一、含川芎嗪血清对L-谷氨酸、5-羟色胺及去甲肾上腺素所致新生大鼠脑细胞内游离钙升高的影响（论文文献综述）
张峻榕[1]（2021）在《Au@TPM的构建及抗阿尔兹海默症活性作用的机制研究》文中指出阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）是一种慢性进行性的神经退行性疾病,其发病的原因十分复杂,与自身因素,遗传条件和环境影响都有关系。目前研究表明,氧化应激现象在老年斑和神经原纤维缠结出现之前就已发生,是AD发病机制最早的变化之一。值得注意的是,在AD患者大脑中会经常检测出丙二醛、过氧化亚硝酸盐和硫巴比土酸等一系列的氧化应激标记物,这说明AD患者脑死亡的主要诱因与抗氧化系统失衡有关。因此通过研发一种介导抑制氧化应激产生的抗氧化剂,已成为预防AD治疗的有效途径。金纳米颗粒（AuNPs）作为细胞内药物或基因递送的纳米载体,具有毒性低,大的比表面积,表面易可控组装和高特异性等特征,这使得它被广泛应用于生物医学领域。本论文通过采用柠檬酸钠还原四氯金酸的经典方法,对两种不同粒径大小的Au NPs进行合成,而后为了使良好抗氧化特性的玉米源单体肽TPM（Leu-Asp-Tyr-Glu）能够与Au NPs自组装在一起,我们将TPM亮氨酸的N端连接一分子3-巯基丙酸组合成为s-TPM,这样重组之后的玉米源活性肽可稳定装载到Au NPs的表面,并由此构建成为功能型的两种纳米抗氧化剂S-Au@TPM和L-Au@TPM。同时利用研究该抗氧化剂分别在细胞和动物模型中的活性作用效果,最终验证出S-Au@TPM和L-Au@TPM在用于抗AD领域应用中具备一定的可行性和适用性。具体研究内容如下:本论文首先对PC12低分化细胞给药后的形态学进行了观察,发现经S-Au@TPM和L-Au@TPM处理48小时后,对细胞具有促分化的作用,细胞轴突会随给药剂量的增加,类似神经元突触一样而伸长,初步证明构建的纳米抗氧化剂对PC12低分化细胞具备一定的神经保护作用,为此我们继续对体外AD细胞模型中的具体抑制作用进行更深入的探究。实验选择L-谷氨酸（L-Glu）作为细胞模型建立药物,利用MTT方法筛选出最优建模剂量为25 m M。在细胞类AD模型中,给药0.25 n M和0.5 n M的S-Au@TPM和L-Au@TPM可显着抑制由L-Glu诱导产生的细胞凋亡率,此时细胞的存活率分别可达90.02±13.89%和86.89±13.24%。本论文的阳性对照药物是盐酸多奈哌齐（Donepezil hydrochloride,DH）。它是一种可逆性中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂,被广泛应用于治疗AD患者的认知功能障碍。我们使用Hochest 33342荧光染色法对细胞凋亡形态和数量进行观察,发现与阳性对照药DH和阴性对照药s-TPM相比,纳米抗氧化剂能够显着抑制模型细胞内凋亡核的固缩数目。同时利用系列实验再次验证,结果表明在L-Glu诱导损伤细胞中,通过给药不同浓度的S-Au@TPM和L-Au@TPM预处理3小时后,可显着降低细胞内乳酸脱氢酶（LDH）漏出量和丙二醛（MDA）生成量的增多,抑制胞内Ca2+浓度的升高,改善线粒体跨膜电位以及过氧化氢酶（CAT）活性的异常,从而缓解建模药物所致的细胞内活性氧（ROS）的过量淤积。以上研究说明,S-Au@TPM和L-Au@TPM能够显着抑制体外细胞类AD模型中的系列损伤,进而对抗氧化应激所造成的氧化系统的失衡。在抗AD动物模型活性研究中,采用Al Cl3与D-半乳糖联合给药的方式,对雌性昆明小鼠进行AD模型的建立。该模型可以充分复制AD主要的病理特征和临床表现,会造成实验小鼠氧化与抗氧化系统失衡、海马和大脑皮层神经元变性坏死、胆碱能系统异常、大脑皮层老年斑病变以及行为学方面的动作障碍等。在本部分实验中,结果表明,AD模型小鼠在给药浓度为0.5 mg/kg、0.7 mg/kg和1.0 mg/kg的S-Au@TPM和L-Au@TPM治疗16天后,会显着改善动物行为学中的系列指标:（1）在水迷宫测试中,能够增强模型小鼠的空间学习和记忆的能力;（2）在疲劳转棒行为学中,能够改善模型小鼠运动的协调能力以及对转棒旋转速度的迟缓应激能力;（3）在自主活动测试中,能够增加模型小鼠在陌生黑暗环境中的适应能力,并对环境做出适时的灵敏应激行为;综上所述,S-Au@TPM和L-Au@TPM能够改善AD模型小鼠神经系统功能性损伤所导致的行为障碍。进一步我们对胆碱能相关指标进行了检测,发现AD模型小鼠经过给药不同剂量的S-Au@TPM和L-Au@TPM治疗后,在下丘脑及血清中缺失的乙酰胆碱（ACh）和乙酰胆碱转移酶（Ch AT）的含量会有所提升,而神经元突触中过度释放的乙酰胆碱酯酶（Ach E）含量被得到了抑制,说明纳米抗氧化剂对胆碱能系统的活性可以进行有效的调控。此外,我们研究了纳米抗氧化剂对Nrf-2/Keap-1途径蛋白干扰表达的影响。结果显示,与AD模型小鼠相比,S-Au@TPM和L-Au@TPM能够上调Nrf-2和HO-1的表达,增加超氧化物歧化酶（SOD）,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和CAT的活性,并降低MDA含量以及Keap-1的蛋白水平。以上结果表明,S-Au@TPM和L-Au@TPM可通过Nrf-2或Keap-1的途径,来减轻由Al Cl3-和D-半乳糖所诱导产生的损伤。同时我们通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）方法分析发现,实验小鼠经给药S-Au@TPM和L-Au@TPM处理后,在体内组织（小肠、肝、脾、肺、肾、脑）中都有纳米抗氧化剂的分布,其中,在小肠中二者的积累较多。在其余器官中,S-Au@TPM的富集量要低于L-Au@TPM,表明小尺寸的S-Au@TPM在体内可以实现较长时间的血液循环,进而达到更加有效的生物利用度。纳米抗氧化剂的富集分布量会随着给药时间的推移而降低,证明它最终会被逐渐的排出体外,避免产生过多的纳米毒性。综上所述,本论文构建的S-Au@TPM和L-Au@TPM具有良好的抗氧化保护作用,可有效抑制细胞体内外AD模型中所引发的系列损伤。S-Au@TPM的抗氧化活性强于L-Au@TPM,这可能是由于小粒径的Au NPs,会与装载的功能性活性肽进行更有效地结合。并且,与大粒径Au NPs相比,小粒径Au NPs更容易穿透细胞膜进入病患组织从而发挥疗效。因此,本论文的研究为开发治疗或预防AD的新型药物提供了新的思路。
王谦[2]（2021）在《褪黑素通过调控睡眠内稳态恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律延长的机制分析》文中研究说明睡眠是生物进化上非常保守的行为,从低等的无脊椎动物到高等的脊椎动物中,均可发现睡眠的现象。睡眠占据了人一生接近1/3的时间,在生长发育,记忆巩固,生理功能调节以及脑内代谢物清除等方面起到了至关重要的作用。在近百年的研究中,科学家们逐渐发现睡眠和觉醒的维持及转换是脑内促睡眠神经核团和促觉醒神经核团分别释放神经递质和信号分子共同作用的结果。尽管该领域的研究已取得了不同程度的进展,睡眠和觉醒精确而复杂的调控机制仍需进一步探究。目前研究发现,睡眠的调控既有节律的特性,又有内稳态平衡的特性,因此学者普遍认为昼夜节律系统和内稳态系统共同参与了睡眠的调控。在哺乳动物中昼夜节律系统的中枢为视交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）。SCN接收外界光照信号后对核内时钟分子CLOCK-Bmal1及CRY-PER等分子进行调控,使其节律震荡与外界环境保持一致。节律系统不仅可以在12h光照（light,L）:12h黑暗（darkness,D）即L:D（12h:12h）的条件下产生与光暗环境相匹配的节律,也可以适应类似L:D（8h:16h）的光暗环境,并产生相应的节律。随光暗环境变化的节律调整使生物体能适应高纬度生活。更有趣的是,节律系统甚至能适应昼夜周期为非24h的条件,例如L:D（11h:11h）周期为22h的环境中,小鼠的跑轮时间缩短为11h,间隔也缩短为11h。同时,内稳态系统也在睡眠和自身昼夜节律调控中起到了重要的作用。内稳态根据机体内环境的动态平衡来调节睡眠需求。一般认为,腹外侧视前核（ventrolateral preoptic nucleus,VLPO）是睡眠-觉醒系统中负责睡眠的神经中枢。研究发现,在VLPO手术去除鼠中,其睡眠时间大幅减少。同时,脑组织切片染色也证实了 VLPO中神经元c-fos表达与睡眠状态呈正相关。还有文献报道,VLPO神经元兴奋可抑制觉醒中枢蓝斑核（locus coeruleus,LC）、中缝背核（dorsal raphe nucleus,DRN）、乳头状结节核（tuberomammillary nucleus,TMN）的兴奋性。以上研究均表明了 VLPO在睡眠调节过程中起到了重要作用。同时,神经解剖学的研究也发现,VLPO与SCN相互之间有密集的神经投射。因此节律系统和内稳态系统相辅相成,共同调节睡眠与觉醒的维持和节律性转换。NMDA受体是广泛分布于神经元中的离子型谷氨酸能受体。该受体可影响突触可塑性及递质分泌,参与神经发育和学习记忆等生物学过程,NMDA受体功能失调与多种神经源性或精神源性疾病相关。近期越来越多的文献表明,NMDA受体参与了睡眠与觉醒的调控。例如,有文献报道在果蝇的睡眠调控中枢R2脑区内,NMDAR1受体表达水平在昼夜间有显着性差异,睡眠时R2脑区NMDA受体处于高表达水平,而清醒时该脑区NMDA受体表达水平显着下降。此外,NMDA受体还被认为与精神类疾病的发生有关,NMDA受体损伤假说在精神分裂症发病机制中受到了广泛认可,而睡眠障碍往往是精神分裂症患者的早发症状,也暗示了NMDA受体很可能参与了睡眠的调控。在本研究中,我们选择NMDA受体的特异性拮抗剂地佐环平（dezocilpine,MK-801）高效选择性抑制NMDA受体,在此基础上分析NMDA受体参与调控睡眠的分子机制。NMDA受体对钙离子有较高的通透性。钙离子在机体内多种生理活动中起到了重要作用,参与了心跳起搏、肌肉收缩、免疫应答、凝血、神经递质释放及突触可塑性调控。近年来的研究表明,在神经功能调控中,有两类分子与钙离子密切相关:分别是钙调蛋白激酶和环磷酸腺苷结合反应原件（cAMP-response element binding protein,CREB）。钙调蛋白激酶 Ⅱ（calcium-calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ）广泛参与了脑内神经核团的功能活动。神经元突触产生的长时程电位增强电流（long-term potentiation,LTP）,会导致钙离子内流,进而激活CaMKⅡ。激活后的CaMKⅡ转位至突触,可与NMDA受体结合,并通过磷酸化AMPA受体的各个亚基使其产生电位增强。在LTP后期,CaMKⅡ还起到了突触形态改变和强化的作用,进而帮助神经元完成其复杂的电生理功能。除了参与细胞突触的各项功能,Ca2+还能进入细胞核参与神经元的转录表达,而CREB在这一过程起到重要作用:CREB与环磷酸腺苷结合反应原件结合蛋白（CREB binding protein,CBP）结合后,经钙调蛋白激酶 Ⅳ（CaMKIV）磷酸化激活,并通过CBP激活下游转录因子,完成对胞核转录的调控。因此,CaMKⅡ与CREB的蛋白表达水平与细胞内钙离子浓度及细胞状态密切相关,可作为评估神经元状态的重要指标。有文献证实,大鼠DRN内CaMKⅡ的表达水平与睡眠-觉醒转换密切相关,在降低CaMKⅡ表达水平后,小鼠表现出明显的入睡困难症状;DRN脑区的CREB也被证实可通过调控食欲肽（orexin）对睡眠起到调控作用,而DRN在睡眠调控中同样起到了重要作用。最近的研究发现,Ca2+直接参与了睡眠和觉醒的调控。作为神经细胞生存的重要环境,脑脊液内Ca2+的水平参与睡眠觉醒的转换调节,降低脑脊液内Ca2+水平,可使小鼠处于清醒状态,而增高脑脊液内Ca2+水平,小鼠可由清醒迅速转入睡眠。另外,作为内稳态调节的重要神经体液因子,腺苷和腺苷受体结合后调控睡眠,而腺苷受体也被认为启动了 Ca2+信号机制。但是,Ca2+信号是否参与NMDA受体功能失调后睡眠和节律异常的形成,以及在VLPO影响睡眠内稳态中的作用,尚需进一步阐述。褪黑素（melatonin）主要由松果体合成,在外周组织也有少量分泌,其产生具有明显的昼夜节律性,晚上分泌多,白天受到光照的抑制几乎不分泌。研究发现,褪黑素对睡眠有较好的促进作用。在临床治疗中,褪黑素已经被作为睡眠辅助药物用于各种类型睡眠障碍的患者,例如在阿尔茨海默病治疗中,褪黑素可被用于改善患者的睡眠质量用以帮助延缓患者病情的发展;在精神分裂症治疗中,褪黑素作为辅助药物常被用于改善患者睡眠质量,并可有效提高精神症状的治疗效果。在长距离飞行的人群中,褪黑素也被用来帮助他们适应新的时区,提示褪黑素对节律调控同样有重要的作用。研究发现,褪黑素可加速由觉醒向入睡潜伏期的转换过程,使小鼠入睡更为迅速。同时,还有文献证实,褪黑素可提高节律相关蛋白ROR的震荡水平,完成对生物节律的调控。目前研究发现褪黑素受体主要有三个亚型:MT1,MT2,MT3,其中MT1与MT2受体在各个脑区均有分布。在与睡眠相关的脑基底部位,褪黑素受体的分布已经被初步证实,在节律中枢SCN以MT1受体为主,SCN内几乎不表达MT2受体;在睡眠内稳态中枢VLPO中,以MT2受体为主,MT1表达很少。MT3受体是一种醌类物质,目前认为仅表达于植物中,在动物体内尚未发现MT3受体。褪黑素受体的分布表明褪黑素可从节律系统及自稳态系统两个方面对睡眠进行调控。但是,褪黑素是否对NMDA受体异常引起的睡眠异常有调控作用,以及可能的调节机制尚不清楚。基于上述背景,我们设计了本研究课题,分为三个部分。