一、使用一次性输液器矫正瓶内负压（论文文献综述）
王滕滕[1]（2021）在《白藜芦醇抑制肾草酸钙结石形成及其机制的研究》文中研究指明研究背景与研究目的肾结石是泌尿外科最常见的病种之一,国内的患病率和复发率均较高。庞大的患病人群已成为一个明显的社会和医疗负担,对临床和科研工作者更是一个严峻的挑战。在既往的研究中,我们通过分析互联网大数据,了解到大众对肾结石疾病的认知状况和健康需求,其中肾结石的药物预防和治疗是大众关注的一大热点。因而,如何更好的通过药物防治肾结石,是目前医学研究亟待解决的问题。当前,对于肾结石的研究面临许多的问题,其中之一是缺乏精确的分析手段。超级计算机和相应计算软件的发展为研究原子和分子之间的相互作用提供了新的途径。与传统的生物实验相比,计算机上进行的计算和模拟可以实现在更微观水平上进行药物作用机制的研究,同时结果的精准度和可靠性都令人满意。基于此,本研究第一部分,将利用量子力学中的第一性原理,研究钙原子（Ca）在白藜芦醇分子（C14H12O3）表面的吸附位置、吸附方式、吸附能量等基础问题,力图从微观结构上阐明白藜芦醇抑制草酸钙结石形成的机制,为以白藜芦醇为基础的药物研发提供思路和依据。网络药理学借助实验数据或文献、数据库,可模拟构建机体内的分子关联网络模型,探寻药物的生物学靶点和分子机制提供了一种新型手段。目前国内外尚无白藜芦醇（Resveratrol,RSV）防治草酸钙肾结石的系统研究,仅有的几个体外实验初步表明RSV具有抑制结石形成的潜能,然而其生物机制尚不明确。本研究第二部分,将利用网络药理学的方法,筛选出RSV抗肾结石的潜在作用靶点,并对其生物过程及作用通路进行预测,力图为进一步的生物实验提供理论支持和指导。单一的计算模拟分析结果可能会与药物在机体内的实际作用状况有偏差,因此,系统的细胞及动物水平的实验验证是有必要的,这又为计算模拟的预测结果提供可靠的证据。在本研究第三、四部分中,我们将以此前两部分研究为基础,重点做RSV防治肾草酸钙结石的细胞及动物研究。研究表明,过饱和的草酸钙晶体可诱发肾脏出现氧化应激损伤,导致肾小管上皮细胞的胞膜结构和功能发生改变,进而促进晶体的粘附和聚集,而晶体的粘附会不断刺激肾脏,反馈生成更多的活性氧,形成一个恶性循环,最终导致结石的生长。因而,肾脏的氧化应激损伤被认为是结石形成的重要机制,而抑制草酸钙晶体引起的肾脏损伤将有利于预防肾结石的形成。通过前两部分研究,我们对RSV防治肾结石的作用机制进行了预测,发现RSV可能通过多条通路抑制结石的形成,其中SIRT1/FOXO3a通路介导的肾脏氧化应激反应可能在其中发挥重要作用。既往研究发现RSV可以激活沉默信息调节因子1（SIRT1）,促使其与叉头框蛋白O3a（FOXO3a）结合,从而调节其转录活性,进而缓解过氧化氢、高糖等诱导的肾脏氧化应激损伤。据此,我们提出以下假说,草酸钙晶体可以抑制SIRT1的表达,而SIRT1的减少可以诱导乙酰化FOXO3a的表达增加,进而引发一系列氧化应激反应。RSV通过激活SIRT1,增强其脱乙酰化活性而调节FOXO3a的转录活性,促使抗氧化酶的生成,清除活性氧（ROS）,从而抑制由草酸钙晶体诱发的肾小管上皮细胞氧化应激反应,发挥其抑制结石形成的作用。目前,国内外尚无相关的系统研究。本研究将通过体外和体内生物实验,力图为RSV防治肾草酸钙结石提供有价值的实验依据。研究方法1.基于第一性原理的白藜芦醇对钙的吸附性能研究本实验采用密度泛函理论为第一性原理计算方法,VASP软件包,计算了白藜芦醇（C14H12O3）、草酸（C2H2O4）对钙的吸附作用性能。其中选择广义梯度近似（GGA）下的PBE泛函计算交换关联相互作用,赝势描述方法为投影缀加平面波（PAW）。K点划分为5×5×1,平面波截断动能为500 eV。结构优化阶段采取共轭梯度算法,收敛标准为两个离子步之间总能量差小于0.0001 eV,同时用DFT-D3 Grime方法对其相互作用进行了矫正。吸附过程中电荷转移量以Bader电荷进行分析。Ca在分子表面的吸附能为Eads,定义公式为:Eads=Esub+Ca-Esub-ECa计算得到的Eads若为负值,表面二者作用时发生放热反应,负值越大,吸附结构越稳定。计算平台由山东大学超级计算中心集群系统提供。1.1 Ca吸附于C14H12O3表面的吸附能分析首先获取白藜芦醇的分子结构式,利用计算机完成对C14H12O3的结构优化,获取其能量最稳定的分子优势构象。根据白藜芦醇的分子结构,选取5个位点作为计算C14H1203吸附Ca的初始位置,计算其吸附能并进行比较。1.2吸附体系的稳定构象为了进一步验证吸附体系的稳定性,我们将计算并描述吸附Ca后,C14H1203结构的变化。1.3 Ca吸附于C14H1203体系的电子结构绘制电荷密度差分图,可直观地显示Ca吸附前后,吸附体系的电荷密度重新分布状况。1.4 Ca吸附于C14H1203与草酸（C2H2O4）上的吸附能比较通过构建稳定的吸附体系并计算吸附能,对比C14H12O3与C2H2O4对Ca的吸附作用。2.基于网络药理学的白藜芦醇防治肾结石的作用机制研究2.1获取白藜芦醇的化学结构及分子、药理特性在PubChem数据库中检索关键词“resveratrol”,获取白藜芦醇的2D及3D结构图。利用TCMSP数据库,检索获取白藜芦醇的分子及药理学特征数据。2.2预测白藜芦醇的潜在作用靶点于 PharmMapper、TCMSP、TCM@TAIWAN、CTD、ETCM 等数据库平台分别检索并结合文献,剔除重复数据,整合后获取白藜芦醇的潜在作用靶点。2.3筛选肾结石疾病相关的靶点于GeneCards、DisGeNE、OMIM等数据库平台分别检索关键词“nephrolithiasis”、“kidney stone”,并查找文献,剔除重复数据,整合后获取获取肾结石疾病相关的靶点。