一、RNA splicing and SR protein phosphorylation under stress in acute myeloid leukemia (AML)（论文文献综述）
曲红[1]（2021）在《circMTOR在慢性髓系白血病伊马替尼耐药中的机制研究》文中认为研究背景和目的:慢性髓系细胞血病（chronic myelogenous leukemia,CML）是一种来源于多能造血干细胞的克隆增殖性疾病,主要由t（9;22）（q34;q11）易位产生典型的BCR-ABL1融合基因,该基因具有高度酪氨酸激酶活性,使肿瘤细胞异常增殖和凋亡受阻。伊马替尼（Imatinib Mesylate,IM）等酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKI）的广泛应用,极大程度改善了 CML患者的长期生存。但仍有一部分患者在治疗过程中出现伊马替尼耐药,导致治疗失败。近期研究证实,环状RNA（circular RNAs,circRNAs）可能通过调控癌基因的表达介导CML对伊马替尼耐药。本研究通过高通量测序技术筛选伊马替尼敏感与耐药组中差异表达的circRNAs表达谱并探索circMTOR在CML耐药中的具体分子调控机制。研究方法:本研究共收集了 5例对伊马替尼敏感CML患者和5例无ABL激酶区突变的伊马替尼耐药CML患者外周血标本,通过分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMCs）进行RNA-seq鉴定,分析两组差异表达的circRNA 表达谱,并采用实时荧光定量 PCR（quantitative real-time-PCR,qRT-PCR）进行验证。通过对测序数据进行深入的生物信息学分析,包括circRNA-miRNA网络、Gene Ontology（GO）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析,选择在伊马替尼耐药患者和耐药细胞系中均显着性高表达的部分circMTOR进行功能验证。应用双荧光素酶报告基因系统来确认circMTOR和预测的miRNA之间的靶标关系,然后通过siRNA干扰技术、qRT-PCR、MTT实验及流式细胞学分析等实验方法,在CML细胞系中进行分子功能研究及其凋亡通路的分子验证。研究结果:RNA-seq分析显示,与伊马替尼敏感的CML患者相比,在伊马替尼耐药的CML患者中有1852个circRNA差异表达（上调800个,下调1052个）。qRT-PCR 结果显示,hsacirc0110442（circMTOR）在 CML 耐药患者的 PBMC 和K562R细胞中表达水平上调最为显着。hsacirc0110442来源于mTOR基因的Exon20和Exon23,本研究中称为circMTOR。我们通过生物信息学构建了circMTOR介导的竞争性内源性RNA（ceRNA）调控网络,GO分析表明circMTOR参与多种生物学过程;根据KEGG分析显示,circMTOR可能与PD-L1/ErbB及VEGF等肿瘤相关的通路有关,通过进一步分析发现,circMTOR存在miR-34a结合位点,而c-Myc可能是miR-34a的靶基因。通过siRNA沉默circMTOR,miR-34a表达上调,引起c-Myc基因表达下调,K562R细胞凋亡率增加,对伊马替尼敏感性增强。结论:1)利用高通量测序技术,在CML伊马替尼耐药和敏感组患者PBMC细胞中筛选到差异表达circRNAs,生物信息分析显示circRNA可能参与多种信号通路调控的CML伊马替尼耐药机制;2)qRT-PCR 验证到hsacirc0110442（circMTOR）在 K562R 组中上调最显着;siRNA敲低circMTOR可显着抑制K562R细胞株的增殖,并诱导细胞凋亡,增强CML细胞对伊马替尼的敏感性;3)双荧光素酶报告基因和功能挽救实验表明circMTOR通过与miR-34a结合发挥ceRNA功能,调控K562R细胞对伊马替尼敏感性;4)Western Blot试验表明,miR-34a通过调控靶基因c-Myc的表达,影响K562R细胞的增殖和凋亡。5)异常活化的circRNAmTOR/miR-34a/c-Myc轴可能为非BCR-ABL1依赖性的伊马替尼耐药机制之一。
