一、哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题（论文文献综述）
李昊[1]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中指出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
王明[2]（2018）在《牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰》文中认为外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显着干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显着干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。
徐金霞,张羽,王勇胜,边珍,卿素珠,张涌[3]（2012）在《1例转基因克隆牛脑和免疫器官组织形态观察报告》文中认为【目的】对1例新生死亡的转基因克隆牛的脑和免疫器官进行观察,分析和评价克隆牛脑和免疫器官的发育状况。【方法】采用病理解剖、组织学常规石蜡切片-HE染色技术,对转基因克隆牛的脑部和免疫器官的组织结构进行系统观察与分析。【结果】该克隆牛体格偏大,头颅骨质较一般犊牛坚硬,免疫器官外观无明显变化。镜下观察显示,大脑皮质层次清晰,有轻度充血和1处明显的点状出血;小脑皮质可分为明显的3层结构,蛛网膜有轻度充血;脾脏红髓轻度淤血并有散在含铁血黄素沉着;白髓中央动脉周围淋巴鞘清晰可见,脾小体数量较多,但脾小体和动脉周围淋巴鞘内淋巴细胞数量较少;淋巴结被膜薄,小梁不发达,皮质淋巴细胞多而密集,但典型的具有生发中心的淋巴小结较少;髓索不明显,髓质部毛细血管扩张充血;胸腺被膜和小梁上血管可见充血现象;皮质部淋巴细胞丰富,可见散布的胸腺细胞;髓质淋巴细胞密集,细胞间可见数量较多的巨噬细胞;嗜酸性胸腺小体易于辨认,但发育不完全。【结论】该例克隆牛脑发育较为成熟,但免疫器官发育不均衡。
曹俊伟[4]（2012）在《人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育》文中指出本研究采用双酶切定向克隆的方法，成功地将人乳铁蛋白表达序列与内部核糖体进入位点（IRES）连接起来，构建了重组载体pIL。通过BamH I单酶切连接构建了人溶菌酶和人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pEBHIL。利用脂质体包裹pEBHIL导入奶牛乳腺上皮细胞，经G418筛选及PCR检测筛选获得阳性细胞，以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。通过PCR法检测转基因克隆胚中的外源基因，并观察绿色荧光蛋白表达，从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测，为进一步移植阳性克隆胚，得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下：1.采用PCR法分别克隆了2255bp的人乳铁蛋白基因（hLTF）和986bp内部核糖体进入位点（IRES）序列，PCR产物回收纯化后，hLTF克隆在pMD18-T Vector的T位点，质粒标记为phLTF；IRES克隆在pGEM-T Easy Vector的T位点，质粒标记为pIRES。将质粒phLTF和质粒pIRES分别用Xba I/Nhe I双酶切，回收目的片段，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆pIL。利用BamH I酶切质粒pIL和质粒pEBH（含人溶菌酶基因），T4DNA连接酶连接，BamH I酶切鉴定连接方向，构建了乳腺特异性表达载体，标记为pEBHIL。此载体含有调控序列（奶牛β-酪蛋白5′和3′调控序列）、目的基因（人溶菌酶基因及人乳铁蛋白基因）、内部核糖体进入位点（IRES）、报告基因（绿色荧光蛋白基因）以及抗性基因（neo+基因）。2．采用脂质体包裹含人溶菌酶/乳铁蛋白的双基因表达载体pEBHIL，导入奶牛乳腺上皮细胞，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，经G418筛选及PCR鉴定获得阳性细胞。转染细胞增殖后经激素诱导，Western Blot检测培养液上清液，证明转染细胞表达并分泌人溶菌酶和人乳铁蛋白，分子量分别是14.7ku和40ku。转基因细胞传代培养15代，对第3、5、7、9、11、13代细胞作染色体核型分析表明，离体条件下培养细胞未发生转化（2n=60）。从而为核移植技术制备转基因牛提供了细胞来源。3.本研究分别从MⅡ卵母细胞去核方法、供核细胞同期化处理、转基因与未转基因的乳腺上皮细胞、冻-融与未冷冻的转基因供核细胞以及转基因乳腺上皮细胞的传代次数等方面比较了克隆胚的构建效率。结果表明，DM辅助去核法较盲吸法更适合MⅡ卵母细胞的去核（19.5%vs11.0%，p<0.05）；接触抑制法诱导牛乳腺上皮细胞同期化的效率显着高于血清饥饿法（19.5%vs11.8%，p<0.05）；转基因与未转基因乳腺上皮细胞为核供体对克隆胚构建效率差异不显着（16.8%vs18.7%，p>0.05）；未冷冻的转基因牛乳腺上皮细胞作为供体细胞构建克隆胚效率显着高于冻-融组（16.8%vs9.2%，p<0.05）；以第3、5、7、9代阳性转基因乳腺上皮细胞为核供体构建克隆胚的效率差异均不显着（P>0.05）。4．PCR法检测表明，外源目的基因已整合到转基因克隆胚的染色体上；荧光显微镜下观察到转基因克隆胚中绿色荧光蛋白（GFP）表达，发现部分克隆胚在2-细胞时就开始表达GFP，但是表达量小，荧光弱，随着胚胎体外发育时间延长，细胞数增多，EGFP的表达也逐渐增强。说明外源基因在胚胎早期阶段可以表达，绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因来实现对外源基因在早期胚胎整合及表达的检测。
朱化彬[5]（2011）在《奶牛体外胚胎生产技术的研究》文中指出体外受精和体细胞克隆技术是提供牛胚胎移植胚胎来源的重要技术方法。本试验（论文）研究了影响牛体外性控胚胎影响因素（试验一）和体细胞克隆的影响因素（试验二）,研究了不同冷冻方法对牛体外受精和体细胞克隆胚胎ATP含量和ROS水平的影响（试验三）,利用实时定量PCR研究了马-牛异种体细胞克隆胚胎线粒体DNA情况（试验四）,得到以下试验结果:试验一:本实验研究了卵母细胞体外成熟后卵丘细胞脱除程度、种公牛个体以及性控精液受精滴体积、性控精子密度等对牛体外性控胚胎生产的影响。试验结果表明:1、卵丘细胞部分脱除组的卵裂率（67±4.74%）显着性高于不脱除组（41±2.23%）、完全脱除组（37.50±2.88%）（P<0.05）;2、种公牛B的性控精液进行体外受精,囊胚率（26.53±3.31%）要显着高于A公牛（17.65±3.65%）和C公牛（16.67±2.36%）（P<0.05）;3、50μL～100μL受精滴囊胚率（20.41±4.33%～23.38±4.47%）无显着性差异（P>0.05）,但显着性高于40μL、30μL的囊胚率（13.79±2.02%、12.12±3.73%）（P<0.05）;4、精子密度0.5×106个/ mL～1×106个/mL的囊胚率（22.58±2.17%～27.27±3.49%）相比无显着性差异（P>0.05）,但显着性高于0.3×106个/mL-1组的囊胚率（16.13±3.46%）（P<0.05）。