首先,给予MK-801处理,选择性抑制NMDA受体,观察NMDA受体功能失调对小鼠自身昼夜节律和光照昼夜节律的影响,从昼夜节律角度反映睡眠-觉醒的变化情况,以及给与褪黑素后是否有干预作用。然后,通过分析昼夜节律系统和内稳态系统的变化,揭示NMDA受体功能失调后引起睡眠障碍的分子机制。最后,通过自由活动状态下的脑电检测进一步分析MK-801及褪黑素对睡眠和自身昼夜节律影响的机制。本研究为理解睡眠的机制提供新的视角,也为褪黑素及其相关受体激动剂类药物的临床应用提供新的思路。第一部分:视交叉上核未参与MK-801及褪黑素对小鼠自身昼夜节律的影响首先,通过自主跑轮实验检测小鼠昼夜节律的变化。跑轮实验是检测啮齿类动物昼夜节律变化的经典实验。小鼠喜好攀岩,睡醒后会立即进行跑轮运动,由此可准确反映其昼夜节律和睡眠觉醒的变化。本实验发现,在L:D（12h:12h）的环境下,小鼠表现出昼伏夜出的行为,其周期为24h。在连续黑暗环境下,去除外界光暗环境的影响,观察小鼠自身昼夜节律的变化,结果显示在连续15d黑暗环境后,其自主跑轮起始时间提前了 6h,约每天提前0.4h,即平均自身昼夜节律为23.6h,与以往的文献报道完全一致,表明在实验中实施的跑轮运动检测客观且准确。在此基础上,我们给予MK-801（0.5mg/kg）腹腔注射处理小鼠来抑制NMDA受体,连续注射7d后,置于连续黑暗的环境中15d,跑轮实验检测结果显示,NMDA受体抑制组小鼠自主跑轮起始时间仅提前了 2-3h,而对照组提前约6h,即抑制NMDA受体后导致小鼠自身昼夜节律在15d内延迟了 3-4h。接下来,我们分别给予浓度为5、10和20mg/kg剂量的褪黑素进行干预实验,检测褪黑素对这一过程是否有干预作用。结果发现5mg/kg的褪黑素使跑轮起始时间提前了 3-4h,较MK-801处理组略有恢复。1Omg/kg的褪黑素使跑轮时间前移5-6h,几乎完全恢复正常。在20mg/kg剂量下,小鼠跑轮时间同样前移至5-6h,与10mg/kg剂量相同。结合相关文献报导,我们在后续实验中采用10mg/kg的褪黑素为本课题实验剂量。然后,我们检测了在标准环境下不同处理组小鼠行为节律是否有差异,于是我们在模型建立完成后将各组小鼠分别置于L:D（12h:12h）的环境下,持续检测7d,结果显示,三组小鼠的跑轮起始时间和终止时间,即觉醒与睡眠的起始时间与外界环境的光暗变化一致,昼夜节律时间均为24h,没有明显差异。即在标准环境下,NMDA受体抑制后节律系统仍表现正常。之后,我们改变光暗时间设置,检测对时差变化的调节能力。一般认为,时差调节能力主要受节律系统控制。我们先是将光暗时相前移4h,发现三组小鼠适应新节律的时间没有显着差异,均在时相前移4-5d后适应了新的节律。然后将光暗实相后移4h,也发现三组小鼠在3-5d内适应了新时差,即抑制NMDA受体后其时差调节能力仍然正常,提示小鼠节律系统并未受到明显影响。为了进一步证实这个结论,我们分别提取三组小鼠的节律中枢SCN组织,并检测其时钟分子PER1、CLOCK在CT0-1及CT12-13时段的表达水平及其相关分子miR-219在CT6-7时段的转录水平的表达。结果显示,MK-801组小鼠PER1及CLOCK的蛋白表达水平在CTO-1与CT12-13之间与对照组比较无统计学差异,褪黑素干预后对上述分子的表达水平同样无明显影响。同时,与节律震荡密切相关的miR-219于CT6-7时段（miR-219转录高峰期）的转录水平在对照组、MK-801处理组及褪黑素干预组之间同样无统计学差异。以上结果表明,抑制NMDA受体后可导致小鼠自身昼夜节律延长,褪黑素几乎彻底恢复了自身昼夜节律,该延长和恢复不是通过SCN控制的节律系统发挥的调节作用。第二部分:褪黑素通过调控腹外侧视前核恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律延长的机制分析在上一部分实验的基础上,我们将目光转移到调控睡眠的另一个重要系统:内稳态系统;并设计实验检测睡眠内稳态中枢VLPO在这一过程中是否出现了明显改变。睡眠内稳态主要是机体在不同睡眠需求状态下进行睡眠和觉醒调节的稳态过程。检测NMDA受体是否参与内稳态调节,首要的实验就是检测在不同睡眠需求状态下,NMDA受体的表达是否发生变化。首先,我们分别提取了对照组小鼠CT12-13、CTO-1及睡眠剥夺24h后（即小鼠睡眠压力由低到高的变化）的VLPO组织,并进行荧光定量PCR检测。结果显示,VLPO脑区NMDA受体（NMDAR1）的转录水平与睡眠需求成正相关,在CT12-13时,即小鼠睡眠压力最低时,其NMDAR1的转录水平同样较低;在CTO-1时,即小鼠的睡眠需求提高时,NMDAR1的转录也增加;在睡眠剥夺24h后,此时睡眠压力最高,小鼠VLPO脑区的NMDAR1转录水平进一步上调。而前额叶皮质（prefrontal cortex,PFC）的NMDAR1受体转录水平并未表现出与睡眠需求的相关性变化。这表明VLPO脑区NMDAR1与睡眠调控密切相关。同时,我们还通过Western blot分析了 VLPO内NMDAR1的蛋白表达水平变化,发现NMDAR1的蛋白水平与睡眠需求也呈正相关。NMDA受体对Ca2+具有高度通透性,因此我们还检测了 CaMKII的表达变化。实验结果发现,随睡眠压力的变化,VLPO内CaMKII与NMDAR1的蛋白表达水平成明显的线性相关关系,提示VLPO内NMDAR1的表达及胞内钙离子及其相关蛋白水平与睡眠内稳态调控密切相关。由于腺苷在睡眠调控中同样被证明起到了重要作用,且腺苷受体（Adenosine receptor,ADR）和NMDA受体均可通透钙离子,我们也检测了 VLPO及PFC脑区内腺苷受体在不同睡眠压力条件下的转录水平变化。结果显示,ADR在PFC脑区的转录水平与睡眠压力无明显线性相关关系,VLPO脑区的ADR在CTO-1时段较CT12-13时段略有提高,在睡眠剥夺后,转录水平进一步上调。本部分实验结果表明,VLPO内NMDAR1受体的表达与睡眠压力密切相关,且NMDA受体的敏感性高于腺苷受体,同时CaMKⅡ也参与了睡眠调控过程。为了验证MK-801抑制NMDA受体后是否也会导致Ca2+信号的变化,以及褪黑素是否会干预这一信号通路。我们检测了 CaMKⅡ及其下游分子p-CREB的蛋白表达变化。结果显示,MK-801可降低细胞内CaMKⅡ与p-CREB的表达水平,同时褪黑素可有效恢复其表达。最后,我们利用脑片钳技术对VLPO神经元给予步阶电流刺激后记录诱发动作电位,并分析了 MK-801及褪黑素处理后VLPO内神经元的兴奋性变化。结果显示,MK-801明显降低了诱发电位的放电频率,并减少了放电幅度。而褪黑素可明显恢复放电频率,增加神经元的兴奋性。本部分结果表明,VLPO的NMDAR1受体与睡眠压力密切相关,MK-801可通过阻断NMDAR1受体影响VLPO脑区神经兴奋性,进而影响其睡眠内稳态调控,成为潜在的导致连续黑暗条件下,小鼠自主跑轮运动检测中昼夜节律延长的原因,而褪黑素可有效干预这一过程。本部分实验还通过Ca2+指示剂pAAV-GcaMP6-dTomato腺相关病毒体内转染进一步确认了 MK-801和褪黑素处理后VLPO内钙离子水平变化情况。通过激光共聚焦显微镜检测脑片VLPO内神经元钙离子水平。结果显示,MK-801可显着降低VLPO内钙离子水平。而褪黑素可以明显改善MK-801所致的VLPO内钙离子水平下降。为了进一步验证此结论,我们选用新生鼠（P7-P10）,取脑后制作活体脑片,给予FLU0-8AM孵育,通过共聚焦显微分析VLPO内钙离子时程变化,结果也发现,MK-801抑制NMDA受体后,脑片内钙离子的荧光强度较对照组明显下降,并在1min后淬灭趋势趋于稳定,而褪黑素同样可以有效提高Ca2+水平。上述实验结果表明,Ca2+信号在MK-801导致自身昼夜节律延长及褪黑素的干预中发挥了重要作用。第三部分:褪黑素恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律延长的脑电分析及MT2受体参与的调节作用为进一步分析抑制NMDA受体导致自身昼夜节律延长的机制,本部分实验通过Labchart系统检测小鼠在自由活动状态下的脑电和肌电变化情况。EEG和EMG可准确反应睡眠和觉醒的转换,并区分出非快速动眼睡眠（non-Rapid Eye Movement,NREM）和快速动眼睡眠（rapid Eye Movement,REM）两个睡眠时相。本部分的EEG结果显示,在L:D（12h:12h）的标准光暗环境下,在黑暗向光照转换时,正常组小鼠由清醒迅速转入了 NREM睡眠时相。MK-801处理鼠由清醒向睡眠转换的时间（即wake-first NREM）较对照组延迟6±2.1min,而给与褪黑素干预后,wake-first NREM转换时相较MK-801显着恢复,与正常对照组转换时间接近。EEG结果表明,MK-801抑制NMDA受体后主要推迟了小鼠由清醒到first-NREM过程的转换,即导致入睡延迟,而褪黑素有效地干预了这一过程。已有研究证实负责睡眠内稳态调节的VLPO脑区主要表达褪黑素MT2受体,较少表达MT1受体;负责节律系统的SCN主要表达MT1受体,几乎不表达MT2受体。此外,还有研究显示MT2敲除鼠NREM睡眠时长较野生型小鼠显着减少。由此我们猜想,MT2受体在褪黑素干预MK-801致小鼠昼夜节律延长这一过程中起到了更为重要的作用。在实验中,我们先是发现褪黑素干预组和MK-801处理组之间NMDAR1表达无差异,而且单独给与褪黑素处理后VLPO内NMDAR1表达和对照组也没有差异,说明褪黑素不是直接通过恢复NMDAR1表达发挥拮抗作用。然后,我们给与MT2受体的特异性阻断剂4P-PDOT腹腔注射后,检测自主跑轮运动的变化。结果显示,4P-PDOT特异性拮抗MT2受体后,有效阻断了褪黑素的干预作用,明显延长小鼠的自身昼夜节律。从行为水平证实褪黑素很可能是通过VLPO的MT2受体完成其干预作用。此外,本实验还检测了 4P-PDOT阻断MT2受体后VLPO脑区的CaMKⅡ和p-CREB表达变化。结果显示,CaMKII和p-CREB的表达量较褪黑素干预组明显下调。单独给予MK-801和4P-PDOT处理后,小鼠VLPO内CaMKⅡ和p-CREB水平也明显下调。腺苷已被证实是参与睡眠-觉醒调节的重要神经因子,可与腺苷受体（ADR）结合后提高细胞内Ca2+水平。NECA是腺苷受体激动剂,是否可模拟褪黑素的作用?我们在实验中给与NECA作用后,检测了自发跑轮实验。结果发现,腺苷受体激动剂NECA可有效模拟褪黑素干预MK-801致自身昼夜节律的延长。EEG同样显示,NECA可改善MK-801所致的wake-first NREM睡眠时相转换的延迟。上述实验结果说明,褪黑素与VLPO内MT2受体结合,增加了 Ca2+信号,从而干预了 MK-801所致自身昼夜节律延迟,而增加VLPO内Ca2+信号是促进觉醒-NREM的转换进而营救NMDA受体异常所致入睡延迟的重要机制。结论本课题经过三部分实验研究,得出如下结论:1)抑制NMDA受体（MK-801处理）可导致小鼠自身昼夜节律延长,褪黑素可有效干预这一改变。节律系统在这一过程中未起到明显作用。2)褪黑素通过调控睡眠内稳态恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律的延长,VLPO内Ca2+-CaMKII-p-CREB通路在这一过程中起到了重要作用。3)脑电检测结果表明,MK-801导致小鼠从黑暗时相转入光照时相时,wake-first NREM 转换明显延迟,即入睡潜伏期延迟。褪黑素明显促进入睡,并通过与VLPO内MT2受体结合,促进Ca2+信号平衡睡眠内稳态,从而有效发挥了干预作用。本研究从内稳态角度理解睡眠-觉醒的调控机制,并提供了新的视角。
田丹枫[3]（2020）在《参知健脑方对拟血管性痴呆细胞模型的神经保护作用及机制研究》文中研究表明血管性痴呆（Vascular Dementia,VD）是痴呆常见类型之一,以记忆力进行性衰退、认知功能障碍及性格、情感等精神改变为主要临床表现。VD的病理机制与兴奋性氨基酸毒性损伤、突触可塑性改变、钙超载、氧化应激损伤及细胞凋亡等过程密切相关,早预防、早发现、早治疗可显着提高VD患者的生存率及生活质量,降低死亡率。课题组基于VD的“毒损脑络”中医创新病因病机理论并结合多年临床经验,创制了具有解毒通络作用的参知健脑方。前期动物体内实验研究表明,本方可改善VD大鼠的认知功能,修复受损海马神经元,通过调控谷氨酸突触囊泡转运关键蛋白clathrin介导的NMDA受体内吞过程,减轻谷氨酸所致神经兴奋性毒性而起到神经保护作用。但研究大多仅从单个靶点或通路评估参知健脑方对VD的干预作用,并未完全解释其药效机制;且目前尚未对其进行体外细胞实验深入分析验证,其分子机制值得更深入地探索研究。目的:基于VD“毒损脑络”理论,（1）通过网络药理学探讨参知健脑方治疗VD的药理作用及分子机制;（2）通过体外实验,筛选干预药物的适宜浓度,并探讨参知健脑方对拟VD细胞模型增殖及毒性的影响;（3）研究参知健脑方对拟VD细胞模型周期、凋亡及细胞内游离Ca2+和ROS/Superoxide水平的影响,探讨其对VD细胞模型谷氨酸兴奋性毒性的神经保护作用,并验证参知健脑方的治疗有效性及网络药理学结果的可靠性;（4）研究参知健脑方对拟VD细胞模型clathrin、RAB5B和NMDAR1表达水平的影响,探讨其是否通过调控clathrin介导的NMDA受体内吞过程发挥对VD的治疗作用,并验证网络药理学结果的可靠性。方法:第一部分:依托多种数据库检索并收集参知健脑方的入血化学成分、作用靶点和VD作用靶点,随后整合数据获得参知健脑方治病靶点。通过Cytoscape3.7.1构建参知健脑方-活性化合物-治病靶点网络图,STRING数据库构建蛋白互作网络,DAVID数据库进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。