姜凤洁[2]（2021）在《m6A识别蛋白HNRNPA2B1通过稳定ILF3 mRNA调节AKT3表达促进多发性骨髓瘤进程》文中指出研究背景和目的:骨髓瘤是一种起源于骨髓造血组织、以浆细胞为主的恶性肿瘤,由于其易产生多发性骨损害,故也称为多发性骨髓瘤（Multiplemyeloma,MM）,发病率在血液恶性肿瘤中位居第二位。MM危害大,发病率逐年升高。新型药物和治疗方案的出现提高了患者的临床疗效,但是大部分患者都会再度发作。目前对复发没有有效治疗方法,亟需新的治疗方法和联合治疗方案。腺嘌呤N6-甲基化（N6-methyladenosine,m6A）调控RNA降解,剪切,核输出等过程,影响基因表达,与多种生理和疾病过程相关,尤其是肿瘤的形成和发展。HNRNPA2B1是一组多功能的RNA结合蛋白,在转录过程中的多个重要环节发挥作用,被证实与多种关键的细胞功能相关。肿瘤的发生发展是由于多种信号通路异常调节导致的,因此,研究肿瘤细胞中致病基因及其调控的信号通路,揭示肿瘤的发病机制,是肿瘤诊断治疗及靶向药物研发的基础,是肿瘤领域中的重要研究方向。本课题首先验证基因芯片筛选出的HNRNPA2B1基因与MM病人生存率及发生发展的作用,通过一系列细胞及动物模型实验探究HNRNPA2B1参与的RNA m6A甲基化（N6-methyladenosine）修饰影响MM的具体调控机制,并寻找靶向HNRNPA2B1调控网络的可以抑制MM细胞增殖的中药单体药物,为MM的治疗提供理论基础。研究方法:1.利用慢病毒包装构建HNRNPA2B1过表达（OE）和shRNA敲低（KD）的稳转细胞株;采用MTT增殖实验检测HNRNPA2B1基因对细胞活力影响;通过流式细胞术（FCM）和蛋白质印迹法（WB）检测凋亡相关指标观察HNRNPA2B1对MM细胞凋亡的影响;NOD-SCID小鼠皮下注射HNRNPA2B1过表达的ARP1细胞株构建异种移植小鼠模型,通过荷瘤体积、重量和生存期验证HNRNPA2B1体内促癌功能。2.利用m6A甲基化测序技术（MeRIP-Seq）寻找HNRNPA2B1通过m6A途径调控的下游基因;qPCR和WB验证HNRNPA2B1敲低、过表达以及m6A合成抑制剂环亮氨酸作用48 h后,ILF3 RNA和蛋白表达,验证m6A参与HNRNPA2B1对ILF3基因的调控。3.用HNRNPA2B1抗体对ARP1野生型和HNRNPA2B1敲低细胞株进行RNA免疫共沉淀（RIP）,通过qPCR比较ILF3的富集量,验证HNRNPA2B1蛋白与ILF3RNA是否直接结合。HNRNPA2B1在细胞内的功能与其核质分布相关,通过免疫荧光共染实验检测HNRNPA2B1和ILF3的亚细胞定位,推断HNRNPA2B1蛋白对ILF3基因的具体调控作用。利用RNA降解实验（RNA合成抑制剂放线菌素D处理,5 μg/mL）,验证HNRNPA2B1蛋白对ILF3 RNA的稳定作用。基于基因芯片数据提示ILF3是MM中的癌基因,构建ILF3敲低的稳转细胞株,通过MTT增殖实验和凋亡实验,验证ILF3是否也促进MM发生发展。4.对ARP1细胞进行RNA免疫共沉淀-测序（RIP-Seq）,寻找ILF3作用的下游基因。用qPCR和WB验证ILF3敲低后AKT3 RNA和蛋白表达,验证ILF3与AKT3 RNA直接结合;利用RNA降解实验,验证ILF3蛋白对AKT3 RNA有稳定作用。用qPCR和WB验证HNRNPA2B1对AKT3 RNA和蛋白表达的影响;利用小干扰技术沉默HNRNPA2B1过表达细胞中AKT3,观察AKT3沉默后MM细胞的增殖,探讨HNRNPA2B1对MM的促癌作用与AKT3的关系。5.利用WB检测不同浓度中药单体药物作用MM细胞48 h后HNRNPA2B1表达情况,寻找靶向作用HNRNPA2B1蛋白的中药单体药物。研究结果:1.基因芯片技术表明HNRNPA2B1在MM患者中表达高于正常（NP）和意义未定的单克隆丙种球蛋白病患者（MGUS）,高表达HNRNPA2B1导致患者总生存期缩短;MTT增殖实验表明,HNRNPA2B1敲低抑制MM细胞增殖,过表达促进细胞增殖;FCM检测到HNRNPA2B1敲低细胞中凋亡明显,HNRNPA2B1敲低后Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3蛋白表达显着增加,表明HNRNPA2B1抑制MM细胞凋亡;小鼠体内试验表明HNRNPA2B1过表达后皮下肿瘤重量和体积显着大于对照组。上述实验揭示HNRNPA2B1在MM中是促癌基因,促进MM的形成,发生和发展。2.MeRIP-Seq表明ILF3 RNA 3’-非编码区上发生明显的m6A修饰,与对照组相比,HNRNPA2B1敲低组检测到的ILF3转录本显着减少;HNRNPA2B1敲低后,ILF3 RNA和蛋白表达均降低,HNRNPA2B1过表达后促ILF3 RNA和蛋白表达;加入m6A合成抑制剂环亮氨酸后,ILF3mRNA和蛋白水平均降低,且与环亮氨酸浓度相关;RIP-qPCR表明,与IgG组相比,HNRNPA2B1与ILF3 RNA结合明显增加,HNRNPA2B1敲低后,检测到的ILF3 RNA量显着降低,说明HNRNPA2B1蛋白与ILF3 RNA直接结合;RNA降解实验表明,加入放线菌素D后,与对照组比较,HNRNPA2B1敲低后,ILF3 RNA稳定性降低。3.RIP-Seq 实验显示 ILF3 蛋白与 AKT3 RNA 上 Exon3,10 和 Intron2,3,10直接结合;ILF3敲低后AKT3 mRNA和蛋白表达量均降低;RIP-qPCR表明,ILF3敲低后,ILF3蛋白与AKT3 RNA结合量减少;RNA降解实验表明,ILF3敲低后,AKT3 RNA降解增加。