一、复合扩增STR位点的DNA分型技术在异基因造血干细胞移植植活证据的研究进展及其应用（论文文献综述）
黄家福[1]（2021）在《单倍体移植及同胞全相合移植治疗成人急性髓系白血病的临床研究》文中指出一 背景及目的急性髓系白血病（AML）是起源于髓系祖细胞的恶性肿瘤,40-60%患者合并细胞遗传学及分子生物学异常,发病的中位年龄超过65岁。约70%的AML患者在初始诱导化疗之后可获得完全缓解（CR）,约30%的患者在两个疗程的诱导后仍未能达到CR;此外,在CR的患者中,还有过半最终复发,预后很差。CR之后,合适的缓解后治疗（PRT）对预防白血病复发至关重要。PRT通常包括以阿糖胞苷为基础的大剂量巩固化疗,自体造血干细胞移植（auto-HSCT）以及异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）。Allo-HSCT是预防疾病复发的最有效手段,对于复发/难治性AML患者来说,allo-HSCT也是唯一可能的治愈手段。HLA位点全相合的同胞兄弟姐妹供者（MSD）是allo-HSCT的第一选择,然而,70%的患者无法获得合适的MSD。越来越多的研究表明,单倍体移植（HID-HSCT）的疗效与MSD-HSCT相似。对于缺乏MSD的恶性血液病病人来说,HID-HSCT是安全有效的治疗选择。然而,对于HID-HSCT在AML的PRT中是否具有与MSD-HSCT同等的疗效,目前仍然存在争议。一些移植中心报导了两种供者类型的移植对于CR AML的疗效相似,也有一些移植中心认为,作为AML的PRT选择,MSD仍然优于HID-HSCT。对于HID-HSCT在复发/难治性AML中是否有同等的疗效,目前也存在一些争议,不同的研究中心报导的结论不一。How等的回顾性研究中,HID与无关供者移植（MUD）、MSD移植治疗复发/难治性AML的总生存率（OS）、无病生存率（RFS）、复发率以及非复发死亡率（NRM）等主要指标均无明显差异。苏州大学第一附属医院的研究也显示了类似的结果。而Battipaglia等在一项EBMT资料的较大规模回顾性研究中,比较MSD和HID-HSCT治疗复发难治性AML的结果,发现单倍体组的OS、RFS显着差于同胞全相合组,作者因此认为,对于复发难治性AML的allo-HSCT,MSD仍然是金标准。由于较多的合并症以及较高的NRM,老年AML患者通常并不选择行allo-HSCT。随着预处理方案,GVHD防治以及支持治疗等技术的进步,接受allo-HSCT的患者年龄上限由40-45岁逐渐提高到目前的75岁以上。越来越多的研究表明,allo-HSCT可以改善老年AML的预后,提高总体生存率。相对于年轻患者,老年人获得合适MSD的机会更小,因为患者的同胞兄弟姐妹往往也同是高龄,身体素质可能并不适合作为allo-HSCT供者。作为一种替代移植方案,老年人HID移植的研究目前相对有限。对于HID移植是否可以安全、有效的治疗老年AML,研究也相对有限。为了客观比较和评价HID、MSD移植在AML PRT的疗效,在复发/难治性AML患者的疗效以及在老年AML患者的疗效,我们回顾性研究2012年1月-2018年12月在南方医院血液科接受MSD或HID移植的AML患者资料,比较两种移植类型的造血重建、GVHD、复发率、NRM、RFS以及OS。目的是为AML患者的PRT选择、复发/难治性AML的供者选择以及老年AML患者的供者选择提供循证医学证据。二 方法我们回顾性分析了南方医院血液科2012年1月至2018年12月间接受MSD或HID移植的成人AML患者的资料。在第一部分中,纳入了435例CR AML患者,包括204例MSD移植以及HID例单倍体移植;在第二部分中,纳入63例复发/难治性AML患者,包括27例MSD以及36例HID移植;在第三部分中,纳入92例年龄≥50岁的AML患者,包括49例MSD以及43例HID移植。患者的疾病临床资料包括年龄、性别、移植前疾病状态、预处理方案、供者类型（HID/MSD）等。所有患者均接受清髓的预处理方案。MSD移植组使用环孢素/A（CsA）或CsA+甲氨蝶呤（MTX）预防GVHD,HID组使用CsA+MTX+抗胸腺球蛋白（ATG）+霉酚酸酯（MMF）预防GVHD。HID组的移植物为粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员的骨髓干细胞联合外周血干细胞,MSD组的移植物为G-CSF动员的外周血干细胞。对比两种供者类型HSCT后造血重建、GVHD、复发、NRM、RFS以及OS等,分别分析比较HID移植和MSD移植治疗CR AML,复发/难治性AML以及年龄≥50岁的老年AML患者的疗效。所有的统计分析由SPSS 24软件完成。三 结果1.第一部分435例CR AML患者中,HID组和MSD组的Ⅱ-Ⅳ°急性GVHD累积发生率是42.0±3.2%vs 22.1±2.9%（P=0.000）;Ⅲ-Ⅳ°急性GVHD 累积发生率为 11.3±2.1%vs 10.2±2.3%（P-0.773）。移植后2年内,HID组和MSD组的累积慢性GVHD发生率为44.1±3.5%vs 38.7±3.6%（P=0.167）;累积慢性广泛性GVHD发生率为14.8±2.5%vs 17.3±2.8%（P=0.671）。移植后1年内,HID组和MSD组的CMV累积感染率是66.8±3.1%vs 35.3±3.3%（P=0.000）;EBV 累积感染是 41.1±3.2%vs 14.2±2.4%（P=0.000）。总体 435 例患者中,103例移植后复发,两组的3年累积复发率分别为20.8±2.8%vs 28.3±3.4%（P=0.217）;46例患者出现非复发死亡,两组的NRM分别为13.1±2.3%vs 8.6±2.1%（P=0.147）。HID组和 MSD 组的 3 年累积 OS 为 70.2±3.0%vs 69.7±3.2%（P=0.962）;3 年累积 RFS 为 67.2±3.1%vs 66.4±3.4%（P=0.744）。亚组分析,遗传学低危组,HID组和MSD组各有26例和30例患者,两组的 3 年复发率、OS 以及 RFS 分别为 13.4±7.2%vs 17.9±7.4%（P=0.714）,72.6±8.8%vs 80.0±7.3%（P=0.571）和69.2±9.1%vs 76.7±7.7%（P=0.500）。遗传学中危组,HID组和MSD组各有76例和72例患者,两组的3年复发率、OS以及RFS分别为20.3±4.8%vs 22.3±5.1%（P=0.941）,73.5±5.1%vs 74.8±5.1%（P=0.708）和 69.6±5.3%vs 71.6±5.4%（P=0.580）。遗传学高危组,HID组和MSD组各有129例和102例患者,两组的3年复发率、OS 以及 RFS 分别为 22.5±3.9%vs 36.8±5.2%（P=0.074）,67.8±4.2%vs 63.1±4.8%（P=0.478）和 65.4±4.2%vs 59.8±5.0%（P=0.673）。2.第二部分63例复发/难治性AML患者中,HID组和MSD组的Ⅱ-Ⅳ°急性GVHD累积发生率是 50.0 ± 8.2%vs 24.1±8.0%%（P=0.037）;Ⅲ-Ⅳ°急性 GVHD 累积发生率为 16.7±6.2%vs 14.8±6.8%（P=0.848）。移植后2年内,HID组和MSD组的累积慢性GVHD发生率为48.0±10.5%vs 39.0± 12.2%（P=0.611）;累积慢性广泛性GVHD 发生率为 11.1±6.3%vs 14.6±8.1%（P=0.783）。移植后1年内,HID组和MSD组的CMV累积感染率是72.2±7.5%vs 40.7±9.5%（P=0.019）;EBV 累积感染率是 52.8±8.3%vs 18.5±7.5%（P=0.000）。总体 63例患者中,37例移植后复发,两组的3年累积复发率分别为58.0±9.1%vs 72.5±9.6%（P=0.582）;11例患者出现非复发死亡,两组的NRM分别为23.8±8.2%vs 18.4±8.6%（P=0.640）。中位随访31.3个月（范围,0.4-76个月）,18例患者存活,45例死亡。HID组和MSD组的3年累积OS为33.3±7.9%vs 28.8±8.9%（P=0.863）;3年累积RFS为30.6±7.2%vs 21.6±8.1%（P=0.714）。3.第三部分92例年龄≥50岁的AML患者中,HID组和MSD组的Ⅱ-Ⅳ°急性GVHD累积发生率是44.2±7.6%vs 22.4±6.0%（P=0.032）;Ⅲ-Ⅳ°急性GVHD累积发生率为 18.6±5.9%vs 12.2±4.7%（P=0.390）。