一、糖尿病大鼠血清一氧化氮浓度的变化（论文文献综述）
汪戎锦[1]（2021）在《基于代谢组学的刺五加叶治疗缺血性脑卒中作用机制研究》文中研究指明缺血性脑卒中作为全球性的公共健康问题,危害着全世界人类的健康,并以其高发病率和高死亡率,引起了科学家们的广泛关注。缺血性脑卒中发生的主要原因为凝结的血栓或栓子阻塞在脑动脉中使大脑供血受限从而引起氧气和营养的供应不足。刺五加叶作为一种可再生资源,因其化学成分以及药效作用与刺五加根相似,被广泛用于脑血管疾病、缺血性心脏病等疾病的治疗。本实验室在前期的研究工作中筛选并制备了刺五加叶的主要活性组分,并采用药效学研究证明了刺五加叶具有抗氧化、抑制细胞损伤以及缺血性脑卒中的保护作用。然而,刺五加叶的化学成分复杂,在体内作用于多个靶点,致使其治疗缺血性脑卒中的整体作用机制研究尚不够深入,目前缺乏系统研究,在一定程度上限制了刺五加叶的开发及应用。代谢组学作为一种系统生物学研究方法,能够对内源性小分子的整体变化进行系统分析,逐渐成为揭示病机复杂疾病的发病机理,和多成分、多靶点药物作用机制的一种强有力工具。因此,本研究围绕脂质异常、神经损伤以及菌群失调等缺血性脑卒中的关键病理环节,采用基于质谱技术的多样本（血清、粪便、尿液、脑组织）代谢组学的研究方法,对刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制进行了深入研究,并阐明其科学内涵。主要研究内容包括以下几个方面:1.刺五加叶治疗缺血性脑卒中的血清脂质组学及其神经保护作用研究首先对刺五加叶的主要活性组分进行基于UPLC方法的成分分析。结果表明,刺五加叶的主要活性组分含有有机酸类化合物、黄酮类化合物和糖苷。其次,建立大鼠缺血性脑卒中疾病模型,并给予刺五加叶治疗四周。由于脂质异常、神经损伤、氧化应激和炎症反应是缺血性脑卒中发作的四个主要方面,本文围绕以上四个方面展开了研究。首先,采用基于UPLC-Q-TOF/MS的脂质组学方法,研究缺血性脑卒中发生后大鼠血清脂质的代谢紊乱,以及刺五加叶的调节作用。利用UPLC-Q-TOF/MS采集刺五加叶给药四周后缺血性脑卒中大鼠血清样本的脂质代谢轮廓,结合Progenesis QI软件进行包括多元统计学分析、潜在脂质标记物鉴定以及通路分析在内的数据处理。共鉴定出27种脂质组学生物标记物,包括PC,PE,SM和TG类脂质,分布在各种脂质代谢途径中,包括甘油磷脂、亚油酸、α-亚麻酸、甘油脂、鞘脂和花生四烯酸代谢途径。结果表明,刺五加叶能够调节缺血性脑卒中发生发展过程中出现的脂质代谢紊乱。其次,针对缺血性脑卒中发生时的神经损伤过程,采用UPLC-TQ/MS对大鼠脑组织及血清中10种神经递质进行了定量研究。结果表明,缺血性脑卒中能够导致谷氨酸（Glu）,天冬氨酸（Asp）等兴奋性氨基酸的过度释放,产生神经毒性,还能够增加γ-氨基丁酸（GABA）、五羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA）以及牛磺酸（Tau）的含量,并降低抑制性神经递质甘氨酸（Gly）以及神经炎症调节剂乙酰胆碱（Ach）的含量。而给予刺五加叶治疗后,能够使以上神经递质在脑组织和血清中的水平均向正常水平调节,说明其能够通过调节缺血性脑卒中大鼠的神经递质含量发挥保护中枢神经系统的作用。最后,通过MDA和SOD的定量分析,检测缺血性脑卒中后氧化应激程度,通过TNF-α,IL-6和IL-10的定量分析,检测炎症反应程度。结果表明,刺五加叶可以在一定程度上减轻机体的氧化应激和炎症损伤,从而减轻缺血性脑卒中对机体的损伤。从调节脂质代谢紊乱、神经损伤、氧化应激反应以及炎症反应等方面揭示了刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制。2.刺五加叶治疗缺血性脑卒中粪便代谢组学研究及其对微生物-肠-脑轴的影响微生物-肠-脑轴双向通讯系统与缺血性脑卒中的发生及预后相互关联,这种关联作用近年来逐渐引起科学家的广泛关注。本文采用基于UPLC-Q-TOF/MS的粪便非靶向代谢组学方法,结合基于UPLC-TQ/MS的粪便胆汁酸靶向代谢组学方法,以及16S r RNA粪便菌群测序,研究了刺五加叶对缺血性脑卒中模型大鼠微生物-肠-脑轴的平衡作用。首先,利用UPLC-Q-TOF/MS采集刺五加叶治疗四周后缺血性脑卒中大鼠粪便样本的代谢轮廓,结合多元统计学分析筛选具有显着差异的潜在生物标记物,并进行通路分析,共鉴定出40个潜在的差异性生物标记物,主要涉及花生四烯酸代谢通路、不饱和脂肪酸的生物合成途径、胆汁酸的生物合成途径、鞘脂代谢通路等。以上生物标记物的含量在缺血性脑卒中发生后具有显着的变化,而刺五加叶可以调节其含量以恢复正常状态。其次,基于UPLC-TQ/MS的靶向代谢组学方法对13种胆汁酸进行了定量分析。结果显示,缺血性脑卒中发生时,大鼠粪便胆汁酸发生代谢紊乱,刺五加叶能够调节多种胆汁酸的含量,使其更加趋近于正常水平。最后,16S r RNA菌群测序结果表明,缺血性脑卒中可导致大鼠肠道内病原体富集,益生菌水平大幅降低,而刺五加叶能够使缺血性脑卒中大鼠体内病原体含量降低,同时增加益生菌水平。上述结果揭示了刺五加叶具有对缺血性脑卒中大鼠微生物-肠-脑轴的调节作用,为阐明刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制研究奠定基础。3.刺五加叶通过对益生菌的调节作用治疗缺血性脑卒中的机制验证选择能够被刺五加叶调节的益生菌给药缺血性脑卒中大鼠,验证给药刺五加叶后,益生菌水平的升高是发挥其治疗效果的重要因素之一。首先,培养罗伊氏乳酸杆菌以及丁酸梭菌并制备菌液,分别给予缺血性脑卒中大鼠以上两种菌液。经四周给药后,检测大鼠粪便的菌群组成。结果表明,与模型组比较,益生菌给药后的缺血性脑卒中大鼠粪便中菌群组成与含量产生较大变化,并与对照组大鼠粪便菌群组成更为相似。其次,采用基于UPLC-TQ/MS的定量方法检测缺血性脑卒中大鼠经益生菌给药后,脑组织中神经递质的含量变化。结果表明,给予两种益生菌后,具有神经毒性的神经递质含量降低,而具有神经调节作用的神经递质含量显着升高,更加趋近于健康大鼠。最后,通过ELISA法检测大鼠血清和脑组织中多种炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的含量和脑组织中MDA、SOD、COX-2、MAO的含量。结果表明,当缺血性脑卒中发生时,大鼠体内IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、COX-2和MAO含量显着升高,而IL-10和SOD含量显着降低。给予两种益生菌后,缺血性脑卒中大鼠体内以上指标的含量均能够被调节至正常水平,推测两种益生菌均能够通过减轻炎症及氧化应激损伤,对机体产生一定的保护作用。本研究验证了刺五加叶能够通过影响微生物-肠-脑轴的代谢,增加体内益生菌丰度,调节卒中引起的神经损伤、炎症反应以及氧化应激损伤,从而起到对机体的保护作用。4.刺五加叶治疗缺血性脑卒中的尿液代谢组学研究尿液样本能够准确、灵敏地反映机体的代谢变化,为代谢组学研究中最重要的生物样本。