试验二:本试验研究了奶牛克隆重构胚不同化学激活方法、克隆重构胚体外培养条件和公牛和母牛供体细胞等对奶牛手工克隆和显微注射克隆效率的影响。试验结果表明:（1）建立了优秀种公牛体细胞系20个,高产奶牛体细胞系4个;（2）A23187+6-DMAP和A23187+放线菌酮组合处理激活体细胞克隆重构胚卵裂率（82.62% VS 78.15%）和囊胚率（34.15% VS 30.21%）差异不显着,但是A23187+6-DMAP囊胚质量较好;（3）克隆重构胚在mCR1aa培养液卵裂率（83.65%）和囊胚率（34.36%）,均显着高于SOF和CR1aa两种培养液;（4）血清饥饿处理供体细胞的克隆重构胚融合率（90.52%±2.62）、卵裂率81.27%±3.68和囊胚率（31.46%±2.42）和接触抑制的克隆重构胚（89.25%±1.92）、（82.44%±4.42）、（30.44%±2.77）差异不显着;（5）种牛克隆胚胎移植妊娠率37.0%（10/27）,其中青年荷斯坦母牛移植妊娠率（46.2%）显着高于经产西门塔尔杂交受体母牛（28.6%）。西门答尔杂交受体母牛移植克隆胚胎后分别在妊娠的70～90d内流产,1头荷斯坦母牛妊娠受体101天后屠宰,1头荷斯坦母牛妊娠155天流产2个胎儿,1头荷斯坦妊娠149天流产2个胎儿。试验三:本实验采用常规法或玻璃化法（OPS法）冷冻保存牛IVF囊胚和SCNT囊胚,利用ATP Bioluminescence Assay Kit HS II和GENMED ROS Assay Kit检测冷冻-解冻后囊胚ATP含量和ROS水平。试验结果表明:1、IVF和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后存活率（92.24±4.54%,78.71±5.91%）均显着高于常规冷冻法（81.56±2.33%、47.89±5.83%）（P<0.05）;2、IVF囊胚和SCNT囊胚OPS法冷冻-解冻后ATP含量（0.62±0.04 pmol, 0.30±0.01 pmol）均显着高于常规冷冻法（0.43±0.06 pmol, 0.21±0.02 pmol）（P<0.05）;但是均显着低于相应的IVF或SCNT对照组新鲜囊胚（0.74±0.05 pmol,0.39±0.01 pmol）;3、玻璃化冷冻IVF囊胚（72.14±4.31 cps）、SCNT囊胚（40.11±5.73 cps）ROS水平高于新鲜IVF囊胚（47.33±3.56 cps）、SCNT囊胚（26.44±1.49 cps）（P<0.05）,常规冷冻组则与此相反（34.41±3.32 cps vs.47.33±3.56 cps;15.46±2.45 cps vs.26.44±1.49 cps）（P<0.05）。试验四:本试验研究了手工克隆和显微注射方法对马-牛异种克隆效率的影响,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测马-牛异种克隆胚胎不同发育阶段线粒体编码基因细胞色素B的转录水平。试验结果表明:（1）手工方法克隆马-牛异种重构胚融合率（95.12%）、卵裂率（97.07%）显着高于显微注射法的融合率（70.25%）和卵裂率（85.21%）,但两者之间的囊胚率差异不显着（2.64%±1.68 vs2.36%±1.59）;（2）供体马CYBT基因的表达水平在1-细胞期的重构胚中表达量最高,而在囊胚期,却没有检测到该基因的转录本。牛CYBT基因,在1-细胞期到8-细胞期,其表达量逐渐下降,而在16-细胞期的异种克隆胚中,该基因的表达量急剧升高到最高值,比1-细胞期增加了11倍,随后囊胚期表达水平锐减到为起始水平的2倍。
赵高平[6]（2011）在《马体细胞核移植的研究》文中研究表明体细胞核移植技术为家畜快速繁育和基因组保存提供了新的机遇和方法。在我国,这项技术在牛羊等家畜的繁育上已得到应用,但在马的繁殖上还很少开展这方面的研究。本研究以纯血马的体细胞为供核细胞,分别以马和驴的卵母细胞为胞质受体构建同种和异种体细胞核移植胚,建立了马的体细胞培养体系及马和驴卵母细胞的体外成熟培养体系,并对胚胎的体外培养、手术法移植早期异构克隆胚到受体马输卵管进行了相关的研究。1.马体细胞系的建立本研究通过对马腿部皮肤组织的体外培养、冻存和复苏的实验研究,建立了马成纤维细胞的培养和保存体系。2.马体细胞核移植胚的构建通过对马卵母细胞两种采集方法的对比,发现切割法比抽吸法更适合马卵母细胞的收集,可获得较高的回收效率。以M199和DMEM/F12为基础培养液用于马卵母细胞的体外成熟培养,结果显示成熟率差异不显着。扩展型（Ex） COCs体外培养24-28小时和紧凑型（Cp） COCs体外培养30-36小时后成熟率分别达到65.2%和42.9%,两种类型COCs成熟后的MⅡ期卵母细胞且具有相同的发育能力。马体细胞核移植实验中发现140V,20Us, 2次脉冲的条件可获得较高的融合效率,融合率达72.5%。采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,重构配的卵裂率为41.9%。3.马-驴异种核移植胚的构建本实验分别采用M199培养液,DMEM/F12培养液和由M199培养液与DMEM/F12培养液按1:1混合组成的培养液作为驴卵母细胞的体外成熟基础培养液,最终成熟率差异不显着（p>0.05）,并且这三种成熟液驴卵母细胞的孤雌激活和发育无显着影响。提高成熟液中钙离子的浓度不能有效提高驴卵母细胞体外成熟和孤雌激活的效率。驴的COCs同马的COCs相似也分为扩展型（Ex） COCs和紧凑型（Cp） COCs,两种类型的COCs分别成熟培养30-36小时和24-28小时后获得MⅡ期卵母细胞的效率分别为75.9%和55.2%。驴卵母细胞在室温下放置于EH培养液中12小时内对卵母细胞的体外成熟率无显着影响。长时间（20-22小时）的运输卵巢、卵母细胞或是使用简易便携式培养系统在运输途中成熟培养驴卵母细胞都不利于卵母细胞的成熟,但后两种方法的成熟效率高于前一种方法。SOFaa和DMEM/F12都可用于驴的胚胎体外培养,差异不显着（p>0.05）。提高发育液中葡萄糖的浓度可促进胚胎的发育,但差异不显着。以马皮肤成纤维细胞和去核的驴卵母细胞胞质体构建马-驴异种核移植胚胎,在融合参数为130-150V,20Us,2次脉冲时可获得较高的融合率,融合率为60-70%,采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,重构配的卵裂率为48.4%。共移植了46枚早期马-驴异种核移植胚胎到5匹受体马的输卵管中,90天检测均未建立妊娠。
盛鹏程,苗向阳,朱瑞良[7]（2010）在《哺乳动物克隆的现状和研究进展》文中研究表明哺乳动物细胞克隆是20世纪末生命科学领域最引人注目的高新技术,该技术对于优良种畜的复制、减少试验用动物数目、动物遗传多样性保存及濒危动物挽救、转基因动物培育等方面具有重要意义。近年来克隆技术发展迅速,多种哺乳动物相继克隆成功,但也存在克隆效率太低、克隆动物表型正常而实质异常的问题。本文详细阐述了克隆效率太低、克隆动物表型正常而实质异常问题,介绍了当前动物克隆技术的发展现状,并对动物克隆涉及的技术进行了总结和概括,着重介绍了卵母细胞的去核方法和重组胚的构建方法。