移植后2年内,HID组和MSD组的累积慢性GVHD发生率为45.3±5.7%vs 32.7±6.2%（P=0.290）;累积慢性广泛性GVHD发生率为 11.3±5.4%vs 18.3±5.9%（P=0.377）。移植后 1年内,HID组和MSD组的CMV累积感染率是65.1±7.3%vs 32.7±6.7%（P=0.004）;EBV累积感染率是44.2±7.6%vs 16.3±5.3%（P=0.006）。总体92例患者中,19例移植后复发,两组的3年累积复发率分别为23.2±7.2%vs 25.0±6.5%（P=0.850）;17例患者出现非复发死亡,两组的NRM分别为23.8±6.5%vs 15.2±5.3%（P=0.262）。中位随访29.6个月（范围,0.4-74.8个月）,58例患者存活,34例死亡。HID组和MSD组的3年累积OS为60.2±7.5%vs 65.1±6.8%（P=0.540）;3年累积RFS为58.1±7.5%vs 63.3±6.9%（P=0.525）。四结论1.HID-HSCT作为AML缓解后的治疗选择,具有和MSD-HSCT相似的疗效;HID-HSCT对于CR的遗传学高危组AML患者表现出更低的复发率,提示更强的GVL效应。2.HID-HSCT治疗复发/难治性AML的复发、RFS、OS以及NRM与MSD-HSCT相似;HID-HSCT作为复发/难治性AML的挽救性治疗选择,具有和MSD-HSCT同等的疗效。3.HID-HSCT作为老年AML的治疗选择,具有和MSD-HSCT同等的疗效;对于缺乏HLA全合同胞供者的老年AML患者,HID是安全有效的替代选择。
郜小岳[2]（2020）在《Allo-HSCT后早期TCR组库特征与动态演变规律的研究》文中提出目的:分析异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后T细胞免疫组库的基本特征和动态演变,在TCR免疫组库水平理解移植后T细胞免疫重建的规律,分析其对移植后复发、Gv HD、病毒感染等主要并发症产生的影响,探索其对临床工作的指导作用和应用前景。方法:入组进行allo-HSCT的恶性血液病病人30例,分别对其移植物（d0）、移植后1个月（d28）和移植后2个月（d61）的外周血进行高通量测序,得到的TCRβ链CDR3免疫组库结合患者随访1年的临床数据进行分析。基于组库数据特征和研究目的,创造性地设计T细胞响应指数（TCRI）,分析其特性后将其运用到数据的统计分析中。结果:1.allo-HSCT后TCR免疫组库的反Simpson多样性指数不断下降（仅d0和d61之间p=0.01）,克隆性指数不断上升（p=0.001）,非复发组d28克隆性指数显着高于复发组（p=0.018）,急性Gv HD组和无急性Gv HD组、CMV激活组和无CMV激活组之间均无显着差异。2.半相合移植组的TCRI在第一个月（TCRI200ab）、第二个月（TCRI200bc）和前两个月（TCRI200ac）均显着高于非半相合移植组（p值分别为0.032、0.007和0.004）;TCRI在急性Gv HD分组、慢性Gv HD分组、CMV分组和EBV分组之间均无显着差异;非复发组的TCRI200bc显着高于复发组（p=0.006）。3.成对数据对比时TCRI200ab显着高于TCRI200bc（p=0.027）,TCRI200bc与TCRI200ac无显着差异（p=0.112）;4.TCRI200bc≥1.0组的累积复发率显着高于TCRI200bc<1.0组（31.25%vs 0%,p=0.0323）,TCRI200bc≥1.0组的1年生存率高于TCRI200bc<1.0组,但无统计学差异（78.57%vs 56.25%,p=0.2813）。5.不同时间点间所有病人的免疫组库VDJ片段使用率有较多差异,以V片段差异较多较显着,J片段次之,D片段无显着差异;复发组与非复发组d61免疫组库V片段和J片段使用率之间有一定差异,D片段无显着差异;复发组与非复发组d61免疫组库TCRβ链CDR3氨基酸构成无显着差异（p>0.05）。6.非复发组在移植后第二个月的优势克隆较复发组使用更多TRBV2、TRBV12-3和TRBJ1-1、TRBJ1-5（p<0.01）,D片段无显着差异;非复发组TCRβ链CDR3氨基酸构成中有更多的甘氨酸和更少的丙氨酸（p<0.05）。7.患者间Gv L相关TCR克隆存在共有基序,如NAGE、SYTT,且这些特异性相似的Gv L相关克隆更倾向于供者HLA限制性,更广泛但相对稍弱的扩增。结论:1.allo-HSCT后早期T细胞均来自于移植物中的供者成熟T淋巴细胞,外周血中这些T细胞的多样性不断下降,克隆性不断上升。2.allo-HSCT后第一个月T细胞扩增主要是内稳态驱动,与供受者之间HLA相合程度相关,第二个月扩增以抗原驱动为主,与复发密切相关,与Gv HD、病毒激活均无关。3.TCRI200bc≥1.0的患者在移植1年内不会复发,且有更高的1年期生存率,提示TCRI200bc≥1.0可作为量化Gv L效应是否足以阻止患者在1年内复发的指标。4.移植后Gv L相关的优势克隆更倾向于使用TRBV2、TRBV12-3和TRBJ1-1、TRBJ1-5等片段,在患者间存在共性,有共有基序,更倾向于供者HLA提呈抗原,基于更广泛且稍弱的方式产生免疫效应。
陆叶[3]（2014）在《探讨亲缘性单倍体造血干细胞联合无关脐血移植治疗儿童血液疾病的可行性》文中提出异基因造血干细胞移植是根治儿童恶性血液病的主要方法。近年来随着移植技术的进步，亲缘性单倍体作为重要的干细胞来源得到了广泛的推广运用。本研究关注的是提高亲缘性单倍体移植疗效的临床措施，对亲缘性单倍体造血干细胞联合无关脐血移植这一技术在治疗儿童恶性血液疾病方面进行可行性探讨。目的：评估应用亲缘性单倍体造血干细胞联合无关脐血移植治疗儿童恶性血液疾病的疗效和安全性。方法：1，病例资料：对2012年8月到12月间6例恶性血液病儿童进行了亲缘性单倍体造血干细胞联合无关脐血的移植。包括2例急性淋巴细胞性白血病（ALL），2例急性髓细胞性白血病（AML），1例慢性粒细胞性白血病（CML）和1例重型再生障碍性贫血（SAA）。中位年龄10岁，中位体重38.3Kg。对供体使用粒细胞刺激因子（G-CSF）进行动员，取骨髓和外周血干细胞作为移植源，未进行体外去除T细胞处理（TCD）。骨髓内中位单个核细胞（MNC）数7.00（1.5112.13）×108/Kg，中位CD34+细胞数1.81（1.232.45）×106/Kg，外周血中位单个核细胞数7.96（4.0914.64）×108/Kg，中位CD34+细胞数5.85（2.7414.20）×106/Kg。在骨髓干细胞输注前4小时注射脐带血，1天后输注外周血干细胞。对受体应用个体化的清髓性预处理，预处理方案为改良马利兰/环磷酰胺（BU/CY）或环磷酰胺/全身照射（CY/TBI）。移植后，每日计数血细胞，监测造血重建。所有的受体均接受环胞霉素A、抗胸腺细胞球蛋白、霉酚酸酯和甲氨蝶呤（CsA+ATG+MMF+MTX）的强化联合免疫抑制，预防移植物抗宿主病（GVHD）。积极防治移植后其他并发症。对患者进行长期随访。2，移植前检测：检测供体的人类白细胞抗原（HLA）-I、II类抗体、主要组织相容性Ⅰ类相关基因A（MICA）抗体、供受者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因型，进行移植前处理，提高移植成功率。3、移植后检测：检测受者的短串联重复序列（STR），确定嵌合情况，预测复发风险。4、移植后并发症防治：检测巨细胞病毒CMV-PP65抗原、CMV-DNA、人乳头瘤病毒（BKV）情况，早期预防，早期诊断，早期治疗，减少移植后并发症，降低严重程度。结果：1、1例患者存在HLA-I、II类抗体阳性，移植前给予利妥昔单抗处理；所有患者MICA抗体均为阴性；2例患者存在KIR不相合，1例受体包含供体型。2、移植后6例患者全部获得供体型植入。中性粒细胞植入中位时间为11.8（1015）天，血小板植入中位时间为14.2（1216）天。监测STR≥95%作为完全植入，其中位时间为18（1421）天。3、2例患者发生aGVHD，无重度aGVHD（IIIIV度），无cGVHD发生。2例患者发生出血性膀胱炎（HC），其中1例存在多瘤病毒（BKV）感染。5例患者有巨细胞病毒（CMV）感染，其中3例病毒感染反复。1例患者并发侵袭性真菌感染（IFI）。无肝静脉闭塞综合症（VOD）发生。4、中位随访时间为376.5天（136496），5例患者无病生存，仅1例重型再生障碍性贫血病人在移植后136天死于间质性肺炎。结论：亲缘性单倍体供体骨髓及外周血干细胞联合脐带血移植可致移植物快速植入、低GVHD发生率和高无病生存率。
