一、RT-PCR技术快速检测烟草丛顶病研究（论文文献综述）
马思思[1]（2020）在《宁南霉素抗烟草花叶病毒的作用机理的初步研究》文中提出烟草花叶病毒病对我国农业生产造成了巨大的影响,烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是导致烟草花叶病毒病最典型的病原。它是世界上危害最严重的十种植物病毒之一。宁南霉素具有显着的抗TMV活性,是一种高效、低毒、低残留的抗病毒药剂。目前对宁南霉素抗TMV的作用机理研究已取得一些进展,但关于宁南霉素对TMV在普通烟（Nicotiana tabacum）系统侵染的影响,以及宁南霉素抗TMV过程中对寄主DNA甲基化相关基因表达水平的影响尚不清楚。心叶烟（Nicotiana glutinosa）半叶枯斑法常用于抗病毒药剂的初步筛选,本文对心叶烟半叶枯斑法进行了优化并验证了宁南霉素对TMV的钝化作用、保护作用、治疗作用。进一步研究了宁南霉素对TMV在普通烟局部侵染和系统侵染能力的影响。本文还首次分析了宁南霉素抗TMV过程中对植物DNA甲基化相关基因表达量的影响。获得以下结果:从培养温度和接种TMV浓度以及接种方法三个方面对心叶烟半叶枯斑法进行了优化,并且验证了宁南霉素对TMV具有良好的钝化、保护、治疗作用,枯斑抑制率分别为71.26%,57.69%和51.22%。DAS-ELISA结果表明TMV在普通烟接种叶发生侵染的最早时间点是12hpi;对系统叶片进行RT-PCR,结果表明接种3天后TMV可发生系统侵染。与喷施灭菌水对照后接种TMV相比,喷施宁南霉素后接种TMV,TMV在接种叶的积累量显着降低。宁南霉素对TMV在系统叶上的积累量没有显着影响,但对TMV在普通烟症状的产生具有明显的延迟作用。通过对灭菌水组、宁南霉素组、灭菌水+TMV组、宁南霉素+TMV组四个不同处理的普通烟接种叶上DNA甲基化相关基因表达量进行RT-qPCR分析。结果表明宁南霉素使普通烟中DNA甲基转移酶DRM2的表达水平显着降低,喷施宁南霉素后接种TMV使DNA甲基转移酶MET1,DRM2和DNA去甲基转移酶ROS1,DML2的表达水平均显着下降。
窦宝存[2]（2020）在《烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作》文中进行了进一步梳理RNA病毒的不依赖帽子翻译调控元件主要包括两类:位于基因组5’端的核糖体内部进入位点（Internal Ribosome Entry Site,IRES）和位于基因组3’端的不依赖帽子翻译调控元件（3’Cap-Independent Translation Element,3’CITE）。其中3’CITE结合的翻译起始复合物,大多是由远距离RNA-RNA互作呈递到基因组5’端起始翻译。参与远距离RNA-RNA互作的5’端区域是否受到临近RNA序列或结构的影响,这方面的研究很少。烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）基因组5’端没有帽子结构（m7GPPPN）,3’端也没有poly（A）尾,依赖其3’非翻译区（Untranslated Region,UTR）的不依赖帽子翻译调控元件BTE招募翻译起始因子进行不依赖帽子翻译,需要远距离RNA-RNA互作的协同调控。前期研究表明,基因组5’末端区域（RI区）是造成多个TBTV分离物翻译效率差异的主要区域之一。在此基础上,通过嵌合突变体的突变和体外翻译实验分析基因组5’端区域的RNA序列对远距离RNA-RNA互作的影响,发现调控TBTV不依赖帽子翻译的远距离RNA-RNA互作受到“精妙的开关”调控。具体结果如下:1.嵌合突变体TB-MDI（1-511）的p35蛋白表达量相对于野生型明显下降,而嵌合突变体拥有与野生型TBTV一样的BTE结构;以远距离互作可能受影响为研究切入点,在嵌合突变体TB-MDI（1-511）的5’末端增加额外的5’UTR序列（AGGTTACGAT）。新增加1个拷贝的5’UTR序列,p35蛋白的表达量并没有变化;新增加2个拷贝的5’UTR序列,p35蛋白表达量恢复到野生型水平。说明弱毒分离物TB-MDI的RI区（1-511nt）可能存在特有的突变,该突变限制了嵌合突变体TB-MDI（1-511）的远距离RNA-RNA互作;而额外2个拷贝的5’UTR序列插入则可以恢复远距离RNA-RNA互作。2.以TB-MDI（1-511）+2*5U为基础,突变不同位置的5’UTR序列中参与远距离互作的碱基（AGGTTACGAT,下划线标出参与互作的碱基）,分析3个5’UTR序列恢复翻译效率的机制。突变3’端的5’UTR,突变体翻译水平降低至TB-MDI（1-511）+2*5U的30%。在此基础上继续突变中间的5’UTR,翻译水平提高至野生型水平;突变5’端的5’UTR,突变体翻译水平降低至50%。同样在此基础上继续突变中间的5’UTR,翻译水平略有降低,但变化并不明显。而5’UTR突变体的BTE区域内的潜在回复突变体无法回复翻译水平。说明3个5’UTR序列对于翻译效率的恢复既有数量效应又有位置效应。3.比较TBTV不同分离物的1-511的序列,翻译效率较低的弱毒分离物（TB-MDI、TB-MDII、TB-JC）与野生型相比,存在9个共有突变位点,分别是第1位的A突变为G、147位的A突变为C、291位的U突变为C、299位的A突变为U、300位的U突变为C、340位的U突变为C、405位的A突变为U、407位的U突变为C和464位的G突变为C。其中三处造成了明显的RNA结构变化,分别是第299-300位碱基处、第405/407位碱基处和第464位碱基处。针对这些突变位点构建两种类型的突变体:以TBTV-Ch为基础将这些位置的碱基分别突变为弱毒分离物的对应位置碱基,翻译水平变化不明显;以嵌合突变体TB-MDI（1-511）为基础,将这些位置的碱基分别突变为TBTV-Ch的对应位置碱基,翻译水平有一定的上升。以TBTV-Ch为基础组合突变两处碱基及以上,翻译水平明显降低;以TB-MDI（1-511）为基础组合突变,翻译水平明显上升。说明第299-300位、第405/407位和第464位碱基的共有突变,通过限制远距离的RNA-RNA互作而降低了不依赖帽子的翻译效率,且同步突变对翻译的抑制效应强于单处突变的抑制效应。以上结果说明,在p35蛋白低水平表达的TBTV分离物的1-511 nt范围内存在特定的突变位点限制不依赖帽子翻译所需的远距离RNA-RNA互作,即TBTV不依赖帽子翻译相关的远距离RNA-RNA互作存在精细的调控开关。
夏烨[3]（2017）在《三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作》文中研究指明烟草（Nicotiana tabacum L）是一种重要经济作物。病毒病给烟草产业带来严重的经济损失。其中,烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）的危害最为严重。近年来,烟田中两种或者多种病毒复合侵染的比例日益增高。烟田土壤带有TMV、CMV、PVY是导致烟株带毒的重要因素。为了建立高效的烟田土壤病毒检测方法,搞清烟草中多重病毒互作的机理,本文展开了系列研究,主要结果如下:1本研究建立了完善的烟田土壤携带病毒的检测方法。分别利用ELISA、RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP的方法均可以对烟田土壤中的TMV、CMV、PVY进行有效检测。四种方法检测TMV灵敏度分别为10-3g土/mL、10-3、10-5和10-6;检测CMV的灵敏度分别是10-1g土/mL、10-1、10-3和10-4;检测PVY的灵敏度分别为10-2 g/mL、10-2、10-4和10-5。2侵染烟草的三种主要病毒在土壤中的分布与含量不同。TMV、PVY的分布最为广泛,CMV最少。随着距离感病烟草根部垂直距离和水平距离的增加,土壤中病毒的含量逐渐减少。随着烟株种植时间的增长,土壤中病毒的积累量和扩散能力都增大。烟草连作土壤里的病毒含量多于烟草与水稻轮作土壤里的病毒含量。3在TMV和CMV复合侵染时,CMV对TMV的CP基因、MP基因、p-183基因和p-126基因的表达起干扰作用。TMV对CMV起协生作用,促进CMV 2b基因、CP基因、MP基因、Rep基因的表达。这种干扰/协生作用在接种30天的时候到达一个向上/下的拐点。在TMV、CMV和PVY三种病毒复合侵染时,PVY对CMV起干扰作用,主要体现在抑制CMV 2b基因、CP基因、MP基因、Rep基因的表达。PVY对TMV起协生作用,主要体现在促进TMV的MP基因和p-183基因的表达。复合侵染21天开始,PVY对TMV协生和CMV对TMV的干扰这两种作用逐渐达到平衡。复合侵染2130天时,PVY对CMV的干扰作用强于TMV对CMV的协生作用。复合侵染过程中,TMV、CMV严重干扰甚至抑制了PVY的基因表达。以上工作的完成,对于深入了解烟田主要病毒的传播途径和在烟草中的互作机理,制定有效措施防控病毒病害,减少经济损失具有重要意义。