张艳丽[8]（2010）在《转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究》文中进行了进一步梳理人溶酶体β-葡萄糖苷酶（human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase）是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵；在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转基因与核移植相结合制备动物乳腺生物反应器是当今转基因整合表达的一种有效途径。因此,本研究选取人溶酶体β-葡萄糖苷酶作为研究对象,首先克隆人GlcCerase cDNA序列并对其在COS7细胞中的表达进行初步研究,然后构建含有人GlcCerase cDNA的乳腺表达载体,经体外培养的乳腺上皮细胞验证载体的有效性后,进一步将该载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞,筛选稳定转基因细胞克隆株,通过体细胞核移植法生产转基因奶山羊克隆胚胎,以期获得乳腺特异性表达GlcCerase的转基因奶山羊乳腺生物反应器。本研究共分为六个部分,第一、二部分进行了人GlcCerase基因的克隆、表达载体的构建及体外细胞表达研究；第三、四部分主要是分离培养了奶山羊胎儿成纤维细胞,并优化了脂质体法转染该细胞的体系,获得了稳定整合人GlcCerase基因的供体细胞；第五部分利用转人GlcCerase基因的奶山羊胎儿成纤维细胞进行了核移植,研究转基因供体细胞对克隆胚胎体外发育的支持作用,并对克隆胚胎进行了胚胎移植；第六部分探讨了外源基因导入对奶山羊体细胞周期分布、细胞凋亡和基因表达水平的影响。主要的研究结果如下：第一部分人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核细胞表达试验中,首先从人胎盘组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人GlcCerase基因的编码序列,经测序分析,所得GlcCerase cDNA与GeneBank中同源性为99%,发现1个碱基差异,导致天冬氨酸到甘氨酸的改变。为了尽快检测所获得的目标基因是否能正常编码获得重组蛋白质,本试验以pEGFP-Cl为基础质粒,构建了含有人GlcCerase基因的真核表达载体pEGFP-GlcCerase。用脂质体介导法将该载体转染入COS7细胞中进行暂态表达研究,可见报告基因GFP顺利表达,经RT-PCR和荧光酶学法进行验证,在细胞中检测到了GlcCerase的mRNA表达,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase的生物活性。这些结果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能够正确编码蛋白,发挥生物学功能,可以用于下一步的乳腺表达载体构建。第二部分人GlcCerase基因乳腺特异性表达载体的构建及乳腺细胞表达试验中,将在体外经真核细胞表达验证正确的GlcCerase基因以及细胞筛选标记基因（Neor）插入含有山羊p-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,经PCR和酶切鉴定,得到正确的重组质粒pBCl-GlcCerase-Neo。为了检测乳腺表达载体的有效性,将该载体转染入小鼠乳腺上皮细胞系——HC-11细胞中,经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,将克隆细胞扩大培养后,经PCR检测结果表明,人GlcCerase基因己成功转入到HC-11细胞中。进一步用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经RT-PCR和Western-blot检测表明,山羊p-酪蛋白基因启动子驱动的人GlcCerase基因能够在乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。这些结果表明,所构建的人GlcCerase基因乳腺表达载体具有生物学功能,为下一步利用该载体进行转基因供体细胞的建立奠定了基础。第三部分奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究,采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,结果表明：该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。进一步利用脂质体法将pEGFP-Cl质粒转染入该细胞,研究了脂质体量、质粒量和转染时间对转染效率的影响,获得了脂质体转染该细胞的最佳条件：24孔细胞培养板中采用4.0μL脂质体转染试剂,1.2μg质粒DNA,细胞在复合物中孵育6 h。这为下一步目的基因转染奶山羊胎儿成纤维细胞的研究提供了参考依据。第四部分建立转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的试验,利用上述优化的转染体系,将线性化的乳腺特异性表达载体pBC 1-GlcCerase-Neo转染胎儿成纤维细胞,经G418筛选8-10天后,获得抗性细胞克隆,进一步通过96孔细胞培养板分离得到来源于单个转基因成纤维细胞的细胞克隆,经PCR扩增检测,得到稳定整人GlcCerase基因的转基因供体细胞8株,和对照组细胞比较,转基因过程中没有导致细胞的生长和核型异常。转基因细胞的核型（2n=58+XX）正常比例为66.8%,而第10-12代的非转染细胞核型正常率为70.9%,二者差异不显着（P>0.05）。这些结果表明可以利用这些阳性转基因细胞作供体细胞进行核移植研究。第五部分人GlcCerase转基因克隆胚胎的制备研究,采集屠宰山羊卵巢,获取卵母细胞并体外成熟培养,成熟率为63.3%。以100%汇合2天的转基因体细胞作核供体,以去核的MⅡ期卵母细胞作核受体进行核移植操作。完成核移植的卵母细胞采用122 kV/cm、20μs/次、间隔1s的直流电脉冲进行融合,融合率为83.3%,融合后的重构胚胎进一步用Ionomycin和6-DMAP进行激活处理,然后转移到SOFaa培养液中与单层卵丘细胞共培养,重构胚的卵裂率为89.1%,发育至桑葚胚/囊胚期的比例为36.4%。以正常体细胞来源的核移植胚胎作为对照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分别为77.8%、90.9%和38.9%,两种供体细胞来源的融合率和胚胎发育率差异不显着。手术法将发生卵裂且形态正常的转基因克隆胚（2-细胞期或以上）移植到同期发情的山羊输卵管中,16只受体山羊中有6只一直没有返情,在第40天经B超检测到2只妊娠的结果,但是最终妊娠没有发育到期,胎儿发生流产。第六部分探讨了外源基因转染对供体细胞生物学特性的影响。将构建的乳腺表达载体pBC1-GlcCerase-Neo分别转染体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞以及成年皮肤成纤维细胞,获得整合有外源基因GlcCerase的转基因体细胞。以非转染的正常细胞为对照,利用流式细胞仪分析了转基因奶山羊体细胞的细胞周期分布和细胞凋亡的情况,研究结果显示：三种转基因细胞100%汇合2d后,G0/G1细胞的百分比都显着低于对照组细胞（P<0.05）,其中转基因胎儿成纤维细胞的G0/G1期比例高于其它两种转基因细胞；转基因胎儿成纤维细胞凋亡率达22.56%,较对照组细胞有显着提高（P<0.05）；然后进一步利用荧光定量PCR法探讨了外源基因转染对胎儿成纤维细胞基因表达模式的影响,检测的基因分别为基因印记基因（IGF2, IGF2R）、凋亡相关基因（Bax）、应激相关基因（热休克蛋白,Hsp70.1）、细胞连接相关基因（Cx43）和DNA甲基化转移酶1基因（DNMT1）。其中IGF2, IGF2R和Cx43mRNA的转录水平显着高于对照组非转染的对照组细胞（P<0.05）。本研究首次从细胞周期分布、细胞凋亡以及基因表达变化模式等方面探讨外源基因转染对奶山羊体细胞的影响,探索转基因克隆效率低的内在机制,为更好地促进供体细胞的重编程,进一步提高转基因克隆的效率奠定了基础。
