一、亚洲小车蝗痘病毒球状体蛋白基因的克隆与序列分析（论文文献综述）
金永玲[1]（2016）在《大垫尖翅蝗抗药性检测及其对丁烯氟虫腈代谢抗性机理研究》文中进行了进一步梳理大垫尖翅蝗Epacromius coerulipes Ivanov是北方草原的优势种蝗虫,分布广泛,为害严重,成虫还有短距离飞翔能力,可以进行迁移危害,对农牧业生产造成了严重的经济损失。目前对蝗虫的治理仍以化学农药为主,致使蝗虫对常用化学杀虫剂产生抗药性,防治效果下降,蝗灾不断爆发。新型杀虫剂丁烯氟虫腈作为蝗虫防治的应急药剂得到了广泛的应用。为了了解田间大垫尖翅蝗对各种常用杀虫剂的抗性发生发展情况,延长药剂的使用寿命,对蝗虫进行抗性检测、研究蝗虫对丁烯氟虫腈抗性发生的机理对于草原蝗虫的抗性治理和可持续治理具有重要的意义。本文以北方优势种蝗虫大垫尖翅蝗为研究对象,在建立杀虫剂敏感基线的基础上通过田间抗药性检测,丁烯氟虫腈抗性筛选及抗性现实遗传力研究,分析了大垫尖翅蝗对10种杀虫剂的抗药性发展动态及对丁烯氟虫腈抗性产生的风险；同时利用敏感品系和丁烯氟虫腈抗性品系蝗虫测定解毒酶活力,分析其抗性产生的生化机制;利用转录组测序技术获得大垫尖翅蝗转录组信息,鉴定分析与杀虫剂抗性相关的基因和功能以及差异表达情况,然后将筛选出的与抗性密切相关的超表达的P450、GSTs和CarE基因利用RT-PCR技术进行定量验证。具体研究结果如下：一、大垫尖翅蝗对10种杀虫剂的敏感基线构建和田间抗药性检测采集于天然草原的大垫尖翅蝗,经过继代培养后利用点滴法进行毒力测定,建立了10种杀虫剂对大垫尖翅蝗的敏感基线。并以此为基准分别在2010年和2013年对大庆周围草原三个不同地点的大垫尖翅蝗抗性情况进行检测,结果表明：大垫尖翅蝗对菊酯类杀虫剂产生了低水平抗性,抗性倍数在5.07～9.41之间；对辛硫磷的敏感性下降,其他药剂均很敏感。同时抗性监测结果也表明,在害虫抗性水平较低的情况下停止用药,害虫会在很短的时间内恢复对药剂的敏感性。在菊酯类农药中混用PBO或在辛硫磷杀虫剂中混用TPP,对杀虫剂均表现出明显的增效作用。可见,该研究为蝗虫抗性治理和综合治理提供药剂的选择和应用的指导,对农牧业生产具有一定的实践意义。二、抗丁烯氟虫腈大垫尖翅蝗的选育及抗性风险评估利用丁烯氟虫腈对大垫尖翅蝗进行连续7代的筛选,抗性增加到11.74倍。从抗性选育的过程看,连续筛选的前4代抗性增长较慢,到F5代抗性增长加快。通过7代的大垫尖翅蝗抗性的现实遗传力的评估,h2=0.3191。同时,推算田间条件下大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈抗性倍数提高10倍需要12～25代,由于大垫尖翅蝗在北方一年仅发生一代,可见抗性风险并不高。三、大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈抗性的生化机制利用活体增效试验和解毒酶活力测定方法,对大垫尖翅蝗丁烯氟虫腈抗性发生的生化机理进行了研究。酶活性测定结果表明：抗性品系中三种解毒酶的活性均显着升高,其中多功能氧化酶、酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性分别是敏感品系的4.04倍、1.94倍和1.34倍。同时,经过丁烯氟虫腈不同剂量诱导后,多功能氧化酶和酯酶在抗感品系中都得到显着诱导,谷胱甘肽S-转移酶仅在抗性品系中诱导显着。增效剂试验结果表明：PBO对抗感试虫的增效作用最显着,TPP次之。而DEM则仅对抗性品系表现出增效作用。综合分析认为多功能氧化酶活性增强在抗性形成中发挥的作用较大。但是酯酶和谷胱甘肽S-转移酶也都可能是大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈抗性产生的因素之一四、大垫尖翅蝗转录组测序利用Illumina/Solexa HiseqTM 2500二代测序平台,在无参考基因组下对大垫尖翅蝗转录组测序,共获得13.4 G原始数据并组装成63,033条unigenes,平均长度为772 bp和N50为1589bp。共计有25,132条unigenes被成功注释,占大垫尖翅蝗总unigenes数目的39.87%。KEGG分析,7,218 unigenes形成218代谢或信息通路。其中,266 unigenes参与外源性物质或药物的代谢途径。此外,5,696简单序列重复被检测到。该转录组测序分析为进一步研究大垫尖翅蝗杀虫剂的抗药性机制及基因功能分析奠定了分子基础。五、差异表达基因分析利用大垫尖翅蝗转录组测序数据库,比较了PS和PR两个品系的基因表达,并对差异表达基因进行了GO、Pathways显着富集分析。结果表明：2,568条差异表达基因中有1,646条上调,922条下调。G0显着富集分析表明细胞组分中显着富集的有61条DEGs;生物学过程显着富集的有150条DEGs,分子功能显着富集的127条DEGs中,氧化还原酶活性基因序列有37条,其表达量上调23条,下调14条,有5条序列在Nr数据库中注释为P450基因。利用topGO软件对注释到G0数据库的差异表达基因进行分析,分子功能中显着富集的节点600052689具有羧酸水解酶活性,4条注释为羧酸酯酶,且高表达说明该节点参与杀虫剂的代谢过程。COG分类中,Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism差异表达基因数量达到28条,占总数2.98%,比例提高。KEGG注释中,差异基因分布在130个代谢通路中。其中核糖体Ribosome,淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism,抗坏血酸和代谢Ascorbate and aldarate metalolism,借助细胞色素p450药物代谢Drug metabolism-cylochrome p450,外源物质p450代谢Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450,糖酵解/糖的异生Glycolysis/Gluconeogenesis,谷胱甘肽代谢Glutathione metabolism 7个通路富集程度最高。其中Drug metabolism-cylochromeP450、Metabolism of xenobiotics by cytochrome p450和Glutathione metabolism三条代谢通路是杀虫剂代谢最重要的路径,对大垫尖翅蝗的研究发现有23条差异基因（上调11条,下调12条）注释到这三条代谢通路中。从代谢通路图中发现与上调基因有关的蛋白有很多,其中谷胱甘肽S-转移酶[EC：2.5.1.18]在三条代谢通路图中都有上调的表现,且出现频率最高。还有大量的脱氢酶和转移酶在代谢通路中上调。这些酶都有可能参与蝗虫对杀虫剂的代谢降解作用。可见这些基因和蛋白是后续基因功能研究和代谢通路研究的基础。六、杀虫剂抗性相关基因的注释和分类在大垫尖翅蝗转录组信息中筛选与杀虫剂抗性相关的基因序列,结果显示316条编码p450、CarE和GSTs三大解毒酶的基因被注释,76条编码杀虫剂目标蛋白的基因被注释。G0数据库注释显示,213 unigenes被确认为可能参与外源性物质的解毒,34条unigenes被确定为编码杀虫剂目标蛋白质。对这些解毒酶基因及靶蛋白基因的SNP位点进行统计分析,有AT、AC、AG、GT、CG、CT类型,共计416个SNP位点被发现。可以通过这些SNP位点来挖掘和发现抗性相关的基因突变。针对大垫尖翅蝗转录组测序结果,与已知基因组信息的物种进行比对,采用NJ法构建p450、CarE、GSTs的系统进化树,结果显示58条p450基因分属于14个CYP家族,52条CarE分属于5个家族,24条GSTs被划分为GSTs的六个家族和Micromal。这些解毒酶的大部分基因家族在C0和COG数据库中的注释均显示可代谢杀虫剂。同时这些解毒酶基因中有48条差异表达（23条上调,25条下调）。这些差异基因将是进一步研究抗性发生机理的主要候选基因。七、超表达解毒酶基因的定量检测选择大垫尖翅蝗转录组中与杀虫剂代谢相关的显着上调表达的解毒酶基因序列,利用RT-PCR技术,以GAPDH为内参基因,通过比较CT值法检测其在PS和PR两品系中的相对表达量。结果显示,在PR品系中5条p450、3条CarE、3条GSTs序列的表达量均高于PS品系,且大部分达到极显着水平。以上结果首先证明差异表达基因的RT-PCR检测与转录组测序结果较一致,即表明转录组测序的准确度和可信度较高,可以以此为基础进行分子生物学的相关研究。其次,更进一步确定了这些解毒酶基因在大垫尖翅蝗抗性品系中超表达。结合前面的生化机理分析,在分子水平上也同样证明大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈的抗药性,与p450、CarE、GSTs三种解毒酶过量表达关系密切。