采用基于UPLC-Q-TOF/MS的非靶向尿液代谢组学方法对刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制进行研究并验证。采用UPLC-Q-TOF/MS采集大鼠尿液样本的代谢轮廓,结合Progenesis QI软件进行数据处理,筛选并鉴定潜在生物标记物,构建基因-酶-生物标记物代谢网络。本研究共筛选出42种在缺血性脑卒中疾病进程中具有显着变化的潜在生物标记物,经刺五加叶治疗后,38种生物标记物的含量变化能够被显着调节,涉及体内牛磺酸和次牛磺酸代谢通路、花生四烯酸代谢通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路、类固醇激素生物合成途径、色氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路和嘧啶代谢途径等多种代谢途径的调节作用。最后,选择3种与以上通路相关的关键酶COX-2,NOS和MAO作为刺五加叶治疗的靶点酶,进行定量验证。结果表明,模型大鼠经刺五加叶治疗后血清和脑组织中三种酶的含量与假手术组大鼠相似,证明了刺五加叶可以通过调节以上三种酶的含量发挥刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用。本实验结果有助于进一步了解缺血性脑卒中的发病机制,并为刺五加叶的潜在治疗机制研究提供科学依据。5.基于高效同位素标记衍生化的刺五加叶治疗缺血性脑卒中尿液代谢组学研究高效化学同位素标记（CIL）衍生化结合液质联用（LC-MS）的代谢组学方法是使用靶向特定官能团的试剂标记生物样本,使所有具有相同官能团的代谢物生成相应的衍生代谢物,在提高总体代谢组学覆盖率的同时,将同位素引入标记代谢物中,使重同位素试剂衍生的代谢产物作为轻同位素试剂衍生代谢物产物的内标,从而提高代谢产物的定性及定量精度。本研究采用基于CIL LC-MS的刺五加叶治疗大鼠缺血性脑卒中的尿液代谢组学方法,分别对胺/酚类亚代谢组和羧酸类亚代谢组进行分析研究。结果表明,刺五加叶能够通过体内多种通路调节缺血性脑卒中发生后的代谢紊乱,与传统尿液代谢组学研究结果相比,CIL LC-MS法筛选出了更多潜在生物标记物,并覆盖更多体内代谢通路,得到了覆盖率更广、定量更精准的代谢组学结果。同时,在每条通路中匹配到更多的具有显着差异的代谢产物,明确通路中上游化合物及下游产物的显着变化及机制,使针对各通路的研究更加全面。最终,从神经保护、调节能量代谢、抑制炎症损伤、拮抗氧化应激的角度对刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制进行系统阐述。进而为刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制提供更加全面的科学依据。综上所述,本论文采用基于大鼠血清、粪便、尿液以及脑组织多种生物样本的代谢组学方法,进行刺五加叶治疗大鼠缺血性脑卒中作用机制的系统研究。将尿液和粪便的非靶向代谢组学研究,与血清脂质、脑组织神经递质以及粪便胆汁酸的靶向代谢组学研究相结合,明确刺五加叶对缺血性脑卒中大鼠体内多种代谢通路的调节作用,对脂质紊乱的调节作用,以及对神经系统的保护作用。其次,通过对大鼠粪便的菌群分析和验证实验,阐述刺五加叶可能通过调节微生物-肠-脑轴双向通讯系统发挥缺血性脑卒中的治疗作用,推测刺五加叶增加肠道益生菌含量是其发挥缺血性脑卒中治疗作用的关键因素之一。并采用基于高效同位素标记结合LC-MS的代谢组学方法,对体内胺/酚类亚代谢组及羧酸类亚代谢组进行全面分析,从神经保护、调节能量代谢、抑制炎症损伤、拮抗氧化应激的角度系统阐述刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制。本研究结合先进的分析技术手段,探讨中药的作用机制,为阐明刺五加叶治疗缺血性脑卒中的作用机制提供理论依据,同时也为中药作用机制的系统研究提供了新的方法路线。
孙敬辉[2]（2021）在《miR-489调控心肌纤维化的机制及人参皂苷Re的干预作用研究》文中提出心肌纤维化（myocardial fibrosis,MF）是众多心血管疾病发展至后期常见的病理改变,常常引起心肌收缩和舒张功能障碍,是心室重构不断进展和不可逆的主要原因。MF的发病机制十分复杂,涉及到神经体液、生长因子、促炎性细胞因子和基因转录之间复杂的相互作用。心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）是MF最主要的效应细胞,可在缺血、炎性因子等促纤维化因素的刺激下分化为肌成纤维细胞。激活的肌成纤维细胞会分泌大量的细胞外基质蛋白,导致心室硬度增加,顺应性降低和心肌电信号传导异常,诱发难治性心力衰竭、恶性心律失常,严重影响心血管疾病的预后。目前MF的治疗尚缺乏特效药物,因此探寻MF发病机制的关键因子及安全可靠的治疗药物,对于MF的治疗刻不容缓。MircoRNAs（miRNAs）是一类在真核细胞中广泛表达的短链非编码RNA。它们可以直接与靶基因的3’UTR区域结合,诱导靶基因mRNAs分解或阻碍其翻译,从而调节多种生理功能和病理过程。miR-489在心肌细胞和CFs中广泛表达。在心肌细胞中miR-489过表达能够下调下游髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,myd88）的水平,减轻血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）诱导的心肌肥厚。重要的是,miR-489转基因小鼠体内AngⅡ诱导的MF明显减轻,说明miR-489能够抑制AngⅡ诱导的MF,miR-489可能是治疗MF的一个潜在靶点。然而,miR-489在MF中的调控机制尚不清楚,尤其是在心肌梗死诱导的MF中miR-489是否也具有同样作用值得进一步研究。中医学中没有MF的直接论述,但MF是众多心血管疾病发展至后期的病理改变,是一种相对慢性渐进性病变。中医传统理论认为“久病多虚”、“久病多瘀”,因此治疗当以补气活血为法。人参是传统医学中补气的要药,具有补益元气,健脾补肺,安神益智等功效,以及抗心肌缺血、抗心律失常、抗动脉粥样硬化和抗纤维化等药理作用。人参皂苷Re是人参的主要活性成分之一,课题组前期研究发现,人参皂苷Re具有抗心肌梗死后MF的作用,并且可以调控Smad2/3的表达。既往研究证实,Smad3是miR-489的直接下游靶点,那么人参皂苷Re是否可以通过调节miR-489来发挥抗MF的作用,值得进行深入研究。本研究通过体外构建miR-489过表达和抑制的CFs模型,证实miR-489对MF和myd88/核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路具有调控作用。在此基础上,以人参皂苷Re为干预手段,通过结扎左冠状动脉前降支构建心肌梗死小鼠模型和AngⅡ干预的乳鼠原代CFs模型,观察人参皂苷Re的抗MF作用,并探讨人参皂苷Re对miR-489及其下游myd88/NF-κB通路的调控作用,为中医药抗MF,改善心血管疾病患者的预后提供科学依据。