2.4筛选白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点绘制韦恩图,获取药物与疾病相关作用靶点的交集,即白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点。2.5构建白藜芦醇抗肾结石的靶点蛋白质互作网络利用STRING 11.0网络平台,输入获取的交集靶点信息,靶点来源中选项设定为人类,自定义互作阈值为0.9,隐藏离散节点,生成蛋白质互作网络图。2.6蛋白质互作网络的拓扑分析利用可视化软件Cytospace,构建“药物-靶点-疾病”作用网络,同时借助其网络分析功能和MCODE插件,筛选出互作网络中的关键靶点和核心模块。2.7功能富集分析利用Metascape及Omicshare平台,将获取的白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因和基因组数据库（KEGG）通路富集分析,并将结果进行可视化。2.8白藜芦醇与核心靶点的分子对接验证进行分子对接实验时,先于PDB数据库检索获取核心靶点对应的蛋白结构,然后利用Pymol软件及AutoDock Vina软件,模拟分析白藜芦醇与靶点蛋白的结合方式,计算其亲和能。3.白藜芦醇体外对草酸钙结石晶体粘附的影响3.1激光共聚焦显微镜下观测体外培养肾小管上皮细胞（HK-2）,实验分四组:第1组:空白对照组;第2组:CaOx处理组;第3组:CaOx+低浓度白藜芦醇组（40μM）;第4组:CaOx+高浓度白藜芦醇组（80μM）。染色后,激光共聚焦显微镜下观测细胞形态及晶体粘附状况。3.2细胞活力检测细胞培养、分组、建模方法同步骤1,当达到作用时间后,加入CCK8试剂,在450 nm处测量吸光度。3.3透明质酸的检测应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分组检测各组透明质酸（HA）的含量。3.4乳酸脱氢酶（LDH）的检测应用分光光度计分组检测各组乳酸脱氢酶的释放量。4.白藜芦醇通过调节SIRT1/FOX03a抑制草酸钙结石诱发的肾脏氧化应激损伤4.1白藜芦醇对草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激指标（SOD、MDA、ROS、CAT）、骨桥蛋白（OPN）、肾损伤分子1（KIM-1）及SIRT1表达的影响（1）细胞模型的构建使用67μg/cm2草酸钙（CaOx）结晶对HK-2细胞连续刺激24小时。建模前1小时给予不同浓度的白藜芦醇（40,80μM）,当CaOx与HK-2相互作用24h后,对细胞及培养液进行收集。实验分为4组:空白对照组;CaOx处理组;CaOx+低浓度白藜芦醇组（40μM）;CaOx+高浓度白藜芦醇组（80μM）。（2）用分光光度计分别检测HK-2细胞中氧化应激指标超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及活性氧（ROS）含量,SIRT1的脱乙酰化活性;Western blot检测SIRT1、FOXO3a、过氧化氢酶（CAT）表达水平;免疫共沉淀检测乙酰化FOXO3a的蛋白水平。（3）用Western blot和荧光定量PCR测定OPN、KIM-1的蛋白及基因水平。4.2 SIRT1对草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激指标的影响（1）分组与处理:体外培养肾小管上皮细胞,分别用SIRT1 siRNA和CON siRNA转染。实验分为4组:CaOx+转染CON siRNA组;CaOx+转染CON siRNA+RSV 处理组;CaOx+转染 SIRT1 siRNA;CaOx+转染 SIRT1 siRNA+RSV处理组。（2）用分光光度计分别检测HK-2细胞中SOD活性、MDA含量及ROS含量;Western blot检测SIRT1、FOXO3a、CAT蛋白表达水平;免疫共沉淀检测乙酰化FOXO3a的蛋白水平。（3）用Western blot和荧光定量PCR测定OPN、KIM-1的蛋白及基因水平。4.3白藜芦醇对大鼠草酸钙结石动物模型代谢指标、结晶沉积及肾组织病理的影响（1）24只Wistar大鼠随机分为3组分别处理:空白对照组（自由采食、饮水+0.9%生理盐水灌胃）,造模组（自由采食+1%乙二醇自由饮水+0.9%生理盐水灌胃）;白藜芦醇干预组（自由采食+1%乙二醇自由饮水+1Omg/kg/dRSV灌胃）。（2）大鼠标本的留取:处死前1天,用代谢笼法分别收集大鼠24h尿液。麻醉后,心脏内取血。解剖肾脏,完成HE染色及蛋白免疫组化染色。（3）肾脏功能及尿液生化检测:临床生化分析仪测定血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）,尿（钙、磷、钾）;比色法测定尿草酸含量。（4）HE染色后观察肾脏的结晶沉积和病理改变。4.4白藜芦醇对大鼠草酸钙结石动物模型肾脏氧化应激指标、OPN、KIM-1及SIRT1表达的影响（1）采用Western blot方法以及免疫沉淀的方法分别检测各组大鼠肾脏中SIRT1、FOXO3a、CAT及乙酰化FOXO3a的表达,并用分光光度计检测SOD活性,MDA含量及SIRT1的脱乙酰活性;（2）用免疫组织化学染色、Western blot和荧光定量PCR测定OPN、KIM-1的蛋白及基因水平。研究结果1.基于第一性原理的白藜芦醇对钙的吸附性能研究1.1 Ca吸附于C14H1203上的吸附能分析首先获取白藜芦醇的结构式,完成对C14H12O3的结构优化,获取了其能量最稳定的优势分子构象。根据白藜芦醇的分子结构,选取了 5个位点作为计算C14H12O3吸附Ca的初始位置。