王成燕[2]（2012）在《混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制》文中指出核型多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus, NPV）作为一类昆虫病原微生物,资源丰富,对害虫作用独特且对环境安全,是一种理想的害虫生物防治剂。但天然的昆虫病毒因宿主范围窄、作用速度慢和作用活性低,大大限制了其在生产上的应用。如何打破昆虫病毒的专化性以及提高它们的毒力成了拓宽昆虫病毒应用范围的重点和难点。NPV间自然重组现象较为普遍,不同NPV间重组可产生宿主域扩大病毒；另外病毒的毒力与宿主密切相关,在一种新宿主中的连续传代可提升其对传代宿主毒力,不过其对原宿主毒力显着下降。病毒在两种不同宿主中交替传代后,病毒能否对两种宿主同时具有高毒力?尚无实验证明。因此,研究不同病毒混合侵染后的宿主域变化及其在不同宿主中交替传代过程中的毒力演化对于揭示病毒进化规律及发掘宿主域扩大和病毒毒力提升具有着重要意义。本研究以鳞翅目重大害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和甜菜夜蛾S. exigua为靶标对象,首先研究两种病毒混合侵染后的宿主域变化,接着研究宿主域扩大病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中交替传代时的毒力演化,最后研究病毒多角体超微结构变化和遗传变异,主要研究结果如下：1病毒混合侵染后的宿主域扩大和交替传代时的毒力演化本文选用不能经口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾NPV （SINPV）日本福冈株和不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜夜蛾NPV （SeNPV）美国株,将它们共同侵染甜菜夜蛾后,获得了能同时感染甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的宿主域扩大病毒株系,其对斜纹夜蛾的致病力与SINPV相当,致死中浓度（LC50值）无显着差异,同时对甜菜夜蛾也具备了一定的侵染力,但尚显着低于SeNPV对甜菜夜蛾的毒力。进一步将该病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这两种宿主中按4种模式进行交替传代,分别为以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的严格交替传代,以及以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的非严格交替传代,研究病毒毒力的演化规律。发现宿主域扩大病毒在经历斜纹夜蛾和甜菜夜蛾多代交替传递过程中,其对甜菜夜蛾的毒力有显着上升,且对斜纹夜蛾的毒力未有显着下降,但在传递20代过程中,除从斜纹夜蛾开始的严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾的毒力一直呈上升趋势,以甜菜夜蛾为起始宿主的严格交替模式以及两种非严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾毒力未一直呈上升趋势,在14代以内显着上升,此后则有所下降。研究表明两种宿主中的交替传代可以提高病毒对一种宿主的适应性且同时保持了其对另一种宿主的适应性。2混合侵染和交替传代后多角体超微结构变化通过透射电镜观察研究了病毒混合侵染和交替传代后其多角体超微结构变化。比较了混合侵染前、混合侵染后、交替传代后以及连续传代后病毒的多角体超微结构。观察结果表明,各病毒均属多粒包埋型病毒,混合侵染没有引起病毒多角体大小的改变,多角体直径无显着差异。但经以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代以及在斜纹夜蛾中的连续传代后,病毒多角体的直径显着减小。同时还发现混合侵染和交替传代都没有造成病毒多角体内病毒束数量的改变,多角体内病毒束平均数量在各病毒间无显着差异。但带来病毒束内核衣壳数量的变化,经过混合侵染及在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中的一次交替传代后,病毒束内平均病毒核衣壳数较起始的SINPV福冈株显着下降,在经历20代次交替后,仍显着低于福冈株,而在斜纹夜蛾中连续传代时病毒核衣壳的数量未有显着变化。另外从各病毒束内不同核衣壳的分布来看,SeNPV美国株中病毒束内核衣壳分布均匀,62.5%病毒束中病毒核衣壳数量为3个,而其余病毒则分布较广,在以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代后的病毒中,病毒核衣壳的数量在1-12个间。研究表明,SeNPV和SlNPV昆合侵染以及在两种宿主中交替繁殖后能够改变其多角体的组装,从而带来多角体超微结构的变化。3混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因变异通过基因组酶切、基因克隆分析研究了病毒混合侵染后的遗传变异。病毒基因组DNA限制性酶切结果表明,混合侵染后宿主域扩大病毒的基因组DNA酶切图谱较混合侵染前的SINPV福冈株没有产生明显变化,Pst Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ这4种限制性酶切图谱均与混合侵染前一致。进一步对病毒多角体蛋白基因（polh）分析发现,病毒混合侵染后其polh基因序列较混合侵染前SlNPV在第281个碱基上发生突变,氨基酸序列也发生相应的变化。另还对宿主域扩大病毒细胞凋亡抑制基因（iap）进行了克隆,发现其与已报道的SpliNPV iap基因同源性达95%,与SlNPV中国株G2iap基因同源性和SlNPV日本株iap同源性均只有80%。4混合侵染和交替传代后病毒全基因组序列变化分析对混合侵染和交替传代前后三个病毒株系的全基因组序列进行了分析,研究发现,SlNPV和SeNPV经过混合侵染后产生的宿主域扩大病毒,在基因组大小上较SlNPV福冈株变小,基因数量也有变化,少了1个基因,基因总长度也有增加；再经过交替传代,基因总长度进一步变长。再从各病毒基因总长度占基因组的百分比来看,混合侵染后产生的宿主域扩大病毒较混合侵染前SlNPV基因总长度占基因组百分增加,再经交替传递20代后,百分比进一步增加。各病毒株系GC含量变化不大。病毒基因组全序列具体分析则发现混合侵染后病毒lef-8（晚期表达因子）基因产生了一个碱基的变化,另外病毒基因组内有一个255bp片段的插入,且在进一步交替传递20代后,此变化仍存在。
王俊梅[3]（2009）在《生物技术对草原蝗虫的控制效果及应用前景》文中研究表明介绍了蝗虫微孢子虫Nosemalocustae、绿僵菌Metarhiziumanisopliae、印楝素（azadirachtin AZ）等几种新型生物防治技术在控制草原蝗虫中的应用及发展前景。蝗虫微孢子虫,是一种专寄生于蝗虫等直翅目昆虫体内的单细胞真核原生动物,防后45 d测定,感染率为50.6%,虫口减退率为73.4%。绿僵菌是一类昆虫病原真菌,防后7 d的防治效果为66.5%,防后12 d的防治效果为76.7%。印楝素,是从印楝Aza-dirachtaindica种子中提取的高效杀虫活性物质,0.3%印楝素乳油在施药2 d后,防治效果达95%以上。应用蝗虫微孢子虫、绿僵菌、印楝素等生物防治技术防治草原蝗虫不仅防治效果较好,而且对人畜、植物安全,不污染环境;有持久控制害虫种群数量的作用,并可通过传播和繁殖,扩大受益面积,从而达到经济、安全、有效地控制害虫,减少虫害损失,保护生态环境的目的。