4.HNRNPA2B1敲低后,AKT3 RNA和蛋白表达均降低;SiAKT3沉默HNRNPA2B1过表达细胞中的AKT3后,HNRNPA2B1过表达引起的增殖被抑制。5.蟾毒灵,去甲斑蝥素,青蒿素,足节香附素A和藤黄酸作用于MM细胞后,HNRNPA2B1蛋白表达降低,其中蟾毒灵,去甲斑蝥素和藤黄酸组蛋白降低明显,表明这些中药单体药物可能通过作用HNRNPA2B1表达抑制MM细胞生长。结论:本研究从临床、细胞和动物层面明确了HNRNPA2B1对MM中的致癌作用,综合运用MeRIP-Seq、RIP-Seq等高通量测序和生化分子生物学技术手段,从表观遗传学层面揭示了 m6A/NRNPA2B1/ILF3/AKT3调控网络。我们的结果显示蟾毒灵,去甲斑蝥素,青蒿素,足节香附素A和藤黄酸影响HNRNPA2B1蛋白表达,HNRNPA2B1可能是MM治疗药物靶点。
吴婉儿[3]（2020）在《基于深度测序及组学研究分析慢性髓系白血病对酪氨酸激酶抑制剂耐药机制研究》文中指出背景和目的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）的广泛应用显着地改善了慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia,CML）患者的缓解率及长期生存。但仍有小部分患者由于药物不耐受和（或）耐药而出现病情进展和难治复发,这也是目前CML临床治疗中的难点和研究热点。而目前患者对TKI产生耐药的机制主要分为BCR-ABL1依赖性和非BCR-ABL1依赖性两种。BCR-ABL1依赖性主要是由于激酶区突变和BCR-ABL1基因扩增,而非BCR-ABL1依赖性的耐药机制就比较复杂。新进研究发现CML耐药患者白血病细胞中存在能量代谢紊乱,糖酵解亢进,且伊马替尼（Imatinib,IM）治疗可一定程度使敏感细胞内能量代谢正常化,而在耐IM的CML细胞中始终维持着高糖酵解代谢状态。探讨CML白血病细胞对IM产生非BCR-ABL1依赖性耐药机制的能量代谢特点以及能量代谢在耐药机制中的作用。以及对TKI耐药和（或）不耐受的CML患者肿瘤相关基因突变进行检测分析。研究方法使用深度测序及液相色谱联用质谱技术（LC-M S）对比不携带BCR-A B L1激酶区突变的对IM耐药CML细胞株K562-R与伊马替尼敏感CML细胞株K562-S间的进行多组学联合分析,剖析细胞内的能量代谢状态,找出关键的调节靶点基因,进行细胞学实验验证,并研究其导致IM耐药的机制。以及基于二代测序技术对TKI耐药和（或）不耐受的CML患者肿瘤相关基因突变进行研究。研究结果首先,发现在K562-R中糖酵解/糖异生途径异常亢进,且其中的6-磷酸果糖激酶-2（PFK-2）与丙酮酸激酶（PK）其中的一种同工酶PKM表达上调,使用C RISPR/Cas9技术建立稳定低表达PKM2的细胞株,发现耐药细胞K562-R在低表达PKM2蛋白后对IM的敏感性得到恢复,证实PKM2的高表达与IM耐药息息相关。此外,在K562-R中谷胱甘肽分解代谢旺盛,且细胞内还原当量NADPH的来源比例发生改变,胞内磷酸戊糖途径代谢减弱,更多的NADPH来源于异柠檬酸转化成α-酮戊二酸过程。在对TKI耐药和（或）不耐受的CML患者基因研究中发现,在耐药患者体内ABL1 KD突变起了主导影响,而CUX1、KIT与GATA2突变则在TKIs不耐受中起着重要作用,其中转录因子基因在TKIs不耐受患者的体内突变数量明显多于TKIs耐药组,提示了转录子基因在TKIs不耐受性中扮演着重要角色。ASXL1与TET2突变与CML患者疾病进展有密切联系,虽然它们均是ARCH突变,但所导致的患者预后不佳的效应是不容忽视的。结论在对IM耐药的细胞中能量代谢紊乱更严重且不能被IM纠正和改善,而PKM2在IM耐药性的产生中起了重要作用。基因组风险评估可改进临床诊断风险分层,在TKIs治疗时代能够更准确地早期识别对TKIs耐药或不耐受的病人。
江珏[4]（2019）在《在T细胞白血病和神经母细胞瘤中靶向癌蛋白MYC的机制研究》文中进行了进一步梳理【目的】急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）是T细胞前体分化受阻并发生异常增殖所致的恶性血液肿瘤,目前尚无有效靶向药物;因此深入研究T-ALL的分子病理机制以探索新型靶向治疗方案具有重要的科学意义和临床价值。癌蛋白MYC异常高表达是驱动T-ALL发生发展的关键分子事件,抑制MYC可有效阻遏T-ALL恶性进展;因此MYC有望成为T-ALL靶向治疗的新靶标。然而转录因子MYC难以直接靶向。本论文旨在阐明癌蛋白MYC在T-ALL中异常高表达的分子机制以探寻间接靶向MYC治疗T-ALL的新策略。我们鉴定出与MYC蛋白特异性结合的有丝分裂激酶?极光激酶B（Aurora B Kinase,AURKB）,研究了AURKB维持MYC蛋白稳态并形成正反馈激活环路的分子机制,评估了AURKB专一性抑制剂下调MYC并抑制T-ALL发生发展的可行性。