5个原始构型分别为:（a）Ca位于3,5-羟基苯环中央正上方;（b）Ca位于3-羟基的氧原子正上方;（c）Ca位于5-羟基的氧原子正上方;（d）Ca位于4’-羟基的氧原子正上方;（e）Ca位于4’-羟基苯环中央正上方。计算结果显示在所有的原始构型中,其吸附能均为负值。在五个初始位点中,构型（a）的吸附能最小,为-0.874 eV,吸附距离为2.39A。1.2吸附体系的稳定构象吸附Ca之后,C14H1203的结构发生驰豫,其侧视图和俯视图直观地显示了Ca的吸附对C14H1203几何结构的影响。1.3 Ca吸附于C14H12O3体系的电子结构吸附时,Ca和C14H1203的碳原子之间存在着电荷聚集,同时Ca背向C14H1203的另一侧存在电荷数目的减少,这表明在吸附过程存在着Ca向C14H12O3的电子转移。进一步的Bader电荷分析表明,吸附过程中有0.855 e-电荷从Ca转移到了C14H12O3,这就是Ca在C14H12O3表面吸附成键的主要特征。1.4 Ca吸附于C14H1203与C2H2O4上的吸附能比较成功构建了草酸（C2H2O4）吸附Ca的稳定构象,计算吸附体系的吸附能为-0.68 eV,大于Ca/C14H1203体系的-0.874 eV,提示C14H1203可竞争性抑制草酸钙的生成。2.基于网络药理学的白藜芦醇防治肾结石的作用机制研究2.1获取白藜芦醇的化学结构及分子、药理特性获取了白藜芦醇的12个主要分子及药理学特征数据,涵盖药物的分子量（228.26D）、生物利用度（19.07%）及类药性（0.11）等指标。2.2预测白藜芦醇的潜在作用靶点于 PharmMapper、TCMSP、TCM@TAIWAN、CTD、ETCM 等数据库平台分别检索并结合文献,剔除重复数据,整合后共获取白藜芦醇的潜在作用靶点421 个。2.3筛选肾结石疾病相关的靶点分别于 GeneCards、DisGeNE、OMIM 等数据库检索关键词“nephrolithiasis”、“kidney stone”,并结合文献,剔除重复数据,整合后共获取获取肾结石疾病相关的靶点1434个。2.4筛选白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点将白藜芦醇潜在作用靶点与肾结石疾病相关靶点进行交集映射,共获取白藜芦醇防治肾结石的潜在靶点115个,结果以韦恩图的形式呈现。2.5构建白藜芦醇抗肾结石的靶点蛋白质互作网络蛋白质互作网络（PPI）网络包括115个作用节点,1601条作用通路,平均的节点度为27.8。2.6蛋白质互作网络的拓扑分析依据标准,利用Cytoscape的网络分析功能,筛选出了白藜芦醇抗肾结石PPI互作网络中的关键靶点,共9个,分别为:AKT1、CAT、FOXO3a（或FOXO3）、JUN、MAPK1、SIRT1、SOD1、T53、VEGFA。进一步利用 Cytoscape 的 MCODE插件,在网络中共筛选出了 3个核心模块。2.7 GO及KEGG功能富集分析GO功能富集分析结果显示,富集于生物过程（BP）的条目共有5025个,涉及细胞过程、代谢进程、生物调节、应激反应、生物过程调节等;富集于细胞成分（CC）的条目共412个,涉及细胞器、生物膜内环境、蛋白复合体、细胞外区域、突触等;富集于分子功能（MF）的条目共575个,涉及催化活性、分子功能调节器、抗氧化活性、分子换能器活性、转运体活性等。这些功能通路多与机体内的氧化应激、炎症、代谢、损伤修复等进程密切相关,提示白藜芦醇可能通过调控上述生物进程而发挥其防治肾结石的潜能。KEGG通路富集分析结果表明,富集的信号通路共233条,靶点主要富集于氧化应激、凋亡、炎症、细胞周期的调控等多方面,结合文献分析,这些靶点与SIRT1/FOXO3a信号通路密切相关,提示白藜芦醇可能是通过调控SIRT1/FOXO3a通路介导的肾脏氧化应激反应而发挥防治肾结石的作用。2.8白藜芦醇与核心靶点的分子对接验证AKT1与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Gly159、Gly157、Glu191与RSV形成氢键相互作用,Asp292、Lys179、Va1164、Lys158、Lys163、Gly162、Phe161、Ile186、His194、Thr195 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-7.9 kcal/mol。CAT与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Ala133、Arg112、Arg365、Thr361与RSV形成氢键相互作用,His362、Arg72、Ser114、Phe132、Gly131、Gly147、Va1146、His75、Tyr358、Va173 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-9.0 kcal/mol。FOXO3a与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Gly198、Leu180、Ser200与RSV形成氢键相互作用,Ser181、Tyr184、Asp199、Ala204、Lys207 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-5.6 kcal/mol。JUN与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Asn17与RSV形成氢键相互作用,Tyr18、Ala15、Lys14与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-4.9kcal/mol。