陈舒[4]（2012）在《红细胞血型基因监测同种异基因造血干细胞移植术后嵌合状态的研究》文中认为研究背景同种异基因造血干细胞移植已经广泛应用于治疗各种恶性血液病和其他疾病患者。通过嵌合动力学的精确定量分析,可以早期识别供者细胞在受者体内植入情况,评估植入失败、植入延迟和患者的GVHD或者复发的风险,从而指导临床及时采取相应的干预。目前,STR-PCR是嵌合状态检测的金标准。然而,STR-PCR法并不是真正意义上的定量技术,其敏感性为1-10%。本研究旨在利用红细胞血型基因结合实时荧光定量PCR（RQ-PCR）技术探索一种更敏感的定量监测同种异基因造血干细胞移植术后供受者嵌合状态的方法。实验方法1、红细胞血型基因多态性位点测序分析：采集随机献血者的EDTA抗凝全血,采用血清学技术鉴定,提取基因组DNA。设计序列特异性引物分别对ABO血型基因5’侧翼转录调控区、外显子5～7和内含子5.6, Kidd血型SLC14A1基因外显子4～11序列进行PCR扩增,扩增产物鉴定纯化后进行双向测序分析。2、红细胞血型基因多态性位点筛选：多态性位点的选择标准主要有：在中国人群中的高度杂合性和高度的序列特异性。3、红细胞血型基因多态性位点实时荧光定量PCR：采集随机献血者EDTA抗凝全血,采用血清学技术鉴定,分别选取血清型为Jk（a+b+）杂合子样本、B型样本和O型样本,提取基因组DNA。ABO血型基因运用测序法进行B101和非B101等位基因以及002和非002等位基因的筛选,获得B101/非B101杂合子和001/002杂合子样本。以筛选样本的基因组DNA为模板对含有SLC14A1基因（838G>A）位点的JK基因片段,含有（796C>A+803G>C）位点和（IVS5+103insCCC）位点的ABO基因片段进行PCR扩增,扩增产物经割胶纯化后的PCR片段以TOPO TA克隆法（Invitrogen公司）连接至PCR-4-TOPO载体。克隆筛选后获取重组质粒进行PCR鉴定,测序分析。采用基因克隆后的质粒DNA制作人工嵌合的样本和作为标准品制备标准曲线。设计序列特异性引物和针对核苷酸多态性位点的TaqManMGB探针进行人工嵌合样本的实时荧光定量PCR分析。结果1、ABO血型系统：根据ABO基因外显子5-7和侧翼内含子多态性分析,中国人群中杂合度较高的ABO等位基因有4个,分别为001（33.693%）、002（22.302%）、B101（20.624%）和A102（19.784%）等位基因,其它等位基因的频率均低于2%。（796C>A+803G>C）是B101和非B101等位基因的区别,人群杂合度为0.33,为位置接近的两个核苷酸多态性；内含子5区域的（IVS5+103insCCC）为O02和非O02等位基因的区别,人群杂合度为0.35,含有连续3个核苷酸的差异。根据5’非编码区测序结果分析,共发现20个多态性位点,包括16个SNP位点和4个重复序列多态性,9个位点在国外文献中已见报道,11个为本研究新发现的变异位点,分别为：-4682A>G、-4597C>T、-4581C>T、-4238A>G、-4105A>C、-2848G>A、-2818C>T、-2247～-2232del CCCTTCCT（8bp-reps）、-2081G>A、-840G>T、-593C>T。16个SNP位点均相距较远。2、Kidd血型系统：经Kidd血型SLC14A1基因外显子4～11序列分析,共发现5个SNP位点,即-99A>G、130G>A、499A>G、588G>A和838G>A,其等位基因频率分别为0.479（-99A）,0.521（-99G）,0.583（130G）,0.417（130A）,0.788（499A）,0.212（499G）,0.925（588G）,0.075（588A）,0.479（838G）,0.521（838A）。各个多态性位点的人群杂合度分别约为：0.50（-99A>G）、0.49（130G>A）、0.33（499A>G）、0.14（588G>A）和0.50（838G>A）。3、人工嵌合样本实时荧光定量检测的实际测量值与理论值无显着差异（P>0.05）。4、利用红细胞Kidd血型SLC14A1基因（838G>A）位点、ABO血型基因（796C>A+803G>C）位点和ABO血型基因（IVS5+103insCCC）进行人工嵌合样本的实时荧光定量检测,检测范围分别约为100%～1.56%、100%～0.39%和100%～0.195%。结论1、在ABO基因的外显子7区域（796C>A+803G>C）,内含子5区域的(IVS5+103insCCC准点和红细胞Kidd血型SLC14A1基因的外显子9区域的SNP位点（838G>A）均符合嵌合状态监测的分子标志物要求,可以进行嵌合体的实时荧光定量检测。2、利用红细胞血型基因多态性位点的实时荧光定量PCR检测人工嵌合样本结果可靠。3、在利用红细胞血型基因多态性位点的实时荧光定量PCR中,增加探针设计的核苷酸多态性位点数目可以提高方法的特异性和敏感性。4、我们成功建立了利用红细胞血型基因的核苷酸多态性位点结合实时荧光定量PCR检测人工嵌合样本的方法。
邵宇[5]（2010）在《异基因造血干细胞移植后供体嵌合率检测方法的建立以及免疫细胞供体嵌合率的动态变化研究》文中进行了进一步梳理目的及意义异基因造血干细胞移植（allo-SCT）是目前能够根治多种造血系统良恶性疾病及部分实体瘤的重要及有效的手段之一。然而,移植后的并发症复发排斥及移植物抗宿主病（GVHD）都极大地影响了移植的临床治疗效果。有研究发现精确动态监测移植后患者的供者细胞嵌合率（DC）可以早期预测GVHD或排斥复发,所以移植后检测DC对于判断移植物状态及决定下一步治疗方案非常重要。嵌合率的检测经典方法有：（1）血型；（2）红细胞同工酶；（3）性染色体核型分析；（4）HLA抗原；（5）限制性长度多态性；（6）可变串联重复序列VNTR；（7）微卫星重复序列STR等。大部分病例可用上述方法得到客观的植入证明,但都存在其固有缺点。本研究的第一部分通过实时定量PCR（RQ-PCR）技术对供受者差异单核苷酸多态性（SNP）位点进行检测,建立了一种目前国内未曾报道的定量检测嵌合体的方法,以达到经济、简便、精确的目的；第二部分重点分析了移植后早期（+7d、+14d）CD4+T细胞、自然杀伤（NK）细胞以及T调节细胞（Treg cell）供者嵌合率与临床结局关系,尤其是+7d嵌合率,希望在患者达到完全嵌合（CC）或在出现临床早期事件之前找到一些预测指标,来指导预后、提前干预。第一部分SNP-PCR定量检测异基因移植后嵌合率方法的建立方法1.收集2007年4月至2009年12月长海医院65例行异基因移植的移植前供受者及移植后患者+7d、+14d、+21d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年、+2年等的EDTA抗凝外周血或骨髓标本共650份；2.按试剂盒盐析法或采用DNAzol或Chelex-100试剂提取基因组DNA,分光光度计测取DNA纯度,-20℃冻存备用；3.选取了9条不同染色体上共18个SNP位点作为备选差异SNP位点,通过定量PCR筛选出供受差异SNP位点；4.RQ-PCR扩增筛选出的供受差异SNP位点,基因GAPDH校正误差,5个浓度梯度GAPDH质粒建立标准曲线,最后通过公式计算出供者嵌合率（DC）；5.通过对已知嵌合比例的模拟嵌合标本进行嵌合率检测,以及同时进行XY-FISH、STR-PCR及特殊融合基因检测来验证方法的准确性及敏感度；6.统计学处理：利用SPSS11.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,相关性检验用直线回归分析,批间差及批内差采用单样本t检验,检验水准α=0.05。结果1.标准品扩增的17次标准曲线,平均斜率为-3.39（-3.22～3.65）,平均截距为39.97（37.33～43.19）,相关系数均大于0.995, RQ-PCR反应体系的扩增效率接近理想水平,实验结果可信；批间差为1.1%,批内差为0.50%,均在可控范围；2.内参GAPDH及各SNP位点所构建的质粒扩增效率基本一致,所以最后仅利用内参一条标准曲线来计算两者的拷贝数；3.95.4%移植前供受者经定量PCR反应后均能找到相互差异的位点。其中阳性率较高的位点有S2、S7b、S10b、Sgst等；4.