韩岩[9]（2010）在《氨基酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响》文中认为氨基酸是体外培养液的重要成分,目前应用的多种培养液中都含有必需／非必需氨酸,但是很少有针对单一氨基酸或联合添加几种氨基酸对胚胎发育影响的研究报道。本实验主要研究了培养液中添加谷氨酰胺、牛磺酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸以及谷氨酰胺与牛磺酸联合添加对重组胚卵裂、8-16C发育及囊胚发育的影响,以期从中探寻氨基酸是否能够提高延边黄牛体细胞克隆效率。本次实验是在体外培养液中分别添加以上几种不同种类不同浓度的氨基酸,对延边黄牛体细胞克隆重组胚进行体外培养,然后观察重组胚的发育情况。实验得出的结果如下：1.在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响的试验中,添加1.0 mmol/L谷氨酰胺组的重组胚的卵裂率、8-16C发育率均高于其他浓度,囊胚率显着高于其他浓度组（P<0.05）,所以确定1.0mmol/L是单独应用谷氨酰胺时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。2.在体外培养液中添加不同浓度的牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响的试验中,添加7mmol/L和14 mmol/L牛磺酸组的重组胚的卵裂率高于其它浓度组,8-16C发育率和囊胚发育率显着高于其它浓度组（P<0.05）,但7mmol/L组在重组胚的卵裂率、8-16C发育率、囊胚发育率上均高于14mmol/L组。所以确定7mmol/L是单独应用牛磺酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。3.在体外培养液中同时添加谷氨酰胺和牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响的试验中,仅有重组胚的卵裂率略高于单独添加组,而囊胚发育率上联合添加组显着低于单独应用组（P<0.05）。4.在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各浓度组之间重组胚的卵裂率和8-16C发育率差异不显着,囊胚发育率上6.4mmol/L.组显着高于其它浓度组（P<0.05）,所以确定6.4mmol/L是单独应用谷氨酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。5.在体外培养液中添加不同浓度的精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各浓度组之间重组胚的卵裂率和8-16C发育率差异不显着,囊胚发育率上0.061mmol/L浓度组显着高于对照组（P<0.05）,各实验组之间差异小显着,但是0.061mmol/L组的囊胚发育率高于其它实验组,所以确定0.061mmol/L是单独应用精氨酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。6.在体外培养液中添加不同浓度的甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各浓度组之间重组胚的卵裂率和8-16C发育率差异不显着,囊胚发育率上7mmol/L组显着高于对照组和最高浓度组（21mmol/L,P<0.05）,略高于14mmol/L浓度组,所以确定7mmol/L是单独应用甘氨酸时最适合延边黄牛卵母细胞体细胞克隆重组胚发育的最佳浓度。7.在体外培养液中添加不同浓度的丙氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,0.586mmol/L浓度的丙氨酸可以促进重组胚的卵裂,显着高于对照组（P<0.05）,各浓度组之间的8-16C发育率上差异不显着,1.172 mmol/L浓度的丙氨酸能够促进囊胚的发育,显着高于对照组（P<0.05）,更适合延边黄牛体细胞克隆重组胚的体外培养。8.在体外培养液中添加不同浓度的脯氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育影响的试验中,各组的卵裂率、8-16C发育率、囊胚率之间差异不显着,但是0.143mmol/L浓度组较其它组更适合延边黄牛体细胞克隆重组胚的体外培养。
张宇,尹多,李丽,方南洙,李钟淑[10]（2010）在《哺乳动物体细胞克隆胚胎端粒酶活性的研究进展》文中认为端粒酶（telom erase）是一种蛋白质与RNA组成的核糖核蛋白,是目前发现的唯一能够延长端粒的一种RNA依赖性DNA聚合酶。在DNA复制过程中丢失的端粒可以被有活性的端粒酶修复回来。哺乳动物端粒酶在发育中受调控,端粒的重编程可能是由于早期胚胎不同时期的端粒酶活性而造成的,因此,研究端粒和端粒酶重编程将为哺乳动物体细胞克隆技术奠定重要的理论基础。本文综述了端粒和端粒酶的结构和功能,及其与哺乳动物体细胞克隆早期胚胎发育的关系,并在此基础上探讨了端粒酶在体细胞克隆动物胚胎发育中的重要作用。
二、哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题（论文提纲范文）
（1）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因大动物研究概况 |
| 1.1.1 转基因大动物的研究历史 |
| 1.1.2 转基因大动物的应用 |
| 1.1.3 大动物传统转基因技术 |
| 1.1.4 大动物转基因定点修饰技术 |
| 1.2 安全位点研究现状 |
| 1.2.1 安全位点Rosa26的发现及研究现状 |
| 1.2.2 安全位点Rosa26的定点修饰 |
| 1.2.3 安全位点Rosa26的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 培养基及常用试剂配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR反应体系与程序 |
| 2.2.2 酶切、连接与转化 |
| 2.2.3 DNA纯化回收 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 基因组提取 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 蛋白提取 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 3'RACE/5'RACE |