第二部分:采用谷氨酸诱导PC12细胞损伤作为VD细胞模型,采用CCK-8法和IncuCyte动态细胞成像技术筛选出谷氨酸适宜造模剂量及参知健脑方低、中、高干预剂量。参知健脑方各剂量与盐酸美金刚分别干预VD细胞模型,观察其对细胞形态、细胞增殖及毒性的作用。第三部分:采用谷氨酸诱导的PC12细胞损伤作为VD细胞模型,参知健脑方各剂量与盐酸美金刚分别干预VD细胞模型,采用流式细胞术等技术观察其对细胞周期、凋亡、细胞内游离Ca2+、活性氧和超氧化物（ROS/Superoxide）水平的影响,qRT-PCR检测caspase-3 mRNA的相对表达水平。第四部分:采用谷氨酸诱导的PC12细胞损伤作为VD细胞模型,参知健脑方各剂量与盐酸美金刚分别干预VD细胞模型。采用免疫荧光和Western blot技术分别检测clathrin、RAB5B和NMDAR1的分布和蛋白表达水平;qRT-PCR技术检测clathrin和NMDAR1在mRNA水平上的表达情况。结果:第一部分:网络药理学研究结果表明,（1）参知健脑方-活性化合物-治病靶点网络图包含3个单味药,18个活性化合物,154个治病靶点。其中,芍药苷、白芍苷和新芒果苷等活性成分关联基因较多,FGF1和FGF2位列治病靶点首位。（2）PPI网络包含154个靶点蛋白,关键蛋白涉及INS、ALB、AKT1、CASP3、JUN、PTGS2等。（3）GO富集分析共有条目4960个,其中生物过程相关条目4176个,细胞组成相关条目306个,分子功能相关条目478个。（4）KEGG富集分析共有相关通路30条,涉及MAPK信号通路、HIF-1信号通路、凋亡通路、神经活性配体-受体相互作用通路、钙信号通路等。第二部分:体外实验结果表明,（1）药物干预剂量筛选:谷氨酸适宜造模剂量为22.5 mM,参知健脑方低、中、高剂量分别为:0.05、0.1、0.2 mg/mL,盐酸美金刚干预剂量为10 μM。（2）细胞形态学:正常PC12细胞呈不规则长梭形,形态完整,突起明显,贴壁牢固;谷氨酸处理的PC12细胞呈圆球形,结构不完整,胞体皱缩,易聚集成团;突起变短或减少、消失,细胞贴壁不牢;随着时间的增加,死细胞数明显增多,细胞死亡率显着上升。与模型组相比,参知健脑方各剂量组细胞胞体均相对完整,部分细胞突起少量存在,存在突触间联系;细胞贴壁较模型组牢固;随着时间的增加,死细胞数增多不明显,细胞死亡率没有显着上升。盐酸美金刚组细胞形态较模型组略有改善。（3）CCK-8增殖实验:谷氨酸可以显着降低PC12细胞活力,抑制细胞增殖（P<0.05）;参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可明显提高PC12细胞活力,促进细胞增殖,降低细胞毒性（P<0.01）。（4）IncuCyte增殖实验:谷氨酸可以持续增加细胞绿色荧光面积和死细胞数,死亡率呈明显上升趋势,细胞融合率持续下降;参知健脑方各剂量均可以有效减少细胞绿色荧光面积和死细胞数,死亡率降低,融合率呈上升趋势;盐酸美金刚的各项结果趋势与谷氨酸类似。（5）CFSE增殖实验:谷氨酸可以明显增高CFSE平均荧光强度（P<0.01）,参知健脑方各剂量和盐酸美金刚CFSE平均荧光强度均呈减弱趋势,但差异无显着统计学意义（P>0.05）。第三部分:体外实验结果表明,（1）细胞周期:谷氨酸可以显着增加S期细胞比例,使细胞阻滞在S期（P<0.01）;参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可以显着降低S期细胞比例（P<0.01）。（2）细胞凋亡:谷氨酸可以明显增加凋亡率（P<0.01）,参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可以显着减少细胞凋亡（P<0.01）。（3）Ca2+和ROS/Superoxide水平:谷氨酸可明显升高细胞内Ca2+和ROS/Superoxide水平（P<0.01）,参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可不同程度降低细胞内Ca2+和ROS水平（P<0.05,P<0.01）。（4）qRT-PCR:谷氨酸可以明显增加caspase-3 mRNA的表达水平（P<0.01）;参知健脑方和盐酸美金刚均可显着降低caspase-3 mRNA的表达水平（P<0.01）。第四部分:体外实验结果表明,（1）免疫荧光:clathrin主要表达于细胞膜和细胞质;RAB5B主要表达于细胞膜和细胞质中的早期内体;NMDAR1主要表达于细胞膜和突触。谷氨酸显着降低clathrin和RAB5B的表达（P<0.01,P<0.01）,增加NMDAR1的水平（P<0.01）;参知健脑方各剂量均可上调clathrin、RAB5B水平（P<0.05,P<0.05）,下调NMDAR1水平（P<0.05）。（2）qRT-PCR:谷氨酸可明显降低clathrin mRNA的表达（P<0.01）,并增加NMDAR1 mRNA的表达水平（P<0.01）;参知健脑方可明显增加clathrin的表达并显着降低NMDAR1的表达水平（P<0.01）。（3）Western Blot:谷氨酸可抑制clathrin和RAB5B的表达,明显增加NMDAR1的表达水平（P<0.01）;参知健脑方各剂量均可以显着上调clathrin、RAB5B表达水平,下调NMDAR1 的水平（P<0.01）。结论:（1）参知健脑方治疗VD的作用靶点和通路机制呈现多角度、多途径、多环节的特点,其治病靶点大多与血管、神经保护及突触可塑性调节相关,且靶点与通路之间相互协同发挥作用,提示这可能是参知健脑方治疗VD的关键,为深入研究参知健脑方治疗VD的其他机制提供了新思路。（2）适宜浓度的谷氨酸可以显着促进PC12细胞增殖,但谷氨酸浓度过高会产生细胞毒性,导致细胞死亡。参知健脑方各剂量能均能明显促进细胞增殖,提高细胞活力及细胞融合率,减少死细胞数目及死亡率,减少细胞毒性损伤;均对细胞形态有一定修复作用,改善细胞贴壁不牢的状态。（3）参知健脑方能有效修复细胞周期循环,下调caspase-3的表达而减少细胞凋亡;降低细胞内Ca2+浓度而阻止Ca2+内流并增强细胞清除ROS和Superoxide的能力,减少谷氨酸毒性积累及氧化应激损伤。参知健脑方可影响上述多种途径发挥神经保护作用;验证了参知健脑方治疗VD的有效性以及网络药理学计算机预测结果的可靠性。（4）Clathrin介导的NMDA受体胞吞障碍导致谷氨酸兴奋性毒性积累,“解毒通络”的参知健脑方可改善谷氨酸损伤PC12细胞clathrin介导的NMDA受体胞吞过程而降低谷氨酸神经兴奋性毒性。其发挥神经保护的作用机制可能与上调clarhrin和RAB5B的表达,促进clathrin介导的NMDA受体胞吞过程有关。验证了参知健脑方治疗VD的有效性以及网络药理学研究结果的可靠性,为“解毒通络”法则治疗VD提供了微观证据。
李倩楠[4]（2020）在《“良关系”丹参-降香药对抗脑缺血损伤脑内物质基础研究》文中认为脑缺血疾病是一种常见的急性脑血管病,具有高复发率、高死亡率的特点,对其的治疗是一直以来的研究重点。丹参是经典的活血化瘀类药物,降香也具有化瘀止血的功效,两者合用常被用来治疗心脑血管疾病。本论文以丹参注射液与香丹注射液为代表,从代谢角度进行了丹参-降香药对抗脑缺血损伤作用的脑内物质基础研究,具体内容有以下几个方面:1.根据《中国药典》规定,对丹参及降香药材中规定指标成分进行含量测定;并建立了一套同时检测注射液中丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、对香豆酸、丹酚酸A、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、香兰素和香草酸等药效成分的HPLC检测方法,并进行了质量控制。结果表明:丹参药材中隐丹参酮、丹参酮ⅡA及丹参酮Ⅰ的总含量大于0.25%,丹酚酸B的含量大于3.0%,降香中挥发油的含量大于1.0%,注射液中原儿茶醛的含量均高于标准,表明药材与注射液符合药典及中药成方制剂的规定,质量合格,可用于后续实验。2.采用HPLC-Q/TOF-MS代谢组学研究手段结合药效学研究,完成了丹参-降香药对抗脑缺血脑代谢组学研究。结果表明,相比于假手术组,模型组中有20种内源性小分子脑内水平发生了紊乱现象。丹参注射液和香丹注射液均可对其产生不同程度的改善作用,香丹高剂量组最为显着,相关代谢通路有:氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢、鞘磷脂代谢及脂肪酸代谢等,同时,在香丹高剂量组中发现了药物成分:咖啡酸,以及代谢产物:丹参素异丙酯和咖啡酸异丙酯,为后续探究丹参-降香药对的入脑成分提供依据。3.运用MD-HPLC-ECD联用技术,研究丹参-降香药对对脑缺血大鼠脑内神经递质的影响及脑内代谢。结果显示:相比假手术组,模型组大鼠脑内多巴、酪氨酸和未知的M1、M2明显发生了异常的变化,给药后,香丹注射液可明显调节发生紊乱的神经递质水平,且效果优于丹参注射液。同时还发现香丹注射液组比丹参注射液组可入脑的成分多,提示丹参与降香合用可促进药物成分如丹参素、迷迭香酸、丹酚酸A,及代谢物:丹参素异丙酯和咖啡酸异丙酯入脑,并推测这些成分可能与香丹注射液调控脑内神经递质异常变化相关。
王志婕[5]（2020）在《大椎穴埋线调控Egr1-T型Ca2+-Limk1-cofilin通路治疗癫痫的机制研究》文中指出目的:本课题先经系统综述验证穴位埋线疗法治疗癫痫的临床有效性及安全性,再以动物实验探究大椎穴埋线疗法调控Egrl-T型Ca2+-Limkl-cofilin通路对癫痫小鼠模型的可能作用机制,以期为临床治疗癫痫提供有效的方案以及有力的证据学依据。方法:系统综述部分应用meta分析评价关于穴位埋线疗法治疗癫痫的临床随机对照试验,对穴位埋线疗法治疗癫痫的临床疗效与安全性进行方法学评价。经计算机检索与手工检索相结合的检索方式,两名研究人员根据既定的纳入标准确定最终纳入的文献,并进行质量评价,以临床疗效为主要结局指标,癫痫相关评价为次要结局指标,结果分析应用RevMan5.3软件。动物实验部分从宏观到微观对大椎穴埋线调控Egrl-T型Ca2+-Limk1-cofilin通路治疗癫痫小鼠的作用机制进行探究。先经腹腔注射不同剂量（8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg）的海仁酸确定造模方案;之后将5周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠150只适应性喂养7天后按照随机数字列表分为空白组、模型组、埋线组、全剂量药物组、埋线+全剂量药物组和埋线+半剂量药物组6组,每组25只。空白组不做干预,每日只行抓取称重;模型组造模后不做治疗,每日只行抓取称重;埋线组造模后予大椎穴埋线治疗（将3mm长的可吸收外科手术缝合线埋入大椎穴）,共埋线1次,7天后观察疗效;全剂量组予奥卡西平（30mg/kg）灌胃治疗,早7时和晚7时两次给药,连续灌胃7天;埋线+全剂量药物组在穴位埋线疗法的基础上予奥卡西平（30mg/kg）灌胃治疗,早7时和晚7时两次给药,连续灌胃7天;埋线+半剂量药物组在穴位埋线疗法的基础上予奥卡西平（15mg/kg）灌胃治疗,早7时和晚7时两次给药,连续灌胃7天。结局指标包括:小鼠体重、旷场实验、HE染色、尼氏染色、Fluoro-Jade B染色、PET/CT检测以及通路中相关蛋白（Egrl、CACNA1H、Limkl、cofilin 以及 p-cofilin）的表达量测定。以SPSS23.0软件包进行统计学分析,以P<0.05代表有统计学意义。结果:1.系统综述分析临床研究的有效性及安全性穴位埋线疗法结合抗癫痫药或中药方剂与抗癫痫药或中药方剂相比可显着提高临床有效率;穴位埋线疗法结合抗癫痫药与抗癫痫药相比可显着降低癫痫评分;单纯使用穴位埋线疗法的临床有效率（RR 1.03,95%CI[0.95,1.12]）和癫痫评分（MD-2.26,95%CI[-5.08,0.56]）与西药相比,不具有显着的统计学差异;穴位埋线疗法对降低癫痫发作频率与对照组相比没有统计学差异（MD-0.46,95%CI[-1.48,0.56]）;安全性方面,目前尚没有明确的证据证明穴位埋线疗法治疗癫痫时会造成严重的临床不良事件。2.造模注射剂量小鼠腹腔单次注射8mg/kg、10mg/kg以及12mg/kg海仁酸造模成功率分别为0%,71.4%和25%,3组间造模成功率具有统计学差异（P<0.01）,故予小鼠腹腔单次注射10mg/kg海仁酸可复制本研究实验周期内较成功的模型成功率,故将以此为复制癫痫小鼠模型的标准计量。3.大椎穴埋线疗法对癫痫小鼠行为学的影响与空白组相比,造模后癫痫小鼠体重减轻（P<0.05）,经埋线、全剂量奥卡西平、埋线+半剂量奥卡西平、埋线+全剂量奥卡西平治疗后均能使小鼠体重增加（P<0.05）;从治疗第2天,使用奥卡西平药物的3组小鼠体重开始增加;治疗第3天起,单纯埋线疗法组小鼠体重开始增加。海仁酸诱导的癫痫小鼠在旷场实验中爬壁次数、中央路程以及中央时间均减少,小鼠表现出焦虑情绪;埋线、全剂量奥卡西平、埋线+半剂量奥卡西平、埋线+全剂量奥卡西平疗法都能改善小鼠的焦虑情绪（P<0.01）,治疗4组相比,埋线疗法较其他3组治疗效果最差（P<0.01）,埋线+全剂量疗法较其他3组治疗效果最优（P<0.01）,埋线+半剂量疗法和单纯全剂量疗法居中且两者治疗效果不具有明显差异（P>0.05）。4.大椎穴埋线疗法对癫痫小鼠海马病理学和脑内葡萄糖代谢的影响HE染色结果显示:空白组的海马CA3区神经元细胞排列规整,细胞结构整齐,细胞器完整;模型组的CA3区神经元细胞大量凋亡,排列极其不规整,细胞丧失原本形态,细胞破裂不完整;经治疗后,细胞形态与模型组相比较有所改善,细胞的凋亡数目与模型组相比减少;治疗4组相比,埋线+全剂量药物组在改善神经细胞形态方面效果最优,细胞排列欠整齐,细胞欠完整,形态欠规则;其次为埋线+半剂量组和全剂量组,且二者的效果相近,细胞排列相对规整,细胞结构较完整,形状较规则;埋线组最差,细胞排列不整齐,细胞相对完整,形状相对规则。