王艳娇[4]（2017）在《柑橘脉突病毒侵染性克隆构建及其基因沉默抑制子鉴定》文中提出柑橘脉突病毒（Citrus vein enation virus,CVEV）是黄矮病毒科（Luteoviridae）豌豆耳突花叶病毒属（Enamovirus）的一种正义单链RNA病毒,引起柑橘脉突病及木瘤病。目前,CVEV在西班牙、南非、澳大利亚、巴西、印度、美国、秘鲁和土耳其等多个国家均有发生,在我国主要分布于浙江黄岩地区。由于该病毒能由多种蚜虫传播,因而具有一定的传播流行风险。为保障我国柑橘产业安全,本研究在建立CVEV实时荧光定量RT-PCR检测方法的基础上,构建CVEV全长cDNA克隆,分析其侵染性,并开展了CVEV基因沉默抑制子的鉴定,以期为CVEV的流行监控、分子生物学及致病机理研究奠定基础。所取得的主要研究结果如下:1.CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立本研究通过设计特异性引物（EVqF4/EVqR4）,优化反应条件,建立了CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;灵敏度较高（为常规RT-PCR的100倍）;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率为101.8%;检测组间和组内变异系数均不超过2.85%,重复性较好,适用于检测田间样品。2.CVEV在代代酸橙植株中的时空分布应用所建立的实时荧光定量RT-PCR检测体系对CVEV在代代酸橙中的时空分布进行检测。结果表明,CVEV在代代酸橙根中,无论春季、夏季或者秋季,其含量相对于其它部位最高,其次是嫩皮;另外,嫩叶、嫩皮和老皮中CVEV含量在春季最高,春、夏、秋依次减少。3.构建CVEV全长cDNA克隆及其序列分析本研究建立了CVEV全基因组一步法RT-PCR扩增体系,并成功获得其全长cDNA克隆36个。序列比对结果显示,本研究所获CVEV全长基因组序列（命名为CVEV-XSH）与已报道的VE-1分离株基因组序列相似度最高,为98.61%;与豌豆耳突花叶病毒-1（Pea enation mosaic virus-1,PEMV-1）和紫花苜蓿耳突病毒（Alfalfa enamovirus-1,AEV）曼菲蒂分离株序列进行比对,其一致性分别为90.46%和90.26%,表明CVEV-XSH基因序列相对保守。根据全基因组序列构建的进化树显示,CVEV-XSH与VE-1、PEMV-1、AEV曼菲蒂分离株聚为一簇,与序列相似性分析结果一致。4.CVEV全长cDNA克隆侵染性分析采用农杆菌介导的本生烟接种法,对获得的36个CVEV全长cDNA克隆进行了侵染实验。生物学观察以及分子检测结果显示未获得侵染性克隆。为此,本研究进一步设计实验,旨在发掘影响其侵染性的因素。首先,利用5’Race技术获得末端序列,并对其变异情况进行分析;结果显示,CVEV 5’端序列保守性极高,未发现变异存在。其次,采用与CVEV全长cDNA克隆相同的方法构建PVX全长cDNA克隆,成功获得PVX全长cDNA侵染性克隆,说明本研究所用双元表达载体pXT1以及构建方法均有效。第三,为避免重组质粒在大肠杆菌中存在不稳定现象而造成侵染失败问题,本研究将CVEV全长基因PCR产物与表达载体pXT1连接后,直接转化农杆菌初步得到4个阳性克隆,接种后经分子检测仍未筛选出侵染性克隆。第四,筛选其它草本寄主,即采用毒源叶片汁液摩擦接种豌豆、蚕豆、芸豆、昆诺藜等草本植株,结果显示均未表现出侵染性。综上表明,CVEV全长cDNA克隆侵染失败并非5’末端序列变异、表达载体以及构建方法所致,而针对重组质粒在大肠杆菌中不稳定以及寄主影响,或者其它原因造成的侵染失败,还需进一步分析探究。5.CVEV基因沉默抑制子的初步鉴定本研究在克隆CVEV 5个开放阅读框（Open reading frame,ORF）编码基因的基础上,构建其重组双元表达载体,并利用农杆菌介导的病毒微型复制子（p35miniBYV-eGFP）共浸润鉴定法开展了沉默抑制子鉴定试验。结果显示:CP表达载体共注射本生烟植株各重复均出现绿色荧光,其荧光强度较负对照强,但与正对照HC-Pro相比较弱,说明CP具有一定的基因沉默抑制作用。其它ORF表达载体共注射植株与负对照相比无明显差异;进一步经实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,CP表达载体共注射本生烟叶片中GFP相对表达量高于负对照1倍左右,低于正对照,其它基因与负对照相比表达差异不大,CP可初步认定为弱抑制子。
周翠姬[5]（2017）在《BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究》文中研究说明病毒协生互作是指两种不相关的病毒复合侵染同一寄主植物,使寄主植物出现更加严重的症状或者其中一种或两种病毒的积累量增加。马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）是最具有经济重要性的植物病毒属之一,该属病毒常与幽影病毒属病毒（umbraviruses）复合侵染,引起严重的植物病害。然而,马铃薯卷叶病毒属病毒与幽影病毒属病毒协生互作的机制尚不十分清楚。本论文以马铃薯卷叶病毒属的芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）以及幽影病毒属的豌豆耳突花叶病毒2号（Pea enation mosaic virus 2,PEMV 2）为主要研究材料,对BrYV与PEMV 2在本生烟（Nicotiana bentaamiana）协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱进行研究。与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟导致:（1）本生烟植株产生严重的症状;（2）BrYV的积累量明显升高;（3）BrYV能够进行摩擦接种;（4）BrYV突破韧皮部局限。BrYV P0突变体病毒BrYV-APO和BrYV-P0H10Q/T11P并不能与PEMV 2在本生烟上协生互作。而缺失了通读结构域（Read-through domain,RTD）的BrYV病毒突变体（BrARTD）能与PEMV 2在本生烟上协生互作。通过农杆菌介导的叶盘转化方法获得了能稳定表达BrYV P0-6×Myc或PEMV 2 ORF4-3×Flag的转基因本生烟植株,为后续研究提供重要的实验材料。以上结果表明BrYV与PEMV 2在本生烟上存在协生互作并引起一系列的协同效应。转录组高通量测序结果表明与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟引起更多的基因表达发生变化,有1778个基因的表达在病毒复合侵染时发生特异性的上调或下调,这些基因主要包括光合作用相关基因、乙烯相关基因、植物防御相关基因、RNA沉默相关基因、转录因子和蛋白翻译相关基因。推测在BrYV与PEMV 2协生互作时发生特异性变化的基因为潜在的与病毒协生互作相关的寄主因子。