| 2.2.11 SSA实验 |
| 2.2.12 TALENs质粒构建 |
| 2.2.13 T7E1检测TALENs效率 |
| 2.2.14 TAT-Cre的纯化 |
| 2.2.15 Western Blotting |
| 2.2.16 Southern Blotting |
| 2.2.17 细胞培养与筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛Rosa26 (bovine Rosa26,bRosa26)位点的定位与表达分析_Toc510886805 |
| 3.1.1 bRosa26位点在基因组中的定位 |
| 3.1.2 3'RACE、5'RACE确定bRosa26转录本 |
| 3.1.3 RT-PCR、Q-PCR检测bRosa26 noncoding RNA在牛各组织中的表达 |
| 3.1.4 bRosa26-EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.1.5 bRosa26启动子体外启动EGFP表达分析 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 TALENs真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.2.1 bRosa26位点TALENs设计与构建 |
| 3.2.2 SSA实验 |
| 3.2.3 T7E1实验 |
| 3.2.4 分析与讨论 |
| 3.3 TALENs介导bRosa26位点基因打靶 |
| 3.3.1 bRosa26位点基因打靶载体构建 |
| 3.3.2 TALENs介导bRosa26位点基因打靶细胞筛选与鉴定 |
| 3.3.3 TAT-Cre重组蛋白报告模型验证 |
| 3.3.4 细胞水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.5 胚胎发育、个体水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.6 分析与讨论 |
| 3.4 RMCE介导bRosa26-EGFP基因替换 |
| 3.4.1 bRosa26-EGFP胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 3.4.2 RMCE替换载体的构建 |
| 3.4.3 RMCE替换克隆点的筛选 |
| 3.4.4 分析与讨论 |
| 3.5 bRosa26位点支持广谱型启动子启动外源基因表达研究 |
| 3.5.1 广谱型启动子启动EGFP打靶载体构建 |
| 3.5.2 细胞克隆点的筛选与鉴定 |
| 3.5.3 外源启动子启动EGFP表达情况分析 |
| 3.5.4 分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（4）人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 抗菌蛋白的研究进展 |
| 1.1 人溶菌酶 |
| 1.1.1 溶菌酶的种类和特点 |
| 1.1.2 溶菌酶的应用 |
| 1.1.3 重组人溶菌酶研究进展 |
| 1.2 人乳铁蛋白研究进展 |
| 1.2.1 乳铁蛋白的分布及特性 |
| 1.2.2 乳铁蛋白的生物学功能 |
| 1.2.3 重组人乳铁蛋白研究进展 |
| 第二章 哺乳动物核移植技术进展 |
| 2.1 哺乳动物核移植技术研究概况 |
| 2.1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 2.1.2 胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 2.1.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 2.1.4 哺乳类转基因克隆动物研究进展 |
| 2.1.5 种间细胞核移植研究进展 |
| 2.2 核移植的相关理论基础与机理 |
| 2.3 核移植的程序 |
| 2.3.1 核移植受体细胞的去核 |
| 2.3.2 核移植供体细胞的分离 |
| 2.3.3 克隆胚胎的重建 |
| 2.3.4 克隆胚的激活 |
| 2.4 影响哺乳动物核移植的因素 |
| 2.4.1 卵母细胞核受体胞质对核移植结果的影响 |
| 2.4.2 核供体对核移植结果的影响 |
| 2.4.3 融合-激活方案对核移植结果的影响 |
| 2.5 哺乳动物核移植的应用前景 |
| 2.5.1 畜牧业 |
| 2.5.2 医疗卫生 |
| 2.5.3 物种保护 |
| 2.6 哺乳动物核移植存在的问题 |
| 第三章 转基因动物研究进展 |
| 3.1 转基因动物研究发展史 |
| 3.2 转基因技术与方法 |
| 3.2.1 显微注射法 |
| 3.2.2 逆转录病毒载体法 |
| 3.2.3 精子载体法 |
| 3.2.4 体细胞克隆法 |
| 3.2.5 胚胎干细胞介导法 |
| 3.2.6 其他技术和方法 |
| 3.3 转基因动物技术的现状及存在的问题 |
| 3.3.1 生产转基因动物需要高水平的 DNA 操作 |
| 3.3.2 转基因动物方法效率低、成本高 |
| 3.3.3 转基因表达水平低，表达效率不高 |
| 3.3.4 转基因在宿主基因组中的行为难以控制，且不容易遗传 |
| 3.3.5 外源基因的整合机制尚不清楚 |
| 3.4 生产转基因动物问题的对策 |
| 3.5 转基因克隆动物技术在生物领域的应用前景 |
| 3.5.1 动物遗传育种 |
| 3.5.2 生物制药及基因治疗 |
| 3.5.3 组织器官移植 |
| 3.5.4 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型 |
| 第四章 hLYZ/hLTF 双基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 IRES 及 hLTF 的 PCR 扩增结果 |
| 4.2.2 phLTF 及 pIRES 的酶切鉴定结果 |
| 4.2.3 对重组质粒 pIL 进行酶切鉴定，结果如下： |
| 4.2.4 对重组质粒 pEBHIL 进行酶切鉴定，结果如下： |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 pEBH-IL 在奶牛乳腺上皮细胞中的表达及乳腺上皮细胞染色体分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 抗性筛选的结果 |
| 5.2.2 GFP 检测 |
| 5.2.3 阳性克隆 PCR 鉴定结果 |
| 5.2.4 SDS-PAGE 凝胶电泳结果 |
| 5.2.5 Western Blot 结果 |
| 5.2.6 牛乳腺上皮细胞染色体分析结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 转基因奶牛克隆胚的体外发育 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试剂和仪器 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同去核方法对克隆胚构建效率的影响 |
| 6.2.2 供体细胞的同步化处理对克隆胚体外发育的影响 |