尼氏染色结果显示:与空白组相比,经造模后的5组海马CA3区神经元细胞尼氏体数量显着缩减,差异具有显着的统计学意义（P<0.01）;模型组的CA3区神经元细胞尼氏体数目显着减少,与空白组相比结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;经4组治疗后,神经元细胞尼氏体数量显着增加,与模型组比较,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;治疗4组相比,埋线+全剂量组与其他3组相比,尼氏体数量最多,结果具有统计学差异（P<0.05）;埋线组与其他3组相比,尼氏体数量最少,结果具有统计学差异（P<0.05）;埋线+半剂量组与全剂量治疗组数目居中,且两组相比结果未见统计学差异（P>0.05）。FJB染色结果显示:与空白组对比,经造模后的5组中海马CA3区FJB（+）细胞数目显着增加,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;模型组CA3区神经元FJB（+）细胞数目显着增加,与空白组相比,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;经4组治疗后,FJB（+）细胞数明显减少,与模型组比较,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;治疗4组中,埋线+全剂量组与其他3组比较,FJB（+）细胞数最少,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;埋线组与其他3组比较,FJB（+）细胞数最多,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;埋线+半剂量组与全剂量治疗组数目居中,且两组相比结果未见统计学差异（P>0.05）。空白组小鼠全脑处于18F-FDG高摄取灶,模型组小鼠为极低摄取灶,治疗4组介于二者之间。SUVmax结果经统计学检验显示:与空白组比较,经造模后的5组SUVmax值均降低,结果具有统计学差异（P<0.01）;与模型组相比,4组治疗组SUVmax增加,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;治疗4组中,埋线+全剂量组SUVmax较其他3组高,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）,埋线组SUVmax较其他3组低,结果具有统计学差异（P<0.05）,埋线组+半剂量组与全剂量组介于二者之间,且两者比较结果不具有统计学差异（P>0.05）。5.大椎穴埋线疗法对癫痫小鼠Egr1-T型Ca2+-Limk1-cofilin通路的影响通路中相关蛋白（Egrl、CACNA1H、Limkl、cofilin以及p-cofilin）在空白组海马组织中表达量极低,造模后其表达量均升高,与空白组相比,差异具有显着的统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,经过治疗的4组蛋白表达量均降低,结果具有显着的统计学差异（P<0.01）;治疗4组中,埋线+全剂量组与其他3组相比,蛋白的表达量最低,结果具有统计学差异（P<0.05）,埋线组与其他3组相比,蛋白表达量最高,差异具有显着的统计学意义（P<0.01）,埋线组+半剂量组与全剂量组相比表达量居中,且两者差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:1.Meta分析结果可知穴位埋线疗法治疗癫痫可以提高临床疗效,且不会引起严重的不良事件;2.腹腔单次注射10mg/kg海仁酸可以成功复制本实验期内稳定的小鼠癫痫模型;3.大椎穴埋线疗法可以改善癫痫小鼠的体重和癫痫共患之焦虑;4.大椎穴埋线疗法可能是通过降低Egrl-T型Ca2+-Limk1-cofilin通路中相关蛋白的表达量,改善癫痫小鼠海马病理学变化以及脑组织葡萄糖代谢状态,从而控制癫痫发作;5.药物联合大椎穴埋线疗法时,可增强正常剂量抗癫痫药物（奥卡西平）的药物疗效;将奥卡西平的服用量减半时,仍能取得较满意的实验效果。
刘珍洪[6]（2020）在《基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用》文中研究表明目的本课题从中医心脑相关理论出发,选用“从心论治”代表方参枝苓口服液,基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨其干预阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的作用机制。AD是老年痴呆症最常见的类型。临床可表现为记忆、情志和行为障碍,对患者家庭、护理人员造成了沉重的经济和精神负担。近年来研究表明,髓鞘损伤与AD、帕金森疾病（Parkinson’sdisease,PD）和中风等神经退行性疾病相关。其中发现AD与髓鞘的破坏和丢失关系密切。研究发现髓鞘损伤早于认知障碍、老年斑（Senileplaque,SPs）和神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFTs）等病理改变,髓鞘损伤可能在AD早期认知障碍中发挥关键作用。PI3K/Akt-mTOR通路是髓鞘形成的强大驱动力,是CNS髓鞘蛋白表达的主要驱动因素。一些研究显示神经元PI3K/Akt-mTOR信号传导的异常和持续激活是AD的早期特征。mTOR在构成髓鞘的少突胶质细胞中对脂质合成,转录因子调节,和细胞骨架具有显着作用,这是少突胶质细胞发育不可或缺的过程。除外,表观遗传阻滞、脂质代谢异常皆与AD的病理密切相关。本研究通过体内实验探索参枝苓口服液是否有改善损伤髓鞘的作用,同时观察体外是否能通过保护Aβ42损伤的少突胶质细胞进而维持髓鞘完整性而防治早期AD。并基于PI3K/Akt-mTOR信号通路、表观遗传调控及脂质代谢探讨其可能机制,为参枝苓口服液保护髓鞘提供可能的证据。方法1.36只3月龄雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为模型组,多奈哌齐组,参枝苓口服液组,每组12只。同背景、同月龄野生型C57BL/6J小鼠12只作为正常组。多奈哌齐组给予多奈哌齐（0.92mg.kg-1·d-1）灌胃给药,参枝苓口服液组给予参枝苓口服液（2.9ml·kg-1·d-1）灌胃给药。正常组和模型组灌予等体积的0.5%CMC。2.利用Y迷宫实验研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠空间识别和记忆能力的影响。3.利用透射电镜研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中淀粉样斑块、髓鞘及少突胶质细胞超微结构的影响。4.利用免疫组化和Western blot方法研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中髓鞘相关蛋白MBP、PLP和MAG与Aβ42蛋白的表达变化影响。5.40只雄性SD成年大鼠（200±20g）随机分为正常组和参枝苓口服液组,参枝苓口服液组以成人（70kg）等效剂量的2倍量进行灌胃,正常组灌服等体积0.5%CMC,每天1次,连续7d,制备参枝苓口服液含药血清。6.UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液含药血清主要有效成分。7.Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞,建立拟AD体外细胞模型。8.利用CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清及阳性药多奈哌齐对OLN-93少突胶质细胞的安全剂量和有效剂量。9.利用Western blot、RT-qRCR法、免疫荧光研究参枝苓口服液含药血清对Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞髓鞘相关蛋白和PI3K/Akt-mTOR信号通路蛋白及mRNA表达影响。10.利用PI3K/Akt-mTOR信号通路抑制剂LY294002（PI3K抑制剂）及Rapamycin（mTOR抑制剂）进一步确认PI3K/Akt-mTOR信号通路在参枝苓口服液髓鞘保护中的参与作用。11.利用染色质免疫共沉淀（CHIP）实验观察参枝苓口服液对Aβ42损伤少突胶质细胞OLN-93的乙酰化组蛋白与MBP基因相互作用。12.利用LC-MS/MS法观察参枝苓口服液对Aβ42损伤少突胶质细胞OLN-93脂质代谢的影响。结果1.体内动物实验参枝苓口服液和阳性对照药多奈哌齐连续灌胃3个月后可以明显延长APPswe/PS1dE9双转基因小鼠在新异臂中活动的路程和持续时间。透射电镜下可观察到在损伤的少突胶质细胞附近淀粉样斑块的沉积,而正常组和治疗组未观察到。同时,透射电镜下观察到参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显改善髓鞘板层的结构、髓磷脂的崩解以及少突胶质细胞的结构破坏。在此基础上,对各组小鼠海马进行免疫组化及Western blot实验结果也显示,参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中髓鞘相关蛋白MBP、PLP和MAG的蛋白表达。同时,APPswe/PS1dE9双转基因模型小鼠海马中观察到Aβ42的蛋白表达上调,参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显下调小鼠海马中Aβ42的蛋白表达。2.UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液及参枝苓含药血清主要有效成分参枝苓口服液中,芍药内酯苷、肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这5种代谢物都能检测到。且浓度含量:甘草酸>芍药苷>芍药内酯苷>肉桂酸>甘草苷。参枝苓口服液大鼠含药血清中,可以检测到肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种代谢物。浓度含量:甘草酸>肉桂酸>芍药苷>甘草苷。芍药内酯苷虽然在质谱中可以检测到峰,但是信号可能与噪音相似,定量检测未检测出含量。提示,参枝苓口服液确实可以经过灌胃入血发挥作用,参枝苓口服液髓鞘保护作用可能与肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种成分密切相关。3.体外细胞实验Aβ42可以诱导OLN-93少突胶质细胞引起损伤,100μMAβ42孵育细胞16h以及1μM、10μM和100μM的Aβ42孵育细胞24h和48h后可以明显降低细胞活力。同时,1～100μM的Aβ42孵育细胞24h,细胞的损伤率明显增加。1～100μM的Aβ42孵育24h可以对细胞形态造成破坏,引起细胞固缩,碎裂,死亡。并且,Aβ42孵育24h可以显着升高OLN-93细胞的凋亡水平。用CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐的安全剂量、给药时间范围结果显示,1%～20%浓度的参枝苓口服液含药血清孵育3～48h对正常OLN-93细胞不具有细胞毒性,甚至16%和20%浓度的参枝苓口服液含药血清孵育24h和48h可以显着提高正常OLN-93细胞的细胞活力。多奈哌齐对正常OLN-93细胞的安全剂量及时间为:孵育 3h（0.01μM,0.1μM,1 μM,10μM,100μM）;孵育 24h（0.01 μM,0.1 μM,1μM,10μM,100μM）;孵育 48h（0.01 μM,0.1μM,1 μM,10μM）。CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐的有效剂量、给药时间范围,16%,20%参枝苓口服液含药血清孵育24h及48h。1 μM,10μM和100μM多奈哌齐孵育3h或24h;0.1μM,1μM和10μM多奈哌齐孵育48h。Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞,与体内动物实验一致,表现为Aβ42明显下调少突胶质细胞髓鞘相关蛋白MBP、PLP、MAG和MOG的表达,并且下调MBP和PLP的mRNA表达水平,而参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐干预后可以明显逆转这些蛋白和mRNA的表达水平。另一方面,Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞还表现为引起PI3K/Akt-mTOR信号通路的异常。Aβ42不仅可以下调PI3K,Akt及mTOR的蛋白和mRNA表达水平,还可以明显下调p-PI3K,p-Akt及p-mTOR的蛋白表达水平,而参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐干预后可以明显逆转这些蛋白和mRNA的表达水平。参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐对Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞的保护作用可以被PI3K/Akt-mTOR信号通路的抑制剂完全逆转,具体表现为,无论是使用LY294002,Rapamycin还是联合使用LY294002与Rapamycin都可以完全逆转参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐上调MBP的能力。