与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上,可重复敏感度可达0.01%,与FISH、STR-PCR结果相比,差异均没有统计学意义,并且与特定白血病融合基因结果比较,供者型100%CC标本,融合基因结果均为0%,相反MC标本,融合基因均为阳性,且同一患者供者细胞的比例越少,融合基因的表达率越高。第二部分异基因移植后早期（+7d、+14d）免疫细胞供者嵌合率的预后意义方法1.收集的标本同前,收集此65名移植患者的一般信息,包括性别、年龄、疾病种类、疾病状态、移植前化疗次数、移植物来源、HLA配型、预处理强度、血型、外周血植入速度、移植后并发症、结局、存活时间；提取基因组DNA（方法同第一部分）,-20℃冻存备用；2.采用SNP-PCR方法（同第一部分）对650份标本进行嵌合率检测,分析+7d、+14d嵌合率与移植并发症及结局的关系；3.收集2008年7月至2009年9月长海医院32例异基因移植后+14d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年等的EDTA抗凝骨髓标本共150份,收集患者的一般信息（具体内容同上）；4.免疫磁珠法分选CD3+、CD56+、CD4+CD25+细胞亚群,提取基因组DNA,-20℃冻存备用；3. SNP-PCR对标本行嵌合率检测（方法同第一部分）,分析+14d各细胞亚群的嵌合率与移植并发症及结局的关系；5.采用SPSS11.0统计分析软件包进行数据的统计分析,数据以均数±标准差表示,两组计数资料用Fish精确概率法分析,计量资料采取t检验,生存分析采用Kaplan-Meier方法,检验水准α=0.05。结果1.无论清髓性还是减低剂量移植,患者均能很好耐受,在65例患者中,2例未植入,2例移植物被排斥,余均顺利植入；2.中性粒细胞平均恢复时间（NRT）以及血小板平均恢复时间（PRT）分别为14天及16天；NRT（PRT）>14天患者的+7d平均嵌合率要低于NRT（PRT）<14d患者,分别是69.6%vs 77.3%以及69.5%vs 78.4%,但差异没有统计学意义（P>0.05）；+7天嵌合率<65%组与>65%组的平均白细胞、血红蛋白以及血小板计数均没有显着差别,分别是0.38±0.75 vs 0.33±0.65×109/L（P=0.819）,83.6±11.8 vs 77.4±17.8g/l（P=0.207）以及22.9±26.9 vs 25.5±37.6x 109/L（]P=0.801）,+7d嵌合率水平与外周血象的高低无直接联系；3.在65例患者中,13例复发,复发患者的+7d及+14d平均嵌合率均明显低于非复发患者,分别为51.86%vs 83.02%及82.89%vs 95.37%（P<0.01）；共24例患者发生GVHD,包括14例aGVHD及13例cGVHD（10例局限型和3例广泛型）,ⅡtoⅣ级aGVHD共有8例；4.随着+7d嵌合率逐渐增加,复发率逐渐降低（P=0.0001）、GVHD发生率逐渐升高（P=0.001）,髓外复发差异不明显；+7d嵌合率<65%组的复发或排斥率显着高于>65%组,为68.8%vs 8.7%（P=0.0001）；+7d嵌合率>85%组GVHD（包括总GVHD及cGVHD）的发生率明显高于<85%组,为46.43% vs 9.52%（P<0.01）, aGVHD在两组之间的差异无统计学意义（P=0.091）；5.随着+14d嵌合率水平的逐渐增加,复发率亦逐渐降低（P=0.002）,而GVHD发生率上升趋势不明显（P>0.05）；但进一步将嵌合率按85%及95%分组后,>85%组复发率显着降低（P<0.01）,>95%组总GVHD及cGVHD的发生率明显升高（P<0.01）；6.共有21名患者在随访的两年半中死亡,24个月总体生存率（OS）为56%,+7d嵌合率在65-85%的这组患者OS明显高于<65%及>85%组,分别是82.6%vs.47.0%（P=0.04）,我们将其定义为+7d的“最佳生存区间”。+14d嵌合率85-95%的区间并没有得到同样的结论（P>0.05）。7.+7d嵌合率在65-85%之间与区间之外的患者相比,疾病类型、移植前化疗次数、疾病状态、移植物类型、年龄、HLA配型、血型、干细胞来源均没有显着差别（P>0.05）。8.32例患者T、NK细胞亚群均分选成功,纯度在75-95%之间；在32例拟分选CD4+CD25+细胞亚群的患者中,2例无差异位点,2例未采集标本,3例分选失败,最后成功的有25例,成功率89.3%,纯度在70-80%之间；9.+14d T细胞嵌合率<80%易于复发,40%vs 4.5%（P=0.024）,但其比例与GVHD的发生尚无统计学联系；+14d NK细胞的嵌合率与复发及GVHD的发生关系并不密切（P>0.05）；10.+14dCD4+CD25+嵌合率的比例与排斥复发及GVHD的关系无统计学意义（P>0.05）,但其与+14d CD4+T细胞嵌合率的差值是否大于零与GVHD的发生有密切联系,如果+14dCD4+CD25+嵌合率高于CD4+T细胞,则不易发生GVHD,反之则GVHD发生明显升高GVHD发生率分别是6.7%vs 50%（P=0.014）。结论1.SNP-PCR方法检测嵌合率方便、准确、可靠,95.4%移植前供受者经定量PCR反应后均能找到相互差异的位点,适宜在中国人群推广应用；与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上,可重复敏感度可达0.01%,与FISH、STR-PCR结果相比,差异均没有统计学意义,与特殊融合基因结果相符；2.NRT>14天患者的+7d平均嵌合率要低于NRT<14d患者,但差异没有统计学意义,PRT同样如此；+7天嵌合率<65%组与>65%组的平均白细胞、血红蛋白以及血小板计数均没有显着差别；+7d供体嵌合率水平与外周血象的高低无直接联系；3.在较强预处理作用下,移植后+7d平均嵌合率即达到76.36%,+14d达到CC的患者>50%,植入速度明显快于报道的非清髓移植（NST）；供体T细胞植入相对缓慢,明显慢于NK细胞；4.随着+7d及+14d嵌合率增加,复发率逐渐降低、GVHD发生率逐渐升高；+7d嵌合率<65%组复发或排斥率显着高于>65%组；>85%组GVHD发生率明显高于<85%组；将+14d嵌合率按85%及95%分组后,>85%组复发率显着降低,>95%组总GVHD及cGVHD的发生率明显升高；+7d嵌合率<65%及+14d<85%可以作为排斥或复发的预警标志,+7d嵌合率>85%及+14d>95%可以作为GVHD发生的预警标志；5.+14d T细胞嵌合率<80%易于复发（P=0.024）,但其比例与GVHD的发生尚无统计学联系；+14d NK细胞的嵌合率与复发及GVHD的发生关系并不密切；6.可以采用磁珠分选的方法分选CD4+CD25+细胞亚群,分选成功率在90%左右,+14d CD4+CD25+嵌合率高于CD4+T细胞,则不易发生GVHD,反之则GVHD发生明显升高,可以作为+14d达到高比例嵌合患者的补充预警标志；7.本组移植患者24个月OS为56%,+7d嵌合率在65-85%的这组患者OS明显高于<65%及>85%组,定义为+7d的“最佳生存区间”,我们认为+7d嵌合率在65-85%之间是指导长期生存的又一重要指标。
曲建华,温丙昭,刘晓霞,董雷,哈力达·亚森,江明,陈瑢,王蕾[6]（2009）在《异基因外周血干细胞移植供受者嵌合体形成的动态检测》文中进行了进一步梳理目的:建立荧光标记的多重扩增短串联重复序列（STR）结合毛细管电泳定量检测异基因外周血干细胞移植（allo-PBSCT）供受者嵌合体的方法,并探讨嵌合体形成与免疫耐受及临床预后的关系。方法:采用PE 9700扩增仪扩增15个STR位点:D8S1179、D21S11、D7S820、D3S1358、CSFIPO、THO1、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA位点和1个性别位点Amelogenin,应用3130XL型DNA测序仪对35例异基因外周血干细胞移植患者上述位点进行基因型分析,并比较供受者移植前后的基因型,确定嵌合体的形成类型,以作为异基因造血干细胞移植中的植活证据,同时用无关个体的DNA混合实验进行可行性和准确性研究。结果:（1）其中32例在15个STR位点中均至少有两个可以区分供受者的有信息位点（有3例无移植前受者标本）,35例患者均在移植后1个月时STR位点及性别位点转为供者型,形成了完全供者嵌合体（CC）,且HLA单倍体相合的15例患者也达到了100%的供者植入,并在随访过程中持久不变。（2）扩增产物中供受者DNA含量的百分比同扩增前混合样本的比例呈显着直线相关（P<0.01）,最小检出DNA百分比为5%。结论:（1）用基因分析仪对STR位点进行基因型检测具有快速、无污染和自动化高、可定量及灵敏度高等优点,用于检测allo-PBSCT植活状态是可靠的。（2）诱导免疫耐受的方法可以成功地诱导CC的形成。