【方法】通过LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱法）筛选T-ALL中与MYC相互作用的蛋白;RNAi或抑制剂处理细胞探究AURKB调控MYC蛋白稳定性的功能作用;RNA-seq（RNA转录组测序）等技术探究AURKB增强MYC转录活性的功效;体外激酶实验合并同位素标记法检测AURKB直接磷酸化MYC;通过CellToxTM-Green细胞毒性检测方法,从938中FDA批准的小分子化合物库中筛选与AURKB抑制剂（AZD1152）协同致死T-ALL细胞的药物;基于异源移植模型的小鼠实验评价AZD1152协同长春新碱的体内抗白血病活性。【结果】我们从质谱实验结果中筛选鉴定出与MYC特异性结合的有丝分裂激酶?AURKB。在T-ALL细胞中抑制AURKB的活性或其表达均可显着下调MYC蛋白水平,但对其mRNA影响不显着。进一步RNA表达谱分析显示受到AURKB调控的基因群中富集MYC下游调控的靶基因。机制研究表明AURKB通过直接磷酸化MYC丝氨酸67位（S67）抑制GSK3β与MYC结合,阻断MYC进入泛素化-蛋白酶体降解途径,从而稳定MYC蛋白。T-ALL中重要的促癌转录因子MYC/TAL1直接转录激活AURKB的表达,至此AURKB-MYC相互激活形了正反馈调节回路促进T-ALL的发生发展。使用AURKB的专一性抑制剂可打断该环路,加速MYC降解进程,并诱导T-ALL细胞凋亡。此外,我们通过大规模药物筛选实验寻找到显着协同AZD1152致死T-ALL细胞的一线抗白血病药物?长春新碱。由于MYC降解依赖功能正常的E3泛素连接酶FBW7参与,我们发现该联合抗白血病的功能仅发生在FBW7野生型的T-ALL细胞中,且在异源移植模型小鼠的临床前研究中证实了联合用药的抗白血病疗效。【结论】AURKB与MYC特异性结合并直接磷酸化MYC S67位从而增强其蛋白稳定性以及转录活性,同时MYC直接调控AURKB基因转录。AURKB-MYC正反馈环路的发现阐明了AURKB与MYC在T-ALL中异常高表达的分子新机制。据此,靶向抑制AURKB可间接抑制MYC表达,并诱导T-ALL细胞死亡。AZD1152与长春新碱联用可协同杀伤T-ALL细胞。我们的发现为靶向MYC的T-ALL治疗提供了重要新思路。此外,该联合作用仅发生在FBW7野生型的T-ALL中,这些研究结果为T-ALL的靶向治疗提供了关键的生物标志物。【目的】癌基因MYC家族主要包括了C-MYC、MYCN和MYCL基因三个成员,分别编码了C-MYC、N-MYC和L-MYC蛋白。癌基因MYC存在功能互补性,在MYCN非扩增的神经母细胞瘤中,普遍存在着C-MYC的高表达。MYC癌蛋白通过调控细胞周期、细胞代谢、剪接等重要的生物过程以及通过直接或间接辅助其它致癌途径,促进肿瘤细胞的生长和增殖,导致了肿瘤的恶性发展。在小鼠模型中,全身性敲除MYC,能够显着抑制肿瘤的发生发展,预示靶向MYC可作为治疗肿瘤的选择方案。虽然抑制MYC是看起来特别有希望的方案,但是由于MYC作为转录因子,由于其结构的特殊性,缺少小分子药物结合的蛋白结构区域,目前并没有直接靶向MYC的小分子药物,所以间接靶向MYC成了目前研究最多的方案。在本部分课题中,我们利用了协同致死的原理,希望从FDA批准的药物库中筛选能够选择性靶向治疗MYC高表达的肿瘤细胞,并期望初步找到小分子化合物促进MYC高表达肿瘤凋亡的机制。【方法】以MYCN驱动的神经母细胞瘤模式细胞为模型中,对938种FDA批准的药物进行高通量筛选,期望能够从中筛选到协同MYC致死肿瘤的小分子化合物。通过凋亡试剂盒和细胞流式分析仪进行细胞凋亡检测分析;通过RT-q PCR来探究药物处理后细胞中相关靶基因m RNA水平的变化;通过Western Blot检测细胞给药后相关靶蛋白水平的变化;通过RNA干扰实验技术,对文章相关目的基因进行基因干扰沉默,并通过RT-q PCR对基因的m RNA水平,以及Western Blot对蛋白水平进行验证。【结果】我们从938个FDA批准的小分子化合物库中筛选到了蛋白酶体抑制剂BTZ能够显着协同癌基因MYC致死肿瘤细胞,BTZ是第一个被用来治疗多发性骨髓瘤的小分子药物,而对MYC低表达的SHEP细胞没有影响。并且能够促进凋亡蛋白cleaved-caspase3的表达,通过BAX而激活NOXA/TRIB3来促进细胞凋亡的机制。【结论】硼替佐米（BTZ）能够协同致死MYC高表达的肿瘤细胞;并且通过NOXA/TRIB3-BAX通路诱导细胞凋亡。