小RNA高通量测序结果说明BrYV与PEMV 2协生互作主要对来源于BrYV病毒的小干扰RNA（Virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs）产生影响,表现为:（1）显着提高了 BrYV vsiRNAs的积累量;（2）改变了 BrYV vsiRNAs的正负义链的比例;（3）明显地改变了 BrYV vsiRNAs在BrYV基因组上的分布以及相对积累量。BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟特异性地引起14个本生烟miRNAs表达水平的变化,其中6个为显着上调,8个为显着下调。以上结果解析了病毒协生互作对病毒vsiRNAs以及寄主miRNAs的影响。同时,对Polerovirus新病毒进行了分子鉴定与序列分析。从豌豆和蚕豆样品中发现并鉴定了一种新的马铃薯卷叶病毒属病毒,暂命名为豌豆温和褪绿病毒（Pea mild chlorosis virus,PMCV）。另外,从甜菜样品中发现了甜菜西方黄化病毒（Beet western yellows virus,BWYV）的一种新株系并获得了其全长基因组序列,该株系存在两种基因型,即BWYV-BJA和BWYV-BJB。这两种基因型全长序列一致性为93.0%,序列差异主要位于基因组的5’端区域,其它区域则相对保守。系统发育进化树分析和重组分析表明BWYV-BJA和BWYV-BJB可能是重组病毒。
王德亚[6]（2017）在《烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化》文中研究指明烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）属于番茄丛矮病毒科幽影病毒属,基因组由一条正义单链RNA（+ssRNA）组成,全长约4,152 nt。5’端缺乏帽子结构（m7GPPPN）,3’末端也不带poly（A）尾,编码4个ORF,包括复制酶组分p35蛋白及其-1位移码产物p98蛋白（RNA依赖RNA聚合酶,RdRp）,运动蛋白p26和p27。前人研究表明,TBTV基因组的3’UTR含有不依赖帽子翻译元件BTE,可以调控报告基因的表达。本文分析了BTE在全长TBTV中对p35蛋白翻译的调控作用以及对TBTV在BY-2原生质体中的RNA积累的作用。另外从中国云南地区克隆了3个新的TBTV弱毒分离物,发现其p35表达量相对于野生型（TBTV-Ch）明显降低,且p35表达量降低与BTE元件的结构变异相关。利用体外翻译系统WGE,以TBTV基因组全长RNA为材料全面分析其不依赖帽子翻译,发现TBTV基因组中除BTE外还存在至少1种类型的不依赖帽子翻译元件。具体结果如下:（1）TBTV全基因组克隆及分子进化:通过5’RACE和3’RACE结合一步RT-PCR的方法,克隆得到3个新的弱毒分离物TBTV-JC（KM016224）、TBTV-MD-I（KM016225）和TBTV-MD-II（KM067277）。基因组全长均为4,152 nt;与之前报道的TBTV分离物不同,第一个碱基是鸟嘌呤（G）而不是腺嘌呤（A）。序列一致性比对发现ORF1编码区是TBTV基因组中变化最大的区域（75.0%-99.2%）;系统进化树显示各基因独立进化;在已报道的7个TBTV分离物中共发现32个疑似的重组事件。（2）BTE元件对于TBTV翻译和复制的影响:通过萤火虫荧光素酶（Fluc）载体和TBTV全长RNA的体外翻译分析,发现BTE元件发挥调控不依赖帽子翻译作用的核心分子特征包括3方面:SL-I的17 nt保守序列;与5’UTR形成远距离RNA-RNA互作的SL-III A;BTE本身的结构稳定性。BTE的突变也影响TBTV在BY-2原生质体中的RNA积累,说明BTE通过调控蛋白翻译从而影响病毒的致病性。（3）TBTV不同分离物体内RNA积累量分析:3个TBTV弱毒分离物在烟草原生质体中的RNA积累量是野生型的30%-40%。而其p35蛋白的表达量是野生型的25%,38%和20%,表明p35表达量降低可能与其弱致病力相关。（4）TBTV不同分离物p35蛋白表达差异的分子机制:嵌合病毒的体外翻译表明,造成弱毒分离物p35蛋白表达量降低的主要调控区域是RI区（基因组5’端的500 nt）和包含BTE的RV区（3’端的3,138 nt到3,885 nt区间）。对于RV区而言,弱毒分离物中BTE内的点突变几乎不影响p35表达,而BTE区域外则存在降低p35表达的突变U3580→A3580。进一步的RNA结构预测,在p35表达量低的TBTV分离物和嵌合病毒中均发现含有典型BTE结构的比例很低;而p35表达量高的TBTV分离物则含有高比例的典型BTE结构特征。利用SHAPE技术分析TBTV不同分离物和嵌合病毒的BTE区域的结构,发现TBTV弱毒分离物以及RV嵌合病毒的BTE区域均发生了明显结构变化。说明BTE的结构变异是导致TBTV弱毒分离物p35蛋白表达降低的分子基础,且此BTE结构变异由BTE区域外的突变造成。这是首次关于不依赖帽子翻译元件在特定RNA病毒不同分离物间结构进化的报道。对于RI区而言,其降低p35蛋白表达的机制在于突变造成5’端的局部结构变化,进而抑制了5’UTR与BTE的SL-III A形成远距离RNA-RNA互作。因此,TBTV弱毒分离物的p35低表达的分子基础是BTE元件的结构变异以及远距离RNA-RNA互作的抑制。（5）TBTV中新的不依赖帽子翻译元件:通过对TBTV 3’UTR区域的系列缺失实验,发现TB-D9（4040-4099）和TB-D10（4093-4152）的缺失会明显降低p35蛋白的表达,通过Mflod预测发现4003-4152形成独立结构域,并且利用SHAPE技术分析发现D9和D10的缺失突变并没有影响BTE元件的活性结构。反式竞争实验也证明了4003-4152区对于p35不依赖帽子翻译的调控作用。因此,在TBTV的3’UTR还存在除BTE之外的不依赖帽子翻译调控元件。利用In line-proing技术分析4003-4152的结构,包含5个发夹结构和3个假节点。此结构与TCV的3’UTR的结构类似,也可能存在TSS结构。
莫笑晗,徐萍,赵兴能,张丽芳,秦西云,夏振远[7]（2015）在《烟草脉扭病毒与烟草丛顶病伴随RNA的互作研究》文中提出烟草丛顶病是我国目前报道的唯一由幽影病毒属和黄症病毒科病毒复合侵染引起的植物病毒病害,给云南烟草生产造成了重大的经济损失。烟草丛顶病病原病毒复合体是目前发现的最复杂的幽影病毒/黄症病毒复合体,其病毒粒子的外壳蛋白由烟草脉扭病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）编码,病毒粒子中包含5种病毒RNA组分。本研究首次获得了烟草丛顶病病原病毒复合体中两种组分[TVDV和烟草丛顶病伴随RNA（Tobacco bushy top disease-associated RNA,TBTDa RNA）]的农杆菌介导的侵染性克隆,建立了这两种病毒组分的反向遗传学平台,并应用农杆菌浸润接种技术对它们的互作关系进行了研究。TBTDaR NA侵染性克隆是第一个马铃薯卷叶病毒属伴随RNA（Polerovirus-associated RNA）的农杆菌介导的侵染性克隆。结果表明:TVDV可以单独侵染本氏烟,但是在植株上不引起明显的症状;TBTDa RNA单独接种无法系统感染本氏烟,也不引起症状;TBTDa RNA和TVDV同时接种本氏烟时导致植株产生明显的病害症状,并且TVDV和TBTDaR NA同时感染了植株的系统叶。TVDV可以帮助TBTDa RNA在植物体内进行系统侵染,反之TBTDaR NA促进了TVDV感染的本氏烟病害症状的产生。