CHIP实验显示:Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞后组蛋白H3乙酰化水平升高。多奈哌齐和参枝苓口服液含药血清下调组蛋白H3乙酰化水平。同时,Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞后,更多的基因MBP发生了组蛋白H3乙酰化。多奈哌齐和参枝苓口服液含药血清可以下调组蛋白H3乙酰化的MBP基因水平。脂质代谢结果显示:正常组的CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS显着高于模型组。模型组的Cer、DG、SM和TG显着高于正常组。两组Cerp、Hex2Cer、HexCer和Sphingosine含量均等。多奈哌齐的Cer、CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS显着高于模型组。模型组的SM和TG明显高于多奈哌齐组。参枝苓口服液的Cer、DG、CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、SM显着高于模型组。模型组的TG明显高于参枝苓口服液组。结论参枝苓口服液具有改善损伤髓鞘的作用,同时参枝苓口服液含药血清能保护Aβ42损伤的少突胶质细胞进而维持髓鞘完整性而防治早期AD。参枝苓口服液的髓鞘保护作用与PI3K/Akt-mTOR信号通路、表观遗传调控及脂质代谢密切相关。首先,参枝苓口服液可能通过上调PI3K,Akt及mTOR mRNA的水平,引起PI3K,Akt及mTOR蛋白的表达水平上调,增加PI3K,Akt及mTOR的磷酸化,增强PI3K/Akt-mTOR信号通路的活性,从而发挥少突胶质细胞及髓鞘保护作用。其次,参枝苓口服液通过下调组蛋白H3乙酰化水平、下调组蛋白H3乙酰化的MBP基因水平从而保护少突胶质细胞。再者,参枝苓口服液通过上调CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS的含量,下调TG含量,调整脂质代谢紊乱从而保护少突胶质细胞。最后,参枝苓口服液髓鞘保护作用的物质基础则可能与肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种成分密切相关。
黄锶哲[7]（2020）在《不同浓度MDMA染毒新生大鼠心肌细胞中钙调控蛋白及NF-κB的作用研究》文中进行了进一步梳理【目的】摇头丸已经成为全球范围内难以避免的社会和公共卫生问题。摇头丸的主要成分3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺（MDMA）的毒性作用已经引起广泛关注,也成为法医毒理学研究热点之一。除了研究比较广泛深入的神经毒性之外,MDMA的心血管毒性作用也得到学者的重视,MDMA可以引起心血管系统功能及形态学的改变,表现为血压升高、心律失常、心肌病甚至心力衰竭出现猝死。研究表明MDMA的直接心肌毒性作用可以导致心肌细胞钙离子浓度失衡、钙振荡模式改变,但具体机制仍未阐明。依此,本课题研究中通过体外原代培养新生大鼠心肌细胞,观察不同浓度及不同作用时间MDMA对心肌细胞的形态学影响及毒性效果,检测目的钙调控蛋白的表达、NF-κB激活-转运入核情况以及PKA、PKC活性,结合相关抑制剂的干预,以期明确MDMA心肌毒性作用的最强浓度及时间,探讨MDMA对参与钙循环的钙调控蛋白及NF-κB的影响及其潜在的作用机制。【方法】实验1体外原代培养新生大鼠心肌细胞,接种培养至第6d建立MDMA染毒细胞模型,设置10～1000μM不同浓度、1～24h不同作用时间分组;构建原代新生大鼠心肌细胞MDMA染毒模型,显微镜观察心肌细胞形态学变化,LDH法及CCK-8法检测MDMA心肌毒性效果。实验2原代培养新生大鼠心肌细胞,设置10～1000μM MDMA染毒及Ry R2、Cav1.2抑制组,MDMA染毒24h,提取细胞蛋白及RNA;应用Western blot及RT-q PCR法检测目的钙调控蛋白Cav1.2、Ry R2、NCX1、PLN的m RNA水平、总蛋白量及磷酸化表达量。实验3原代培养新生大鼠心肌细胞,设置10～1000μM MDMA染毒及Ry R2、Cav1.2、NF-κB、PKA、PKC抑制组,MDMA染毒24h;免疫荧光染色观察NF-κB激活-转运入核情况;检测PKA、PKC相对活性;应用Western blot及RT-q PCR法检测目的钙调控蛋白Cav1.2、Ry R2、NCX1、PLN在NF-κB、PKA阻断后的m RNA水平、总蛋白量及磷酸化表达量。【结果】1.MDMA染毒确实可以引起原代培养新生大鼠心肌细胞形态学的改变,主要表现为胞浆内出现空泡、细胞皱缩、心肌细胞自发性搏动节律改变,且形态学改变程度随作用浓度、时间增加而增强;2.LDH法检测结果提示10～1000μM MDMA对心肌细胞有毒性损坏作用,且毒性作用与染毒时间存在依赖性;CCK-8法检测结果显示1000μM MDMA染毒使得心肌细胞存活率降低;3.MDMA使LTCC表达量上升,上调Ry R2及其磷酸化蛋白的表达,NCX1蛋白表达量上升,PLN表达上调;4.MDMA染毒使PKA、PKC活性增加;5.10～1000μM浓度范围内MDMA染毒能使NF-κB激活-转运入核增强,该效果与MDMA作用浓度成正比;6.PKA、NF-κB被阻断后,MDMA引起目的钙调控蛋白表达的变化与纯MDMA染毒时存在不同程度或趋势的差异。【结论】1.MDMA心肌毒性作用与浓度和染毒时间存在剂量、时间依赖性,且提示在MDMA心肌毒性研究中,以1000μM×24h MDMA染毒构建模型较为合适;2.MDMA染毒对目的钙调控蛋白表达具有不同程度或趋势的影响作用,且与MDMA作用浓度具有一定关系;3.MDMA染毒可以激活NF-κB使转运入核增强;4.MDMA染毒后PKA可以对Cav1.2及Ry R2产生正向调节作用以维持钙离子浓度平衡;MDMA染毒后可通过NF-κB途径介导Cav1.2、Ry R2,对钙离子浓度产生影响。
王鹏伟[8]（2020）在《基于BDNF-TrkB信号通路探讨交泰丸对慢性束缚应激大鼠抗焦虑作用的机制研究》文中研究表明目的:通过慢性束缚应激建立大鼠焦虑模型,观察交泰丸对慢性束缚应激大鼠一般状态、体重和行为学的影响,并通过检测大鼠海马糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor,GR）、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）、酪氨酸激酶受体B（Tropomyosin receptor kinase B,Trk B）和p-Trk B蛋白表达水平,以及BDNF m RNA和Trk B m RNA的表达水平,探讨交泰丸的抗焦虑作用机制。方法:选取Wistar雄性大鼠60只,按体重和旷场实验结果随机将大鼠分为空白组、模型组、地西泮组和交泰丸低、中、高剂量组,每组10只,分笼饲养。空白组不进行任何刺激,其余各组采用14天慢性束缚应激法建立大鼠焦虑模型。交泰丸各剂量组和地西泮组在每天束缚前分别灌服交泰丸低剂量（0.75 g生药/kg）、中剂量（1.5 g生药/kg）、高剂量（3 g生药/kg）和地西泮（地西泮,1 mg/kg）,空白组和模型组灌服等量超纯水。观察大鼠一般状态和体重变化情况,观察大鼠旷场实验（直立次数和运动总距离）和明暗箱实验（穿箱次数和明箱停留时间）以反映大鼠焦虑状态。采用蛋白免疫印迹法（Western bloting）测定大鼠海马组织中GR、BDNF、Trk B和p-Trk B蛋白表达水平。采用RT-PCR法测定大鼠海马BDNF m RNA和Trk B m RNA的表达水平。结果:1.交泰丸对慢性束缚应激大鼠一般状态和体重的影响:经过14天慢性束缚应激,与空白组相比,模型组大鼠有精神紧张,容易躁怒,毛皮直立散乱、变黄发暗,喜蛰伏角落,大便不成形的症状,交泰丸各剂量组和地西泮组焦虑表现较模型组有所改善。大鼠体重变化情况:与空白组相比,模型组大鼠体重显着减轻（P<0.01）;与模型组相比,地西泮组大鼠体重显着增加（P<0.05）,交泰丸各剂量组大鼠体重有增加趋势,但无统计学差异。2.交泰丸对慢性束缚应激大鼠行为学影响:在旷场实验中,模型组大鼠经过14天的慢性束缚应激后,与空白组相比,大鼠直立次数和运动总距离均明显减少（P<0.01）;与模型组相比,交泰丸中剂量组和地西泮组大鼠直立次数显着增加（P<0.05）,交泰丸高、低剂量组有增加趋势,但无统计学差异;与模型组相比,交泰丸低、中、高剂量组和地西泮组大鼠运动总距离明显增加（P<0.05或P<0.01）。在明暗箱实验中,模型组大鼠经过14天的慢性束缚应激后,与空白组相比,大鼠穿箱次数和明箱停留时间均明显减少（P<0.01）;与模型组相比,交泰丸低、中、高剂量组和地西泮组大鼠穿箱次数显着增多（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,交泰丸中剂量组和地西泮组大鼠明箱停留时间显着增加（P<0.05）。3.交泰丸对慢性束缚应激大鼠BDNF-Trk B信号通路的影响:交泰丸对慢性束缚应激大鼠海马GR、BDNF、Trk B和p-Trk B蛋白表达水平的影响:经过14天慢性束缚应激后,与空白组相比,模型组大鼠海马GR、BDNF、Trk B和p-Trk B蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与模型组相比,交泰丸各剂量组和地西泮组大鼠海马BDNF和p-Trk B蛋白表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,交泰丸低剂量组大鼠海马GR蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,交泰丸中、高剂量组和地西泮组大鼠海马GR蛋白表达水平有升高趋势,但无统计学差异;与模型组相比,交泰丸低、中剂量组和地西泮组大鼠海马Trk B蛋白表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）,交泰丸高剂量组大鼠海马Trk B蛋白表达水平有升高趋势,但无统计学差异。交泰丸对慢性束缚应激大鼠海马BDNF m RNA和Trk B m RNA表达水平的影响:经过14天慢性束缚应激后,与空白组相比,模型组大鼠海马BDNF m RNA和Trk B m RNA表达水平显着降低（P<0.01）;与模型组相比,交泰丸各剂量组和地西泮组大鼠海马BDNF m RNA和Trk B m RNA表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）。结论:交泰丸能够改善慢性束缚应激大鼠焦虑样行为,可能是通过改善BDNF-Trk B信号通路关键因子水平实现的。
李文康[9]（2020）在《针刺对PCPA失眠大鼠海马5-HT递质、5-HT1AR(5-HT2AR)/AC信号通路与二者关联性影响研究》文中认为目的:探讨针刺改善PCPA失眠在中枢5-HT睡眠递质及5-HT亚型受体后信号通路的作用机制。方法:选取70只健康SPF级SD雄性大鼠,随机抽选16只为正常组,剩余54只进行造模并筛选,随机分为3组:模型组、针刺（针刺脐内环合失眠穴方）组、非穴组,各16只。针刺组采用针刺脐内环合失眠穴方干预治疗,非穴组予针刺双侧肋下各2个固定点治疗,正常组、模型组则不采用任何针刺,仅予相同时间和强度的抓摸刺激。干预6天后,取大鼠海马组织,样本编号并相应保存待检;免疫组化法检测5-HT1A、5-HT2A受体形态学的变化;酶联免疫法检测各组海马5-HT的含量,放射免疫分析法测定AC活性,运用统计方法分析二者的关联性。结果:1.免疫形态学观察:相对于正常组,模型组大鼠海马5-HT1AR阳性表达数减少,呈散在、疏松排列;5-HT2AR阳性颗粒数目明显增加,阳性表达区域趋于集中;通过针刺后,针刺组大鼠海马5-HT1AR阳性表达颗粒分布集中且较规则,颜色加深;而5-HT2AR棕色表达数则明显减少,阳性区域颜色较浅。2.实验指标显示:A、相对于正常组,模型组海马区5-HT1AR表达下降而5-HT2AR表达上升（均P<0.01）;海马内5-HT含量显着下降（P<0.01）,AC活性降低（P<0.01）,模型组海马5-HT含量损害与AC活性损伤呈正相关性,r=0.648,P<0.01;B、非穴组各组数据与模型组均无显着性差异（均P>0.05）;且非穴组5-HT含量与AC活性相关性不强;C、与模型组比较,针刺组海马内5-HT1AR表达上升而5-HT2AR表达下降（P<0.01、P<0.01）;5-HT含量显着升高（P<0.01）,AC活性明显提高（P<0.01）,针刺对5-HT含量提高与AC活性上调也呈正相关性,r=0.644,P<0.01;D、与非穴组比较,针刺组海马内5-HT1AR表达上升,而5-HT2AR表达下降（P<0.01、P<0.01）;5-HT含量显着提高（P<0.01）,AC活性明显上调（P<0.01）。结论:1.PCPA模型大鼠海马呈现5-HT1A、5-HT2A受体形态异常;针刺有改善PCPA失眠模型大鼠海马5-HT1A、5-HT2A受体形态作用。2.PCPA模型大鼠海马呈现5-HT含量、AC活性均受损降低及二者的受损呈一定正相关性;而针刺脐内环穴合失眠方有显着升高其5-HT含量、上调其AC活性的作用,对二者的改善也呈一定相关性。3.实验支持该针法通过改善5-HT睡眠递质、5-HT亚型受体后信号通路机制及其交互机制综合起到治疗PCPA失眠的作用机制。