耿一婷[5]（2019）在《hsa＿circ＿0009361在结直肠癌进展中的作用及机制研究》文中指出结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均位于前列。近年来,尽管CRC的临床治疗技术取得了较大的发展,但晚期患者的预后仍不理想。侵袭与转移是CRC患者死亡的主要原因。因此,有必要寻找CRC生长、转移的驱动因子,探索影响CRC进展的机制,寻找晚期CRC治疗的新靶点。腺瘤性结肠息肉病基因（adenomatous polyposis coli,APC）及其同源产物APC2的功能缺失或β-catenin的致癌性突变是大多数散发性CRC的限速事件。β-catenin在位于侵袭前沿和迁移至基质的肿瘤细胞内表现为高信号,这种差异性Wnt信号传导活性反映了细胞不同的增殖和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）能力,影响肿瘤生长和侵袭转移等恶性行为。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一种环状闭合结构的特殊RNA,可通过竞争性结合相应的微小RNA（micro RNA,mi RNA）,间接调节靶基因的表达,发挥重要的转录后调控作用,即竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）机制。一些circ RNA被发现在CRC中表达异常,并与肿瘤大小、临床分期以及患者预后密切相关。然而,circ RNA作为ce RNA,在CRC的发展进程,尤其在EMT相关性侵袭转移中,与吸附的mi RNA及下游靶基因之间的竞争性调控模式尚不明确,有待进一步研究。本研究分三个部分,第一部分通过circ RNA芯片筛选CRC和癌旁组织中差异表达的circ RNA,并检测hsa＿circ＿0009361在CRC组织和细胞中的表达水平;第二部分通过体外实验和体内实验明确hsa＿circ＿0009361在CRC中的生物学功能;第三部分应用生物信息学方法和细胞实验阐明hsa＿circ＿0009361/mi R-582/APC2构成ce RNA网络,影响CRC进展的机制。第一部分hsa＿circ＿0009361在CRC组织和细胞中的表达特征【目的】明确CRC组织与癌旁组织中circ RNA的表达谱,筛选表达差异最显着的circ RNA。【方法】通过circ RNA微阵列分析,分析10对CRC组织与癌旁非肿瘤组织中circ RNA的表达差异,在20对新鲜CRC组织中应用q RT-PCR方法进行验证。选择表达差异最显着的circ RNA,应用q RT-PCR检测其在各CRC细胞株中的表达水平。【结果】在15095个circ RNA中,有48个circ RNA在CRC组织与癌旁组织的差异表达较为显着（Fold Change>2,P<0.05）,其中40个circ RNA在CRC组织中表达显着上调,8个circ RNA在CRC组织中表达显着下调。应用q RT-PCR方法进行验证,5个表达上调最显着的circ RNA分别为:hsa＿circ＿0000423、hsa＿circ＿0000512、hsa＿circ＿0000511、hsa＿circ＿0000467和hsa＿circ＿0000231;5个表达下调最显着的circ RNA分别为:hsa＿circ＿0009361、hsa＿circ＿0012185、hsa＿circ＿0001455、hsa＿circ＿0000775和hsa＿circ＿0001669。其中,hsa＿circ＿0009361在CRC组织中表达下调最显着（FC=31.25,P<0.001）。与人正常结肠上皮细胞NCM460相比,hsa＿circ＿0009361在CRC细胞HT29,SW480,HCT-116,Lovo,SW48,DLD-1和Caco-2中均显着低表达。【结论】在CRC组织中表达异常上调的circ RNA多于异常下调的circ RNA。hsa＿circ＿0009361在CRC组织中表达下调最为显着,并且在大多数CRC细胞系中其表达水平显着低于正常结肠上皮细胞。第二部分hsa＿circ＿0009361在CRC中的生物学功能【目的】明确hsa＿circ＿0009361在CRC细胞和动物模型中发挥的生物学功能。【方法】构建hsa＿circ＿0009361过表达载体以及覆盖hsa＿circ＿0009361反向剪接区域的si RNA,分别转染HCT-116细胞和Lovo细胞,建立hsa＿circ＿0009361过表达HCT-116细胞株和hsa＿circ＿0009361沉默的Lovo细胞株。应用CCK-8细胞增殖实验检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别用于检测细胞的迁移和侵袭能力。将hsa＿circ＿0009361过表达HCT-116细胞、转染空载体的HCT-116细胞和未经转染处理的HCT-116细胞分别皮下接种到BALB/c裸鼠背部,建立移植瘤模型,定时测量肿瘤体积和重量。将上述三种HCT-116细胞分别通过尾静脉注射到BALB/c裸鼠,建立转移模型,观察对比肺转移瘤的数量。应用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色检测小鼠肿瘤组织中APC2、E-钙粘蛋白和β-catenin的表达水平。【结果】在HCT-116细胞中过表达hsa＿circ＿0009361可以抑制细胞增殖,促进凋亡,并显着降低细胞的迁移和侵袭能力。