莫笑晗,徐萍,赵兴能,张丽芳,秦西云,夏振远[8]（2015）在《烟草脉扭病毒与烟草丛顶病伴随RNA的互作研究》文中指出烟草丛顶病是我国目前报道的唯一由幽影病毒属和黄症病毒科病毒复合侵染引起的植物病毒病害,给云南烟草生产造成了重大的经济损失。烟草丛顶病病原病毒复合体是目前发现的最复杂的幽影病毒/黄症病毒复合体,其病毒粒子的外壳蛋白由烟草脉扭病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）编码,病毒粒子中包含5种病毒RNA组分。本研究首次获得了烟草丛顶病病原病毒复合体中两种组分[TVDV和烟草丛顶病伴随RNA（Tobacco bushy top disease-associated RNA,TBTDa RNA）]的农杆菌介导的侵染性克隆,建立了这两种病毒组分的反向遗传学平台,并应用农杆菌浸润接种技术对它们的互作关系进行了研究。TBTDa RNA侵染性克隆是第一个马铃薯卷叶病毒属伴随RNA（Polerovirus-associated RNA）的农杆菌介导的侵染性克隆。结果表明:TVDV可以单独侵染本氏烟,但是在植株上不引起明显的症状;TBTDa RNA单独接种无法系统感染本氏烟,也不引起症状;TBTDa RNA和TVDV同时接种本氏烟时导致植株产生明显的病害症状,并且TVDV和TBTDa RNA同时感染了植株的系统叶。TVDV可以帮助TBTDa RNA在植物体内进行系统侵染,反之TBTDa RNA促进了TVDV感染的本氏烟病害症状的产生。
李晓静[9]（2014）在《三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析》文中提出三七是我国中药材中的一颗明珠，具有非常重要的药用和医疗保健价值。但因其特殊的生长、管理条件，很容易造成病毒病的发生，该病害的发生严重影响三七的生活力，降低三七的产量和质量，对生产构成严重的威胁。但到目前为止，有关三七病毒病的研究很少，而且现有的研究也仅仅停留在三七病毒病原物的鉴定层面上。植物病毒病被称作是“植物的癌症”，防治植物病毒病最重要的工作首先就是要明确病毒病原物，然后才能通过分析各个病原物的传播方式、寄主范围及发生规律等方面防控病毒病的发生。鉴于此，本文旨在通过对三七病毒病病原物开展进一步的鉴定研究，探明三七病毒中除三七Y病毒（Panax virus Y，PnVY）外的其他种类及优势种，明确其寄主范围，确定病毒分离物/复合体与症状类型的相关性，为进一步深入开展相关病毒的致病性分子机理、病害的监测和预报以及有效防控提供坚实的理论基础和技术指导，并对国内外该领域的相关研究工作起到一定的借鉴和推动作用。本文以三七病叶为材料提取dsRNA及提纯病毒，并尝试以dsRNA为模板构建cDNA文库得到可能的病毒种类，以三七病毒提纯产物为材料通过电镜技术和SDS-PAGE、质谱分析技术分别进行病毒粒子形态观察及可能的病毒种类初步鉴定。结果经dsRNA、提纯病毒及电镜技术等再次验证三七病样除了PnVY之外还存在不止一种病毒病原物。而由于提取的dsRNA浓度过低，致使没能成功完成对cDNA文库的构建。质谱分析的结果显示三七病样中可能存在大豆矮缩病毒（Soybean dwarf virus，SbDV），但经SbDV特异性引物检测及序列分析，并未在该批三七病样中检测到SbDV。应用双生病毒（geminiviruses）的基因组DNA及卫星（betasatellite）的DNA检测通用引物和中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的特异性引物，在三七病样YWSh03中检测到了的TYLCCNV和TYLCCNB，并获得了TYLCCNV和TYLCCNB的全长基因组序列。然后将含有TYLCCNV及TYLCCNB侵染性克隆的农杆菌菌悬液、菌落接种至三七叶片上，并且通过获毒的粉虱对三七进行传毒试验。结果农杆菌接种的三七苗都表现为黄化症状，而粉虱传毒的三七苗症状不明显，但通过PCR检测均能检测到TYLCCNV和TYLCCB。通过分子生物学和生物学的方法证实了TYLCCNV及TYLCCNB对三七的侵染，完成了柯赫氏法则的验证，这是TYLCCNV及TYLCCNB侵染人参属植物的首次报道。以三七病叶、dsRNA和病毒提纯产物为接种材料，将其摩擦接种于供试植株中，接种一月之久，大部分寄主表现出褪绿黄化的症状，但经RT-PCR检测后，PnVY的寄主只有有茄科的黄烟、辣椒和豆科的豇豆。对文山、红河、昆明、曲靖等地的三七种植园进行了病害调查和相关病毒的检测。发现三七病毒病的症状类型多样，发病率逐年增加，且田间表现复合症状的居多。初步建立了PnVY和TYLCCNV的双重PCR检测体系，该体系能够快速及时准确的对三七田间这两种病毒的发生开展检测及分析。运用双重PCR检测体系对不同地区三七病样的PnVY和TYLCCNV的带毒率进行检测，发现由两种病毒复合侵染的现象较多，复合侵染率在38.7%50.0%之间，且从整体来讲，PnVY对三七的侵染率最高。获得了5个PnVY分离物的全基因组序列、6个TYLCCNV分离物基因组全序列及4个TYLCCNB的基因组全序列，并对其进行基因组结构分析及系统进化分析，推测三七病毒病复杂多样的症状类型可能与TYLCCNV及TYLCCNB无太大相关性，但可能与PnVY的基因组结构相关，尤其是PnVY的P1蛋白可能与三七症状多样性相关。
王凤龙,任广伟,张成省[10]（2012）在《烟草植物保护技术发展现状与趋势》文中研究说明本报告综述了近两年来我国烟草植物保护技术的研究进展。在烟草病理方面,对烟草与病原物互作、重要病害病原物变异进行了研究,研发了重要病害的分子检测技术,并对生产上发生的新病害种类进行了鉴定。在烟草昆虫方面,开展了重要害虫控制基础及抗药性研究,明确了B型烟粉虱与其它昆虫的种间竞争关系,初步明确了茉莉酸甲酯在烟草诱导抗虫性方面的作用,开始关注全球气候变化对烟草及有害生物的影响。以生物防治为代表的环境友好型病虫害防治技术取得较大进展,分离鉴定、筛选评价了大量优良生防菌株,优化了拮抗菌株的生产工艺。部分天敌的保护和商品化生产日益成熟,并在生产中成功应用。以农药减量控害、节本增效为目标,从农药、药械和施药方式等方面入手,开展了精准高效施药技术研究,取得了重要研究进展。全国烟草病虫害预测预报网络日趋完善,制定了一批病虫害测报调查技术规程,病虫害监测预警水平明显提升。农药大田对比试验网络进一步健全,农药管理更加规范,使用技术更趋合理。本报告还讨论了国内外烟草植物保护技术存在的差异,分析该领域的发展趋势并提出了重点研究方向。
二、RT-PCR技术快速检测烟草丛顶病研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RT-PCR技术快速检测烟草丛顶病研究（论文提纲范文）
（1）宁南霉素抗烟草花叶病毒的作用机理的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 烟草花叶病毒病的概况 |
| 1.1.1 烟草花叶病毒的简介 |
| 1.1.2 烟草花叶病毒的危害 |
| 1.1.3 烟草病毒病的防治措施 |
| 1.2 抗植物病毒作用机理的研究进展 |
| 1.2.1 抑制病毒侵染寄主 |
| 1.2.2 影响病毒在寄主体内的复制和增殖 |
| 1.2.3 抑制寄主的症状表达 |
| 1.2.4 诱导寄主产生抗病性 |
| 1.3 宁南霉素抗TMV作用机理的研究进展 |
| 1.3.1 宁南霉素抑制TMV CP聚合 |
| 1.3.2 宁南霉素对TMV侵染的影响 |
| 1.3.3 宁南霉素诱导寄主产生抗病性 |
| 1.4 DNA甲基化对植物抗病性的影响 |
| 1.4.1 DNA甲基化和去甲基化的简介 |
| 1.4.2 DNA甲基化诱导植物产生抗病性的研究 |
| 1.5 心叶烟半叶枯斑法 |
| 1.6 研究背景和意义 |
| 1.7 研究内容及方法设计 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 方法设计 |
| 第二章 验证宁南霉素对TMV的钝化、保护和治疗作用 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试寄主 |
| 2.1.2 供试毒源 |
| 2.1.3 供试药剂与主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 TMV的提纯及浓度测定 |
| 2.2.2 心叶烟半叶枯斑法的优化 |
| 2.2.3 验证宁南霉素对TMV的钝化、保护和治疗作用 |
| 2.2.4 数据统计与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 紫外分光光度计测定TMV的浓度 |
| 2.3.2 心叶烟半叶枯斑法的优化 |