周洪旭[4]（2009）在《两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定》文中提出围食膜（peritrophic matrix,PM）是大多数昆虫中肠内壁的一层厚薄均匀的长管状薄膜,成圆桶状把肠腔和中肠壁细胞分开,自中肠前端一直延伸至后肠。它主要由几丁质和蛋白质组成,是昆虫中肠天然的防御体系,具有保护中肠上皮细胞、阻止有害物质侵入和帮助消化等多种功能,是害虫生物防治的潜在靶标。鳃金龟是我国重要的地下害虫,其幼虫（蛴螬）在土壤中生活,取食植物的地下部分,并把周围的土壤颗粒、病原微生物等物质一同带入消化道,因此围食膜对蛴螬的生长发育具有重要的作用。本文采用生化和分子生物学技术等手段,对华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）和暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）围食膜的形态结构和化学组成进行了研究,构建了华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库,分离鉴定新的PM靶标蛋白,明确其生理功能,并研究生物防治促进因子对围食膜的作用与影响,寻找生物防治新靶标,为发展新的高效生物杀虫剂和鳃金龟的生物防治提供理论依据。1.通过光学显微镜和电子显微镜观察发现,鳃金龟幼虫围食膜位于中肠两端的两个“液囊环”（sac-circles）之间,是一层厚薄均匀的长管状薄膜,表面平滑致密,无孔无缝,具有一定弹性,但与鳞翅目昆虫围食膜相比,韧性较差,解剖时其围食膜易破碎。应用Bradford法和苯酚-硫酸法,测定华北大黑鳃金龟围食膜蛋白含量为36.38%,糖含量为8.84%;暗黑鳃金龟围食膜蛋白含量为38.26%,糖含量为9.08%。2.SDS-PAGE分析发现华北大黑鳃金龟PM蛋白至少有28条多肽,暗黑鳃金龟比较清楚的PM蛋白带有15条,而鳞翅目昆虫粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫和粘虫PM蛋白分别有19、17、16和9条,与鳞翅目昆虫围食膜相比,华北大黑鳃金龟围食膜蛋白种类相对较多。肠粘蛋白（insect intestinal mucin, IIM）是昆虫围食膜中的重要蛋白,而应用TnPM-IIM特异性抗血清对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜蛋白做Western blot检测,未发现两种鳃金龟围食膜中有类似于鳞翅目昆虫的粘蛋白。3.应用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit、Oligotex mRNA Mini Kit以及Stratagene公司cDNA Synthesis Kit,成功构建了华北大黑鳃金龟3龄幼虫中肠cDNA表达文库,原始文库滴度为1.9×106 pfu/mL,扩增后滴度为1.4×109pfu/ml,文库重组率为99.97%,插入片段在0.8-2.3kb之间,平均长度为1.6kb。4.应用Western blot检测发现棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体、粉纹夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体与华北大黑鳃金龟围食膜蛋白之间有交叉反应,并用这两种抗体免疫筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库,得到122个阳性克隆,测序及序列比对后得到Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin3、Ho-Peritrophin4四个华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因,Genbank登录号分别是FJ393548、FJ393549、FJ393550和FJ573145,最长读码框（ORF）分别编码729、477、528和324个氨基酸,含有9、6、5和4个几丁质结合功能域（CBD）,不含粘蛋白功能域,含有1-4个N-连糖基化位点,N端不含有信号肽。Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin4的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点大部分位于CBD内部,受到保护,不会被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解。而Ho-Peritrophin3的第5个CBD下游区域富含大量的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点。通过构建重组表达质粒,Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2和Ho-Peritrophin3在大肠杆菌中分别表达出78、51和57KD的目的蛋白,几丁质结合实验表明Ho-Peritrophin1和Ho-Peritrophin3具有几丁质结合活性。5.从华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库中筛选得到了HoSP1和HoSP2两种华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶全长基因,在Genbank登录号分别为FJ573146和FJ573147,开放阅读框（ORF）长783和786bp,编码260和261个氨基酸,均含有3对半胱氨酸残基,与CzSP3相似性最高,分别为52.47%和51.52%,催化活性中心位于His80、Asp125、Ser215,His80、Asp125、Ser216。通过构建重组表达质粒,HoSP1和HoSP2在大肠杆菌中表达出26.7kDa和27.1kDa的蛋白。筛选得到了华北大黑鳃金龟羧酸酯酶基因HoCL,在Genbank登录号为FJ573148,开放阅读框（ORF）长1599bp,编码532个氨基酸,含有3个半胱氨酸残基,具有Ser207,Asp333和His422的催化活性中心,推导的蛋白质分子量为59.5kDa,属于B类羧酸酯酶。6.以棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白和荧光增白剂FB28为先导物,测定了其对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜的作用和影响,发现棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白在不同浓度和不同时间下均不能降解两种鳃金龟的围食膜;采用液滴法喂食华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟10uL 1%的FB28,2.5h时,PM前端破损,扫描电镜观察中后段围食膜,发现围食膜上出现一些分布均匀的空洞;喂食至6h时,PM完全崩解,喂食至12h,PM基本恢复。可见,荧光增白剂FB28能够破坏鳃金龟围食膜,但破坏作用是短暂的、可修复的。为进一步研究荧光增白剂与病原微生物联合使用防治鳃金龟提供了理论依据。