郭波[10]（2019）在《基于代谢组学中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢特征及穴位刺激调节的可能机制》文中研究指明研究目的:关于中长跑物质代谢和能量代谢的研究已取得了很多有益成果,但大多基于传统生理生化方法预设一些常规大分子物质进行研究,很难全面反映运动训练和竞赛对运动员代谢产生的整体性、系统性影响,所以,迫切需要引入一种新的理念和方法,更加全面、准确的反映中长跑训练中物质代谢和能量代谢的整体性和动态性变化。穴位刺激能够激发人体的自我调节功能,在促进身体机能恢复、改善机体运动能力等方面具有很大的潜力。以往的穴位刺激研究往往专注于某一物质或某几个物质的变化,很难体现穴位刺激对人体调节的整体作用。代谢组学通过“全景式”地扫描代谢物的变化,可对所获得的高通量生物学信息进行分析,是揭示大负荷训练对机体代谢影响和穴位刺激调节强有力的分析方法。本研究采用基于核磁共振的代谢组学方法分析和探讨中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢特征,寻找影响中长跑运动员大负荷训练阶段代谢通路变化的关键代谢物,构建代谢组学图谱;研究长期穴位刺激干预对中长跑运动员大负荷训练后代谢模式的改变及其分子机制,尝试从代谢的角度解释穴位刺激在运动员机能状态恢复中可能的作用机制。研究方法:选取上海体育学院附属竞校中长跑队男子运动员18名,均身体健康,分成实验组（LTA,9名）:穴位刺激组,对照组（LTR,9名）:自然恢复组。选取“足三里”（双腿）、“委中”（双腿）、“肾俞”和“关元”穴,对实验组（LTA）运动员进行电针刺激,每天治疗30分钟,持续时间4周。采集三次尿样的时间分别为:训练阶段开始的早晨（周一）;训练中期（两周之后）的周一早晨;训练阶段结束（四周之后）的周一早晨。使用预饱和压水峰的NoesyPr1d脉冲[RD-90-t1-90-tm-90-ACQ]采集一维NOESY谱图。所有谱图均在25℃条件下使用带有超低温探头的Bruker（Karlsruhe,Germany）Avance III600 MHz谱仪进行采集。使用MestReNova软件进行FID数据的处理（版本12.0,Mestrelab Research S.L.）。使用0.3 Hz的线宽因子进行FID的傅里叶变换来提高谱图的信噪比,然后对谱图进行相位矫正,基线调整,谱峰对齐,将TSP的甲基峰定标为0.00 ppm。将每个不重叠的谱峰进行归属后代谢物取其峰高度作为谱峰的定量结果,然后进行数据的归一化处理。将归一化后的数据进行UV标度化后在SIMCA-P+14（Umetrics AB,Ume?,Sweden）软件上进行主成分分析（PCA）,最小二乘法-监督分析（PLS-DA）,潜在结构的正交投影-监督分析（OPLS-DA）。研究结果:（1）大负荷训练后,运动员尿液中牛磺酸、抗坏血酸、N-乙酰基糖蛋白、2-氨基已二酸、葡萄糖、2-羟基异丁酸的含量显着下降;谷氨酰胺、酪氨酸、丙二醇、乳酸、二甲基甘氨酸、缬氨酸、甲基烟酰胺、α-酮戊二酸、丙氨酸和甲酸含量显着上升,主要涉及氨基酸代谢、能量代谢、氧化应激和肠道菌群代谢通路的变化。（2）穴位刺激以后,运动员尿液中N-乙酰基糖蛋白、苯乙酰甘氨酸含量上升;谷氨酰胺、柠檬酸、乳酸、α-酮戊二酸、酪氨酸、3-氨基异丁酸、甘氨酸、甲酸的含量下降。穴位刺激对运动员产生影响的代谢通路主要有氨基酸代谢、能量代谢和肠道菌群代谢。研究结论:（1）中长跑运动员大负荷训练阶段训练开始、结束时尿液样本的NMR代谢图谱存在显着差异,能够从代谢组学分析中筛选出影响中长跑运动员大负荷训练阶段代谢通路变化的关键代谢物。（2）中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢特征为:有氧氧化代谢发挥最大作用;糖酵解占有很大比重,乳酸大量堆积;氨基酸代谢活跃,多数氨基酸分解代谢增强;氧化应激水平较高。（3）穴位刺激能对大负荷训练阶段中长跑运动员的能量代谢、氨基酸代谢及肠道菌群代谢起到良好的调节作用。（4）穴位刺激具有靶向性,其可能机制是穴位刺激能够增强或抑制相应代谢通路上酶的活性;穴位刺激的“双向调节”作用,客观而言是对机体固有的调节功能进行激活。
二、含川芎嗪血清对L-谷氨酸、5-羟色胺及去甲肾上腺素所致新生大鼠脑细胞内游离钙升高的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、含川芎嗪血清对L-谷氨酸、5-羟色胺及去甲肾上腺素所致新生大鼠脑细胞内游离钙升高的影响（论文提纲范文）
（1）Au@TPM的构建及抗阿尔兹海默症活性作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 阿尔茨海默症 |
| 1.1.1 阿尔兹海默症概述与发展趋势 |
| 1.1.2 阿尔兹海默症的发病机制 |
| 1.1.3 阿尔兹海默症的建模药物 |
| 1.1.4 阿尔兹海默症治疗药物的应用进展 |
| 1.2 金纳米粒子 |
| 1.2.1 金纳米粒子的特异性 |
| 1.2.2 金纳米粒子在生物医药领域中的应用 |
| 1.3 生物活性肽 |
| 1.3.1 生物活性肽的概述 |
| 1.3.2 功能性玉米肽 |
| 1.3.3 生物活性肽的治疗优势 |
| 1.4 立题依据与研究内容 |
| 第二章 Au@TPM纳米抗氧化剂的构建与表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 S-Au@TPM抗氧化剂的构建与表征 |
| 2.3.2 L-Au@TPM抗氧化剂的构建与表征 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 S-Au@TPM抗氧化剂的合成表征结果 |
| 2.4.2 L-Au@TPM抗氧化剂的合成表征结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Au@TPM对L-谷氨酸诱导AD细胞模型的活性作用及相关机制的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PC12 低分化细胞的培养 |
| 3.3.2 Au@TPM对 PC12 低分化细胞作用48 小时的形态学检测 |
| 3.3.3 L-谷氨酸对体外细胞模型建立的最适给药浓度筛选 |
| 3.3.4 盐酸多奈哌齐作为阳性对照药对PC12 低分化细胞最适给药剂量的筛选 |
| 3.3.5 s-TPM作为阴性对照药对PC12 低分化细胞最适给药浓度的筛选 |
| 3.3.6 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导体外AD模型的细胞活力变化影响 |
| 3.3.7 细胞凋亡形态的分析检测 |
| 3.3.8 细胞内LDH含量的检测 |
| 3.3.9 细胞内Ca~(2+)内流浓度的检测 |
| 3.3.10 细胞内线粒体跨膜电位的检测 |
| 3.3.11 细胞内MDA含量的检测 |
| 3.3.12 细胞内CAT含量的检测 |
| 3.3.13 细胞内ROS含量的测定 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 Au@TPM诱导PC12 低分化细胞作用48 小时的形态学观察 |
| 3.4.2 L-谷氨酸对PC12 低分化细胞体外建模的最适给药浓度结果 |
| 3.4.3 盐酸多奈哌齐作为阳性对照药对PC12 低分化细胞最适给药浓度的筛选结果 |
| 3.4.4 s-TPM作为阴性对照药对PC12 低分化细胞最适给药浓度的筛选结果 |
| 3.4.5 Au@TPM抑制由L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞损伤的活力变化结果 |
| 3.4.6 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞凋亡形态的影响 |
| 3.4.7 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞LDH的影响 |
| 3.4.8 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞Ca~(2+)内流的影响 |
| 3.4.9 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞线粒体跨膜电位的影响 |
| 3.4.10 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞中MDA的影响 |
| 3.4.11 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞中CAT的影响 |
| 3.4.12 Au@TPM对 L-谷氨酸诱导PC12 低分化细胞中ROS的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Au@TPM对 Al Cl_3与D-半乳糖联合建立AD小鼠模型的神经保护作用及相关机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 阿尔兹海默症模型小鼠的建立和各组给药办法 |
| 4.3.2 实验小鼠给药后的体重指标检测 |
| 4.3.3 Morris水迷宫检测 |
| 4.3.4 自主活动实验 |
| 4.3.5 疲劳转棒行为学实验 |
| 4.3.6 实验各组小鼠的样本收集处理 |
| 4.3.7 乙酰胆碱(ACh)含量在下丘脑及血清中的检测 |
| 4.3.8 乙酰胆碱转移酶(Ch AT)含量在下丘脑及血清中的检测 |
| 4.3.9 乙酰胆碱酯酶(Ach E)含量在下丘脑及血清中的检测 |
| 4.3.10 Au@TPM对 AD模型小鼠脑组织中MDA含量的影响 |
| 4.3.11 超氧化物歧化酶(SOD)在下丘脑及血清中含量的检测 |
| 4.3.12 Au@TPM对 AD模型小鼠脑组织中CAT含量的影响 |
| 4.3.13 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)在下丘脑及血清中含量检测 |
| 4.3.14 Western Blot的检测分析 |
| 4.3.15 Au@TPM的体内生物分布研究 |
| 4.3.16 数据统计处理 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 各组实验小鼠给药后对体重指标的影响 |
| 4.4.2 Au@TPM改善实验小鼠水迷宫行为的结果 |
| 4.4.3 Au@TPM对实验小鼠疲劳转棒的影响 |
| 4.4.4 Au@TPM改善实验小鼠自主活动行为的结果 |
| 4.4.5 Au@TPM对 AD模型小鼠下丘脑及血清中ACh的检测结果 |
| 4.4.6 Au@TPM对 AD模型小鼠下丘脑及血清中Ch AT的检测结果 |
| 4.4.7 Au@TPM对 AD模型小鼠下丘脑及血清中Ach E的检测结果 |
| 4.4.8 Au@TPM抑制AD模型小鼠脑内MDA的含量 |
| 4.4.9 Au@TPM上调AD模型小鼠下丘脑及血清中SOD的含量 |
| 4.4.10 Au@TPM上调AD模型小鼠脑内CAT的含量 |
| 4.4.11 Au@TPM上调AD模型小鼠下丘脑及血清中GSH-Px的含量 |
| 4.4.12 Au@TPM对 AD模型小鼠脑组织中氧化应激信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.4.13 Au@TPM的体内生物分布影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）褪黑素通过调控睡眠内稳态恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律延长的机制分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 符号说明 |
| 第一部分 视交叉上核未参与MK-801及褪黑素对小鼠自身昼夜节律的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 褪黑素通过调控腹外侧视前核恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律延长的机制分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 褪黑素恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律延长的脑电分析及MT2受体参与的调节作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 节律系统和内稳态系统调控睡眠-觉醒的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）参知健脑方对拟血管性痴呆细胞模型的神经保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 参知健脑方各组分药物改善认知机制研究 |
| 1 人参 |
| 1.1 中医认识 |
| 1.2 化学成分 |
| 1.3 改善认知机制 |
| 2 知母 |
| 2.1 中医认识 |
| 2.2 化学成分 |
| 2.3 改善认知机制 |
| 3 赤芍 |
| 3.1 中医认识 |
| 3.2 化学成分 |
| 3.3 改善认知机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 神经元突触囊泡内吞途径对神经系统疾病的影响 |