| 2.3.3 宁南霉素对TMV的钝化、保护和治疗作用 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 宁南霉素对TMV在普通烟积累量及症状产生的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试寄主 |
| 3.1.2 供试毒源 |
| 3.1.3 供试药剂与主要试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) |
| 3.2.2 RT-PCR检测方法 |
| 3.2.3 检测宁南霉素对TMV在普通烟接种叶上积累量的影响 |
| 3.2.4 检测宁南霉素对TMV在普通烟系统叶上积累量及症状产生的影响 |
| 3.2.5 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 宁南霉素对TMV在普通烟接种叶上积累量的影响 |
| 3.3.2 宁南霉素对TMV在普通烟系统叶上积累量及症状产生的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 宁南霉素抗TMV过程中对DNA甲基化相关基因表达量的影响 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试寄主 |
| 4.1.2 供试毒源 |
| 4.1.3 供试药剂与主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 RT-q PCR引物的合成 |
| 4.2.2 验证引物的特异性 |
| 4.2.3 RT-q PCR体系的优化 |
| 4.2.4 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RT-PCR验证引物特异性 |
| 4.3.2 宁南霉素对DNA甲基化相关基因表达量的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论与创新 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间成果 |
（2）烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 RNA病毒的不依赖帽子翻译机制 |
| 1.1.1 RNA病毒的5’端核糖体内部进入位点(5’IRES) |
| 1.1.2 RNA病毒的3’端不依赖帽子翻译调控元件(3’CITE) |
| 1.2 烟草丛顶病及烟草丛顶病毒 |
| 1.2.1 烟草丛顶病 |
| 1.2.2 烟草丛顶病毒 |
| 1.2.3 烟草丛顶病毒的不依赖帽子翻译 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、抗体 |
| 2.1.2 所用分子生物学试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 引物合成和测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 碱裂解法小量提质粒 |
| 2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.3 重叠PCR反应 |
| 2.2.4 酶切反应 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.7 PCR产物或酶切产物的胶回收 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选突变体质粒 |
| 2.2.11 体外转录 |
| 2.2.12 小麦胚芽提取物(WGE)中的体外翻译 |
| 2.2.13 考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.14 Western Blot分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TBTV RI区嵌合突变体通过影响远距离RNA-RNA互作调控翻译 |
| 3.2 TBTV RI区调控远距离互作的分子开关定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 3 ’CITE介导的翻译增强机制 |
| 4.2 TBTV不依赖帽子翻译中的3’CITE元件 |
| 4.3 TBTV不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附表1引物列表 |
| 附表2质粒列表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 烟草及烟草病毒病概述 |
| 1.2 烟草三种常见病毒的基本特征 |
| 1.2.1 TMV |
| 1.2.2 CMV |
| 1.2.3 PVY |
| 1.3 烟草病毒的检测方法 |
| 1.3.1 血清学方法 |
| 1.3.2 PCR技术 |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR |
| 1.3.4 环介导等温扩增技术 |
| 1.3.5 烟草病毒TMV、CMV和PVY的检测方法的探究 |
| 1.4 土壤携带病毒研究简介 |
| 1.4.1 土壤中病毒病的研究情况 |
| 1.4.2 烟田土壤病毒研究的重要性 |
| 1.5 植物病毒间的相互作用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 土壤材料 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 菌株及抗血清 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 土壤样品的处理 |
| 2.2.2 间接ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） |
| 2.2.3 RNA提取用具的处理 |
| 2.2.4 烟草叶片总RNA的抽提 |
| 2.2.5 土壤总RNA的抽提 |
| 2.2.6 引物的设计与合成 |
| 2.2.7 RT-PCR反应 |
| 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳反应 |
| 2.2.9 TMV、CMV、PVY的实时荧光定量RT-PCR |
| 2.2.10 RT-LAMP |
| 2.2.11 TMV、CMV、PVY在烟草体内的互作研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 土壤中3种病毒的ELISA检测结果 |
| 3.2 烟草叶片和土壤总RNA的抽提 |
| 3.3 土壤中TMV、CMV、PVY的RT-PCR检测 |
| 3.3.1 土壤样品RT-PCR的灵敏度检测 |
| 3.3.2 RT-PCR扩增产物的检测 |
| 3.4 土壤中TMV、CMV、PVY含量的荧光定量PCR测定 |
| 3.4.1 TMV、CMV、PVY阳性重组质粒DNA标准品的制备 |
| 3.4.2 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.4.3 土壤样品TMV、CMV、PVY含量的测定 |
| 3.4.3.1 荧光定量PCR检测灵敏度分析 |
| 3.4.3.2 土壤样品TMV、CMV、PVY含量的测定 |
| 3.5 土壤中3种病毒的RT-LAMP的检测及灵敏度分析结果 |
| 3.5.1 RT-LAMP检测体系的探究 |
| 3.5.2 土壤样品RT-LAMP的灵敏度检测 |
| 3.6 土壤样品TMV、CMV、PVY的4种检测方法的灵敏度比较 |
| 3.7 土壤样品TMV、CMV、PVY的4种检测方法的特异性比较 |
| 3.8 烟草主要病毒在烟草体内的互作研究 |
| 3.8.1 复合侵染加剧病害症状 |
| 3.8.2 复合侵染改变病毒基因的相对表达水平 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 四种检测方法的优缺点比较 |