牛德庆[5]（2008）在《具有杀虫活性极地微生物的筛选与研究》文中提出从极地微生物的次生代谢产物中寻找具有杀虫活性的生理活性物质,对于开发新型的生物杀虫剂具有较重要的意义。本研究利用实验室珍贵的极地微生物资源,对具有杀虫活性的极地微生物的进行筛选和杀虫活性物质研究,现将主要研究结果总结如下:1.以小菜蛾为试虫,采用常规浸虫和微型平板法对采自南极,北极和白令海峡的152株极地微生物进行了杀虫活性初步筛选,获得了38株具有杀虫活性的菌株,其中真菌20株,细菌15株,放线菌3株。经过复筛得到7株具有较高较稳定的杀虫活性菌株,其中真菌4株,细菌3株,放线菌1株。2.对影响南极生境真菌Gliocladium catenulatum T31生长和杀虫活性的初始pH值,发酵时间,培养温度等影响因子进行了研究。并以小菜蛾为试虫,以校正死亡率为评价指标,利用微型平板法对真菌T31的杀虫活性进行测试,发酵液杀虫活性最高为60.42%。发酵物经乙酸乙酯提取后,丙酮溶解0.33mg/mL浓度下,发酵液粗提物杀虫活性最高为82.05%,菌体提取物杀虫活性为76.92%。盆栽试验证明该菌株发酵液对小菜蛾第7d的虫口减退率为54.2%。3.以小菜蛾幼虫为指示试虫,利用微型平板法和常规浸虫法对真菌T31进行杀虫活性追踪,进而采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20、ODS、HPLC等多种分离手段活性跟踪分离发酵产物中的杀虫次级代谢物,并对化合物进行结构鉴定。得到9种化合物。4.对极地放线菌B27-13和极地细菌BBY9-4进行混合发酵,利用协同培养原理通过变化接种比例和接种时间,得到不同杀虫活性的混合发酵液,结果显示协同培养能提高杀虫活性和代谢物成分,相比两菌单独培养的活性（68.75%和58.33%）,协同培养发酵液杀虫活性达70.80%。利用HPLC图谱分析,初步判断出杀虫活性成分的所在。
王莉[6]（2007）在《苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析》文中提出本论文以苏云金芽胞杆菌为研究对象，克隆并绘制了质粒pBMB165的物理图谱，同时对苏云金芽胞杆菌BMB171 Enhancin蛋白基因的增效活性做了初步研究。本文第一部分，以苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp．tenebrionis，H8ab)菌株YBT-1765为出发菌株，对其可检测到的最大质粒pBMB165进行克隆分析研究。通过对YBT-1765总质粒和全基因组DNA分别进行BamHI和HindⅢ不完全酶切，以pBeloBACll为载体，成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组的细菌人工染色体（BAC）文库和质粒的BAC文库。根据已克隆的包含复制子oril65在内的3.6kb片段（pBMB165-F4A）中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针，通过染色体步移方式进行筛选。在对质粒文库进行筛选时，得到5个具有重叠关系的克隆子，测定这些克隆子的末端序列。根据这些末端序列设计引物，通过染色体步移方式，对YBT-1765的基因组BAC文库进行筛选，获得8个覆盖质粒pBMB165不同区域的克隆子。测定这8个阳性克隆子的末端序列，序列结果显示它们之间存在着重叠群，并且能够覆盖整个质粒pBMB165。通过对上述13个克隆子进行NotI、SphI、HindⅢ和BamHI酶切分析，建立了质粒pBMB165的物理图谱和线状重叠连锁图，并测算出该质粒的大小为82kb。对其中一个阳性克隆pBMB165A2作了序列测定；根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB165上转座因子的存在机率，在pBMB165A2上转座因子存在的机率值为40.5％，说明pBMB165中存在丰富的转座因子，YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案，成功解决了大质粒难克隆的问题。本文第二部分，以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为研究对象，对苏云金芽胞杆菌的Enhancin蛋白的增效活性做了初步研究，从而进一步认识Enhancin蛋白在促进Bt感染昆虫中的作用。根据已知的Enhancin蛋白基因序列设计特异引物，以BMB171菌株的基因组DNA为模板，能扩增出对应的预期目的片段Enhancin蛋白基因。经测序分析其预计蛋白质由742个氨基酸组成，其氨基酸序列与已经发现的昆虫病毒的增效蛋白有20％左右的序列一致，与鼠疫杆菌的增效蛋白同源性在31％以上。利用同源重组敲除BMB171菌株中的Enhancin蛋白基因，构建了突变株BMB1084。将表达杀虫晶体蛋白基因crylAc10的重组质粒pBMB1086导入菌株BMB171和突变株BMB1084，分别构建重组菌BMB1087和BMB1088。用上述重组菌的胞晶混合物分别感染棉铃虫一龄幼虫，重组菌BMB1087的LD50为0.46 mL／mL，比BMB1088 （2.73mL／mL）降低了82.85％，增效倍数为5.83，表明Enhancin蛋白显着提高了Bt对棉铃虫幼虫的毒力。
李永丹,史雪岩,田兆丰,阿不都外力.依玛木,高希武[7]（2006）在《新疆红胫戟纹蝗痘病毒包涵体蛋白基因序列分析》文中研究表明通过对红胫戟纹蝗痘病毒Dociostarus kraussiEPV（DkEPV）包涵体蛋白基因克隆、测序与同源性分析,结果显示,DkEPV包涵体蛋白基因包含2 922 bps的开放阅读框架,编码109.4 kDa蛋白质。与鳞翅目及鞘翅目昆虫痘病毒包涵体蛋白氨基酸的同源性小于20%,而与其他直翅目昆虫痘病毒包涵体蛋白氨基酸的同源性均高于80%。DkEPV包涵体蛋白包含19个半胱氨酸位点,主要分布在C-末端。此包涵体蛋白基因启动子区域基因,富含A+T,并且具有典型的痘病毒晚期启动子信号TAAATG,直翅目昆虫痘病毒之间此序列保守。同时在此痘病毒包涵体基因的下游克隆了另一个不完整的基因序列,与血黑蝗痘病毒的MSV072基因同源,与包涵体蛋白基因比邻但方向相反。
黄哲[8]（2005）在《昆虫病毒重组增效蛋白的生物活性》文中认为本研究采用时间-剂量-死亡率模型（TDM）,分析了粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）颗粒体病毒重组增效蛋白P96和粘虫痘病毒（Pseudaletia separata entomopoxvirus,PsEPV）重组增效蛋白P39对棉铃虫（Helicoverpa armigem）核型多角体病毒（HaNPV）感染棉铃虫幼虫的增效作用。结果显示:感染HaNPV后11d,HaNPV+P96组的LC50为3.47×103PIBs/mL,比HaNPV组（3.89×104PIBs/mL）降低了91.08%,增效倍数为11.2;且在1.6×104～1.6×106PIBs/mL浓度范围内,HaNPV+P96组的LT50较HaNPV组缩短0.3～1.8d。HaNPV+P39组的LC50为1.08×103PIBs/mL,比HaNPV组（1.38×104PIBs/mL）降低了92.18%,增效倍数达12.8;在1.6×103～1.6×106PIBs/mLHaNPV浓度范围内,P39可缩短LY500.5～2.7d。结果表明P96和P39均具明显的生物活性,能有效促进HaNPV对棉铃虫幼虫的感染,提高死亡率并缩短致死时间,且P39的增效活性优于P96。