研究一 miR-489调节心肌纤维化的机制研究目的:在正常培养的CFs和AngⅡ干预的CFs中转染miR-489 mimic和inhibitor观察miR-489模拟物和抑制物对CFs表型分化、迁移和分泌等细胞生物学行为的影响,并探讨其作用机制。方法:提取乳鼠原代CFs,经波形蛋白免疫荧光鉴定纯度后,按照如下分组:（1）在正常培养条件下的CFs中转染miR-489 mimic,构建miR-489过表达模型。CFs分为3组:正常组（Normal）、miR-489过表达组（mimic）、miR-489阴性对照组（mimic-NC）。（2）在AngⅡ干预的CFs中转染miR-489 mimic,构建miR-489过表达模型。CFs 分为 3 组:AngⅡ组（AngⅡ）、AngⅡ+miR-489 过表达组（AngⅡ+mimic）、AngⅡ+miR-489 阴性对照组（AngⅡ+mimic-NC）。（3）在正常培养条件下的CFs中转染miR-489 inhibitor,构建miR-489抑制模型。CFs 分为 3 组:正常组（Normal）、miR-489 抑制组（inhibitor）、miR-489阴性对照组（inhibitor-NC）。（4）在AngⅡ干预的CFs中转染miR-489 inhibitor,构建miR-489抑制模型。CFs 分为 3 组:AngⅡ组（AngⅡ）、AngⅡ+miR-489 抑制组（AngⅡ+inhibitor）、AngⅡ+miR-489 阴性对照组（AngⅡ+inhibitor-NC）。采用qPCR技术检测miR-489 mimic转染的CFs中miR-489的表达水平,验证转染效果。采用Western blot技术检测各组中α-SMA的表达情况,观察CFs的分化情况;检测Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达,观察CFs胶原蛋白的分泌情况;检测CFs中myd88、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表达情况,观察miR-489的调控作用。结果:（1）经波形蛋白免疫荧光检测证实提取的CFs纯度在95%以上,符合实验要求。（2）与Normal组和mimic-NC组比较,mimic组miR-489的表达水平显着升高（P<0.01）,Normal组和mimic-NC组之间无显着性差异（P>0.05）,说明 miR-489 mimic 转染成功。与 Normal 组和 inhibitor-NC 组相比,inhibitor 组myd88表达显着上调（P<0.01）,Normal组和inhibitor-NC组之间无统计学差异（P>0.05）,说明miR-489 inhibitor转染成功。（3）在正常条件下培养的CFs和AngⅡ干预的CFs中,miR-489过表达均能够显着抑制myd88、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表达,降低p-NF-κB p65/p65的比值;抑制miR-489能够促进myd88、α-SMA、Collagen Ⅰ和 Collagen Ⅲ的表达,上调 p-NF-κBp65/p65 的比值。结论:在正常培养的CFs和AngⅡ干预的CFs中miR-489过表达均能够抑制下游myd88/NF-κB通路的活化,减轻CFs的纤维化反应;抑制miR-489能够激活下游myd88/NF-κB信号通路,促进CFs的纤维化反应。这表明在生理和病理情况下CFs中miR-489均可调节myd88/NF-κB信号通路,改善心肌纤维化反应。研究二人参皂苷Re调节心肌梗死后心肌纤维化的机制研究目的:观察人参皂苷Re对急性心肌梗死后小鼠心功能、血清学标志物、组织病理学改变和相关基因蛋白表达的影响,探讨人参皂苷Re改善梗死后MF的分子机制。方法:通过结扎左冠状动脉前降支构建C57BL/6小鼠心肌梗死后MF模型。小鼠被随机分为4组:假手术组（Sham）、模型组（Model）、低剂量人参皂苷Re组（L,19.5mg/kg/d）和高剂量人参皂苷Re组（H,39mg/kg/d）,每组10只。术后第二天开始灌胃给药,1次/天,连续灌胃四周。心脏超声检测各组小鼠左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）,观察心功能情况;通过心重指数（HWI）、心胫比（HW/TL）以及心肌中ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达,观察心梗后心肌代偿性肥厚情况;通过ELISA方法检测血清中心肌损伤（CK-MB）、心力衰竭（BNP）、肝肾功能（ALT、S-Cr）和 RAAS（AngⅡ）等标记物的含量;通过HE和Masson染色,观察心梗后心肌组织及纤维化的病变情况;Western blot 检测 myd88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ等相关蛋白表达;qPCR技术检测miR-489和myd88的表达形况。结果:（1）与Sham组相比,Model组LVEF和LVFS显着减低（P<0.01）;与Model组比较,低高剂量人参皂苷Re组LVEF和LVFS明显升高（P<0.01）。（2）与Sham组比较,Model组CK-MB、BNP和AngⅡ水平显着升高（P<0.01）;与Model组比较,低高剂量人参皂苷Re组CK-MB、BNP和AngⅡ水平显着下降（P<0.05）,ALT 和 S-Cr 无明显变化（P>0.05）。（3）与 Sham 组比较,Model组HWI、HW/TL以及心肌中ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达显着升高（P<0.01）,给以低高剂量人参皂苷Re干预后,这些指标明显下降（P<0.05）。（4）与Sham组比较,Model组心肌结构排列紊乱,肌丝较粗,呈波状变化,伴有大量炎症细胞浸润和胶原蛋白沉积。给予人参皂苷Re干预后组织病理改变明显减轻。（5）与 Sham 组比较,Model 组 myd88、p-NF-κB p65、α-SMA、Collagen Ⅰ和CollagenⅢ的表达明显升高,miR-489的表达显着下调（P<0.01）;与Model组比较,低高剂量人参皂苷Re组myd88、p-NF-κB p65、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达明显降低,miR-489的表达显着上调（P<0.05）。以上检测中低高剂量人参皂苷Re组之间无统计学差异（P>0.05）。结论:人参皂苷Re能够改善心肌梗死后小鼠的心脏功能,抑制心肌代偿性肥厚,减轻心肌缺血损伤和胶原蛋白沉积,改善组织病理学病变,且未发现明显肝肾毒性。其机制可能与调节心肌梗死后小鼠心肌中miR-489/myd88/NF-κB信号通路有关。研究三 人参皂苷Re干预AngⅡ诱导CFs生物学行为改变的机制研究目的:采用AngⅡ诱导C57BL/6乳鼠原代CFs,观察人参皂苷Re对CFs分化、迁移和分泌等生物学行为的影响,并探讨其相关机制。