MAPK1与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Met108、Asp167、Asn154、Lys54 与 RSV 形成氢键相互作用,Cys166、Leu156、Leu107、Asp106、Ala52、Gln105、Va139 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-7.2 kcal/mol。SIRT1与RSV的结合模式:氨基酸残基Lys304与RSV形成氢键相互作用,Glu300、Glu214、Asp298、Pro212、Ala295、Tyr301、Asp289、Pro291、Asp292与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-7.5 kcal/mol。SOD1与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Lys23与RSV形成氢键相互作用,Gly33、Va129、Trp32与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-5.2 kcal/mol。TP53与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Leu330、Leu348与RSV形成氢键相互作用,Asn345、Phe338、Phe341、Arg342、Arg344与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-6.1 kcal/mol。VEGFA与RSV 的结合模式:氨基酸残基 Tyr45、Ile43、Glu44、Glu42、Phe36、Pro40 与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-5.4 kcal/mol。3.白藜芦醇体外对草酸钙结石晶体粘附的影响3.1激光共聚焦显微镜下观察结果镜下观察,白藜芦醇可修复肾小管上皮细胞形态,减少草酸钙结石晶体在细胞表面的粘附。3.2细胞活力检测白藜芦醇可以减轻CaOx晶体对HK-2细胞的毒性作用,细胞活力出现显着升高（P<0.05）,显示白藜芦醇具有抑制细胞凋亡或坏死的作用。3.3透明质酸含量的变化空白对照组的HA含量最低,草酸钙处理组HA浓度明显升高（P<0.05）,而白藜芦醇组HA浓度明显低于对照组（P<0.05）。3.4乳酸脱氢酶（LDH）的检测空白对照组的LDH含量最低,加入CaOx晶体后,LDH含量显着增加（P<0.05）。白藜芦醇干预后,LDH含量明显下降（P<0.05）,提示白藜芦醇具有显着的细胞修复功能。4.白藜芦醇通过上调SIRTl/FOXO3a可抑制草酸钙结石诱发的肾小管上皮细胞氧化应激损伤,进而抑制结石形成4.1白藜芦醇改善了草酸钙晶体诱发的肾小管上皮细胞氧化应激损伤并增加了SIRT1的表达4.1.1 HK-2 细胞中 SOD、CAT、ROS 及 MDA 的变化草酸钙晶体干预后,HK-2细胞中SOD、CAT均显着下降（P<0.05）,而ROS、MDA显着上升（P<0.05）。白藜芦醇干预后,SOD活性及CAT表达明显增加（P<0.05）,ROS总量及MDA含量下降明显（P<0.05）。4.1.2 HK-2细胞中OPN、KIM-1的变化草酸钙晶体干预后,HK-2细胞中OPN、KIM-1表达量显着上升（P<0.05）。白藜芦醇干预后,OPN、KIM-1表达量明显下降（P<0.05）。4.1.3 HK-2细胞中SIRT1及其脱乙酰活性、FOXO3a、乙酰化FOXO3a的变化白藜芦醇能明显逆转草酸钙晶体诱发的SIRT1蛋白表达减少的趋势,增加SIRT1脱乙酰化活性及FOXO3a的表达（P<0.05）。同时白藜芦醇组细胞中乙酰化FOXO3a的表达较单纯草酸钙组明显下降（P<0.05）。4.2 SIRT1参与了对草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激反应的调控4.2.1 SIRT1RNA干扰后,HK-2细胞中SOD、CAT、ROS及MDA等氧化应激指标及FOXO3a、乙酰化FOXO3a的变化与CON siRNA转染组相较,SIRT1 siRNA转染的肾小管上皮细胞中SIRT1的基因和蛋白表达明显减少（P<0.05）,SOD活性、CAT含量及FOXO3a表达下降（P<0.05）,ROS总量、MDA含量及乙酰化FOXO3a表达升高（P<0.05）。白藜芦醇干预后,CON siRNA转染组细胞中各项氧化应激指标改善明显,FOXO3a蛋白表达水平增加而乙酰化FOXO3a表达减少（P<0.05）;与之相反,SIRT1 siRNA转染组细胞中各项氧化应激指标改善不明显,FOXO3a表达增加及乙酰化FOXO3a表达减少不明显（P<0.05）。4.2.2 SIRT1RNA干扰后,HK-2细胞中OPN、KIM-1的变化与CON siRNA转染组相较,SIRT1 siRNA转染组细胞中OPN及KIM-1的表达量增加（P<0.05）;在白藜芦醇干预后,两组细胞中OPN及KIM-1的表达量均出现了不同程度的下降,但SIRT1 siRNA转染的细胞组其表达量仍较高（P<0.05）。4.3白藜芦醇改善了草酸钙大鼠肾脏的代谢指标、结晶沉积及肾组织病理异常白藜芦醇可降低草酸钙大鼠模型的血尿素氮和肌酐,减少尿中草酸、钙、磷的含量（P<0.05）。同时,白藜芦醇可以减少草酸钙大鼠肾脏的晶体沉积,改善其病理异常,具有抑制结石形成和保护肾脏的作用。