李永丹[9]（2005）在《蝗虫EPV sph基因及OaEPV与绿僵菌及化学农药混用的杀虫效果》文中研究说明本文对意大利蝗痘病毒Calliptamus ualicus EPV（CiEPV）、两伯利亚蝗疸病毒Gomphocerussibiricus EPV（GsEPV）、红胫戟纹蝗痘病毒Dociostarus kraussi EPV（DkEPV）包涵体蛋白基因进行了克隆、测序、分析,对亚洲小车蝗痘病毒Oedaleus asiaticus EPV（OaEPV）的增效性进行了初步研究,并生物测定了OaEPV与化学杀虫剂混用的杀虫效果,这些工作有利于蝗虫痘病毒在生物防治上的开发利用。 CiEPV、GsEPV与DkEPV sph基因序列全长分别为4242 b p、4488 bp与 4242 bp,分别包含2922bp、2967bp与2922bp的开放阅读框架,编码的蛋白分子量为109.2、111.1及109.4 kDa。序列分析表明,CiEPV、GsEPV与DkEPV与直翅目昆虫痘病毒的包涵体蛋白,氨基酸水平上同源性都大于75%:而与鳞翅目EPV和鞘翅目EPV的包涵体蛋白,氨基酸水平上同源性都小于20%。CiEPV、GsEPV与DkEPV的包涵体蛋白分别包含19、21、19个半胱氨酸残基,并且聚集在蛋白的C-末端。基因的5′端非编码区包含了基因转录的启动区域,具有典型痘病毒的晚期基因启动标志序列TAAATG。在启动子ATG上游45个核苷酸的区域,可能为基因转录的启动区域,直翅目昆虫此序列的同源性达98%。基冈的3′非编码区,均发现另一个不完全的开放阅读框架（ORF）,与sph基因方向相反。此序列与MsEPV的潜在蛋白基因MSV072序列同源性80%以上。 接种最为1.67×105OBs/头的OaEPV与1.67×105孢子/头的绿僵菌混合感染黄胫小车蝗及东亚飞蝗,比用同量的绿僵菌孢子单独感染两种试虫,杀虫效果更为明显,增效率7d分别可达41.7%,28.9%。OaEPV的增效作用与OaEPV的用量有关,OaEPV的剂量越大,增设作用越强。OaEPV经2×SDS包涵体碱性裂解缓冲液裂解,离心,分别用上清液及沉淀与绿僵菌孢子混合感染黄胫小车蝗,上清液的增效活性比沉淀大2.5倍。用三种不同方法（2×SDS包涵体碱性裂解液法,0.02 mol/L NaOH裂解法,8 mol/L尿素裂解法）裂解OaEPV所得蛋白液与绿僵菌混用,生测结果表明,包涵体裂解液法制备所得蛋白增效活性最高,NaOH裂解法次之,尿素裂解法制备的蛋白几乎没有增效活性。将OaEPV用包涵体碱性裂解液裂解后,用葡聚糖G-200凝胶柱层析进行分离,出现两个洗脱峰,这两个峰的洗脱液浓缩后进行生物测定,初步表明增效作用主要为第二个峰的蛋白片段。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,第二个峰的蛋白片段的分子量为40 kDa左右。 OaEPV与化学杀虫剂辛硫鳞、甲基对硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯、卡死克、抑太保及西维因7种农药混合感染黄胫小车蝗的LC50,均比单独使用农药均有所下降,卡死克、抑太保的下降率达49.0%与42.8%,效果最为明显。
赵朝阳,王丽英,李永丹,贠桂玲[10]（2003）在《亚洲小车蝗痘病毒球状体蛋白基因的克隆与序列分析》文中认为通过PCR扩增,获得OaEPV球状体蛋白基因编码区序列,并进行克隆、测序。分析结果显示,OaEPV球状体蛋白基因编码区全长为2967bp,编码分子量为111kDa的球状体蛋白。同源性分析表明,OaEPV球状体蛋白基因与直翅目昆虫痘病毒关系最近,与鳞翅目和鞘翅目昆虫痘病毒关系较远。对已知的几种昆虫痘病毒球状体蛋白基因做系统进化树,结果显示,以病毒寄主的昆虫分类目作为昆虫痘病毒的分属依据,更符合分子水平的分析结果,也与近年来许多学者所提出的“将鳞翅目与直翅目昆虫痘病毒分为2个不同的属”的观点相一致。对这些球状体蛋白氨基酸序列的疏水性进行分析,表明球状体蛋白的疏水性随寄主昆虫所处的目不同而表现出较大差异,这可能是因为病毒与寄主长期的协同进化的结果。
二、亚洲小车蝗痘病毒球状体蛋白基因的克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、亚洲小车蝗痘病毒球状体蛋白基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）大垫尖翅蝗抗药性检测及其对丁烯氟虫腈代谢抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究目的意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 大垫尖翅蝗发生与危害 |
| 1.2.2 大垫尖翅蝗的防治 |
| 1.2.3 昆虫抗药性研究概况 |
| 1.3 转录组及测序技术 |
| 1.3.1 转录组 |
| 1.3.2 转录组测序技术 |
| 1.3.3 高通量测序技术的应用 |
| 1.3.4 转录组测序在昆虫抗性研究中的应用 |
| 1.4 研究主要内容 |
| 第二章 大垫尖翅蝗对10种杀虫剂的敏感基线的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 供试药剂 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.4 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 敏感基线的建立 |
| 2.2.2 不同杀虫剂的毒力比较 |
| 2.3 结论 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 大垫尖翅蝗田间种群抗药性检测及治理 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试虫源 |
| 3.1.2 供试药剂 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.1.4 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 抗药性检测情况 |
| 3.2.2 增效剂在抗性治理中的作用 |
| 3.3 结论 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 大垫尖翅蝗丁烯氟虫腈抗性品系筛选及抗性生化机理研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试昆虫与饲养 |
| 4.1.2 农药与试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 抗性品系筛选 |
| 4.1.5 增效剂的活体增效试验 |
| 4.1.6 解毒酶活性测定 |
| 4.1.7 蛋白含量测定 |
| 4.1.8 数据统计 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 丁烯氟虫腈对大垫尖翅蝗的抗性筛选 |
| 4.2.2 现实抗性遗传力及抗性风险评估 |
| 4.2.3 三种增效剂对丁烯氟虫腈的增效作用 |
| 4.2.4 代谢解毒酶活性比较 |
| 4.3 结论 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 抗性选育及抗性风险评估 |
| 4.4.2 增效剂的研究 |
| 4.4.3 解毒酶系的研究 |
| 第五章 大垫尖翅蝗转录组测序分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 实验试剂和仪器 |
| 5.1.3 RNA提取与检验 |
| 5.1.4 cDNA文库构建和测序 |
| 5.1.5 信息分析流程 |
| 5.1.6 测序数据及其质量控制 |
| 5.1.7 转录组测序数据组装 |
| 5.1.8 转录组测序文库质量评估 |
| 5.1.9 基因功能注 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RNA样品检验结果 |
| 5.2.2 测序质量控制 |
| 5.2.3 转录组组装结果 |
| 5.2.4 基因功能注释 |
| 5.2.5 SSR discovery |
| 5.3 结论 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 大垫尖翅蝗差异表达基因分析 |
| 6.1 分析方法 |
| 6.1.1 Unigene表达量计算 |
| 6.1.2 差异表达基因筛选与聚类分析 |
| 6.1.3 差异表达基因功能注释和富集分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 差异表达基因检测和分布 |
| 6.2.2 差异表达基因注释及其聚类分析 |
| 6.2.3 差异表达基因GO分析 |