方法:提取乳鼠原代CFs后,通过CCK-8法筛选人参皂苷Re的安全浓度范围。CFs被随机分为5组:正常组（Normal）、模型组（Model）和人参皂苷Re低、中、高剂量组。给以相应药物处理后,收集细胞进行相关检测。采用Transwell实验和划痕实验检测各组CFs的迁移情况;采用免疫荧光和Western blot技术检测α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达情况,观察CFs分化为肌成纤维细胞和胶原蛋白的分泌情况;通过qPCR技术和Western blot技术检测miR-489、myd88、NF-κB p65 和 p-NF-κBp65 的表达情况。结果:（1）经 CCK-8 法选定 50μmol/L、100μmol/L 和 200μmol/L 为人参皂苷Re的干预浓度。（2）与Normal组比较,Model组穿过Transwell小室的CFs数量显着增多,迁移距离明显增长（P<0.01）;与Model组相比,低中高剂量人参皂苷Re均能减少穿过Transwell小室的CFs数量,缩短迁移距离（P<0.01）。（3）与 Normal 组比较,Model 组α-SMA、Collagen Ⅰ和 Collagen Ⅲ的荧光强度和蛋白表达量均明显升高（P<0.01）;与Model组相比,低中高剂量人参皂苷Re均能降低α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的荧光强度和蛋白表达量（P<0.01）。（4）与Normal组比较,Model组miR-489水平显着降低,myd88的表达和p-NF-κB p65/p65比值显着升高（P<0.01）,低中高剂量人参皂苷Re均能抑制这种趋势（P<0.05）。以上检测中低中高剂量人参皂苷Re组之间未发现统计学差异（P>0.05）。结论:人参皂苷Re能够抑制AngⅡ诱导的CFs迁移、表型分化和分泌等生物学行为的改变;其机制可能与调节AngⅡ诱导的CFs中miR-489/myd88/NF-κB信号通路有关。
谢俊豪[3]（2021）在《人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究》文中进行了进一步梳理糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是一种全球性慢性代谢性疾病。据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF）报告显示,到2040年,糖尿病人口预计将从2015年的4.15亿增加到6.42亿。1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM）的病例以每年3%-5%速度稳步增加,全世界患有T1DM的青年人数（<20岁）超过100万人,按照目前的趋势发展,预计每年将增加10万人。胰岛素终生替代疗法是目前临床T1DM的主要治疗方法,但其不能遏制胰岛功能进行性衰竭,也无法有效阻止T1DM相关并发症的发生和进展。近年来,干细胞疗法有望通过胰岛β细胞替代或再生,保护甚至重建内源性胰岛素分泌系统,从而改善疾病进程与预后,是T1DM治疗领域备受关注的研究方向。而人乳牙牙髓干细胞（stem cells from pulps of human exfoliated deciduous teeth,SHED）的应用逐步显示其潜在优势。SHED较其他间充质干细胞来源丰富、获取简单、增殖能力强、低免疫原性、低致瘤风险,且不存在伦理问题,有更好的免疫调节作用,较好的生物学稳定性和良性特征,较低的凋亡性和衰老性。已证明SHED可诱导为胰岛β细胞,显示其运用于未来T1DM治疗的巨大潜力。目前,其应用于DM的研究正逐步开展,尚未见其治疗T1DM恢复β细胞功能相关基础及临床研究的报道,其发挥作用的机制也有待阐明。一、研究目的（一）通过尾静脉和胰背动脉两种途径移植SHED,探究不同移植途径对SHED治疗STZ诱导DM大鼠疗效的影响。（二）皮下注射胰岛素,维持DM大鼠血糖于不同水平,通过尾静脉多次移植SHED,探究不同血糖水平DM大鼠多次输注SHED疗效差异。（三）通过动物和细胞实验,探究SHED治疗DM的可能机制。二、研究方法180-200g雄性SD大鼠,适应性喂养后,予60mg/kg STZ腹腔注射构建糖尿病模型。（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠随机选取48只STZ诱导DM大鼠,分为DM对照组（DM组,diabetes mellitus group,n=14）,尾静脉输注组（CV组,Caudal vein infusion SHED group,n=16）,胰背动脉输注组（DPA组,Dorsal pancreatic artery infusion SHED group,n=18）。对照大鼠12只为正常对照组（NC组,Normal control group,n=12）。成模后,CV组和DPA组皮下注射胰岛素降糖治疗,一周左右至目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测大鼠食量、体重、空腹血糖,每天监测CV组和DPA组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射剂量。治疗前及SHED治疗2周后,行口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）评价糖代谢情况,并留取血清标本检测C肽、糖化血清蛋白（glycated serum protein,GSP）等。干细胞治疗2周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠36只STZ诱导DM大鼠分为DM对照组（diabetes mellitus group,DM组,n=6）,胰岛素治疗组（n=12）和干细胞治疗组（n=18）,其中胰岛素治疗组又分为中糖组（Middle glycemic group,MG组）和低糖组（Low glycemic group,LG组）;干细胞治疗组又分为高糖干细胞组（High glycemic SHED group,HGSHED组）、中糖干细胞组（Middle glycemic SHED group,MGSHED组）和低糖干细胞组（Low glycemic SHED group,LGSHED组）,每组各6只。未造模大鼠为正常对照组（normal control group,NC组,n=6只）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠均给予胰岛素治疗,2周内达到目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测食量、体重、空腹血糖,每天监测MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射量。治疗前和第3次输注干细胞2周后,分别对所有大鼠行OGTT试验,评价糖代谢情况,并留取血清检测C肽、GSP等。