黄霞,程磊,王芳,毛伟,李维[7]（2008）在《Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定》文中研究说明目的探讨应用Profiler体系进行短串联重复序列（STR）基因位点检查在异基因造血干细胞移植中的作用。方法采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术,对11例异基因造血干细胞移植的供者和受者移植前、后STR基因进行检测,了解造血干细胞的植入情况。结果11例异基因造血干细胞移植受者移植后STR基因型与受者移植前STR基因型不同,与供者STR基因型完全相同,提示供者造血干细胞的植入。结论应用Profiler体系进行STR基因位点检查可用于判断异基因造血干细胞移植的植入情况。
袁晓[8]（2008）在《复合扩增荧光标记STR-PCR定量检测技术在异基因造血干细胞移植术中的应用》文中研究表明目的利用微卫星片段（Short tandem repeat ,STR）遗传多态性的特点,结合聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）和毛细管电泳技术,采用复合扩增荧光标记短串联重复序列STR-PCR结合毛细管电泳检测15个STR基因座和1个性别位点的方法,建立异基因造血干细胞移植术（Allogeneic stem cell transplantation,Allo-HSCT）后嵌合体组成的定量检测方法。分别检测骨髓（Bone marrow transplantation,BMT）联合外周血造血干细胞术（Peripheral blood stem cell transplantation, PBSCT）或单纯PBSCT后30天造血细胞嵌合体组成情况以及非血缘脐血移植（Unrelated Cord blood transplantation, UCBT）后30天内造血细胞嵌合体的动态变化,判断移植物植入情况,同时在移植术后长期跟踪检测造血细胞嵌合体组成以评价疾病状态、预测疾病转归等,并将此方法和其他临床检测手段相比较,观察其实际临床应用价值。方法建立识别个体的荧光标记复合PCR扩增STR位点结合毛细管电泳检测嵌合体方法,使用Promage公司的PowerPlex16个体识别试剂盒扩增荧光标记多重STR,特异性STR位点选择包括:D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、PentaE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、PentaD、vWA、D8S1179、TPOX、FGA 15个基因座和1个性别基因Amelogenin。扩增产物经ABI公司的3100型遗传分析仪进行毛细管电泳,GenScan?等分析软件分析数据,检测异基因造血干细胞移植术后移植受者造血细胞嵌合体组成情况,判断移植物植入情况,同时,在定性检测的基础上,依据毛细管电泳后DNA信息峰曲线下面积的大小,定量计算供者细胞的嵌合率。用此技术检测2006年至2007年间在安徽省立医院血液科接受Allo-HSCT术的44例血液系统恶性肿瘤患者移植后不同时间点造血细胞嵌合体组成情况。35例Allo-HSCT受者（其中33例BMT联合PBSCT、2例PBSCT）检测移植后30天造血细胞嵌合体组成以判断移植物植入情况,9例UCBT患者连续检测移植后30天内（移植后7、14、21、30天）造血细胞嵌合体组成变化,并同时和相应的外周血象比较,以观察移植物的植入规律并提前预测移植效果。移植后定期跟踪检测移植受者造血细胞嵌合体变化以预测移植物永久植入情况和疾病的转归。结果全部移植受者在移植后不同时间点经复合扩增荧光标记STR-PCR定量技术检测造血细胞嵌合体组成中均检测到供者成分。35例BMT/PBSCT受者全部获得造血重建,34例移植受者术后30天经STR-PCR定量技术检测造血细胞嵌合体组成呈完全供者型（Full donor chimera,FDC）,1例63岁ALL患者行减低强度PBSCT,移植后30天嵌合体呈混合嵌合（Mixed chimera,MC）,移植后90天嵌合体呈FDC。9例UCBT受者在移植后不同时间均检测到供者成分,发现获得造血重建的7例移植受者,在移植后7天造血未恢复外周血中嵌合体均呈FDC,而2例未获得造血重建受者移植后7天嵌合体呈MC,移植后30天外周血和骨髓中均未检测到供者基因成分。跟踪随访中,7例骨髓复发患者均提前出现嵌合体中供者成分减低的现象,2例髓外复发患者其嵌合体仍呈FDC。结论1,复合扩增荧光标记STR一PCR结合毛细管电泳技术能准确有效地判断出Allo-HSCT术后早期移植物植入状况,并能连续动态监测移植后移植物永久植入情况,及时预测疾病的转归,为临床早期干预治疗提供可靠的实验依据;2,UCBT后30天内连续检测嵌合体组成情况,在外周血象尚未恢复时（移植后7天）即可提前预测移植物被植入,与沿用的移植成功指标ANC具有很好的关联性,并可揭示脐血移植植入动力学的规律,该技术可作为早期评估UCBT是否成功最灵敏特异的指标。3,该方法灵敏度高、特异性强、标本需要量少、适应范围广,具有很好的临床应用价值。
曲建华[9]（2007）在《亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床和实验研究》文中认为异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是目前可治愈白血病、骨髓增生异常综合征等恶性血液病的最有效方法,而异基因外周血干细胞移植（allo-PBSCT）的主要优点为移植后造血重建快,感染并发症少,且避免了对供体麻醉及多部位穿刺采集骨髓细胞的不便,使供者更易接受,目前已有取代异基因骨髓移植（allo-BMT）的趋势。但由于找到人类白细胞抗原（HLA）相合供者的几率很低,尤其在我们新疆少数民族地区更为明显,而限制了其广泛的应用,很多患者则因无合适供者失去移植治疗的机会而死亡。如能跨越HLA限制建立HLA单倍体相合移植将使HSCT更广泛应用,会使需要移植的恶性血液病患者基本都能及时在身边找到合适供者。但与HLA相合移植比较,由于HLA不同的免疫学障碍,HEA单倍体相合移植面临植入失败率高、造血重建慢、移植物抗宿主病（GVHD）重、免疫重建延迟、致死性感染发生率高、移植相关死亡率高等诸多障碍。为了克服HLA限制就必须在临床上尽可能地建立免疫耐受,免疫耐受是指机体只对以前接触过的特定抗原不应答,而对不引起耐受的其它抗原仍能进行良好的免疫应答,免疫耐受具有的免疫特异性与免疫缺陷或药物引起的对免疫系统的普遍抑制作用相比具有显而易见的优势,如果能够成功诱导免疫耐受,HLA单倍体相合移植将会取得与全相合移植相同的临床效果,从而显着扩大移植的适应征,提高患者的存活率。所以在器官移植日益发展的今天,对免疫耐受产生的机制及人工诱导免疫耐受方法的研究受到了科学界的广泛关注,是亟待解决的医学课题。目前结合国内外文献报道,造血干细胞移植中诱导免疫耐受的方法许多仍在动物实验或临床实验研究阶段,真正用于临床还需要更多的研究和探索,本研究首先旨在临床上对单倍体相合PBSCT患者采用切实可行的方案实施免疫耐受诱导,并且从临床治疗效果、嵌合体形成、细胞因子及免疫重建等实验角度来探讨是否达到免疫耐受,并与同期进行的全相合PBSCT进行对照研究,以探讨方案的可行性。第一部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床研究目的:探讨应用亲属HLA单倍体相合allo-PBSCT治疗恶性血液病的疗效。方法:亲属供者HLA单倍体相合未去除T细胞（TCD）的allo-PBSCT治疗恶性血液病患者20例,移植后结果与同期连续完成的25例供受者HLA全相合组相比较。用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对供者进行外周血干细胞（PBSC）动员,动员前后检测外周血及单采PBSC移植物中单个核细胞（MNC）及CD34+细胞数。