| 6.3 结论 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 大垫尖翅蝗抗性相关基因的筛选、鉴定与分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 目的基因的筛选 |
| 7.1.2 抗性基因序列SNP位点分析 |
| 7.1.3 构建解毒酶基因系统发育树 |
| 7.1.4 解毒酶基因RT-PCR检测 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 杀虫剂抗性相关基因的注释分析 |
| 7.2.2 SNP位点分析 |
| 7.2.3 解毒酶基因系统发育分析 |
| 7.2.4 解毒酶q-PCR检测结果 |
| 7.3 结论 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表文章 |
（2）混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 昆虫病毒的种类及应用现状 |
| 1.1 核型核多角体病毒 |
| 1.2 颗粒体病毒 |
| 1.3 质型多角体病毒 |
| 1.4 昆虫痘病毒 |
| 2 病毒重组拓宽病毒杀虫谱研究进展 |
| 2.1 昆虫病毒自然重组拓宽杀虫谱 |
| 2.2 运用基因工程技术扩大宿主域 |
| 3 宿主中连续传代提升病毒毒力研究进展 |
| 4 病毒宿主域和毒力及杀虫速度相关基因研究进展 |
| 4.1 与宿主域相关的基因 |
| 4.2 与毒力速度相关的基因 |
| 5 论文研究内容及目的意义 |
| 5.1 研究内容 |
| 5.2 研究目的与意义 |
| 5.3 技术路线 |
| 第二章 混合侵染和交替传代时斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域扩大和毒力演化 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 两种核型多角体病毒混合侵染后的宿主域扩大 |
| 2.2 宿主域扩大病毒交替传代时对斜纹夜蛾毒力的演化 |
| 2.3 宿主域扩大病毒对甜菜夜蛾毒力的演化 |
| 3 讨论 |
| 第三章 混合侵染和交替传代后病毒多角体超微结构变化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 病毒的蔗糖密度梯度离心 |
| 1.3 超薄切片样品制备 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 透射电镜观察结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒混合侵染前后基因组DNA限制性酶切图谱比较 |
| 2.2 宿主域扩大病毒polh基因变异 |
| 2.3 宿主域扩大病毒Iap基因的克隆 |
| 3 讨论 |
| 第五章 病毒宿主域扩大和毒力提升后其全基因组变异分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 病毒DNA的提取 |
| 1.3 DNA浓度测定 |
| 1.4 基因组全序列测定分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 全基因组序列分析和基因预测 |
| 2.2 混合侵染和交替传代后病毒基因组变异分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）生物技术对草原蝗虫的控制效果及应用前景（论文提纲范文）
| 1 控制草原蝗虫的必要性 |
| 2 生物防治技术的发展历程 |
| 3 生物防治研究及应用现状 |
| 3.1 蝗虫微孢子虫 |
| 3.1.1 杀虫机理 |
| 3.1.2 应用现状 |
| 3.2 绿僵菌 |
| 3.2.1 杀虫机理 |
| 3.2.2 应用现状 |
| 3.3 印楝素 |
| 3.3.1 杀虫机理 |
| 3.3.2 应用现状 |
| 3.4 苏云金芽孢杆菌 (Bt) |
| 3.4.1 杀虫机理 |
| 3.4.2 应用现状 |
| 3.5 蝗虫痘病毒 |
| 3.6 动物天敌 |
| 4 结论 |
（4）两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 昆虫中肠防御体系-围食膜 |
| 1.1.1 围食膜的结构组成 |
| 1.1.2 围食膜的功能 |
| 1.1.3 围食膜的形成及机理 |
| 1.2 生物防治促进因子 |
| 1.2.1 病毒增效蛋白 |
| 1.2.2 荧光增白剂 |
| 1.2.3 几丁质酶及几丁质合成抑制剂对围食膜的作用 |
| 1.2.4 外源凝集素对围食膜的作用 |
| 1.3 cDNA 文库—研究新基因的有效工具 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试昆虫病原微生物 |
| 2.1.3 供试菌株及试剂盒 |
| 2.1.4 供试抗体 |
| 2.1.5 常用培养基 |
| 2.1.6 常用试剂及溶液 |
| 2.1.7 常用蛋白与DNA Marker |
| 2.1.8 常用仪器设备 |
| 2.2 方法步骤 |
| 2.2.1 围食膜的形态观察 |
| 2.2.2 围食膜组分含量测定 |
| 2.2.3 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的构建 |
| 2.2.4 围食膜蛋白的筛选 |
| 2.2.5 围食膜蛋白基因的原核表达及特性鉴定 |
| 2.2.6 丝氨酸蛋白酶的原核表达 |
| 2.2.7 增效蛋白对PM 的作用 |
| 2.2.8 荧光增白剂FB28对PM的作用与影响 |
| 2.2.9 低温对鳃金龟围食膜的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鳃金龟围食膜结构与组成 |
| 3.1.1 PM 的生理位置 |
| 3.1.2 PM 的结构组成 |
| 3.2 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的构建 |
| 3.2.1 总RNA 的提取 |
| 3.2.2 cDNA 第一链、第二链的合成 |
| 3.2.3 cDNA 分级分离及定量 |
| 3.2.4 文库的容量及重组率 |
| 3.2.5 PCR 鉴定文库插入片段大小 |
| 3.3 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的筛选 |
| 3.3.1 利用棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库 |
| 3.3.2 利用粉纹夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库 |
| 3.3.3 华北大黑鳃金龟PM 蛋白基因序列分析 |
| 3.4 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因的原核表达及特性鉴定 |
| 3.4.1 重组表达质粒 PET-21b-Ho-Peritrophin 的构建 |
| 3.4.2 重组子的鉴定 |
| 3.4.3 围食膜蛋白在原核系统的表达 |
| 3.4.4 重组围食膜蛋白的几丁质结合活性 |
| 3.5 丝氨酸蛋白酶与羧酸酯酶的筛选与鉴定 |
| 3.5.1 丝氨酸蛋白酶的筛选与鉴定 |
| 3.5.2 羧酸酯酶的筛选与序列分析 |
| 3.6 生物防治促进因子对鳃金龟围食膜的影响 |
| 3.6.1 增效蛋白对PM 的影响 |
| 3.6.2 荧光增白剂 FB28 对 PM 的作用与影响 |
| 3.7 低温对PM 的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鳃金龟围食膜结构与组成 |
| 4.1.1 PM 的形态与结构分析 |
| 4.1.2 PM 蛋白及糖含量分析 |
| 4.2 cDNA 文库的构建 |
| 4.2.1 高质量的RNA 和载体 |