干细胞治疗5周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining,HE染色）观察胰腺病理变化,透射电镜观察胰岛β细胞内部结构变化,免疫组织化学和免疫荧光双标染色探究β/α胰岛细胞比例、胰岛素和胰高血糖素分泌情况。冰冻切片活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）染色及氧化应激相关指标检测评价各组大鼠胰腺氧化应激情况,蛋白质印迹法（Western-Blot,WB）分析胰腺Keap1/Nrf2抗氧化信号通路、p-Erk激活情况和抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达情况。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、细胞模型的构建予不同浓度STZ（50mM、20 mM、10 mM、7.5 mM、5 mM、2.5 mM、1.25 mM、1 mM）刺激胰岛RIN-m5F细胞不同时间（2h、6h、12h、24h）,行Cell-Counting Kit-8检测,选择抑制率为50%的浓度和时间为后续细胞实验造模条件,在该浓度和时间检测ROS,确定DM氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验按照不同处理分为正常对照组（normal control group,NC组）、SHED培养上清液处理组（culture medium treatment group,CM组）、STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）。各组进行ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR确定Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）m RNA表达量变化。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰查阅文献确定HGF为本研究细胞因子,SHED改善STZ诱导的DM胰岛β细胞功能可能与其分泌较高量的HGF密切相关,并对SHED的HGF基因进行siRNA干扰。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验按照不同处理分为STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）、STZ+siRNA干扰SHED培养上清液处理组（STZ+siRNACM组）及STZ+重组肝细胞生长因子处理组（STZ+HGF组）。各组进行相关检测,包括ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR检测Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、PCNA m RNA表达量变化。并进一步通过Western Blot探索HGF在细胞模型中对Keap1、Nrf2、p-Erk、p-Akt及凋亡相关蛋白的影响。三、研究结果（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠干细胞治疗后,CV组和DPA组大鼠每周日均食量明显少于DM组（均P<0.01）,且CV组小于DPA组（P<0.01）。CV组和DPA组大鼠体重明显大于DM组（P<0.01）（P<0.05）,CV组大鼠体重也明显大于DPA组大鼠（P<0.01）。治疗后1周,两组空腹血糖均值相同（15.68mmol/L）,且治疗后2周,两组空腹血糖均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组日均胰岛素注射量较治疗前（第5周）均明显减少（P=0.001,P=0.001）。治疗后,CV组和DPA组血糖AUC0-120min均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组大鼠C肽AUC0-120min水平较治疗前明显升高（P=0.004）（P=0.001）,且CV组明显高于DM组和DPA组（均P<0.01）。DM组大鼠GSP水平明显高于NC组、CV组和DPA组（均P<0.01）,但三组之间无明显差异（P>0.05）。CV组大鼠GSP治疗前后无明显变化（P=0.309）,DPA组大鼠GSP较治疗前降低（P=0.001）。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠干细胞治疗后,MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均食量均明显小于DM组、HGSHED组和MG组（P<0.05）（P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠体重均明显大于同期DM组和HGSHED组（均P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠空腹血糖均明显低于同期DM组和HGSHED组,且MG组、MGSHED组和LGSHED组空腹血糖与NC组无明显差异（P>0.05）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均胰岛素使用量较干细胞治疗前均明显减少（P<0.05）（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组血糖AUC0-120min较治疗前逐渐降低（均P<0.01）,且均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。DM组C肽AUC0-120min较治疗前明显降低（P<0.01）,而HGSHED组治疗前后无明显变化。DM组、HGSHED组和MG组大鼠C肽AUC0-120min水平均明显低于NC组（P<0.05）（P<0.01）;MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠C肽AUC0-120min水平明显高于DM组和HGSHED组（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组GSP水平均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究1、HE染色,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组胰岛体积较DM组和HGSHED组明显增大,胰岛细胞明显增多,细胞核染色清晰度明显增加,空泡细胞和玻璃样变减少,炎性细胞浸润明显减少。MGSHED组较MG组、LGSHED组较LG组体积增大,改善更明显。其中,MGSHED组胰岛体积最大,但小于NC组。