预防GVHD方案在HLA全相合移植者采用环孢素A（CsA）+氨甲喋呤（MTX）标准方案,HLA一个位点不合者在上述方案基础上加用霉酚酸酯（MMF）,2～3个位点不合者在CsA+MTX+MMF方案的基础上又加用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）及CD25单抗。结果:单倍体组和全相合组输入的MNC的中位数分别为14.62（8.59-31.78）×108/kg体重及14.45（7.62-19.9）×106/kg体重,单倍体组和全相合组输入的CD34+细胞的中位数分别为9.13（4.57-41.78）×106/kg体重及6.58（2.31-18.89）×106/kg体重。45例患者全部植活,20例单倍体患者中位数植活时间为13（10～20）d,现中位数随访时间21（2～64）个月,无白血病存活17例（85%）,25例全相合患者中位数植活时间为14（8～17）天,现中位数随访时间23（6～40）个月,无白血病存活20例（80%）。HLA全相合组及单倍体组2年预期无病生存率分别为77.2%和76.4%（P＞0.05）,单倍体组的aGVHD发生率（35%）与全相合组（8%）相比无显着差异（P＞0.05）,cGVHD的发生率在两组间（45%,40%）亦无显着差异（P＞0.05）,MNC及CD34+细胞数与aGVHD及cGVHD的发生率均无相关性。结论:1)在CsA+MTX标准方案的基础上依据HLA不合的差异程度适当增加免疫抑制剂可减少和减轻亲属HLA单倍体相合PBSCT中GVHD的发病率及严重性并改善生存率。2)应用亲属HLA单倍体相合PBSCT可以突破HLA障碍,显着扩大移植的适应征。第二部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植供受者嵌合体形成的动态检测目的:建立荧光标记的多重扩增短串联重复序列（STR）结合毛细管电泳定量检测allo-PBSCT供受者嵌合体的方法,并探讨嵌合体形成与免疫耐受及临床预后的关系。方法:采用PE9700扩增仪扩增15个STR位点:D8S1179、D21S11、D7S820、D3S1358、CSFIPO、THO1、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA位点和一个性别位点Amelogenin,用3130XL型DNA测序仪对上述位点进行基因型分析,并比较供受者移植前后的基因型,确定嵌合体的形成类型,以作为异基因造血干细胞移植中的植活证据,同时用无关个体的DNA混合实验进行可行性和准确性研究。结果:用该方法分析35例移植对的结果显示:其中32例在15个STR位点中均至少有两个可以区分供受者的有信息位点（有3例无移植前受者标本）,35例患者均在移植后1个月时STR位点及性别位点转为供者型,形成了完全供者嵌合体（CC）,且HLA单倍体相合的15例患者也达到了100%的供者植入,部分患者于14天抽血时即转为供者型,并在随访过程中持久不变。35例患者同时进行移植后红细胞抗原、性染色体及PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测嵌合体形成,对HLA单倍体相合患者同时进行移植后HLA分型检测,上述指标均于移植后不同时间转为供者型。扩增产物中供受者DNA含量的百分比同扩增前混合样本的比例呈显着直线相关（P＜0.01）,最小检出DNA百分比为5%。结论:1)用基因分析仪对STR位点进行基因型检测具有快速、无污染和自动化高、可定量及灵敏度高等优点,用于检测allo-PBSCT植活状态是可靠的。2)本组移植患者所采用的诱导免疫耐受的方法可以成功地诱导CC的形成。第三部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植患者外周血Th1/Th2型细胞因子与GVHD的关系目的:探讨单倍体allo-PBSCT患者外周血淋巴细胞中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4水平的变化及其临床意义。方法:用流式细胞仪动态检测28例行allo-PBSCT患者外周血淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的水平。结果:13例单倍体相合患者移植后IFN-γ的水平逐渐降低,并自+6个月开始显着低于移植前水平（P＜0.05）,于+18个月时达最低值;而IL-4的水平在移植后初期呈下降趋势,在+1月至+6月时显着低于移植前水平（P＜0.05）,但自+12月至+18月时显着高于移植前水平;15例全相合组患者移植后IFN-γ的水平也逐渐降低,而IL-4的水平在移植后呈上升趋势,在+18月时显着高于移植前水平。两组IFN-γ和IL-4的水平在移植后不同时间均无显着差异。所有患者均获得造血重建,其中5例发生aGVHD,8例发生cGVHD,IFN-γ在aGVHD+组显着高于aGVHD-组（P＜0.05）,而IL-4的水平在两组间无显着差异（P＞0.05）。IFN-γ和IL-4的水平在cGVHD+组和cGVHD-组之间均无显着差异（P＞0.05）。结论:1)IFN-γ在人类aGVHD的发病中起重要的正向调节作用,可干扰免疫耐受的形成,移植后动态检测IFN-γ水平有助于预测aGVHD的发生。2)加强的预处理及预防GVHD方案对单倍体组IFN-γ和IL-4的表达并无显着影响。第四部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植后免疫功能的随防研究目的:探讨HLA单倍体相合allo-PBSCT后免疫功能重建的规律,及时指导移植后感染的防治。方法:采用间接免疫荧光法测定上述15例单倍体相合患者在接受allo-PBSCT后外周血T（CD3、CD4、CD8）、B（CD19）、NK（CD56）细胞亚群的动态变化,结果与同期连续完成的25例HLA全相合患者相比较,以32名健康供者测定的结果作为对照。结果:1)CD3+、CD4+、CD4+/CD8+在+1月时均比正常对照显着下降,CD3+细胞在+3月时即恢复正常,CD4+细胞在+3月时仍显着低于正常对照,在+6～+12月时基本达到正常;CD8+细胞的恢复较快,在+1月时仅比正常对照略下降,而在+3月、+6月时已显着高于正常对照,于+12月后逐渐恢复正常;CD4+/CD8+在移植后逐渐下降,在+1、+3、+6月时均比正常对照显着下降,且在+3月及+6月时呈倒置现象,+12月后逐渐恢复正常;CD19+B细胞在移植后无下降,且在移植+1月及+18月显着高于正常对照;CD56+NK细胞在移植后也无明显下降,且在移植+3月时显着高于正常对照。2)全相合和单倍体相合组的T、B、NK细胞亚群在+1月、+6月、+12月时相比均无显着差异,但在移植+3月时,单倍体相合组的CD3+、CD8+细胞显着高于全相合组（P＜0.05）,而CD4+/CD8+显着低于全相合组,且呈倒置。3)在移植后早期+1月和+3月时aGVHD+组和aGVHD-组的各淋巴细胞亚群均无显着差异（P＞0.05）;在移植后+1月时cGVHD+组的CD4+细胞显着高于cGVHD-组（P＜0.05）,其它时间段两组各淋巴细胞亚群均无显着差异（P＞0.05）。结论:1)多种免疫抑制剂的联合应用对HLA单倍体未进行TCD的allo-PBSCT免疫重建的速度无显着影响,值得推广应用。2)aGVHD和cGVHD的发生对allo-PBSCT免疫重建无重大影响。
任秀宝[10]（2006）在《活化动员亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗恶性实体瘤的基础和临床实验研究》文中提出第—部分:活化动员的亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗晚期转移或化疗抵抗性 实体瘤初步观察 目的:初步探讨活化动员的亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗晚期转移性/化疗抗性实体瘤的可行性。方法:11例晚期转移性/化疗抵抗性恶性实体瘤患者,供者为与患者HLA半相合直亲属。供者经10μg/kg·d G-CSF动员3天后采集haplo-HSCs,体外用大剂量rhIL-2培养激活4h后回输患者。观察治疗后临床反应;采用流式细胞仪、LDH和ELISA试剂盒检测动员、活化前后表型,IL-2短期活化前后的非特异性杀瘤活性以及患者回输前后血清中各种细胞因子的含量变化。结果:11例患者回输的单个核细胞总数达（2.5～4.3）x1010。经G-CSF动员后T细胞,尤其是CD4+T细胞显着下降,而NK细胞比例显着上升;经大剂量IL-2短期活化后,活化细胞（包括CD69+和CD25+细胞）亚群比例显着升高。体外实验中可观察到IL-2短期活化的单个核细胞具有类似LAK样的较高的非特异性杀瘤活性。经过治疗,11例患者血清中Th1类细胞因子,如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α含量明显升高,而Th2类细胞因子,如TGF-β含量明显下降。治疗后8例观察到临床症状的缓解,或肿瘤标志物的降低,或影像学资料的改善,其中1例治疗后4月时达到临床PR,1例在治疗后9月达到MR,2例无效,截至1年随访期结束时共有6例患者仍病情稳定,而有5例死亡。结论:IL-2短期活化的HLA半相合的单个核细胞具有明显的抗肿瘤效应,为治疗晚期转移性/化疗抗性实体瘤提供了新的希望。