4.4白藜芦醇改善了草酸钙大鼠肾脏的氧化应激损伤并增加了 SIRT1的表达4.4.1大鼠肾脏中SOD、CAT及MDA的变化与正常对照组大鼠相较,造模组大鼠肾脏SOD活性明显降低,CAT表达明显减少,而MDA的含量明显增加（P<0.05）。白藜芦醇治疗后,SOD活性及CAT表达明显增加,而MDA的含量明显减少（P<0.05）。4.4.2大鼠肾脏中OPN及KIM-1的变化与细胞实验一致,正常对照组大鼠肾脏组织中OPN的表达最少,造模组大鼠肾脏组织中OPN表达明显增加（P<0.05）。白藜芦醇干预后,与造模组相比,OPN表达明显减少,且与治疗剂量呈正比（P<0.05）。KIM-1的表达水平与OPN相似。4.4.3大鼠肾脏中SIRT1及脱乙酰活性、FOXO3a、乙酰化FOXO3a的变化与正常对照组大鼠相较,造模组大鼠肾脏SIRT1及FOXO3a表达明显减少,SIRT1脱乙酰化活性降低,而乙酰化FOXO3a表达明显增加。白藜芦醇治疗后,大鼠肾脏上述指标发生逆转。研究结论1.Ca原子可稳定吸附于C14H1203分子表面,竞争性抑制草酸钙的生成,这是首次从原子和分子角度阐述C14H1203防治草酸钙肾结石的机理,为以白藜芦醇为基础的药物研发提供了思路和依据。2.网络药理学分析结果提示白藜芦醇可以通过多靶点、多通路发挥防治肾结石的药效。SIRTl/FOXO3a通路介导的肾脏氧化应激反应可能在白藜芦醇抗肾结石的过程发挥重要作用,这为进一步的生物实验提供了重要参考。3.体外实验证实白藜芦醇可以抑制草酸钙晶体与肾小管上皮细胞的粘附,增加细胞活力,减少受损细胞透明质酸及乳酸脱氢酶的分泌,具有抑制细胞凋亡及修复受损细胞的潜能。4.白藜芦醇具有抑制草酸钙结石形成的药理作用,其机制可能是通过调控SIRT1/FOXO3a,抑制草酸钙晶体诱发的肾脏氧化应激损伤来实现的。
高德艳,蒋红梅,王贤华,石玉琦,文霞,李力[2]（2008）在《产妇发生乳头皲裂的原因及护理》文中指出收集整理产妇乳头皲裂的发病原因、预防、治疗方法及护理,供同行借鉴。
石秋连,蔡玉娇,陈艳敏,黎连花,李小杏,梁棉[3]（2006）在《Y型乳头矫正器的研制及临床应用》文中研究指明目的探讨凹陷或扁平乳头的有效矫正方法及Y型乳头矫正器的矫正效果。方法将66例乳头凹陷或乳头扁平的初产妇分为观察组穴38例雪,用自行研制的乳头矫正器进行矫正。对照组穴28例雪用一次性注射器抽吸矫正。结果2组在乳头伸展长度、吸乳器每次持续作用时间、产妇舒适度、乳头矫正时间、总使用次数上有显着性差异穴p<0.05雪。结论自制的Y型乳头矫正器矫正乳头凹陷和乳头扁平效果优于一次性注射器抽吸矫正。
范植蓉,王虹,陈红宇,丁永艳,朱文惠,杨艳芳[4]（2004）在《侧孔抽吸式负压吸乳器的应用性研究》文中指出目的探讨扁平或凹陷乳头的有效矫正方法及侧孔抽吸式负压吸乳器的效果。方法将 12 2例乳头扁平或凹陷的初产妇分为三组。观察组 （38例 ）用自行研制的侧孔抽吸式负压吸乳器矫正 ,对照 1组 （42例 ）用一次性注射器抽吸矫正 ,对照 2组 （42例 ）用市售吸乳器矫正。结果矫正后乳头伸展长度 ,乳腺管疏通数 ,吸乳器每次持续作用时间、使用次数等指标观察组与对照 1、2组比较 ,差异有显着性意义 （均P <0 .0 1）。矫正后哺乳成功率观察组与对照 1组比较 ,差异无显着性意义 （P >0 .0 5 ） ;与对照 2组比较 ,差异有显着性意义 （P >0 .0 5 ） ;矫正过程中产妇舒适度观察组与对照 1组比较 ,差异有显着性意义 （P <0 .0 1） ;与对照 2组比较 ,差异无显着性意义 （P >0 .0 5 ）。结论侧孔抽吸式负压吸乳器矫正扁平或凹陷乳头的效果优于注射器抽吸和市售吸乳器矫正法 ,在使用过程中能减轻产妇痛苦 ,使产妇感觉舒适 ,乐于接受 ;矫正后产后早期哺乳成功 ,增强母乳喂养信心 ,提高母乳喂养率。
李丽,杜长茹[5]（2004）在《临床使用一次性医疗用品遇到的问题及对策》文中研究表明随着社会的进步,人们的自我保护意识不断提高,医院感染越来越受到人们的重视。为了防止医院内感染,一次性医疗用品逐步取代了过去反复使用的医疗用品。一次性医疗用品的使用,给临床护士带来了简捷、方便。同时,也带来了新的问题。本文就使用一次性医疗用品过程中遇到的问题提出对策。
李怀兰,李霞[6]（2004）在《使用一次性输液器矫正瓶内负压》文中指出
张丽琴[7]（2017）在《洗胃技术用于双颌手术后呕吐的预防》文中研究指明目的探讨改良洗胃技术用于正颌术后患者因胃内积血而引发恶心、呕吐的预防效果。方法选择2012年1月2015年12月期间实施双颌截骨手术的50例患者,按手术的单双号顺序随机分为对照组和观察组。对照组采用传统胃肠减压方法,观察组采取手术当日及次日鼻饲前各给予一次5%葡萄糖氯化钠溶液500 ml洗胃,并配合正确的胃肠减压技术,以减轻胃内积血所导致的术后呕吐反应,观察并记录患者术后24 h内发生恶心、呕吐的情况。结果与对照组比较,观察组术后呕吐的发生率明显下降（P<0.05）。结论洗胃可有效预防正颌患者术后呕吐的发生,提高了术后患者的舒适度,降低了治疗及护理的风险,同时也体现了人文护理及优质护理的内涵。
雷明,王燕,周婉平[8]（2013）在《乳头凹陷者母乳喂养的研究进展》文中进行了进一步梳理母乳喂养是世界卫生组织和联合国儿童基金会全力倡导的科学育儿方法,也是保障儿童健康成长的根本措施[1-2]。推广母乳喂养对婴儿、母亲及家庭、社会都有积极作用[3]。文献[4]报道,乳头正常者与异常者的纯母乳喂养率分别为85.8%与15%。如何提高乳头异常者的母乳喂养率,是母乳喂养工作的重点与难点。在乳头异常者中乳头凹陷占多数,且对母乳喂养影响最大,因此本文对近年来关于乳头凹陷者母乳喂养方面的研究进行综述。