2、胰腺电镜结果显示,各治疗组胰岛β细胞状态不同程度改善,MGSHED组改善最为明显。胰岛免疫组织化学和荧光双标染色均显示,各治疗组β/α细胞比例增大,胰岛素分泌增多,而胰高血糖素分泌不同程度减少。3、ROS染色,DM组平均荧光强度最大,各治疗组大鼠较DM组平均荧光强度一定程度降低。其中,MGSHED组平均荧光强度最小。4、各治疗组大鼠胰腺总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）不同程度升高,而丙二醛（MDA）、一氧化氮合成酶（NOS）分型尤其是i NOS一定程度降低。5、Western Blot蛋白分析,DM组大鼠胰腺Nrf2蛋白表达较NC组明显减少,各治疗组均有不同程度增加,其中MGSHED组Nrf2蛋白表达增加最多。而DM组大鼠胰腺Keap1蛋白表达较NC组明显增加,各治疗组一定程度减少,MGSHED组Keap1蛋白表达最少。DM组p-Erk、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少,各治疗组一定程度增加,MGSHED组明显大于MG组,LGSHED组明显大于LG组。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、STZ浓度为5mM、时间为12h,作为后续细胞实验造模条件。ROS荧光强度明显增强表明氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验STZ+CM组较STZ组ROS平均荧光强度减小,抗氧化相关指标T-AOC、SOD、GSH升高,脂质过氧化产物MDA减少,细胞凋亡率明显降低,增殖率明显升高（p<0.01）。STZ+CM组Nrf2m RNA表达量明显高于STZ组（p<0.01）,而STZ+CM组Keap1表达量明显低于STZ组（p<0.01）。STZ+CM组Bcl-2和PCNA m RNA表达量明显大于STZ组（p<0.01）,而Bax和Caspase-3明显小于STZ组（p<0.01）。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰siRNA-HGF干扰SHED,HOMO-HGF-2能明显抑制SHED细胞中HGF基因m RNA（抑制率约71.78%）（p<0.01）和蛋白表达。Elisa法检测SHED培养上清液中HGF浓度,siRNA-HGF2组明显低于NC组和siRNA-NC组（p<0.05）（P<0.01）。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验STZ+CM组ROS平均荧光强度明显小于STZ+siRNACM组（p<0.01）,STZ+siRNACM组T-AOC明显小于STZ+CM组（p<0.01）,细胞增殖率（p<0.05）、Nrf2（p<0.01）,Bcl-2、PCNA m RNA表达量明显低于STZ+CM组（p<0.01）,而Caspase-3m RNA表达量明显高于STZ+CM组（p<0.01）。5、Western Blot检测确定HGF作用相关蛋白发现,重组HGF能激活Nrf2、p-Erk、p-Akt,下调Keap1,增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,减少凋亡相关蛋白Caspase-3表达。四、研究结论1、不同输注途径及不同血糖水平SHED治疗对DM大鼠症状、糖代谢相关指标及胰岛分泌功能均有不同程度的改善作用。2、不同输注途径移植SHED,输注相同次数,在相同糖代谢水平,观察相同时间,对血糖改善作用类似。3、多次尾静脉移植SHED,对不同血糖水平DM大鼠疗效不同。MGSHED组DM大鼠症状、糖代谢及胰岛功能整体改善效果较好,表明维持血糖平稳控制于合适的水平,更利于SHED体内存活迁移及相关细胞因子分泌,达到更好的治疗效果。4、控制血糖水平后,多次静脉移植SHED,可明显改善糖尿病症状,降低空腹血糖水平、改善胰岛储备与分泌功能、减少胰岛素使用剂量,且三次移植效果优于一次。5、SHED移植治疗DM大鼠,可能启动胰腺内源性氧化应激系统,增强其抗氧化能力,调节氧化应激可能是其发挥作用重要机制之一。最重要的抗氧化信号通路Keap1/Nrf2与调控密切相关。且与p-Erk激活相关的细胞增殖及Bcl-2家族蛋白的活化减轻细胞凋亡相关。6、体外研究发现,SHED减少STZ诱导胰腺RIN-m5F细胞氧化应激、促进其存活与其分泌大量HGF密切相关。可能通过HGF激活p-Erk、p-Akt及Keap1/Nrf2抗氧化信号通路,启动内源性抗氧化途径,从而影响氧化应激相关指标,并减少凋亡蛋白,促进抗凋亡及增殖相关蛋白表达,保护β细胞,从而在抗糖尿病中发挥重要作用。
崔恩宁[4]（2021）在《灯盏乙素抑制海马神经元细胞凋亡减轻2型糖尿病认知功能障碍的机制研究》文中研究指明[目的]本研究通过8周的高糖高脂饮食联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ.35mg/kg）腹腔注射的方法建立SD大鼠2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）模型,探讨不同剂量灯盏乙素（scutellarin,Scu）灌胃治疗后是否通过抑制炎症因子和氧化应激,调控BDNF/TrkB和PI3k/Akt/CREB传导通路,缓解大鼠海马神经元凋亡,促进糖尿病性认知功能障碍（Diabetes-associated cognitive decline,DACD）的改善。[方法]1.100只10周龄SPF级雄性SD大鼠（180±20 g）,适应性喂养两周后按照随机数字表法选取15只作为正常对照组（Control组）,其余为T2DM模型组。Control组用标准饲料喂养,T2DM模型组大鼠采用高糖、高脂饮食,8W后一次性腹腔注射35 mg/Kg链脲佐菌素诱导糖尿病模型。三天后,测定SD大鼠尾静脉随机血糖浓度,若血糖浓度≥16.7mmol/L且持续1周以上我们就认定为2型糖尿病模型建立成功。2.把造模成功的大鼠参照随机数字表的方法分为:模型组、灯盏乙素低、中、高剂量组、二甲双胍组;其中灯盏乙素低、中、高剂量组分别给予灯盏乙素25、50、100 mg/Kg/d灌胃治疗;二甲双胍组给予二甲双胍120 mg/Kg/d灌胃治疗;对照组和模型组则给予等体积的生理盐水腹腔灌胃。持续八周。灌胃期间,每周监测各组大鼠一般情况、体重和空腹血糖的变化并根据体重调整灌胃体积。在灌胃给药治疗的第4W末和第8周末,分别进行口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test,OGTT）和胰岛素耐量实验（insulin tolerance test,ITT）检测血糖稳态。3.灌胃结束后,分别进行Morris水迷宫实验（Morris water maze,MWM）和旷场实验旷场实验（Open field test,OFT）来对比大鼠的学习记忆能力和在新异环境中探究行为和紧张度。4.