二、复合扩增STR位点的DNA分型技术在异基因造血干细胞移植植活证据的研究进展及其应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、复合扩增STR位点的DNA分型技术在异基因造血干细胞移植植活证据的研究进展及其应用（论文提纲范文）
（1）单倍体移植及同胞全相合移植治疗成人急性髓系白血病的临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 单倍体移植及同胞全相合移植治疗CR AML的疗效比较 |
| 前言 |
| 病例与方法 |
| 1.1.1 病例资料 |
| 1.1.2 HLA配型和供者选择 |
| 1.1.3 造血干细胞来源 |
| 1.1.4 预处理方案 |
| 1.1.5 GVHD的防治 |
| 1.1.6 环孢素减量及DLI |
| 1.1.7 感染的预防 |
| 1.1.8 并发症的预防 |
| 1.1.9 植活指标及复发监测 |
| 1.1.10 评估指标以及统计学方法 |
| 结果 |
| 1.2.1 一般特性 |
| 1.2.2 造血重建 |
| 1.2.3 GVHD |
| 1.2.4 病毒感染 |
| 1.2.5 复发以及非复发死亡率 |
| 1.2.6 无病生存以及总生存 |
| 1.2.7 亚组分析 |
| 讨论 |
| 第一部分 结论 |
| 第二部分 单倍体移植及同胞全相合移植治疗复发/难治性AML的疗效比较 |
| 前言 |
| 病例与方法 |
| 2.1.1 病例资料 |
| 2.1.2 HLA配型和供者选择 |
| 2.1.3 造血干细胞来源 |
| 2.1.4 预处理方案 |
| 2.1.5 GVHD的防治 |
| 2.1.6 环孢素减量及DLI |
| 2.1.7 感染的预防 |
| 2.1.8 并发症的预防 |
| 2.1.9 植活指标及复发监测 |
| 2.1.10 评估指标以及统计学方法 |
| 结果 |
| 2.2.1 一般特性 |
| 2.2.2 造血重建 |
| 2.2.3 GVHD |
| 2.2.4 病毒感染 |
| 2.2.5 复发以及非复发死亡率 |
| 2.2.6 无病生存以及总生存 |
| 讨论 |
| 第二部分 结论 |
| 第三部分 单倍体移植与同胞全相合移植治疗年龄≥50岁的AML患者的疗效比较 |
| 前言 |
| 病例与方法 |
| 3.1.1 病例资料 |
| 3.1.2 HLA配型和供者选择 |
| 3.1.3 造血干细胞来源 |
| 3.1.4 预处理方案 |
| 3.1.5 GVHD的防治 |
| 3.1.6 环孢素减量及DLI |
| 3.1.7 感染的预防 |
| 3.1.8 并发症的预防 |
| 3.1.9 植活指标及复发监测 |
| 3.1.10 评估指标以及统计学方法 |
| 结果 |
| 3.2.1 一般特性 |
| 3.2.2 造血重建 |
| 3.2.3 GVHD |
| 3.2.4 病毒感染 |
| 3.2.5 复发以及非复发死亡率 |
| 3.2.6 无病生存以及总生存 |
| 讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的论文 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 致谢 |
（2）Allo-HSCT后早期TCR组库特征与动态演变规律的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 造血干细胞移植 |
| 1.1.1 造血干细胞移植的发展过程 |
| 1.1.2 造血干细胞移植的分类 |
| 1.1.3 造血干细胞移植的过程 |
| 1.1.4 造血干细胞采集物的成分 |
| 1.1.5 造血干细胞移植后的主要并发症 |
| 1.2 移植后免疫重建 |
| 1.2.1 allo-HSCT后免疫细胞数量和功能重建 |
| 1.2.2 allo-HSCT后患者T细胞来源和重建 |
| 1.2.3 allo-HSCT后抗原提呈与识别 |
| 1.3 TCR免疫组库 |
| 1.3.1 TCR |
| 1.3.2 T细胞免疫组库 |
| 1.3.3 下一代测序技术 |
| 1.3.4 相关研究进展 |
| 1.4 本研究的主要目的和研究思路 |
| 第二章 实验与数据可靠性分析 |
| 2.1 实验流程和伦理申报 |
| 2.1.1 实验流程图 |
| 2.1.2 伦理申报 |
| 2.1.3 临床试验注册 |
| 2.2 提取单个核细胞RNA |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验注意事项 |
| 2.3 免疫组库高通量测序 |
| 2.3.1 测序的流程 |
| 2.3.2 TCR免疫组库高通量测序 |
| 2.4 测序数据规律分析 |
| 2.4.1 测序数据重复性 |
| 2.4.2 测序数据代表性 |
| 2.4.3 测序数据偏倚 |
| 第三章 新指数的设计与特点 |
| 3.1 新指数的设计 |
| 3.1.1 本研究的指导思想 |
| 3.1.2 数据结构 |
| 3.1.3 新指数的设计过程 |
| 3.2 新指数的特点 |
| 3.2.1 新指数的特征 |
| 3.2.2 新指数的优缺点 |
| 3.2.3 应用新指数的注意事项 |
| 3.3 新指数与常用指数对比 |
| 3.3.1 分析免疫组库的常用指数 |
| 3.3.2 新指数与传统常用指数对比 |
| 第四章 结果分析与讨论 |
| 4.1 移植后早期TCR组库特征 |
| 4.1.1 统计分析方法 |
| 4.1.2 患者的临床数据 |
| 4.1.3 患者的测序数据 |
| 4.1.4 移植后TCR免疫组库多样性和克隆性变化趋势 |
| 4.1.5 讨论 |
| 4.2 TCR组库动态变化与移植后主要并发症 |
| 4.2.1 移植后TCR组库中的主要克隆 |
| 4.2.2 移植后免疫组库不平行扩增与临床并发症的关系 |
| 4.2.3 VDJ片段使用率及氨基酸组成与临床并发症 |
| 4.2.4 讨论 |
| 4.3 GvL相关克隆共性分析 |
| 4.3.1 GvL相关克隆的共性分析 |
| 4.3.2 患者间共享特异性的GvL相关克隆特征 |
| 4.3.3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）探讨亲缘性单倍体造血干细胞联合无关脐血移植治疗儿童血液疾病的可行性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 资料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英汉双解缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（4）红细胞血型基因监测同种异基因造血干细胞移植术后嵌合状态的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 目次 |
| 前言 |
| 第一部分 红细胞血型基因高杂合度多态性位点筛选 |
| 一、ABO血型基因5’侧翼转录调控区、外显子5~7和内含子5、6的序列多态性#选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 二、Kidd血型SLC14A1基因外显子4 ~ 11序列多态性位点傩选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 红细胞血型基因多态性位点实时定量PCR |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 在读期间发表的论文、课题资助 |
