其分子机制 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验动物的繁育 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 寨卡病毒扩增 |
| 2.7 荧光寨卡病毒制备 |
| 2.8 寨卡病毒滴定 |
| 2.9 抗寨卡病毒药物筛选 |
| 2.10 氯喹细胞毒性评估 |
| 2.11 氯喹剂量抑制实验 |
| 2.12 氯喹抑制寨卡病毒感染流式实验 |
| 2.13 氯喹抑制寨卡子代病毒增殖实验 |
| 2.14 不同细胞系氯喹抗寨卡病毒活性验证 |
| 2.15 寨卡病毒基因组复制规律探索实验 |
| 2.16 氯喹时间添加实验 |
| 2.17 氯喹影响病毒结合实验 |
| 2.18 早期内体分离实验 |
| 2.19 BCA法测内体蛋白浓度 |
| 2.20 寨卡病毒荧光定位实验 |
| 2.21 Western blot检测细胞LC3及P62蛋白表达 |
| 2.22 氯化铵抗寨卡病毒活性验证 |
| 2.23 寨卡病毒NS5标准品制备 |
| 2.24 总RNA提取及荧光定量PCR |
| 2.25 寨卡病毒乳鼠感染模型构建 |
| 2.26 乳鼠氯喹给药剂量及给药次数探索实验 |
| 2.27 氯喹乳鼠治疗实验 |
| 2.28 氯喹母乳给药实验 |
| 2.29 氯喹成年鼠治疗实验 |
| 2.30 寨卡病毒母婴传播模型构建 |
| 2.31 氯喹孕鼠给药剂量探索实验 |
| 2.32 氯喹母婴阻断实验 |
| 2.33 数据统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 氯喹有效抑制寨卡病毒的感染 |
| 3.2 氯喹剂量依赖性抑制寨卡病毒的感染与复制 |
| 3.3 氯喹在不同细胞系中均可抑制寨卡病毒的感染 |
| 3.4 寨卡病毒乳鼠感染模型建立 |
| 3.5 乳鼠氯喹给药剂量及给药次数探索 |
| 3.6 感染早期氯喹给药可显着抑制SCID Beige新生鼠的感染 |
| 3.7 母乳给药未能抑制SCID Beige新生鼠的感染 |
| 3.8 氯喹减轻SCID Beige成年鼠病毒血症 |
| 3.9 寨卡病毒母婴传播模型建立 |
| 3.10 SCID Beige孕鼠氯喹给药剂量探索 |
| 3.11 氯喹可显着阻断寨卡病毒母婴传播 |
| 3.12 氯喳抑制寨卡病毒早期及中晚期的感染 |
| 3.13 氯喹阻断寨卡病毒RNA由内体向胞质的释放 |
| 3.14 寨卡病毒感染促进细胞自噬增加 |
| 3.15 氯喹阻断寨卡病毒自噬依赖性的复制 |
| 3.16 氯化铵阻断寨卡病毒的感染 |
| 4 讨论 |
| 第三章 寨卡病毒单克隆抗体体内保护作用评价 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究目的及意义 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验动物的繁育 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 寨卡病毒扩增 |
| 2.7 寨卡病毒滴定 |
| 2.8 动物组织RNA提取及荧光定量 |
| 2.9 抗体治疗实验 |
| 2.10 7B3抗体剂量治疗实验 |
| 2.11 7B3、6A6抗体预防实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 成功克隆出寨卡病毒单克隆抗体 |
| 3.2 7B3、6A6、1C11抗体可有效治疗寨卡病毒的感染 |
| 3.3 7B3抗体剂量依赖性抑制寨卡病毒的感染 |
| 3.4 7B3、6A6抗体可有效预防寨卡病毒的感染 |
| 4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录文中缩写 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 |
（7）水痘-带状疱疹病毒（VZV）感染与细胞自噬的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 带状疱疹患者外周血T淋巴细胞、皮肤组织中自噬的发生 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 VZV感染的SHSYSY细胞中自噬与病毒复制的相互关系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 VZV感染的SHSYSY细胞中STAT3对自噬与病毒复制的调节 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）BCAP通过双向调节PI3K/AKT和NF-κB信号活化控制树突状细胞的成熟（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 树突状细胞研究进展 |
| 1.1.1 树突状细胞的分化发育命运 |
| 1.1.2 树突状细胞的表型和分类 |
| 1.1.3 树突状细胞的生理功能 |
| 1.1.4 DCs的病理功能 |