卢丽玲[9]（2020）在《宫外孕破裂大出血术中自体血回收手术配合技巧》文中认为宫外孕是临床常见的一种异位妊娠,是指受精卵在子宫体腔之外着床,根据着床部位的不同,分为宫颈妊娠、卵巢妊娠、腹腔妊娠、输卵管妊娠[1]。宫外孕患者由于孕囊破裂,发生大出血的概率较高,若不能给予及时、有效的救治,极易因失血性休克而死亡[2]。异位妊娠破裂大出血、完全性前置胎盘、胎盘早剥、产后大出血等是妇产科危急重症,出血迅猛,需输液、输血、外科止血等抢救措施。利用血液回收机回收、处理术野无菌自体血已成为抢救急性大出血患者的一种常规手段,据统计,近年来创伤急救手术中32.6%～59.5%的患者死于失血性休克。
刘晋萍[10]（2014）在《减少围体外循环期的血制品输入对低体重先天性心脏病患儿的临床研究》文中研究说明研究总体思路在低体重先天性心脏病患儿体外循环术中所应用的血液制品主要是库存红细胞（PRBC）和新鲜冰冻血浆（FFP）。血制品对手术后患者所带来的不良影响已被大量研究所证实。能否合理安全地减少或避免血液制品在低体重先天性心脏病患儿体外循环术中的应用成为本课题的研究重点。在国外的医学中心已有类似的研究报告,但由于中西方文化、人种、社会经济等众多因素的影响,使得我们很难照搬国外中心的临床研究结果。因此,我们必须探讨适合我们国情的围体外循环期用血指南,并为国内同行提供科学合理的临床用血依据。本研究将分成以下两大部分：第一部分拟探讨围体外循环期的改良节约用血策略对低体重先天性心脏病患儿的安全性。研究将分成两个阶段：第一阶段首先选择符合入选标准的低体重先天性心脏病患儿,根据采用传统体外循环预充库血方案或采用无库血预充（改良节约用血策略）方案将患儿分成传统组和改良组。对两组患儿术前、术中及术后一系列临床资料进行收集和统计分析,明确实施改良节约用血策略在减少库存红细胞用量及改善患儿预后方面的临床效果,以进一步证实该策略的可行性和安全性。第二阶段根据实施无库血预充方案的改良组患儿在手术治疗过程中和手术后的输血情况,再进一步分成免输血组、术中输血组和术后输血组。依据三组患儿的临床数据的统计结果初步总结出：①低体重先天性心脏病患儿术中的安全血液稀释度；②哪些患儿适宜进行免输血体外循环手术；③评价术中、术后输血与免输血组患儿的近期预后差异；④影响患儿输血的危险因素评估。最终达到验证免输库血或少输库血体外循环技术的安全性。第二部分研究拟探讨体外循环实施无血浆预充策略对低体重患儿心脏术后凝血及临床状况的影响。选择符合入选标准的低体重先天性心脏病患儿,根据体外循环胶体预充方案分成两组,传统预充血浆成分的患儿为对照组,采用改良人工胶体液替代血浆成分的患儿为试验组。收集患儿围体外循环期的临床观察指标,并用血栓弹力图（TEG）观察术前、术后的凝血功能监测指标变化,通过两组间的比较,旨在评价实施人工胶体液替代血浆技术在婴幼儿体外循环管理中的可行性与安全性。为进一步探寻体外循环术中合适的血浆替代品及完善血浆的临床规范应用和应对血源紧张状况起到积极的推动作用。研究目的评价改良节约用血策略对低体重（≤15kg）先天性心脏病患儿的可行性及安全性,并进一步针对实施传统和改良库血预充体外循环术后患儿的血制品输入情况及临床预后进行分析：1、低体重先天性心脏病患儿术中的安全血液稀释度；2、免输血体外循环手术的适应证；3、评价术中输血、术后输血与免输血患儿的近期预后,探讨影响输血的相关危险因素。最终验证减少血液制品输入的体外循环技术安全性。研究方法自2011年2月至2013年10月,按入选标准纳入531例先天性心脏病患儿进行研究。先进入第一阶段研究即传统组（C组,n=248例）患儿采用传统库血预充方案,改良组（M组,n=283例）患儿实施改良节约用血策略即无库血预充方案进行相应的外科治疗,收集两组患儿围术期的相关资料并分析该策略的可行性和安全性,第二阶段研究即对改良组患儿进一步分组,如患儿在CPB中发生与低血红蛋白浓度相关的缺氧指征时,则需严格按照输血指征申请输血治疗,并被纳入术中输血组；如手术后进行输血治疗的患儿需纳入到术后输血组；成功实施免输血手术的患儿,需纳入免输血组,收集三组患儿围术期的重要监测指标及血制品的用量、收集所有患儿住院期间一般资料,于CPB前、CPB开始后10min、停机前及停机改良超滤后分别监测血气,记录术后24小时胸液引流量及患儿术后早期恢复的相关评价指标。研究结果第一阶段对传统组与改良组患儿初步分析表明,改良组患儿的红细胞用量明显少于传统组（p<0.001）;改良组患儿术后机械通气时间、ICU停留时间及24小时胸液引流量明显低于传统组（p=0.028,p=0.034,p=0.012）；两组间的住院时间、再次气管插管、术后腹透及死亡率等均无统计学差异（p>0.05）。第二阶段的研究结果显示：与免输血组相比,术中输血组患儿体重、年龄、身高均明显较低（p<0.01）,24小时胸液引流量更多（p<0.05）；术中输血组术前HCT均低于免输血组和术后输血组（p<0.01,p<0.05）,三组间住院时间存在统计学差异（p=0.047）。多因素logistic回归分析表明,术前HCT、体重、身高可降低术中输血的风险（OR=0.811, p<0.001; OR=0.717,p<0.001; OR=0.909,p=0.008）,预充量则增加术中输血风险（OR=1.006; p=0.032）,体重、紫绀分别为降低和增加术后输血风险（OR=0.833,p=0.009; OR=2.597, p=0.019）。经过ROC曲线分析及与发生术中输血相关的HCTcutoff值提示：体重≤10kg患儿,术前与术中最低HCT值ROC曲线下面积（AUC）分别是0.800（0.664～0.938,p=0.002）和AUC0.802(0.723～0.896。术前最低HCT的Cutoff值为39.5%时,敏感度为0.774,特异度为0.727,术中最低HCT的Cutoff值为23.5%时,敏感度为0.750,特异度为0.731,因此当术前HCT>39.5%时,可尝试免输血体外循环术,且术中最低HCT安全值为23.5%。