（5）异基因造血干细胞移植后供体嵌合率检测方法的建立以及免疫细胞供体嵌合率的动态变化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 异基因造血干细胞移植术后供体嵌合率SNP-PCR检测方法的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 异基因造血干细胞移植后+7d、+14d免疫细胞亚群供体嵌合率与预后的关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 博士期间发表文章及承担课题 |
| 致谢 |
（6）异基因外周血干细胞移植供受者嵌合体形成的动态检测（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 实验步骤 |
| 1.2.1 全血DNA提取步骤(Chelex100 DNA提取法) |
| 1.2.2 PCR扩增 |
| 1.2.3 3130XL Data Collection V3.0软件收集信息 |
| 1.2.4 Grenemapper3.2软件分析信息 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 1.3 体外模拟混合嵌合体样本的制备 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 移植后嵌合体形成 |
| 2.2 方法的灵敏度 |
| 2.3 体外模拟混合嵌合体的计算 |
| 2.4 移植后造血恢复情况 |
| 2.5 GVHD发生情况 |
| 3 讨论 |
（7）Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1标本来源: |
| 1.2 试剂: |
| 1.3 仪器: |
| 2 方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
（8）复合扩增荧光标记STR-PCR定量检测技术在异基因造血干细胞移植术中的应用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 前言 |
| 1 第一部分 复合扩增荧光标记 STR-PCR 定量检测造血细胞嵌合体组成技术的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2. 结果判断 |
| 2 第二部分 复合扩增荧光标记 STR-PCR 定量检测技术在异基因骨髓或外周血造血干细胞移植中的应用 |
| 1. 临床资料 |
| 2.试验方法 |
| 3.结果 |
| 3 第三部分 复合扩增荧光标记 STR-PCR 定量检测技术在非血缘脐血移植中的应用 |
| 1. 临床资料 |
| 2.试验方法 |
| 3. 结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Allo-HSCT 术后检测造血细胞嵌合体的意义 |
| 4.2 Allo-HSCT 术后移植物植入检测方法的研究现状 |
| 4.3 STR-PCR 技术在检测嵌合体方面的优势 |
| 4.4 STR-PCR 技术在本研究中的应用 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（9）亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床研究 |
| 2.亲属HLA单倍体外周血干细胞移植供受者嵌合体的动态检测 |
| 3.亲属HLA单倍体外周血干细胞移植患者外周血Th1/Th2型细胞因子与GVHD的关系 |
| 4.亲属HLA单倍体外周血干细胞移植后免疫功能的随防研究;「’ |
| 第一部分 HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床研究 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 HLA配型 |
| 1.3 预处理方案 |
| 1.4 移植物抗宿主病(GVHD)预防 |
| 1.5 造血干细胞的动员采集及移植 |
| 1.6 植活证据检测 |
| 1.7 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 HLA单倍体外周血干细胞移植供受者嵌合体的动态检测 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.5 方法的准确性 |
| 1.6 体外模拟混合嵌合体样本的制备 |
| 1.7 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 HLA单倍体外周血干细胞移植患者外周血Th1/Th2型细胞因子与GVHD的关系 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 IFN-γ、IL-4的检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第四部分 HLA单倍体外周血干细胞移植后免疫功能的随防研究 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（10）活化动员亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗恶性实体瘤的基础和临床实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 活化动员的亲缘间 HLA半相合异基因单个核细胞治疗晚期转移或化疗抵抗性实体瘤初步观察 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 供受者之间母胎微嵌合促进活化的 HLA半相合异基因单个核细胞抗肿瘤效应 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 供受者混合嵌合有助于提高活化 MHC半相合供者淋巴细胞的抗肿瘤效应 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 综述 |
| 致谢 |
四、复合扩增STR位点的DNA分型技术在异基因造血干细胞移植植活证据的研究进展及其应用（论文参考文献）
- [1]单倍体移植及同胞全相合移植治疗成人急性髓系白血病的临床研究[D]. 黄家福. 南方医科大学, 2021
- [2]Allo-HSCT后早期TCR组库特征与动态演变规律的研究[D]. 郜小岳. 军事科学院, 2020(01)
- [3]探讨亲缘性单倍体造血干细胞联合无关脐血移植治疗儿童血液疾病的可行性[D]. 陆叶. 苏州大学, 2014(01)
- [4]红细胞血型基因监测同种异基因造血干细胞移植术后嵌合状态的研究[D]. 陈舒. 浙江大学, 2012(04)
- [5]异基因造血干细胞移植后供体嵌合率检测方法的建立以及免疫细胞供体嵌合率的动态变化研究[D]. 邵宇. 第二军医大学, 2010(10)
- [6]异基因外周血干细胞移植供受者嵌合体形成的动态检测[J]. 曲建华,温丙昭,刘晓霞,董雷,哈力达·亚森,江明,陈瑢,王蕾. 新疆医科大学学报, 2009(10)
- [7]Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定[J]. 黄霞,程磊,王芳,毛伟,李维. 临床输血与检验, 2008(03)
- [8]复合扩增荧光标记STR-PCR定量检测技术在异基因造血干细胞移植术中的应用[D]. 袁晓. 安徽医科大学, 2008(05)
- [9]亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床和实验研究[D]. 曲建华. 新疆医科大学, 2007(09)
- [10]活化动员亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗恶性实体瘤的基础和临床实验研究[D]. 任秀宝. 天津医科大学, 2006(09)