在Lovo细胞中沉默hsa＿circ＿0009361则可以促进细胞的迁移和侵袭,但对细胞增殖和凋亡水平无明显影响。此外,过表达hsa＿circ＿0009361可以显着升高HCT-116细胞中E-钙粘蛋白的表达水平,降低波形蛋白的表达水平,而沉默hsa＿circ＿0009361则可以显着降低Lovo细胞中E-钙粘蛋白的表达水平,升高波形蛋白的表达水平。在动物实验中,hsa＿circ＿0009361过表达组小鼠肿瘤的平均体积和重量均显着低于对照组,肺转移瘤的平均数量也明显低于对照组。IHC显示,与对照组相比,hsa＿circ＿0009361过表达组小鼠的肿瘤组织中APC2和E-钙粘蛋白的表达水平升高,而β-catenin的表达水平降低。【结论】hsa＿circ＿0009361可以抑制CRC细胞增殖,促进凋亡,并对E-钙粘蛋白和波形蛋白分别具有正性和负性调节作用,通过阻断EMT过程显着降低CRC细胞的迁移和侵袭能力。hsa＿circ＿0009361在体内也能够显着抑制CRC的生长和转移,其机制可能与Wnt/β-catenin通路活性有关。第三部分hsa＿circ＿0009361/mi R-582/APC2构成ce RNA网络影响CRC进展的机制【目的】鉴定hsa＿circ＿0009361吸附的mi RNA及其靶基因,阐明hsa＿circ＿0009361通过ce RNA网络影响CRC进展的机制。【方法】通过生物信息学方法筛选hsa＿circ＿0009361可能结合的mi RNA,q RT-PCR检测其在CRC组织中的表达水平。调节CRC细胞中hsa＿circ＿0009361的表达,观察目标mi RNA表达水平的变化。RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）观察hsa＿circ＿0009361与目标mi RNA在HCT-116细胞中的共定位。RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）和双荧光素酶报告实验验证hsa＿circ＿0009361与目标mi RNA的结合关系。应用生物信息学方法筛选目标mi RNA可能调控的靶基因,RIP和双荧光素酶报告实验验证目标mi RNA与该靶基因的结合关系。调节HCT-116细胞中hsa＿circ＿0009361与目标mi RNA的表达,western blotting检测靶基因的表达水平,TOP/FOP Flash双荧光素酶报告实验评估Wnt/β-catenin通路活性。细胞功能回复实验验证上述结果。【结果】在生物信息学方法筛选出的与hsa＿circ＿0009361具有互补序列的候选mi RNA中,mi R-582在CRC组织中的表达与hsa＿circ＿0009361的表达水平呈负性相关。在CRC细胞中,mi R-582的表达也受到hsa＿circ＿0009361的负性调节。RNA FISH显示hsa＿circ＿0009361和mi R-582共定位于HCT-116的细胞质中。RIP和双荧光素酶报告实验证明,hsa＿circ＿0009361和mi R-582可以直接结合。通过生物信息学方法、RIP和双荧光素酶报告等实验,确定APC2是mi R-582调控的靶基因,APC2的表达以及Wnt/β-catenin通路活性均受到hsa＿circ＿0009361和mi R-582的调控。回复实验证实,mi R-582和APC2均可阻断hsa＿circ＿0009361所介导的CRC细胞在增殖、迁移和侵袭能力方面的改变。【结论】hsa＿circ＿0009361是mi R-582的海绵,Wnt/β-catenin通路抑制剂APC2是mi R-582调控的靶基因。hsa＿circ＿0009361可作为ce RNA,通过竞争性结合mi R-582,间接上调APC2的表达,抑制Wnt/β-catenin通路的活性。hsa＿circ＿0009361在CRC中的异常低表达使其抑癌作用减弱,促进CRC的进展。
二、RNA splicing and SR protein phosphorylation under stress in acute myeloid leukemia (AML)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNA splicing and SR protein phosphorylation under stress in acute myeloid leukemia (AML)（论文提纲范文）
（1）circMTOR在慢性髓系白血病伊马替尼耐药中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 中文综述 |
| 第一部分高通量测序筛选CML耐药相关circRNAs |
| 引言 |
| 1 研究对象与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第二部分高通量测序结果筛选及circMTOR功能验证 |