| 1.2 Toll样受体家族的研究进展 |
| 1.2.1 模式识别受体的分类与功能 |
| 1.2.2 Toll样受体家族的分类与功能 |
| 1.2.3 TLRs的表达分布与病理功能 |
| 1.3 BCAP蛋白的研究进展 |
| 1.3.1 BCAP的结构与功能 |
| 1.3.2 BCAP对胞内信号转导的调节作用 |
| 1.3.3 BCAP在免疫细胞中的功能 |
| 1.4 研究目的与研究方案 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究方案 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 实验试剂及器材 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验小鼠 |
| 2.2.2 实验所用细胞系 |
| 2.2.3 实验所用菌种 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PCR鉴定小鼠基因型 |
| 2.3.2 流式鉴定CD45.1小鼠基因型 |
| 2.3.3 DC2.4细胞系的培养 |
| 2.3.4 PCR法检测支原体污染 |
| 2.3.5 稳转敲低细胞系的构建及筛选 |
| 2.3.6 RNA抽提及反转录 |
| 2.3.7 实时定量PCR实验 |
| 2.3.8 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.9 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.3.10 免疫沉淀法检测蛋白磷酸化 |
| 2.3.11 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.12 亚细胞组分抽提实验 |
| 2.3.13 小鼠组织免疫细胞分离 |
| 2.3.14 流式细胞术检测胞外分子 |
| 2.3.15 流式细胞术检测胞内分子 |
| 2.3.16 骨髓来源树突状细胞诱导培养方案 |
| 2.3.17 树突状细胞内吞检测 |
| 2.3.18 树突状细胞迁移能力检测 |
| 2.3.19 MACS分选方案 |
| 2.3.20 DC-T细胞共孵育实验 |
| 2.3.21 CDllc-DTR→CD45.1骨髓嵌合小鼠构建 |
| 2.3.22 抗体特异性T细胞体内增殖检测:体内免疫法 |
| 2.3.23 抗体特异性T细胞体内增殖检测:体外预免疫法 |
| 2.3.24 DH5α感染实验 |
| 2.3.25 混合骨髓嵌合实验 |
| 2.3.26 李斯特菌感染实验 |
| 2.3.27 数据的统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 BCAP影响树突状细胞介导的抗感染免疫 |
| 3.1.1 DCs中缺陷BCAP促进小鼠脾脏中李斯特菌的清除 |
| 3.1.2 DCs中缺陷BCAP影响抗李斯特菌的适应性免疫应答 |
| 3.1.3 DCs中缺陷BCAP会影响李斯特菌感染时T细胞的活化和增殖 |
| 3.2 BCAP限制树突状细胞起始T细胞应答的能力 |
| 3.2.1 BCAP缺陷增强DCs起始李斯特菌特异性T细胞增殖的能力 |
| 3.2.2 体外实验中BCAP缺陷增强DCs促进T细胞应答的能力 |
| 3.2.3 体内实验中BCAP缺陷增强DCs促进T细胞应答的能力 |
| 3.3 BCAP限制树突状细胞的成熟 |
| 3.3.1 BCAP限制DCs成熟时表面共刺激分子的表达 |
| 3.3.2 BCAP缺陷的DCs会产生更高水平的炎症因子 |
| 3.3.3 BCAP缺陷的DCs成熟后吞噬能力下降 |
| 3.3.4 BCAP缺陷损伤DCs迁移能力 |
| 3.4 BCAP调节Toll样受体下游信号转导 |
| 3.4.1 BCAP介导DCs中TLR4诱导的PI3K/AKT信号的起始 |
| 3.4.2 BCAP限制了TLR4活化时NF-κB信号的活化时间 |
| 3.4.3 BCAP缺陷不影响TLR4下游MAPK信号通路的活化 |
| 3.4.4 BCAP主要调节MyD88依赖的下游信号转导 |
| 3.5 BCAP与MyD88及p85α相互作用 |
| 3.5.1 BCAP通过MyD88和p85α调节TLR4下游信号 |
| 3.5.2 BCAP与MyD88、p85α相互作用调节下游信号的活化 |
| 3.5.3 BCAP磷酸化状态影响了其与MyD88、p85 α的相互作用 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 4.1 研究总结 |
| 4.2 研究的创新性和意义 |
| 4.3 研究中存在的问题 |
| 4.3.1 BCAP磷酸化和去磷酸化的机制 |
| 4.3.2 BCAP介导的双向双通路模型中有待验证的问题 |
| 4.3.3 不同细胞BCAP调节NF-κB信号方式的异同 |
| 4.3.4 BCAP在不同类型TLRs下游作用方式的异同 |
| 4.3.5 信号通路变化与DCs表型、功能改变的联系 |
| 4.3.6 混合骨髓嵌合模型的缺陷 |
| 4.3.7 BCAP在不同细胞中功能不同的解释 |