| 4.2.2 不同方法检测烟田土壤主要病毒灵敏度的比较与分析 |
| 4.2.3 烟田土壤主要病毒的生态特点分析 |
| 4.2.4 烟草主要病毒的互作研究 |
| 4.2.6 病毒基因沉默抑制子在病毒互作中的作用 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）柑橘脉突病毒侵染性克隆构建及其基因沉默抑制子鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词与中英对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 柑橘脉突病毒（Citrus vein enation virus, CVEV）研究进展 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 CVEV的理化特性和传播途径 |
| 1.1.3 CVEV的分类地位及分子生物学特性 |
| 1.1.4 CVEV检测方法 |
| 1.2 果树病毒侵染性克隆的构建及其应用研究进展 |
| 1.2.1 果树病毒侵染性克隆现状 |
| 1.2.2 果树病毒侵染性克隆的构建 |
| 1.2.3 果树病毒侵染性克隆的应用 |
| 1.2.4 展望 |
| 1.3 植物病毒基因沉默抑制子研究进展 |
| 1.3.1 基因沉默 |
| 1.3.2 基因沉默抑制子 |
| 1.3.3 展望 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 主要研究内容 |
| 2.3.1 CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用 |
| 2.3.2 CVEV基因组全长cDNA克隆构建 |
| 2.3.3 CVEV基因组全长cDNA克隆侵染性分析 |
| 2.3.4 CVEV基因沉默抑制子初步鉴定 |
| 第三章 柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试毒源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 RNA提取 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 RT-PCR扩增与克隆鉴定 |
| 3.2.4 制备质粒标准品 |
| 3.2.5 实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立 |
| 3.2.6 实时荧光定量RT-PCR检测体系的评价 |
| 3.2.7 实时荧光定量RT-PCR检测体系的应用 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RT-PCR扩增与克隆鉴定 |
| 3.3.2 实时荧光定量RT-PCR条件的优化及体系的确定 |
| 3.3.3 实时荧光定量RT-PCR反应体系的测试 |
| 3.3.4 应用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 CVEV全长cDNA克隆及序列分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试毒源 |
| 4.1.2 载体 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 菌株 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 柑橘叶片总RNA提取（Trizol试剂） |
| 4.2.2 引物设计 |
| 4.2.3 RT-PCR扩增与克隆鉴定 |
| 4.2.4 序列分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 柑橘叶片总RNA提取 |
| 4.3.2 RT-PCR扩增、克隆与测序 |
| 4.3.3 CVEV基因组全长cDNA的PCR鉴定及序列分析 |
| 4.3.4 CVEV序列二级结构 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 CVEV全长cDNA扩增及克隆 |
| 4.4.2 CVEV全长cDNA序列分析 |
| 第五章 CVEV全长cDNA克隆的侵染性分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 CVEV全长cDNA阳性克隆 |
| 5.1.2 植物材料 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 接种缓冲液成分 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 农杆菌转化 |
| 5.2.3 接种农杆菌液准备 |
| 5.2.4 接种 |
| 5.2.5 影响CVEV全长cDNA克隆侵染性因素分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 CVEV全长cDNA侵染性分析 |
| 5.3.2 影响CVEV全长cDNA克隆侵染性的分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 CVEV基因沉默抑制子的初步鉴定 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 供试毒源 |
| 6.1.2 表达载体及草本植物 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.1.5 主要缓冲液成分 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 柑橘叶片总RNA提取 |
| 6.2.2 引物设计 |
| 6.2.3 RT-PCR扩增与克隆鉴定 |
| 6.2.4 沉默抑制子鉴定 |
| 6.2.5 沉默抑制子效应分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 CVEV 5 个ORF的RT-PCR扩增 |
| 6.3.2 CVEV ORF重组表达载体构建 |
| 6.3.3 沉默表型观察 |
| 6.3.4 接种本生烟植株的实时荧光定量RT-PCR检测 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 主要结论及展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.1.1 CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用 |
| 7.1.2 CVEV全长cDNA克隆构建及序列分析 |
| 7.1.3 CVEV全长cDNA克隆的侵染性分析 |
| 7.1.4 CVEV编码基因沉默抑制子的鉴定 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及参加科研项目 |
| 致谢 |
（5）BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物病原间协生互作的研究进展 |
| 1.2 植物病毒与病毒互作 |
| 1.3 病毒协生互作产生的影响 |
| 1.4 参与病毒协生互作的病毒因子 |
| 1.5 利用演化博弈论研究病毒协生 |
| 1.6 马铃薯卷叶病毒属病毒及其韧皮部局限特性 |
| 1.7 幽影病毒属病毒简介 |
| 1.8 黄症病毒科病毒与幽影病毒属病毒互作的研究进展 |
| 1.9 马铃薯卷叶病毒属病毒的分类研究概况 |
| 1.10 本论文研究意义与目的 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 溶液及培养基的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 BrYV与PEMV 2协生互作的生物学特征 |