| 引言 |
| 1 研究对象与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第三部分cicMTOR生信分析及耐药机制研究 |
| 引言 |
| 1 研究对象与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 英文缩写 |
| 博士期间主要工作 |
| 参与课题项目 |
| 致谢 |
（2）m6A识别蛋白HNRNPA2B1通过稳定ILF3 mRNA调节AKT3表达促进多发性骨髓瘤进程（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1. MM的病因及发病机制 |
| 2. MM的治疗 |
| 2.1 一线治疗方案 |
| 2.2 复发治疗方案 |
| 2.3 支持治疗方案 |
| 2.4 中医中药治疗MM |
| 3. RNA m6A修饰与肿瘤发生 |
| 3.1 m6A修饰过程 |
| 3.2 m6A生物学功能 |
| 4. HNRNPA2B1参与m6A修饰 |
| 4.1 HNRNPA2B1基因 |
| 4.2 HNRNPA2B1在肿瘤中的作用 |
| 5. 小结与讨论 |
| 第二章 HNRNPA2B1与MM细胞增殖凋亡的关系 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料 |
| 2.1 临床数据(基因芯片数据) |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 试剂配制 |
| 3. 方法 |
| 3.1 细胞复苏 |
| 3.2 细胞冻存 |
| 3.3 细胞培养及传代 |
| 3.4 重组质粒构建 |
| 3.5 慢病毒包装 |
| 3.6 慢病毒转染 |
| 3.7 稳转细胞株构建 |
| 3.8 WB步骤 |
| 3.9 细胞增殖实验(MTT法) |
| 3.10 统计学分析 |
| 3.11 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.12 免疫缺陷鼠皮下移植瘤实验 |
| 4. 结果 |
| 4.1 HNRNPA2B1基因在MM患者中高表达且与不良预后相关 |
| 4.2 敲低和过表达HNRNPA2B1细胞株的构建 |
| 4.3 HNRNPA2B1基因对MM细胞增殖影响 |
| 4.4 HNRNPA2B1基因敲低后促进MM细胞凋亡 |
| 4.5 HHNRNPA2B1基因过表达后促进小鼠异种移植瘤生长 |
| 5. 小结与讨论 |
| 第三章 HNRNPA2B1促进MM细胞增殖作用机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 试剂配制 |
| 3. 方法 |
| 3.1 RNA提取 |
| 3.2 RNA逆转录 |
| 3.3 RT-qPCR |
| 3.4 RIP实验方法 |
| 3.5 免疫荧光实验 |
| 3.6 RNA降解实验 |
| 3.7 电穿孔实验 |
| 3.8 m6A甲基化测序(MeRIP-Seq) |
| 4. 结果 |
| 4.1 m6A甲基化测序结果 |
| 4.2 HNRNPA2B1通过识别ILF3 RNA上的m6A调控ILF3表达 |
| 4.3 HNRNPA2B1稳定ILF3 RNA |
| 4.4 ILF3促进MM增殖抑制其凋亡 |
| 4.5 ILF3与AKT3 RNA结合调控其表达 |
| 4.6 ILF3稳定AKT3 RNA |
| 4.7 HNRNPA2B1通过促进ILF3介导的AKT3表达促进MM发展 |
| 5. 小结与讨论 |
| 第四章 调控HNRNPA2B1的传统中药单体药物筛选 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 药物储存液配制 |
| 2.5 实验仪器 |
| 3. 方法 |
| 3.1 MTT法检测药物对细胞增殖影响及半数抑制浓度(IC_(50)) |
| 4. 结果 |
| 4.1 中药单体药物对ARP1细胞中HNRNPA2B1蛋白表达影响 |
| 4.2 蟾毒灵,去甲斑蝥素和藤黄酸对MM细胞抑制实验 |
| 4.3 蟾毒灵,去甲斑蝥素和藤黄酸对H929细胞中HNRNPA2B1表达影响 |
| 5. 小结与讨论 |
| 全文总结和展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 文献综述 RNA N6-甲基化修饰在胂癯中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）基于深度测序及组学研究分析慢性髓系白血病对酪氨酸激酶抑制剂耐药机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 对伊马替尼耐药的K562-R细胞株的诱导与鉴定 |
| 引言 |