| 6.2.3 转基因与未转基因乳腺上皮细胞克隆胚发育的比较 |
| 6.2.4 转基因乳腺上皮细胞的冻-融对克隆胚发育的影响 |
| 6.2.5 转基因乳腺上皮细胞传代次数对构建克隆胚体外发育的影响 |
| 6.2.6 EGFP 在克隆胚中的表达 |
| 6.2.7 克隆胚外源基因的 PCR 检测结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）奶牛体外胚胎生产技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 牛卵母细胞体外受精技术研究新进展 |
| 前言 |
| 1.1 影响牛卵母细胞体外受精效率的主要因素 |
| 1.2 牛卵母细胞体外受精技术研究新进展 |
| 1.3 奶牛体外性控胚胎生产 |
| 1.4 其他研究进展 |
| 1.5 牛卵母细胞体外受精存在的问题及对策 |
| 第二章 动物体细胞克隆研究进展 |
| 前言 |
| 2.1 体细胞克隆技术研究的主要成就 |
| 2.2 体细胞克隆技术程序与方法 |
| 结语 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 第一章 奶牛体外性控胚胎生产影响因素的研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 奶牛体细胞克隆技术的研究 |
| 前言 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.2 试验结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 不同冷冻方法对牛体外胚胎ATP 含量与ROS 水平的影响 |
| 3.1 试验材料与试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 第四章 马-牛异种克隆胚胎线粒体遗传分析 |
| 前言 |
| 4.1 试验材料与试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 第五章 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（6）马体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.1.1 哺乳动物体细胞克隆技术的研究现状 |
| 1.1.2 哺乳动物体细胞克隆技术的步骤 |
| 1.1.3 目前诞生的几种克隆哺乳类动物及克隆技术在应用中遇到的问题 |
| 1.1.4 体细胞克隆技术与其他技术的结合应用 |
| 1.1.5 体细胞克隆技术存在的问题 |
| 1.2 哺乳动物异种核移植研究进展 |
| 1.2.1 哺乳动物异种核移植的研究现状 |
| 1.2.2 影响哺乳动物异种核移植效率的因素 |
| 1.2.3 异种细胞核移植技术的应用前景 |
| 1.2.4 马异种核移植研究 |
| 1.3 马体细胞克隆研究进展 |
| 1.3.1 马卵母细胞体外成熟 |
| 1.3.2 马克隆胚的构建 |
| 1.3.3 克隆马的效率 |
| 1.4 本研究的目的意义及研究内容 |
| 1.4.1 研究的目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 马皮肤成纤维细胞的分离和体外培养的研究 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 操作液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 马皮肤组织的采集 |
| 2.2.2 原代培养 |
| 2.2.3 传代培养和纯化 |
| 2.2.4 细胞冷冻保存 |
| 2.2.5 细胞解冻复苏 |
| 2.2.6 细胞生长曲线 |
| 2.2.7 染色体检查 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细胞的培养 |
| 2.3.2 细胞的生长曲线 |
| 2.3.3 染色体计数分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 马体细胞核移植的研究 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 操作液 |
| 3.1.5 卵母细胞体外成熟液 |
| 3.1.6 孤雌激活液 |
| 3.1.7 胚胎培养液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 马卵母细胞体外成熟和孤雌激活 |
| 3.2.2 马的体细胞克隆胚的构建 |
| 3.3 数据分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 不同采卵方法对卵母细胞回首率的影响 |
| 3.4.2 不同成熟液对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4.3 不同成熟液对卵母细胞孤雌激活效率的影响 |
| 3.4.4 不同类型卵母细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率的影响 |
| 3.4.5 核移植效率 |
| 3.4.6 融合电压对融合效率的影响 |
| 3.4.7 克隆胚发育情况 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 马体细胞-驴卵母细胞异种核移植研究 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 操作液 |
| 4.1.5 卵母细胞成熟液 |
| 4.1.6 孤雌激活液 |
| 4.1.7 胚胎培养液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 驴卵巢的收集和驴卵母细胞的采集 |
| 4.2.2 驴卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 驴卵母细胞孤雌激活和体外发育 |
| 4.2.4 马-驴异种克隆胚的构建 |
| 4.3 数据分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 不同成熟液对驴卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.4.2 不同成熟液对孤雌胚发育的影响 |
| 4.4.3 不同卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.4.4 不同卵母细胞保存对驴卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.4.5 不同运输方式对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.4.6 不同激活方法对驴卵母细胞激活效率的影响 |
| 4.4.7 不同发育液对驴卵母细胞孤雌胚胎发育的影响 |
| 4.4.8 提高发育液中葡萄糖浓度对驴孤雌胚胎发育的影响 |
| 4.4.9 提高成熟液 Ca~(2+) 浓度对驴卵母细胞成熟和激活效率的影响 |
| 4.4.10 不同融合电压对马-驴克隆胚融合效率的影响 |