| 4.2.2 cDNA 文库质量 |
| 4.3 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的分离及鉴定 |
| 4.3.1 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的筛选 |
| 4.3.2 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因克隆及鉴定 |
| 4.4 丝氨酸蛋白酶与羧酸酯酶 |
| 4.4.1 丝氨酸蛋白酶 |
| 4.4.2 羧酸酯酶 |
| 4.5 增效蛋白及荧光增白剂对PM 的作用 |
| 4.5.1 增效蛋白对PM 的作用 |
| 4.5.2 荧光增白剂对PM 的作用与影响 |
| 4.6 问题与展望 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）具有杀虫活性极地微生物的筛选与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 生物源杀虫剂研究进展 |
| 1.1 植物源杀虫剂 |
| 1.1.1 杀虫植物的活性成分 |
| 1.1.2 植物源杀虫剂的作用机制 |
| 1.2 动物源杀虫剂 |
| 1.2.1 天敌昆虫 |
| 1.2.2 昆虫信息素 |
| 1.2.3 昆虫生长调节剂 |
| 1.3 微生物源生物杀虫剂 |
| 1.3.1 微生物活体杀虫剂 |
| 1.3.2 微生物代谢产物杀虫剂 |
| 1.3.3 转基因抗虫植物 |
| 1.3.4 微生物源杀虫剂存在的问题及应对策略 |
| 2 海洋生物源杀虫活性物质研究现状 |
| 2.1 海洋毒素 |
| 2.2 海藻提取物 |
| 2.3 海洋微生物次生代谢产物 |
| 2.4 农用海洋生物杀虫物质的筛选利用研究 |
| 2.4.1 海洋生物活性物质资源材料的采集和培养 |
| 2.4.2 海洋生物活性物质的筛选 |
| 2.4.3 海洋生物活性物质分离纯化及产品制备技术 |
| 2.4.4 海洋生物技术保证海洋药源生物供应 |
| 3 极地微生物活性物质研究进展和极地微生物农药资源开发的重要性 |
| 3.1 抗冻物质 |
| 3.2 多不饱和脂肪酸 |
| 3.3 抗紫外辐射物质 |
| 3.4 抗菌、抗肿瘤物质 |
| 3.5 低温酶 |
| 3.6 极地微生物农业资源开发利用的可行性 |
| 第二章 极地微生物杀虫活性菌株的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.1.1 试剂 |
| 1.1.2 试验用主要仪器 |
| 1.2 供测菌株及培养基 |
| 1.2.1 供测菌株 |
| 1.3 供试虫体及其饲养 |
| 1.3.1 小菜蛾饲养材料的培植 |
| 1.3.2 小菜蛾的人工繁殖和饲养 |
| 1.4 筛选 |
| 1.4.1 初筛 |
| 1.4.2 复筛 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株分离结果 |
| 2.2 初筛结果 |
| 2.3 复筛结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章：南极生境真菌T31 菌株（Gliocladium catenulatum）的研究 |
| 第一节：T31 菌株培养条件的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基 |
| 1.2 微生物菌株 |
| 1.3 发酵培养条件的优化 |
| 1.4 T31 菌株培养时间与菌体生物量、杀虫活性关系研究 |
| 1.5 生长曲线的测定 |
| 1.6 显微形态观察和菌属鉴定 |
| 1.7 盆栽实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 初始pH 值对菌株T31 的影响结果 |
| 2.2 装液量对T31 的影响 |
| 2.3 T31 菌株发酵时间与菌体生物量，杀虫活性的关系 |
| 2.4 T31 生长曲线的测定 |
| 2.5 T31 显微形态描述和菌属鉴定 |
| 2.6 盆栽试验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节：T31 菌株活性物质的分离提取 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 发酵液预处理 |
| 1.3 T31 发酵液的萃取步骤和杀虫活性测定 |
| 1.4 T31 菌体的萃取步骤和杀虫活性测定 |
| 1.5 T31 粗提物的薄层层析(TLC)分析结果 |
| 1.6 杀虫活性组分的跟踪分离 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 T31 发酵液的萃取和杀虫活性测定结果 |
| 2.2 T31 薄层层析结果分析 |
| 2.3 T31 化合物分离结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章：协同培养对两株极地微生物杀虫活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 微生物菌株 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 协同培养各菌株的生长曲线测定 |
| 1.3.1 极地细菌BBY9-4 的生长曲线测定 |
| 1.3.2 极地放线菌 B27-13 的生长曲线测定 |
| 1.4 协同培养实施方案 |
| 1.5 协同培养后各混合发酵液的杀虫活性测试 |
| 1.6 混合发酵液提取物的HPLC 图谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 协同培养各极地微生物的生长曲线 |
| 2.1.1 极地细菌BBY9-4 的生长曲线测定 |
| 2.1.2 极地放线菌 B27-13 的生长曲线测定 |
| 2.2 协同培养各发酵液最终形态及杀虫活性比较 |
| 2.3 混合发酵液提取物的HPLC 图谱分析 |
| 3. 讨论 |
| 本论文创新点 |
| 在读期间发表文章目录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 细菌质粒的基本特征 |
| 1.1.1.1 质粒的类型 |
| 1.1.1.2 质粒的复制 |
| 1.1.1.3 质粒拷贝数 |
| 1.1.1.4 质粒的不相容性 |
| 1.1.1.5 质粒分离的稳定性 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的研究进展 |
| 1.1.2.1 苏云金芽胞杆菌质粒的分类 |
| 1.1.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒多态性 |
| 1.1.2.3 苏云金芽胞杆菌质粒的功能 |
| 1.1.2.4 YBT-1765菌株质粒的研究进展 |
| 1.1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.1.1 菌株和质粒 |
| 1.2.1.2 培养基及培养条件 |
| 1.2.1.3 试剂和仪器 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.2.1 DNA操作 |
| 1.2.2.2 DNA电泳分析 |
| 1.2.2.3 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定 |
| 1.2.2.4 BAC文库的构建 |
| 1.2.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.2.6 酶切片段大小的估算 |
| 1.2.2.7 序列测定和序列分析 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 菌株YBT-1765 BAC文库的构建 |