行为学实验结束后,ELISA测定大鼠血清空腹血糖水平（Fasting blood glucose,FBG）和空腹胰岛素水平（Fasting insulin,FINS）,计算大鼠的胰岛素抵抗指数（HOMA insulin resistance index,HOMA-IR）和胰岛素敏感性指数（Insulin sensitivity index,ISI）。5.测定血清肝生化指标、血脂:丙氨酸转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartic transaminase,AST）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）。6.检测大鼠的血清、海马中氧化应激因子和抗氧化应激因子:丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）;过氧化氢酶（Catalase,CAT）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）。7.ELISA法测定大鼠血清和海马炎性因子指标:肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）。8.采用HE染色、尼氏染色和TUNEL染色观察大鼠海马神经元病理结构改变。9.采用免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）和免疫印迹法（Western blotting,WB）分别检测海马中BDNF/TrkB及其下游信号通路PI3K/Akt/CREB,Caspase 家族成员（Procaspase-3、Cleaved-caspase-3、Procaspase-8、Cleaved-caspase-8、Procaspase-9、Cleaved-caspase-9、Procaspase-12）和 B 淋巴细胞瘤-2（B-celllymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）的表达情况。[结果]1.SD大鼠高糖高脂饮食+小剂量STZ腹腔注射的方法成功建立了 T2DM模型。在灌胃治疗期间,Control组大鼠体重稳定增长,血糖稳定在正常范围;Model组大鼠体重持续下降,血糖显着升高,糖耐量和胰岛素耐量受损严重（P<0.05）;各Scu治疗组大鼠体重依旧呈下降趋势,但下降程度趋于平缓,存在时间依赖性和剂量依赖性,血糖、第4W的糖耐量和胰岛素耐量和第8W的胰岛素耐量未见明显改善（P>0.05）。2.2.Morris水迷宫实验:（1）定位航行实验结果表明,与Control组比较,Model组大鼠出现严重的空间学习障碍,表现为逃避潜伏期延长（P<0.05）;与Model组比较,Scu各组与Met-120组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）,随着训练次数的增加,各组大鼠总路程逐渐降低。第2-5天,与Control组比较,Model组大鼠总路程延长（P<0.05）;与Model组比较,Scu各组与Met-120组大鼠在第2-4天的总路程均缩短（P<0.05）;在第5天,总路程均缩短,但仅Scu-50组差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）空间探索实验结果表明各组大鼠总路程和平均速度差异无统计学意义（P>0.05）。与Control组比较,Model组大鼠穿越平台次数、目标象限路程百分比、目标象限停留时间百分比减少（P<0.05）;与Model组比较,Scu-25组、Scu-50组、Scu-100组、Met-120组大鼠穿越平台次数、目标象限路程百分比、目标象限停留时间百分比增多（P<0.05）,其中,Scu-50组效果优于其他用药各组。旷场实验:与Control组比较,Model组大鼠总探索距离缩短,平均速度减慢,进入中心区域次数减少,中央区域停留时间降低,直立次数变少,梳理毛发次数增多,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Model组比较,Scu-25组、Scu-50组、Scu-100组、Met-120组大鼠总探索距离延长,平均速度加快,进入中心区域次数增多,中央区域停留时间增加,直立次数变多,梳理毛发次数减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。其中,Scu-50剂量组效果优于其余各用药组。3.与Control组比较,Model组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR升高,ISI降低（P<0.05）;与 Model 组比较,Scu 各组与 Met-120 组大鼠 FBG、FINS、HOMA-IR、水平降低,ISI升高（P<0.05）。4.血清肝生化指标、血脂结果显示,与Control组比较,Model组大鼠血清ALT、AST、TC、TG含量均升高（P<0.05）,与Model组比较,Scu各组与Met-120组大鼠ALT、AST、TC、TG含量均降低（P<0.05）,其中Scu-100组效果优于Met-120 组。5.与Control组比较,Model组大鼠血清、海马匀浆氧化应激相关因子（MDA、ROS）含量均升高（P<0.05）,抗氧化应激相关因子（CAT、GSH、SOD）含量均降低（P<0.05）,炎性因子（TNF-α、IL-lβ、IL-6）均增加（P<0.05）;与Model组比较,经过Scu与Met治疗后,大鼠血清、海马匀浆氧化应激相关因子（MDA、ROS）含量降低（P<0.05）,抗氧化应激相关因子（CAT、GSH、SOD）含量升高（P<0.05）,炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）减少（P<0.05）,存在剂量依赖性,而Scu-25组在某些指标中差异无统计学意义（P>0.05）。6.HE染色、尼氏染色和TUNEL染色结果显示,Model组大鼠海马神经元细胞核固缩浓染,尼氏体减少,出现大量的黄褐色凋亡小体,表明其有明显的病理损伤,而经过Scu和Met治疗后,神经元细胞核固缩浓染现象减少,尼氏体数量增多,凋亡小体数目减少。7.IHC和WB的结果显示:与Control组比较,Model组大鼠海马BDNF、p-TrkB、TrkB、p-PI3K、PI3K、p-Akt（Ser473）、p-Akt（Thr308）、Akt、p-CREB、CREB、Bcl-2 蛋白下降（P<0.05）;经过药物治疗后,BDNF、p-TrkB、TrkB、p-PI3K、PI3K、p-Akt（Ser473）、p-Akt（Thr308）、Akt、p-CREB、CREB、Bcl-2 蛋白升高（P<0.05）。8.IHC和WB的结果显示:与Control组比较,Model组大鼠海马Procaspase-3、Cleaved-caspase-3、Procaspase-8、Cleaved-caspase-8、Procaspase-9、Cleaved-caspase-9、Procaspase-12、Bax 蛋白升高（P<0.05）;经过药物治疗后,Procaspase-3、Cleaved-caspase-3、Procaspase-8、Cleaved-caspase-8、Procaspase-9、Cleaved-caspase-9、Procaspase-12、Bax 蛋白下降（P<0.05）。[结论]1.Scu可以减轻炎症因子的表达失衡、抗氧化应激、调节脂代谢紊乱,改善胰岛素抵抗。2.Scu可能通过上调BDNF/TrkB及其下游信号通路PI3K/Akt/CREB来减轻T2DM大鼠海马神经元凋亡,从而改善糖尿病性认知功能障碍,具有神经保护作用。