| 1 研究对象与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 第二章 慢性髓系白血病细胞系多组学研究 |
| 引言 |
| 1 研究对象与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 糖酵解关键酶PKM2调控CML耐药机制初步探讨 |
| 引言 |
| 1 研究对象与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 基于二代测序技术分析TKIs耐药或不耐受CML患者的肿瘤相关基因突变 |
| 引言 |
| 1 研究对象与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 硕士期间主要工作 |
| 致谢 |
（4）在T细胞白血病和神经母细胞瘤中靶向癌蛋白MYC的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 第一部分 极光激酶B与癌蛋白MYC正反馈环路促急性T淋巴细胞白血病发生发展的机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一节 极光激酶 B（AURKB）与MYC结合并维持其蛋白稳定性 |
| 实验材料与实验方法 |
| 结果 |
| 第二节 AURKB直接磷酸化MYC增强其稳定性 |
| 实验材料与实验方法 |
| 结果 |
| 第三节 转录因子 MYC/TAL1 共同转录激活 AURKB形成正反馈调节环路 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 AURKB抑制剂与VCR协同诱导 T-ALL 细胞凋亡 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第五节 AURKB促进FBW7泛素化降解稳定其下游靶蛋白 MCL-1 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第六节 AZD1152 与 VCR 协同抑制 T-ALL 发病进程 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 硼替佐米(Bortezomib)选择性致死 MYC 高表达肿瘤细胞 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 已发表及待发表论文 |
| 致谢 |
（5）hsa＿circ＿0009361在结直肠癌进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1.分析hsa_circ_0009361在CRC组织和细胞中的表达特征 |
| 2.明确hsa_circ_0009361在CRC中的生物学功能 |
| 3.阐明hsa_circ_0009361/miR-582/APC2 构成ceRNA网络影响CRC进展的机制 |
| 参考文献 |
| 第一部分 hsa_circ_0009361 在结直肠癌组织和细胞中的表达特征 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 hsa_circ_0009361 在结直肠癌中的生物学功能 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 hsa_circ_0009361/miR-582/APC2 构成ceRNA网络影响结直肠癌进展的机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 circRNA在肿瘤中的功能及临床意义 |
| 参考文献 |
| 附录一 结直肠癌临床资料 |
| 附录二 缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 攻读博士期间参与的课题研究 |
| 致谢 |
四、RNA splicing and SR protein phosphorylation under stress in acute myeloid leukemia (AML)（论文参考文献）
- [1]circMTOR在慢性髓系白血病伊马替尼耐药中的机制研究[D]. 曲红. 南方医科大学, 2021
- [2]m6A识别蛋白HNRNPA2B1通过稳定ILF3 mRNA调节AKT3表达促进多发性骨髓瘤进程[D]. 姜凤洁. 南京中医药大学, 2021(02)
- [3]基于深度测序及组学研究分析慢性髓系白血病对酪氨酸激酶抑制剂耐药机制研究[D]. 吴婉儿. 南方医科大学, 2020
- [4]在T细胞白血病和神经母细胞瘤中靶向癌蛋白MYC的机制研究[D]. 江珏. 武汉大学, 2019(06)
- [5]hsa＿circ＿0009361在结直肠癌进展中的作用及机制研究[D]. 耿一婷. 苏州大学, 2019(06)