对于体重>10kg患儿,术前HCT与术中最低HCT的ROC曲线下面积（AUC）分别是0.749（0.570～0.927,p=0.013）和0.712（0.616～0.808,p值<0.001）。术前HCT的Cutoff值为35.5%时,敏感度为0.583,特异度为0.931,术中最低HCT的Cutoff为21.8%时,敏感度为0.750,特异度为0.766,因此体重>10kg患儿术前HCT>35.5%时,可尝试免输血体外循环术,且术中最低HCT安全值为21.8%。结论本研究认为：合理实施改良节约用血策略可显着减少低体重先天性心脏病患儿围术期的血制品用量,可明显缩短患儿术后早期的恢复时间,并未给患儿术后带来其它不良影响；在应用此策略基础上,熟悉低体重患儿免输血的保护因素和危险因素,以及患儿术前HCT和术中安全血液稀释度,将为15kg以下患儿安全实施少输血制品心脏手术奠定良好基础。研究目的新鲜冰冻血浆（FFP）一直以来被视为婴幼儿体外循环预充液的重要组分,旨在通过预防性使用血浆,保护体外循环术后的凝血功能。但目前预防性使用血浆的临床效果存在很大争议,而且缺乏婴幼儿预防性使用血浆的循证医学研究。目前,我国血源紧张的状况日趋严重,再加上输入血制品会导致一系列的不良反应,因此,正确认识血浆的预防性使用价值以及评价人工胶体能否安全有效地替代血浆十分重要。本研究拟通过观察体外循环管路有无预充血浆对先天性心脏病患儿术后凝血功能以及临床状况的影响,以明确婴幼儿体外循环中预防性使用血浆,是否能达到预期改善术后凝血功能的效果。并且进一步评价人工胶体能否安全有效地作为血浆替代品用于体外循环预充,为临床安全合理地使用血浆提供依据。研究方法2012年12月至2013年08月,择期行先天性心脏病矫治术患儿115例,年龄小于3岁,体重在5～15kg之间。根据体外循环管路预充胶体液种类的不同,随机分为两组：佳乐施组（Gelofusine,G组,n=58）,FFP组（F组,n=57）。G组预充佳乐施10～20ml/kg,F组预充1～2U（1U=100ml）FFP,两组均预充醋酸钠林格液100～200ml,根据术前HCT水平预充0～1U少白悬浮红细胞。采用血栓弹力图仪（Thrombelastogram,TEG）检测切皮前及鱼精蛋白中和后15min快速TEG以及功能性纤维蛋白原（FLEV）的含量。观察术后肝肾功能,记录术后6h、24h和总胸液引流量,计算血制品、凝血制剂的使用量以及呼吸机时间、ICU时间和住院时间。分析术前的血液系统指标及鱼精蛋白中和后检测的TEG参数与术后出血量的关系。研究结果两组患儿术前一般资料基本一致。两组患儿均痊愈出院,无二次开胸止血,无术后肝肾功能损害。预充FFP可显着提高术后纤维蛋白原（MAf、FLEV）的含量（5.6±2.1vs9.2±2.6,p=0.008；154.3±37.6vS195.2±39.0,p=0.006）,但对凝血因子水平（R值）、血小板功能（MAp值）及最终形成的血凝块强度（MA值）均无明显影响（p>0.05）。另外,FFP预充不能减少术后出血量,对减少RBC、PLT、FFP等血制品及凝血制剂的使用量无统计学差异（p>0.05）。两组患儿的术后呼吸机时间、ICU时间和住院时间无统计学差异（p>0.05）。鱼精蛋白中和后测得的MA值与术后6h出血量相关（r=0.615,p<0.001）。简单线性回归结果显示,转机时间（r=0.263,p=0.047）、紫绀型（r=0.307,p=0.033）及术前FLEV水平（r=-0.468,p=0.013）三个指标与术后6h出血量相关。进一步行多元线性回归分析,结果显示仅术前FLEV与术后早期出血量有关（r=0.331,p=0.037）。结论婴幼儿先天性心脏病体外循环中预防性使用血浆能够显着提高术后纤维蛋白原水平,但对减少术后出血及血制品输注、促进临床恢复方面没有明显保护作用。合理选择人工胶体液在常规择期手术的先天性心脏病患儿中可安全有效的替代血浆用于体外循环管路预充,从而减少血浆使用量。因此,我们不建议在婴幼儿体外循环管路预充时常规使用血浆。TEG可实时监测凝血系统功能,对于预测心脏术后出血的风险以及指导血制品的输入有重要价值。
二、使用一次性输液器矫正瓶内负压（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、使用一次性输液器矫正瓶内负压（论文提纲范文）
（1）白藜芦醇抑制肾草酸钙结石形成及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 基于第一性原理的白藜芦醇对钙的吸附性能研究 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 基于网络药理学的白藜芦醇防治肾结石的作用机制研究 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 白藜芦醇体外对草酸钙结石晶体粘附的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 白藜芦醇通过调节SIRT1/FOXO3a抑制草酸钙结石诱发的肾脏氧化应激损伤 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 研究总结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾草酸钙结石发病机制及防治的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Paper one |
| Paper Two |
（2）产妇发生乳头皲裂的原因及护理（论文提纲范文）
| 1 乳头皲裂的发病原因 |