| 4.4.11 融合胚激活和发育情况 |
| 4.4.12 胚胎移植结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 不同成熟液对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.5.2 不同成熟液对孤雌发育的影响 |
| 4.5.3 不同卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.5.4 不同卵母细胞保存时间对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.5.5 不同运输方式对驴卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.5.6 不同激活方法对驴卵母细胞激活效率的影响 |
| 4.5.7 不同发育液对驴卵母细胞的孤雌胚胎发育的的影响 |
| 4.5.8 提高发育液中葡萄糖浓度对驴的孤雌胚胎发育的影响 |
| 4.5.9 提高成熟液 Ca~(2+) 浓度对驴卵母细胞成熟和激活效率的影响 |
| 4.6 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）哺乳动物克隆的现状和研究进展（论文提纲范文）
| 1 动物克隆技术 |
| 1.1 动物克隆技术的研究方法 |
| 1.2 核移植的基本技术环节 |
| 1.2.1 受体卵母细胞 |
| 1.2.2 体细胞的制备 |
| 1.2.3 重组胚的构建方法 |
| 1) 融合法 |
| 2) 胞质内注射 |
| 3) 去透明带———显微操作仪辅助去核法 |
| 4) 去透明带手工克隆方案 |
| 5) 连续核移植 |
| 6) 四倍体胎盘补偿法 |
| 1.2.4 融合和激活 |
| 1.3 去核卵母细胞质对供体细胞核移植效果的影响 |
| 2 克隆技术中亟待解决的问题 |
| 2.1 体细胞克隆成功率低 |
| 2.2 供体核与受体胞质细胞周期同步的问题 |
| 2.3 线粒体来源问题 |
| 2.4 端粒的问题 |
| 2.5 X染色体灭活问题 |
| 2.6 克隆胚胎某些基因的再程序化异常 |
| 3 哺乳动物核移植技术的应用前景 |
| 3.1 在畜牧方面的作用 |
| 3.2 复制濒危动物扩大其种群 |
| 3.3 体细胞克隆技术在医药生产方面的价值 |
| 3.4 体细胞核移植结合基因打靶技术、胚胎干细胞技术将提高转基因动物的生产效率 |
| 3.5 在临床方面的作用 |
| 3.6 体细胞克隆对帮助阐明一些生物学基础问题的价值 |
| 4 结语 |
（8）转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1 哺乳动物体细胞核移植技术的发展 |
| 2 哺乳动物体细胞核移植的基本技术环节 |
| 2.1 供体细胞的选择 |
| 2.2 核受体胞质的准备 |
| 2.3 供体细胞和受体细胞的重组 |
| 2.4 重构胚的激活 |
| 2.5 重构胚的培养 |
| 3 哺乳动物体细胞核移植有关机理研究进展 |
| 3.1 受体细胞和供体细胞的核质互作 |
| 3.2 体细胞供体核的表观重编程 |
| 4 体细胞核移植技术存在的问题与应用前景 |
| 4.1 体细胞细胞核移植技术存在的问题 |
| 4.2 应用前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器生产重组药用蛋白的研究进展 |
| 1 转基因动物制药的诞生 |
| 1.1 细菌基因工程药物阶段 |
| 1.2 细胞基因工程药物阶段 |
| 1.3 转基因动物制药阶段 |
| 2 动物乳腺生物反应器的研究简史 |
| 3 乳腺生物反应器的分类 |
| 3.1 啮齿动物乳腺生物反应器 |
| 3.2 反刍动物乳腺生物反应器 |
| 4 乳腺生物反应器表达载体构建的研究 |
| 4.1 与乳腺组织特异性表达有关的调控元件 |
| 4.2 基于普通质粒的表达载体 |
| 4.3 基于人工染色体的表达载体 |
| 4.4 基于基因打靶的表达载体 |
| 5 乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展 |
| 5.1 原核期胚胎的显微注射法 |
| 5.2 转座子介导法 |
| 5.3 逆转录病毒介导法 |
| 5.4 精子载体法 |
| 5.5 胚胎干细胞介导法 |
| 5.6 原始生殖细胞介导法 |
| 5.7 转基因克隆动物法 |
| 5.8 体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 5.9 诱导多能干细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 6 乳腺生物反应器的鉴定 |
| 6.1 DNA水平的检测 |
| 6.2 RNA水平的检测 |
| 6.3 目的蛋白的检测 |
| 7 转基因乳腺生物反应器存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 人溶酶体β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人胎盘组织总RNA的完整性 |
| 2.2 GlcCerase cDNA的扩增 |
| 2.3 GlcCerase序列分析结果 |
| 2.4 pEGFP-GlcCerase重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.5 荧光显微镜观察COS7细胞中GFP基因的表达 |
| 2.6 转染COS7细胞中GlcCerase基因的mRNA表达 |
| 2.7 转染COS7细胞中GlcCerase基因的蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 人GleCerase基因乳腺表达载体的构建及其在乳腺上皮细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体的鉴定 |
| 2.2 HC-11细胞的转染与鉴定 |
| 2.3 GlcCerase基因在转基因HC-11细胞中的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺特异表达载体的构建 |
| 3.2 乳腺特异表达载体的验证手段 |
| 3.3 乳腺上皮细胞合成乳蛋白的可能机制 |
| 参考文献 |
| 第五章 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞的一般形态观察 |
| 2.2 胎儿细胞性别鉴定 |
| 2.3 胎儿细胞生长曲线分析 |
| 2.4 胎儿细胞核型分析 |
| 2.5 胎儿细胞转染效率的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的原代培养与生物学特性分析 |
| 3.2 脂质体转染体细胞效率的优化 |
| 参考文献 |
| 第六章 转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞抗性试验 |
| 2.2 外源基因转染山羊胎儿成纤维细胞 |