| 3.1 BrYV与PEMV2在本生烟中存在协生互作 |
| 3.2 PEMV 2能使BrYV进行摩擦接种 |
| 3.3 BrYV与PEMV-2复合侵染时能突破韧皮部局限 |
| 3.4 探索BrYV病毒中参与BrYV与PEMV 2协生互作的蛋白 |
| 3.5 P0~(Br)、ORF3~(PE)和ORF4~(PE)转基因本生烟的培育 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 第四章 BrYV与PEMV 2协生互作所引起的植物转录组变化特征分析 |
| 4.1 样品采集与转录组测序 |
| 4.2 差异表达基因的鉴定 |
| 4.3 差异表达基因的GO分析 |
| 4.4 差异表达基因的KEGG分析 |
| 4.5 光合作用相关基因的变化 |
| 4.6 乙烯相关基因的变化 |
| 4.7 植物防御相关基因的变化 |
| 4.8 RNA沉默相关基因的变化 |
| 4.9 转录因子的变化 |
| 4.10 蛋白翻译相关基因的变化 |
| 4.11 RT-qPCR验证转录组测序结果 |
| 4.12 本章小结与讨论 |
| 第五章 BrYV与PEMV 2协生互作引起siRNAs的变化特征 |
| 5.1 BrYV与PEMV 2协生互作时病毒siRNAs的特征 |
| 5.2 BrYV与PEMV 2协生互作时miRNAs的变化特征 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.1 一种侵染豆科作物的Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.2 甜菜西方黄化病毒北京株系的分子鉴定与序列分析 |
| 6.3 本章小结与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 联合培养期间的主要研究工作 |
| 附录Ⅱ 载体构建和检测所用引物 |
| 附录Ⅲ 病毒vsiRNA杂交所用引物 |
| 附录Ⅳ RT-qPCR相关引物 |
| 个人简历 |
（6）烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 真核细胞典型的依赖帽子翻译起始 |
| 1.2 植物RNA病毒不依赖帽子翻译机制的研究进展 |
| 1.2.1 植物RNA病毒的5’IRES元件 |
| 1.2.2 植物RNA病毒的3’CITE元件 |
| 1.3 植物RNA病毒的分子进化 |
| 1.4 RNA结构分析方法 |
| 1.5 烟草丛顶病毒的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、抗体、悬浮细胞 |
| 2.1.2 烟草丛顶病样品 |
| 2.1.3 所用载体及试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 引物合成和测序 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR检测 |
| 2.2.3 重叠PCR |
| 2.2.4 cDNA末端快速扩增(RACE) |
| 2.2.4.1 cDNA5’末端快速扩增(5’RACE) |
| 2.2.4.2 cDNA3’末端快速扩增(3’RACE) |
| 2.2.5 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.6 PCR产物或酶切产物的胶回收 |
| 2.2.7 连接反应 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选重组质粒 |
| 2.2.11 Cracking快速鉴定 |
| 2.2.12 酶切鉴定法 |
| 2.2.13 酶切反应 |
| 2.2.14 碱裂解法小量提质粒 |
| 2.2.15 体外转录 |
| 2.2.16 5 ’加帽体外转录反应体系 |
| 2.2.17 在麦胚提取物(WheatGermExtract)中的体外翻译 |
| 2.2.18 拟南芥原生质体的制备与侵染 |
| 2.2.18.1 拟南芥愈伤组织的培养 |
| 2.2.18.2 原生质体的制备 |
| 2.2.18.3 原生质体的侵染 |
| 2.2.19 WesternBlot分析 |
| 2.2.20 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.21 RNA体外结构分析技术---In-lineprobing |
| 2.2.22 RNA体外结构分析技术-SHAPE(selective2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE) |
| 2.2.22.1 RNA的处理 |
| 2.2.22.2 引物标记 |
| 2.2.22.3 SHAPE反应 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TBTV新分离物全基因组克隆与序列进化分析 |
| 3.1.1 TBTV新分离物的全基因组克隆 |
| 3.1.2 TBTV的分子变异与进化分析 |
| 3.1.2.1 TBTV的分子变异 |
| 3.1.2.2 TBTV系统进化树 |
| 3.1.2.3 TBTVRNA重组分析 |
| 3.2 TBTV不依赖帽子翻译元件BTE元件的结构特征 |
| 3.2.1 BTE元件对Fluc报告基因的调控作用验证 |
| 3.2.2 BTE元件对TBTV病毒全长p35蛋白的翻译调控作用 |
| 3.3 TBTV不依赖帽子翻译元件BTE元件的分子进化 |
| 3.3.1 TBTV不同分离物的复制效率与p35蛋白表达分析 |
| 3.3.2 TBTVp35蛋白差异表达的调控区域定位 |
| 3.3.3 RV区调控p35蛋白差异表达的分子基础 |
| 3.3.3.1 RV区中造成p35降低的突变位点定位 |
| 3.3.3.2 TBTV不同分离物中BTE的结构变异与p35蛋白表达的关系 |
| 3.3.3.3 TBTV弱毒分离物的BTE结构变异导致p35蛋白表达量的降低 |
| 3.3.4 RI区调控p35蛋白差异表达的内在机理 |
| 3.4 TBTV不依赖帽子翻译元件类TSS元件的定位与结构特征分析 |
| 3.4.1 TBTV中新的不依赖帽子翻译元件定位 |
| 3.4.1.1 缺失定位 |
| 3.4.1.2 缺失突变体元件的结构分析 |
| 3.4.1.3 类TSS元件与BTE元件的翻译活性分析 |
| 3.4.1.4 类TSS元件的结构特征 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TBTV分子进化 |
| 4.2 TBTV中的不依赖帽子翻译元件 |
| 4.3 类BTE元件在TBTV不同分离物的结构进化分析 |
| 4.4 CITE的分子进化 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
（8）烟草脉扭病毒与烟草丛顶病伴随RNA的互作研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1实验材料 |
| 1.2实验方法 |
| 1.2.1 TVDV和TBTDa RNA的基因组c DNA全长序列扩增 |
| 1.2.2 TVDV和TBTDa RNA的农杆菌介导的侵染性克隆构建 |
| 1.2.2.1双元载体p CB301-CH载体骨架的制备 |
| 1.2.2.2病毒侵染性克隆载体的构建和筛选 |
| 1.2.2.3病毒侵染性克隆载体转化农杆菌 |
| 1.2.3农杆菌浸润接种试验 |
| 2结果与分析 |
| 2.1 TVDV和TBTDa RNA基因组c DNA全长序列的扩增 |
| 2.2 TVDV和TBTDa RNA农杆菌介导的侵染性克隆的构建 |
| 2.3农杆菌浸润接种试验 |
| 3讨论 |
（9）三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 三七病毒病病原鉴定的研究概况 |