| 2 乳头皲裂的预防 |
| 2.1 教会孕妇做好孕期的乳房护理 |
| 2.2 产后尽早让产妇掌握正确的母乳喂养方法 |
| 2.3 教会产妇喂奶后护理乳房的方法 |
| 3 乳头皲裂的治疗方法 |
| 3.1 蛋黄油治疗乳头皲裂 |
| 3.2 美宝湿润烧伤膏治疗乳头皱裂 |
| 3.3 中药外敷治疗乳头皲裂 |
| 3.4 扶济复治疗乳头皲裂 |
| 3.5 铋糊剂治疗乳头皲裂 |
（3）Y型乳头矫正器的研制及临床应用（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 对照组采用一次性注射器抽吸乳头法矫正[1]。 |
| 1.2.2 观察组采用自制Y型乳头矫正器连接低负压吸引器进行矫正。 |
| 1.2.2. 1 制作方法： |
| 1.2.2. 2 操作方法 |
| 1.2.3 评定方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 工作原理 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.3 优点 |
（4）侧孔抽吸式负压吸乳器的应用性研究（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 应用方法: |
| 1.2.2 评定方法: |
| 1.2.3 统计学方法: |
| 2 结果 |
| 2.1 三组乳头伸展长度, 乳腺管疏通数, 吸乳器每次使用持续时间、总使用次数比较 |
| 2.2 产妇舒适度、哺乳成功率比较 |
| 3 讨论 |
（7）洗胃技术用于双颌手术后呕吐的预防（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 对照组 |
| 1.2.2 观察组 |
| 1.2.2. 1 术前护理 |
| 1.2.2. 2 术后护理 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 洗胃指征的确立 |
| 3.2 洗胃时机的选择 |
| 3.3 洗胃液的选择 |
| 3.4 严格掌握灌洗及抽吸技巧 |
| 3.5 效果分析 |
| 4 小结 |
（8）乳头凹陷者母乳喂养的研究进展（论文提纲范文）
| 1 乳头凹陷概况及其对母乳喂养的影响 |
| 2 乳头凹陷者母乳喂养失败的原因分析 |
| 2.1 乳头原因 |
| 2.2 产妇及家属原因 |
| 2.3 医护原因 |
| 3 乳头凹陷纠正方法 |
| 3.1“十字法”[26] |
| 3.2 注射器抽吸法 |
| 3.3 同心圆胶布法[35] |
| 3.4 辅助乳头法 |
| 3.5 侧孔抽吸式负压吸乳器法[38] |
| 4 促进乳头凹陷者母乳喂养成功的有效措施 |
| 4.1 尽早、尽力做到首次吸吮成功,保证首次吸吮时间≥30min |
| 4.2 资深护士提供24h及时帮助 |
| 4.3 重视对产妇的母乳喂养健康教育,建立强有力的支持系统 |
| 4.4 加强产后访视 |
（9）宫外孕破裂大出血术中自体血回收手术配合技巧（论文提纲范文）
| 1 一般资料 |
| 2 术前准备 |
| 2.1 仪器物品准备 |
| 2.2 病人的准备 |
| 3 术中配合 |
| 4 术后处理 |
| 5 自体血回收机使用技巧 |
| 6 讨论 |
（10）减少围体外循环期的血制品输入对低体重先天性心脏病患儿的临床研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文第一部分 实施围体外循环期的改良节约用血策略对低体重先天性心脏病患儿的安全性研究 |
| 背景 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 全文第二部分 围体外循环实施无血浆预充策略对低体重患儿心脏术后凝血及临床状况的影响 |
| 背景 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 婴幼儿免输血心脏手术研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究总结 |
| 个人简介 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、使用一次性输液器矫正瓶内负压（论文参考文献）
- [1]白藜芦醇抑制肾草酸钙结石形成及其机制的研究[D]. 王滕滕. 山东大学, 2021(11)
- [2]产妇发生乳头皲裂的原因及护理[J]. 高德艳,蒋红梅,王贤华,石玉琦,文霞,李力. 中国医药指南, 2008(20)
- [3]Y型乳头矫正器的研制及临床应用[J]. 石秋连,蔡玉娇,陈艳敏,黎连花,李小杏,梁棉. 当代护士(学术版), 2006(09)
- [4]侧孔抽吸式负压吸乳器的应用性研究[J]. 范植蓉,王虹,陈红宇,丁永艳,朱文惠,杨艳芳. 护理学杂志, 2004(24)
- [5]临床使用一次性医疗用品遇到的问题及对策[J]. 李丽,杜长茹. 中国疗养医学, 2004(05)
- [6]使用一次性输液器矫正瓶内负压[J]. 李怀兰,李霞. 护理研究, 2004(01)
- [7]洗胃技术用于双颌手术后呕吐的预防[J]. 张丽琴. 当代护士(上旬刊), 2017(04)
- [8]乳头凹陷者母乳喂养的研究进展[J]. 雷明,王燕,周婉平. 中华护理杂志, 2013(11)
- [9]宫外孕破裂大出血术中自体血回收手术配合技巧[J]. 卢丽玲. 实用妇科内分泌电子杂志, 2020(03)
- [10]减少围体外循环期的血制品输入对低体重先天性心脏病患儿的临床研究[D]. 刘晋萍. 北京协和医学院, 2014(01)