| 1 网格蛋白介导的内吞作用(CME)与神经系统疾病 |
| 1.1 网格蛋白包被组装 |
| 1.2 质膜内陷和凹窝形成 |
| 1.3 凹陷收缩和剪切 |
| 1.4 囊泡去包被 |
| 2 Kiss and run途径 |
| 3 不依赖网格蛋白的大量内吞作用(clathrin-independent bulk endocytosis,CIE) |
| 4 超速内吞作用 |
| 5 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 基于网络药理学的参知健脑方治疗血管性痴呆机制研究 |
| 1 研究材料 |
| 1.1 数据库 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 参知健脑方入血活性化学成分的检索与筛选 |
| 2.2 参知健脑方药物成分-靶点、VD疾病-靶点及参知健脑方治病靶点的预测 |
| 2.3 参知健脑方活性成分-VD-靶点的网络构建 |
| 2.4 基因本体论(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 参知健脑方潜在入血活性化学成分的筛选结果 |
| 3.2 参知健脑方药物成分-靶点、VD疾病-靶点及参知健脑方治病靶点预测结果 |
| 3.3 参知健脑方-活性成分-VD靶点的网络构建 |
| 3.4 GO功能及KEGG通路富集分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 中医药研究与网络药理学 |
| 4.2 参知健脑方的理法方药分析 |
| 4.3 参知健脑方的网络药理学分析 |
| 5 小结 |
| 第二部分 参知健脑方和谷氨酸干预浓度筛选及其对拟VD细胞模型增殖及毒性的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PC12细胞培养 |
| 2.2 谷氨酸诱导PC12细胞损伤的最适宜造模浓度筛选及参知健脑方低、中、高剂量适宜浓度筛选(CCK-8法) |
| 2.3 谷氨酸造模适宜浓度及干预药物适宜浓度的筛选验证(IncuCyte长时间动态活细胞成像及功能分析系统) |
| 2.4 谷氨酸诱导损伤PC12细胞模型的建立及分组给药 |
| 2.5 CCK-8法检测各组细胞增殖及毒性 |
| 2.6 IncuCyte长时间动态活细胞成像及功能分析系统检测各组细胞增殖及毒性2.7 CFSE细胞增殖实验 |
| 2.7 CFSE细胞增殖实验 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 生理状态下PC12细胞的形态学特征 |
| 3.2 不同浓度谷氨酸和参知健脑方溶液对PC12细胞增殖及毒性的影响 |
| 3.3 参知健脑方对拟VD细胞模型的增殖及毒性影响 |
| 3.4 CFSE细胞增殖实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 “毒损脑络”与VD |
| 4.2 “毒损脑络”的现代生物学内涵 |
| 4.3 “解毒通络”是治疗VD的重要法则 |
| 4.4 谷氨酸诱导损伤PC12细胞模型的建立 |
| 4.5 参知健脑方对谷氨酸损伤PC12细胞的增殖及毒性作用 |
| 5 小结 |
| 第三部分 参知健脑方对拟VD细胞模型周期、凋亡、钙离子浓度及活性氧的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PC12细胞培养 |
| 2.2 谷氨酸损伤的PC12细胞模型的建立及各组给药 |
| 2.3 流式细胞术检测PC12细胞周期 |
| 2.4 流式细胞术检测PC12细胞凋亡 |
| 2.5 高内涵细胞成像分析系统检测PC12细胞内游离钙离子浓度、活性氧及超氧化物的水平 |
| 2.6 qRT-PCR技术检测PC12细胞caspase-3 mRNA的相对表达水平 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 PC12细胞周期检测结果 |
| 3.2 PC12细胞凋亡检测结果 |
| 3.3 PC12细胞内游离钙离子浓度、活性氧及超氧化物的水平检测结果 |
| 3.4 参知健脑方对谷氨酸损伤PC12细胞caspase-3 mRNA表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 参知健脑方与谷氨酸损伤的PC12细胞周期阻滞 |
| 4.2 参知健脑方与谷氨酸损伤的PC12细胞凋亡 |
| 4.3 参知健脑方与谷氨酸诱导的PC12细胞内钙超载及氧化应激损伤 |
| 4.4 “解毒通络”法则的部分生物学内涵 |
| 5 小结 |
| 第四部分 参知健脑方对拟VD细胞模型clathrin介导的NMDA受体胞吞过程的作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞免疫荧光技术检测PC12细胞clathrin、RAB5B和NMDAR1的分布和表达水平 |
| 2.2 qRT-PCR检测PC12细胞clathrin mRNA和NMDAR1 mRNA的表达水平 |
| 2.3 Western Blot检测PC12细胞clathrin、RAB5B及NMDAR1的表达水平 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 PC12细胞的细胞免疫荧光检测结果 |
| 3.2 PC12细胞的qRT-PCR检测结果 |
| 3.3 PC12细胞的Western Blot检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 参知健脑方与clathrin介导的细胞内吞作用 |
| 4.2 参知健脑方与NMDA受体的内吞过程 |
| 4.3 “解毒通络”法则的部分生物学内涵 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）“良关系”丹参-降香药对抗脑缺血损伤脑内物质基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丹参-降香药对研究进展 |
| 1.1.1 丹参的药理作用研究 |
| 1.1.2 降香的药理作用研究 |
| 1.2 微透析技术在脑内代谢研究中的应用 |
| 1.3 代谢组学研究 |
| 1.4 本论文研究内容与意义 |
| 第二章 注射液的制备及主要成分含量测定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器设备 |
| 2.1.2 实验药品及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 注射液的制备 |
| 2.2.2 丹参与降香药材质量标准控制 |
| 2.2.3 色谱条件 |
| 2.2.4 对照品溶液的制备 |
| 2.2.5 供试品溶液的制备 |
| 2.2.6 方法学考察 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 高效液相色谱条件的优化 |
| 2.3.2 丹参和降香药材质量标准建立 |
| 2.3.3 注射液的质量控制 |
| 2.3.4 方法学考察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 丹参-降香药对抗脑缺血脑代谢组学研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品试剂 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.2 实验动物 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 色谱及质谱条件 |
| 3.3.2 动物分组及给药 |
| 3.4 MCAO模型的制备 |
| 3.5 大鼠脑组织收集、处理 |
| 3.6 数据分析 |
| 3.7 结果与讨论 |
| 3.7.1 HPLC-Q/TOF-MS方法的优化 |
| 3.7.2 方法学考察 |
| 3.7.3 大鼠脑缺血模型评价 |
| 3.7.4 脑组织HPLC-Q/TOF-MS代谢组学结果分析 |
| 3.7.5 大鼠代谢组学脑组织样本中药物及代谢物成分分析 |
| 3.8 小结 |
| 第四章 丹参-降香药对对大鼠海马区神经递质的影响及代谢研究 |
| 4.1 实验仪器及试剂 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验药品、试剂 |
| 4.2 MD-HPLC-ECD检测脑内神经递质及药物成分方法学的建立 |
| 4.2.1 标准品的配制 |
| 4.2.2 色谱检测条件 |
| 4.2.3 方法学考察 |
| 4.3 丹参-降香药对对大鼠海马区神经递质的影响及其代谢研究 |
| 4.3.1 动物分组及给药 |
| 4.3.2 脑海马区定位 |
| 4.3.3 微透析样品采集 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 HPLC-ECD检测条件优化 |
| 4.4.2 方法学考察结果 |
| 4.4.3 丹参-降香对脑内内源性物质的影响 |
| 4.4.4 丹参-降香药对中入脑成分的含量变化 |
| 4.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）大椎穴埋线调控Egr1-T型Ca2+-Limk1-cofilin通路治疗癫痫的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 癫痫的中医学相关认识 |
| 一、病名 |
| 二、病因病机 |
| 三、辨证分型 |
| 四、辨证论治 |
| 五、穴位埋线疗法的临床应用 |
| 六、大椎穴治疗癫痫的依据 |
| 第二节 现代医学对癫痫病的认识 |
| 一、病因 |
| 二、诊断方法 |
| 三、分型 |
| 四、治疗 |
| 第三节 癫痫耐药的研究进展 |
| 一、耐药假说 |
| 二、耐药的相关危险因素 |
| 三、耐药的治疗 |
| 第四节 癫痫共患疾病的研究进展 |
| 一、焦虑和抑郁 |
| 二、偏头痛 |
| 三、心脏病 |
| 四、其他 |
| 第五节 癫痫相关的动物模型 |
| 一、遗传性癫痫模型 |
| 二、急性癫痫模型 |
| 三、慢性癫痫模型 |
| 第六节 Egr1-T型Ca~(2+)-Limk1-cofilin通路在癫痫发病中的作用 |
| 一、钙离子稳态失衡是癫痫发生的主要根源 |
| 二、Cav3.2表达上调导致Ca~(2+)大量内流是癫痫发作的关键 |
| 三、Egr1介导Cav3.2表达 |
| 四、Egr1调控T型Ca~(2+)通路异常可能是癫痫发作的重要路径 |
| 五、钙离子异常内流是导致Limk1/cofilin细胞凋亡通路开放的前提 |
| 六、葡萄糖代谢异常促进Ca~(2+)内流 |
| 七、埋线疗法可能干预Egr1-T型Ca~(2+)-Limk1-cofilin通路调控癫痫 |
| 第二章 Meta分析探讨穴位埋线疗法治疗癫痫的有效性及安全性 |
| 一、资料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三章 实验研究 |
| 第一节 癫痫模型的建立及验证 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 大椎穴埋线疗法对癫痫小鼠体重及焦虑情绪的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 大椎穴埋线疗法对癫痫小鼠海马病理学和脑内葡萄糖代谢的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四节 大椎穴埋线对癫痫小鼠Egr1-T型Ca~(2+)-Limk1-cofilin通路的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第五节 总结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一“从心论治”阿尔茨海默病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 PI3K/Akt及其相关信号通路在AD中研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 参枝苓口服液对APP~(swe)/PS1~(dE9)双转基因AD模型小鼠认知行为及髓鞘的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 参枝苓口服液对Aβ_(42)致少突胶质细胞OLN-93损伤的保护作用机制 |
| 参考文献 |