| 1.3.2 菌株YBT-1765 BAC文库的筛选和分析 |
| 1.3.2.1 YBT-1765质粒的BAC文库的筛选与分析 |
| 1.3.2.2 YBT-1765基因组的BAC文库筛选与分析 |
| 1.3.3 质粒pBMB165的拼接 |
| 1.3.3.1 质粒pBMB165的部分限制性酶切图谱 |
| 1.3.3.2 质粒pBMB165的线状重叠连锁图 |
| 1.3.4 转座因子存在的大致机率 |
| 1.4 讨论 |
| 2 苏云金芽胞杆菌Enhancin蛋白的初步研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 昆虫杆状病毒增效蛋白 |
| 2.1.1.1 昆虫杆状病毒增效蛋白的发现及其增效活性 |
| 2.1.1.2 增效蛋白的作用机理 |
| 2.1.1.3 增效蛋白核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 2.1.2 Bt中的增效蛋白类似基因 |
| 2.1.3 增效蛋白在害虫防治上应用的展望 |
| 2.1.4 本研究的目的和意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.2.1.2 培养基及培养条件 |
| 2.2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.2.1.4 供试昆虫 |
| 2.2.1.5 生物测定试剂和感染饲料配方 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 DNA操作，DNA电泳分析，重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定 |
| 2.2.2.2 聚合酶链式反应 |
| 2.2.2.3 同源重组 |
| 2.2.2.4 复红简单染色 |
| 2.2.2.5 伴胞晶体的培养 |
| 2.2.2.6 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.2.7 生物测定 |
| 2.2.2.8 菌体生长时间与菌体OD_(600)值对应曲线 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 Enhancin蛋白基因的克隆及序列分析 |
| 2.3.2 BMB171突变体的构建 |
| 2.3.2.1 整合载体的构建 |
| 2.3.3.2 突变体的筛选及验证 |
| 2.3.3 BMB171和突变株BMB1084比较 |
| 2.3.3.1 BMB171与突变株BMB1084生长情况的比较 |
| 2.3.3.2 BMB171与突变株BMB1084芽胞形成的比较 |
| 2.3.4 Enhancin蛋白基因对Bt杀棉铃虫幼虫的增效杀虫活性 |
| 2.3.4.1 晶体蛋白基因cry1Ac10在BMB171和突变株BMB1084表达 |
| 2.3.4.2 生物测定 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）昆虫病毒重组增效蛋白的生物活性（论文提纲范文）
| 1 前言 |
| 1.1 昆虫病毒增效蛋白的发现及其增效活性 |
| 1.2 增效蛋白的生理生化性质 |
| 1.3 增效蛋白的作用机理 |
| 1.4 增效蛋白核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 1.5 昆虫病毒增效蛋白的应用 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 生物测定 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 棉铃虫感染HaNPV后的累计死亡率观察值 |
| 3.2 TDM模型拟合及参数估计 |
| 3.3 有效致死剂量的估计 |
| 3.4 剂量的时间效应估计 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）蝗虫EPV sph基因及OaEPV与绿僵菌及化学农药混用的杀虫效果（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.1.1 昆虫痘病毒基因的研究 |
| 1.1.2 昆虫痘病毒载体系统表达外源基因的研究 |
| 1.1.3 昆虫病毒增效蛋白(enhancin，En)的研究 |
| 1.2 本论文的研究内容与意义 |
| 1.3 本论文的技术路线 |
| 第二章 EPV sph基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 PCR产物的鉴定 |
| 2.2.2 PCR扩增产物克隆及重组质粒的分析 |
| 2.2.3 CiEPV，GsEPV及DkEPV包涵体蛋白基因序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 昆虫痘病毒包涵体蛋白、包涵体蛋白基因及功能 |
| 2.3.2 蝗虫痘病毒之间亲源关系 |
| 2.3.3 昆虫痘病毒的亲源关系与分类 |
| 第三章 OaEPV包涵体蛋白的增效性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 OaEPV与绿僵菌混用群体接种黄胫小车蝗和东亚飞蝗的杀虫效果 |
| 3.2.2 OaEPV与绿僵菌混用单头感染黄胫小车蝗的杀虫效果 |
| 3.2.3 不同浓度OaEPV与绿僵菌混用对黄胫小车蝗的杀虫效果 |
| 3.2.4 OaEPV包涵体蛋白溶液与病毒粒子的增效作用比较 |
| 3.2.5 不同裂解方法所得OaEPV包涵体蛋白的增效性比较 |
| 3.2.6 以包涵体碱性裂解液处理OaEPV所得包涵体蛋白片段增效性比较 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 OaEPV与化学杀虫剂混用的杀虫效果 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 OaEPV与化学杀虫剂混用LC_(50) |
| 4.2.2 OaEPV与化学杀虫剂混川的杀虫效果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
四、亚洲小车蝗痘病毒球状体蛋白基因的克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]大垫尖翅蝗抗药性检测及其对丁烯氟虫腈代谢抗性机理研究[D]. 金永玲. 沈阳农业大学, 2016(10)
- [2]混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制[D]. 王成燕. 南京农业大学, 2012(04)
- [3]生物技术对草原蝗虫的控制效果及应用前景[J]. 王俊梅. 草业科学, 2009(09)
- [4]两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定[D]. 周洪旭. 山东农业大学, 2009(03)
- [5]具有杀虫活性极地微生物的筛选与研究[D]. 牛德庆. 国家海洋局第一海洋研究所, 2008(12)
- [6]苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析[D]. 王莉. 华中农业大学, 2007(02)
- [7]新疆红胫戟纹蝗痘病毒包涵体蛋白基因序列分析[J]. 李永丹,史雪岩,田兆丰,阿不都外力.依玛木,高希武. 新疆农业科学, 2006(01)
- [8]昆虫病毒重组增效蛋白的生物活性[D]. 黄哲. 湖南农业大学, 2005(05)
- [9]蝗虫EPV sph基因及OaEPV与绿僵菌及化学农药混用的杀虫效果[D]. 李永丹. 中国农业大学, 2005(04)
- [10]亚洲小车蝗痘病毒球状体蛋白基因的克隆与序列分析[J]. 赵朝阳,王丽英,李永丹,贠桂玲. 中国病毒学, 2003(06)