| 第5章 附录 |
| 5.1 附录一: 流式细胞术所用抗体信息 |
| 5.2 附录二: 蛋白印迹实验所用抗体信息 |
| 5.3 附录三: 小鼠鉴定所用PCR引物信息 |
| 5.4 附录四: 实验所用定量PCR引物信息 |
| 5.5 附录五: 缩略语表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（9）表达PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性单纯疱疹病毒的构建及其抗肿瘤疗效的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 以溶瘤病毒为基础的联合免疫治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 基金支持 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2联合CAR-T抗胃癌疗效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胃癌的的研究和治疗现状 |
| 1.2 CAR-T细胞疗法的原理 |
| 1.3 CAR-T细胞疗法在肿瘤中的应用 |
| 1.4 CAR-T细胞疗法在实体瘤中面临的挑战 |
| 1.5 溶瘤病毒疗法 |
| 1.6 立题的目的及意义 |
| 1.7 本论文的主要研究内容 |
| 第2章 靶向CD19 的嵌合抗原受体的慢病毒载体制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 plvx-acgfp1-h1928z载体构建 |
| 2.3 plvx-acgfp1-h1928z慢病毒载体的包装 |
| 2.4 Western blot检测CD19-CAR的表达 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.6 本章讨论 |
| 第3章 CAR-T细胞的制备及体外活性验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 BGC823-CD19 稳转细胞系的构建 |
| 3.3 靶向CD19的CAR-T细胞的制备 |
| 3.4 CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤 |
| 3.5 CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.7 本章讨论 |
| 第4章 CAR-T细胞与溶瘤病毒联合对BGC823 荷瘤小鼠的治疗 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 oHSV2 溶瘤病毒的生产 |
| 4.3 溶瘤病毒与CAR-T联合治疗动物实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 本章结论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件1 |
| 中英文缩略词对照表 |
四、免疫印迹技术在B病毒与单纯疱疹病毒鉴别中的应用（论文参考文献）
- [1]CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究[D]. 郭琼. 吉林大学, 2021(01)
- [2]cGAS-STING通路介导OAS-RNaseL系统调控外源基因表达机制的研究[D]. 傅雅娟. 福建师范大学, 2020(12)
- [3]HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究[D]. 沈阳坤. 福建师范大学, 2020(12)
- [4]基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱及针刺网络调节作用规律的研究[D]. 陈勇. 天津中医药大学, 2020
- [5]黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究[D]. 杨帆. 扬州大学, 2020
- [6]评价抗寨卡病毒药物的体内保护作用并阐明其分子机制[D]. 张胜南. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [7]水痘-带状疱疹病毒（VZV）感染与细胞自噬的相关研究[D]. 赵阳. 南方医科大学, 2019(02)
- [8]BCAP通过双向调节PI3K/AKT和NF-κB信号活化控制树突状细胞的成熟[D]. 苗玉辉. 中国科学技术大学, 2019(01)
- [9]表达PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性单纯疱疹病毒的构建及其抗肿瘤疗效的研究[D]. 朱玉洁. 北京协和医学院, 2019
- [10]溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2联合CAR-T抗胃癌疗效研究[D]. 王润杨. 湖北工业大学, 2019(08)