| 2.3 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.4 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.5 转基因细胞的核型分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转基因阳性细胞克隆的分离 |
| 3.2 转基因阳性细胞的筛选 |
| 3.3 转基因供体细胞的染色体倍性 |
| 参考文献 |
| 第七章 转人GlcCerase基因奶山羊克隆胚的构建及胚胎移植 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊卵母细胞的体外成熟培养 |
| 2.2 山羊转基因体细胞的核移植 |
| 2.3 转基因体细胞克隆胚的体外培养与发育 |
| 2.4 转基因体细胞克隆胚的PCR检测 |
| 2.5 山羊转基因克隆胚的胚胎移植 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转染和筛选对转基因克隆胚胎发育的影响 |
| 3.2 技术操作过程对核移植效率的影响 |
| 3.3 重构胚胎培养体系 |
| 参考文献 |
| 第八章 外源基因转染对奶山羊供体细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养细胞的形态与生长曲线 |
| 2.2 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.3 外源基因转染对细胞周期分布的影响 |
| 2.4 外源基因转染对细胞凋亡的影响 |
| 2.5 外源基因转染对细胞基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因转染对奶羊体细胞周期分布和细胞凋亡的影响 |
| 3.2 外源基因转染对奶羊体细胞基因相对表达水平的影响 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的内容 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）氨基酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 哺乳动物体细胞克隆技术的研究现状 |
| 1.2 影响哺乳动物体细胞克隆效率因素 |
| 1.2.1 培养条件对体细胞克隆效率的影响 |
| 1.2.2 培养液成分对体细胞克隆效率的影响 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植技术存在的问题及应用前景 |
| 1.3.1 哺乳动物体细胞核移植技术存在的问题 |
| 1.3.2 哺乳动物体细胞核移植技术应用前景 |
| 1.4 本实验研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验时间和地点 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 试验主要药品及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 药品的配制 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.3 试验设计 |
| 2.4 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 培养液中添加不同浓度谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.2 培养液中添加不同浓度牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.3 培养液中谷氨酰胺及牛磺酸联合添加对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.4 培养液中添加不同浓度谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.5 培养液中添加不同浓度精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.6 培养液中添加不同浓度甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.7 培养液中添加不同浓度丙氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 3.8 培养液中添加不同浓度脯氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.2 牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.3 谷氨酰胺与牛磺酸联合作用对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.4 谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.5 精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.6 甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.7 脯氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 4.8 丙氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A.硕士期间发表的论文 |
四、哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题（论文参考文献）
- [1]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [2]牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰[D]. 王明. 中国农业大学, 2018(02)
- [3]1例转基因克隆牛脑和免疫器官组织形态观察报告[J]. 徐金霞,张羽,王勇胜,边珍,卿素珠,张涌. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2012(06)
- [4]人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育[D]. 曹俊伟. 西北农林科技大学, 2012(11)
- [5]奶牛体外胚胎生产技术的研究[D]. 朱化彬. 甘肃农业大学, 2011(04)
- [6]马体细胞核移植的研究[D]. 赵高平. 内蒙古农业大学, 2011(12)
- [7]哺乳动物克隆的现状和研究进展[J]. 盛鹏程,苗向阳,朱瑞良. 科技导报, 2010(13)
- [8]转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D]. 张艳丽. 南京农业大学, 2010(06)
- [9]氨基酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响[D]. 韩岩. 延边大学, 2010(10)
- [10]哺乳动物体细胞克隆胚胎端粒酶活性的研究进展[J]. 张宇,尹多,李丽,方南洙,李钟淑. 江苏农业科学, 2010(02)