| 实验一 UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液含药血清主要化学成分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93拟AD体外模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 参枝苓口服液含药血清及多奈哌齐对OLN-93细胞安全剂量及有效剂量筛选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 参枝苓口服液含药血清对Aβ_(42)损伤OLN-93细胞髓鞘相关蛋白及PI3K/Akt-mTOR通路的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 参枝苓口服液对Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93的乙酰化组蛋白与MBP基因相互作用影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 参枝苓口服液对Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93脂质代谢的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在问题和不足 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）不同浓度MDMA染毒新生大鼠心肌细胞中钙调控蛋白及NF-κB的作用研究（论文提纲范文）
| 主要缩略语英汉对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 不同浓度不同染毒时间MDMA对原代培养新生大鼠心肌细胞的毒性作用 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 新生大鼠心肌细胞MDMA染毒模型中钙调控蛋白的表达变化 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 MDMA染毒心肌细胞中NF-ΚB及蛋白激酶A、C的改变及其对钙调控蛋白的作用 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 课题小结 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 MDMA 心血管系统毒性作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）基于BDNF-TrkB信号通路探讨交泰丸对慢性束缚应激大鼠抗焦虑作用的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究一 交泰丸对慢性束缚应激大鼠焦虑模型的药效学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验药物与制备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 交泰丸对慢性束缚应激大鼠一般状态的影响 |
| 2.2 交泰丸对慢性束缚应激大鼠体重的影响 |
| 2.3 交泰丸对慢性束缚应激大鼠旷场实验的影响 |
| 2.4 交泰丸对慢性束缚应激大鼠明暗箱实验的影响 |
| 3 小结 |
| 研究二 基于BDNF-Trk B信号通路探讨交泰丸抗焦虑的作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 交泰丸对大鼠海马GR蛋白表达水平的影响 |
| 2.2 交泰丸对大鼠海马BDNF蛋白表达水平的影响 |
| 2.3 交泰丸对大鼠海马TrkB蛋白表达水平的影响 |
| 2.4 交泰丸对大鼠海马p-TrkB蛋白表达水平的影响 |
| 2.5 交泰丸对大鼠海马BDNF m RNA表达水平的影响 |
| 2.6 交泰丸对大鼠海马Trk B m RNA表达水平的影响 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 焦虑症发病机制中西医研究进展 |
| 1 中医学对焦虑症的认识 |
| 1.1 焦虑症的病因病机 |
| 1.2 治则治法 |
| 2 西医学对焦虑症发病机制的认识 |
| 2.1 神经递质与焦虑 |
| 2.2 内分泌系统与焦虑 |
| 2.3 氧化应激与焦虑 |
| 2.4 免疫系统与焦虑 |
| 3 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）针刺对PCPA失眠大鼠海马5-HT递质、5-HT1AR(5-HT2AR)/AC信号通路与二者关联性影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对失眠的认识 |
| 1.1 失眠概念及分类 |
| 1.1.1 原发性失眠 |
| 1.1.2 继发性失眠 |
| 1.2 失眠的影响因素 |
| 1.3 失眠发病机制的认识 |
| 1.3.1 与睡眠相关的脑结构及功能 |
| 1.3.2 中枢神经递质与失眠 |
| 1.3.3 下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱与失眠 |
| 1.3.4 AC活性与cAMP含量异常 |
| 1.4 失眠的西医治疗 |
| 1.4.1 药物治疗 |
| 1.4.2 非药物疗法 |
| 1.4.3 现代医学治疗的不足 |
| 2 祖国医学对失眠的研究进展 |
| 2.1 失眠的中医病因 |
| 2.1.1 外感六邪 |
| 2.1.2 内伤情志 |
| 2.1.3 胃肠不和 |
| 2.1.4 气血亏虚 |
| 2.2 失眠的中医病机 |
| 2.2.1 《黄帝内经》的睡眠理论 |
| 2.2.2 阴阳失调 |
| 2.2.3 脏腑不调 |
| 2.2.4 血瘀气郁 |
| 2.2.5 虚实为纲 |
| 2.3 失眠的中医发病学说 |
| 2.4 中药对失眠的治疗 |
| 2.5 针灸治疗失眠 |
| 2.5.1 针刺疗法 |
| 2.5.2 特种针法 |
| 2.5.3 灸法对失眠的治疗 |
| 2.5.4 针灸综合疗法治疗失眠 |
| 2.6 其他疗法 |
| 2.6.1 推拿对失眠的治疗 |
| 2.6.2 民族医学 |
| 2.7 中医针灸治疗的优势 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与设备 |
| 1.2 动物与分组 |
| 1.3 造模 |
| 1.4 干预方法 |
| 1.5 标本采集与储存 |
| 1.6 操作方法 |
| 1.6.1 使用ELISA法测定5-羟色胺(5-HT)含量 |
| 1.6.2 免疫组化染色法检测大鼠海马5-HT_(1A)、5-HT_(2A)受体的表达 |
| 1.6.3 放射免疫分析法(RIA)检测腺苷酸环化酶(AC)活性 |
| 1.7 数据统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各组大鼠海马5-HT、AC活性及二者相关回归方程 |
| 2.2 诸组大鼠海马5-HT_(1A)R、5-HT_(2A)R免疫组化病理影响 |
| 2.2.1 200倍镜下病理形态学描述 |
| 2.2.2 各组大鼠海马5-HT_(1A)R、5-HT_(2A)R的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验研究选择PCPA模型的理由 |
| 3.2 针刺脐内环穴合失眠方组方用穴分析 |
| 3.3 针刺失眠穴方合脐内环有调节睡眠-觉醒周期的作用机制分析 |
| 3.4 针刺脐内环穴合失眠穴方调节海马5-HT_(1A)与5-HT_(2A)受体表达的机制分析 |
| 3.5 针刺脐内环穴合失眠穴方调节失眠大鼠海马5-HT含量及AC活性的作用及意义 |
| 3.5.1 脐内环穴合失眠穴方调节失眠大鼠海马5-HT含量及AC活性的作用 |
| 3.5.2 针刺脐内环穴合失眠穴方调节5-HT含量与AC活性的关联性探讨 |
| 3.5.3 5-HT含量与AC活性关联性研究结果的意义 |
| 4 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 穴位埋线联合其他疗法治疗失眠的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（10）基于代谢组学中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢特征及穴位刺激调节的可能机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出 |
| 1.1.1 物质代谢与能量代谢:决定中长跑运动成绩的关键因素 |
| 1.1.2 机能恢复:运动员竞技能力提高的保障 |
| 1.1.3 穴位刺激:促进身体机能恢复的有效手段 |
| 1.1.4 代谢组学:研究运动人体科学的新工具 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究的总体思路 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 中长跑项目的供能特点 |
| 2.1.1 中长跑的项目特征 |
| 2.1.2 中长跑项目的供能特点 |
| 2.1.3 小结 |
| 2.2 代谢组学概述 |
| 2.2.1 “代谢组学”概念 |
| 2.2.2 代谢组学的研究思路 |
| 2.2.3 NMR代谢组学研究 |
| 2.2.4 小结 |
| 2.3 代谢组学应用于运动人体研究的进展与展望 |
| 2.3.1 运动代谢组学的研究进展 |
| 2.3.2 代谢组学应用于运动人体科学研究的前景展望 |
| 2.3.3 小结 |
| 2.4 代谢组学在穴位刺激领域的研究进展 |
| 2.4.1 效应机制研究 |
| 2.4.2 处方配伍的研究 |
| 2.4.3 比较针刺研究 |
| 2.4.4 小结 |
| 2.5 穴位刺激与运动后人体机能恢复相关研究 |
| 2.5.1 运动性疲劳的概念及产生的主要机制研究 |
| 2.5.2 穴位刺激促进运动后人体机能恢复的研究 |
| 2.5.3 小结 |
| 参考文献 |
| 3 研究方法与设计 |
| 3.1 文献资料法 |
| 3.2 专家访谈法 |
| 3.3 实验法 |
| 3.3.1 实验对象 |
| 3.3.2 实验方案 |
| 3.3.3 饮食控制 |
| 3.3.4 穴位刺激方案 |
| 3.3.5 NMR代谢组学 |
| 3.4 数理统计法 |
| 4 中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢特征 |
| 4.1 结果 |
| 4.1.1 本训练阶段负荷安排 |
| 4.1.2 尿液中代谢物的一维核磁共振氢谱 |
| 4.1.3 尿液中代谢物的多变量统计分析 |
| 4.1.4 运动员尿液中的差异化代谢物 |
| 4.1.5 代谢物归属及所涉及的代谢通路 |
| 4.2 分析与讨论 |
| 4.2.1 本训练阶段负荷安排 |
| 4.2.2 中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢特征 |
| 4.2.3 尿液是研究中长跑代谢特征的有效体液 |
| 4.2.4 代谢特征对中长跑训练的指导意义 |
| 4.3 结论 |
| 5 穴位刺激对中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢调节及可能机制 |
| 5.1 结果 |
| 5.1.1 穴位刺激前实验组与对照组尿液多变量统计 |
| 5.1.2 穴位刺激后实验组与对照组尿液一维核磁共振氢谱 |
| 5.1.3 穴位刺激后实验组与对照组尿液的多变量统计 |
| 5.1.4 代谢物归属及代谢途径分析 |
| 5.2 分析与讨论 |
| 5.2.1 穴位刺激对能量代谢和身体机能的影响 |
| 5.2.2 穴位刺激对中长跑运动员代谢的影响及可能机制 |
| 5.2.3 穴位刺激调节的靶向性与双向调节作用 |
| 5.3 结论 |
| 全文总结 |
| 总结论 |
| 研究创新点 |
| 研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附件一 |
| 附件二 |
| 附件三 |
| 致谢 |
| 主要学习经历及攻读博士期间的学术成果 |
四、含川芎嗪血清对L-谷氨酸、5-羟色胺及去甲肾上腺素所致新生大鼠脑细胞内游离钙升高的影响（论文参考文献）
- [1]Au@TPM的构建及抗阿尔兹海默症活性作用的机制研究[D]. 张峻榕. 吉林大学, 2021(01)
- [2]褪黑素通过调控睡眠内稳态恢复MK-801致小鼠自身昼夜节律延长的机制分析[D]. 王谦. 山东大学, 2021(11)
- [3]参知健脑方对拟血管性痴呆细胞模型的神经保护作用及机制研究[D]. 田丹枫. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]“良关系”丹参-降香药对抗脑缺血损伤脑内物质基础研究[D]. 李倩楠. 西北大学, 2020(02)
- [5]大椎穴埋线调控Egr1-T型Ca2+-Limk1-cofilin通路治疗癫痫的机制研究[D]. 王志婕. 广州中医药大学, 2020(06)
- [6]基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用[D]. 刘珍洪. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]不同浓度MDMA染毒新生大鼠心肌细胞中钙调控蛋白及NF-κB的作用研究[D]. 黄锶哲. 华中科技大学, 2020
- [8]基于BDNF-TrkB信号通路探讨交泰丸对慢性束缚应激大鼠抗焦虑作用的机制研究[D]. 王鹏伟. 天津中医药大学, 2020(04)
- [9]针刺对PCPA失眠大鼠海马5-HT递质、5-HT1AR(5-HT2AR)/AC信号通路与二者关联性影响研究[D]. 李文康. 广西中医药大学, 2020(02)
- [10]基于代谢组学中长跑运动员大负荷训练阶段的代谢特征及穴位刺激调节的可能机制[D]. 郭波. 上海体育学院, 2019(01)