| 1.2 PnVY 的发现及其基因组结构 |
| 1.3 马铃薯 Y 病毒属病毒简介及部分基因功能 |
| 1.4 双生病毒的研究概况 |
| 1.4.1 双生病毒的分类、寄主范围及介体传播 |
| 1.4.2 双生病毒的危害 |
| 1.5 TYLCCNV 和 TYLCCNB 的研究概况 |
| 1.5.1 TYLCCNV 和 TYLCCNB 的生物学特性及其基因组结构 |
| 1.5.2 TYLCCNV 和 TYLCCNB 在中国的研究现状 |
| 1.5.3 TYLCCNV 在云南的发生分布及其遗传多样性 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常用分子生物学试剂和仪器 |
| 2.1.2 常用缓冲液及培养基配方 |
| 2.1.3 菌种及载体 |
| 2.2 侵染三七的病毒种类鉴定 |
| 2.2.1 三七病叶 dsRNA 的提取 |
| 2.2.2 cDNA 文库构建 |
| 2.2.3 三七病叶的病毒提纯 |
| 2.2.4 提纯病毒的负染、SDS-PAGE 电泳及质谱分析 |
| 2.2.5 三七病样总核酸的提取 |
| 2.2.6 PnVY 寄主范围的测定 |
| 2.2.7 检测引物的序列 |
| 2.2.8 RT-PCR 及 PCR 检测 |
| 2.2.9 PCR 产物的纯化回收、克隆及序列拼接、确认及提交 |
| 2.2.10 TYLCCNV 及 TYLCCNB 对三七的侵染 |
| 2.3 三七病毒病田间调查及 PnVY、TYLCCNV 双重 PCR 检测方法建立 |
| 2.3.1 三七病毒病田间调查时间与地点 |
| 2.3.2 CTAB 法提取总核酸 |
| 2.3.3 双重 PCR 检测方法的建立 |
| 2.3.4 田间样品分子检测统计 |
| 2.4 侵染三七的 PnVY 及 TYLCCNV 不同分离物间全基因组分子变异 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 CTAB 法提取总核酸 |
| 2.4.3 引物的设计与序列 |
| 2.4.4 RT-PCR 检测、纯化回收，克隆及序列拼接、确认及提交 |
| 2.4.5 不同 PnVY 分离物的基因组序列分析 |
| 2.4.6 不同 TYLCCNV 和 TYLCCNB 分离物的基因组序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 侵染三七的病毒种类的鉴定 |
| 3.1.1 可能引起三七病毒病的其他病毒 RT-PCR 检测结果 |
| 3.1.2 TYLCCNV 及 TYLCCNB 对三七的侵染 |
| 3.1.3 dsRNA 电泳检测 |
| 3.1.4 cDNA 文库构建 |
| 3.1.5 电镜观察 |
| 3.1.6 SDS-PAGE 电泳及蛋白质质谱分析 |
| 3.1.7 SbDV 的 RT-PCR 检测 |
| 3.2 PnVY 寄主范围测试 |
| 3.2.1 三七病样 dsRNA 提取产物和提纯病毒的 RT-PCR 检测结果 |
| 3.2.2 供试寄主的症状类型及 RT-PCR 检测结果 |
| 3.3 三七病毒病田间调查及 PnVY 和 TYLCCNV 分子检测 |
| 3.3.1 田间三七病毒病症状类型 |
| 3.3.2 田间三七病毒病的发生特点 |
| 3.3.3 双重 RT-PCR 检测体系的初步建立 |
| 3.3.4 田间三七病样的 PnVY 和 TYLCCNV 分子检测统计 |
| 3.4 侵染三七的 PnVY 及 TYLCCNV 不同分离物的分子变异 |
| 3.4.1 不同 PnVY 分离物的基因组全序列分析 |
| 3.4.2 不同 TYLCCNV 分离物的基因组全序列比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 三七病毒病可能的其他病原 |
| 4.1.1 dsRNA 分析技术 |
| 4.1.2 ToMV、CMV 及 SbDV 等三七上可能存在的病毒病原 |
| 4.1.3 TYLCCNV 和 TYLCCNB 对三七的致病性及危害 |
| 4.1.4 PnVY 寄主范围的测试 |
| 4.2 双重 RT-PCR 检测 PnVY 与 TYLCCNV 体系的建立 |
| 4.3 三七病毒病的田间调查及症状类型与病毒病原的相关性 |
| 4.4 不同 PnVY 分离物编 P1 的氨基酸变异 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 发表的文章及授权专利 |
（10）烟草植物保护技术发展现状与趋势（论文提纲范文）
| 一、引言 |
| 二、烟草植物保护技术最新研究进展 |
| (一) 烟草植保技术网络平台进一步完善 |
| 1.全国烟草病虫害预测预报及综合防治网 |
| 2.农药田间药效对比试验网 |
| (二) 烟草病理研究进展 |
| 1.烟草与病原物互作研究 |
| 2.病原物寄主适应性变异与致病力分化 |
| 3.烟草病害分子检测技术 |
| 4.烟草病害防治策略的创新发展 |
| 5.烟草新发生病害研究进展 |
| (三) 烟草昆虫研究进展 |
| 1.烟夜蛾与棉铃虫控制基础研究 |
| 2.B 型烟粉虱与其它昆虫的种间竞争 |
| 3.茉莉酸甲酯对烟草的诱导抗虫性 |
| 4.烟草主要害虫抗药性监测与治理 |
| 5.全球气候变化对烟草及有害生物的影响 |
| (四) 生物防治技术研究进展 |
| 1.害虫天敌保护和利用 |
| 2.昆虫性信息素利用 |
| 3.昆虫病原与病害拮抗微生物 |
| 4.诱导抗病性 |
| 5.植物源农药的开发和利用 |
| (五) 农药高效利用技术研究进展 |
| 四、国内外烟草植保技术研究进展比较 |
| 1.有害生物监测、预警的自动化和智能化水平需进一步提高。 |
| 2.有害生物综防技术集成与创新需进一步加强。 |
| 3.有害生物基础研究的深度和系统性尚需加强。 |
| 五、烟草植保技术发展趋势与展望 |
| 1.加强基础研究, 突破综合治理瓶颈。 |
| 2.发展生防技术, 提升综合治理水平。 |
| 3.应用高新技术, 提高监测预警水平。 |
| 4.服务现代烟草, 完善植保标准体系。 |
四、RT-PCR技术快速检测烟草丛顶病研究（论文参考文献）
- [1]宁南霉素抗烟草花叶病毒的作用机理的初步研究[D]. 马思思. 佛山科学技术学院, 2020(01)
- [2]烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作[D]. 窦宝存. 山东农业大学, 2020
- [3]三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作[D]. 夏烨. 华南农业大学, 2017(08)
- [4]柑橘脉突病毒侵染性克隆构建及其基因沉默抑制子鉴定[D]. 王艳娇. 西南大学, 2017(02)
- [5]BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究[D]. 周翠姬. 中国农业大学, 2017(05)
- [6]烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化[D]. 王德亚. 山东农业大学, 2017(08)
- [7]烟草脉扭病毒与烟草丛顶病伴随RNA的互作研究[A]. 莫笑晗,徐萍,赵兴能,张丽芳,秦西云,夏振远. 中国烟草学会2015年度优秀论文汇编, 2015
- [8]烟草脉扭病毒与烟草丛顶病伴随RNA的互作研究[A]. 莫笑晗,徐萍,赵兴能,张丽芳,秦西云,夏振远. 第五届云南省科协学术年会暨乌蒙山片区发展论坛论文集, 2015
- [9]三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析[D]. 李晓静. 云南农业大学, 2014(12)
- [10]烟草植物保护技术发展现状与趋势[A]. 王凤龙,任广伟,张成省. 2010年—2011年烟草科学与技术学科发展报告, 2012