王建武[5]（2021）在《小分子IR-61改善STZ诱导的糖尿病大鼠排尿功能的实验研究》文中指出背景:糖尿病膀胱功能障碍（diabetic bladder dysfunction,DBD）是糖尿病最常见的泌尿系统并发症。据估计,DBD在糖尿病患者中的患病率在43-87%之间,虽然DBD不会危及患者的生命,但它对患者的生活质量造成了极大的困扰。然而到目前为止,对于那些控制血糖和行为疗法无效的患者,尤其是发生逼尿肌收缩无力的DBD晚期患者,临床上仍缺乏有效的治疗手段。因此,开发一种新的DBD治疗手段仍具有十分重要的临床意义。课题组在之前的研究中合成了一种新型七甲川花菁荧光小分子化合物—IR-61。研究发现IR-61具有良好的生物相容性,可优先蓄积于细胞的线粒体中,并可减轻氧化应激引起的细胞损伤。考虑到DBD的发生发展与高血糖引起的氧化应激损伤密不可分,我们假设具有潜在抗氧化作用的IR-61可以通过调节糖尿病环境中膀胱组织和细胞的氧化应激水平,减轻膀胱组织和细胞的氧化应激损伤,从而对糖尿病环境下的膀胱功能起到一定的保护作用。在本实验中,我们研究了IR-61对链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病大鼠膀胱功能、组织、细胞的影响,探讨了其能否预防或减缓DBD的发生发展及其可能的作用机制。材料与方法:用STZ诱导建立雌性糖尿病大鼠模型后,通过腹腔分别注射IR-61溶液或空白溶剂,分为对照组、糖尿病组和IR-61治疗组。首先我们通过近红外荧光成像检测IR-61在糖尿病大鼠重要脏器中的蓄积水平以及通过组织冰冻切片、细胞免疫荧光染色在共聚焦显微镜下明确其组织、亚细胞定位。然后通过充盈性膀胱测压评价IR-61对糖尿病大鼠膀胱功能的改善作用。最后分离各组大鼠的膀胱组织进行近红外荧光成像、组织透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）、组织切片染色以及通过组织蛋白质印迹实验（western blot,WB）检测分析相关蛋白分子的表达情况。结果:离体器官的近红外荧光成像显示IR-61在糖尿病大鼠的膀胱内高度蓄积并主要定位在膀胱的平滑肌层,同时共聚焦实验证明其主要定位于膀胱平滑肌细胞（bladder smooth muscle cells,BSMCs）的线粒体上。充盈性膀胱测压实验证明IR-61能够显着改善糖尿病大鼠的排尿功能。组织形态学相关实验结果显示,IR-61有效地减轻了糖尿病大鼠膀胱平滑肌（bladder smooth muscle,BSM）的病理损伤。此外,IR-61有效减少了线粒体凋亡途径相关蛋白（B淋巴细胞瘤-2基因,Bcl-2;BCL2关联X蛋白,BAX;细胞色素C,Cytochrome C;剪切型的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9,cleaved-Caspase-9）的不利表达,显着降低了糖尿病大鼠BSMCs的凋亡水平。同时组织冰冻切片染色和透射电镜结果证明IR-61可显着降低糖尿病大鼠BSM中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平,减轻BSMCs线粒体的损伤。此外,蛋白印迹实验发现IR-61可显着上调糖尿病大鼠BSM中红系衍生的核因子2相关因子2（Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,Nrf2）及其下游相关抗氧化蛋白的表达水平。总而言之,以上结果表明IR-61可能通过Nrf2激活BSMCs的内源性抗氧化系统,抵御高糖环境对线粒体、BSMCs、平滑肌组织的氧化应激损伤,进而保护了糖尿病大鼠的排尿功能。结论:1.IR-61可以高度聚集于糖尿病大鼠的膀胱组织中,并且主要定位在膀胱平滑肌层以及BSMCs的线粒体上。2.IR-61对糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织和排尿功能具有显着的保护作用,而对糖尿病大鼠的体重和血糖水平并没有明显的改善作用。3.IR-61可能通过激活Nrf2通路保护BSMCs的线粒体免受氧化应激损伤,抑制其发生凋亡,提示了这可能是IR-61预防或减缓糖尿病大鼠DBD发生发展的潜在作用机制。
高翔[6]（2021）在《卡托普利通过抑制氧化损伤和血脂异常治疗糖尿病视网膜病变》文中研究说明目的对糖尿病视网膜病变（DR）的治疗研究上,卡托普利表现出优秀的治疗效果,但其作用机制尚不清楚。氧化损伤和血脂异常在DR的发病机制中起着重要作用,本研究旨在探讨卡托普利治疗DR的疗效与氧化损伤和血脂异常的关系。方法经门诊及住院部确定患者信息,收集患者血常规信息及血液样本,整理记录。按随机数字表法,将糖尿病模型鼠分为治疗组和未治疗组,给予治疗组卡托普利25 mg/kg/天,给予未治疗组同比容积的生理盐水。所有小鼠均以正常成分的饲料及冷白开水喂养,定期测定小鼠的空腹血糖、体重、24-h摄食量和24-h饮水量,共12周。人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）分别在含有5.5 mmol/L或30 mmol/L的葡萄糖培养基中培养,30 mmol/L的高葡萄糖组再分别使用1mmol/L或2 mmol/L的卡托普利处理24h。采用HE染色和伊文思蓝造影检测视网膜病理。用相应的试剂盒检测小鼠血清及视网膜组织和人视网膜微血管内皮细胞中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和一氧化氮（NO）水平。用蛋白免疫印迹法检测SREBP1、SREBP2、e NOS、i NOS以及VEGF在小鼠视网膜和HRMECs中的浓度。结果临床数据显示,与未服用卡托普利的DR患者相比,服用卡托普利的DR患者血液样本中TC、TG、NO的含量降低。与未治疗组小鼠相比,卡托普利治疗组小鼠的体重和24-h摄食量分别在第7-12周和第11-12周显示降低,两组小鼠间的血糖、摄水量无统计学差异;与正常对照组小鼠相比,T2DM小鼠的血糖、体重、摄食量、摄水量均增高。卡托普利能明显改善视网膜细胞各层结构,抑制新生血管生成。T2DM小鼠视网膜组织和暴露于30 mmol/L含糖量培养基的HRMECs中的TC、TG和NO浓度升高,卡托普利治疗组的各项数据均降低。高糖处理的HRMECs和T2DM小鼠视网膜组织中SREBP1、SREBP2、i NOS和VEGF的表达水平上调,而e NOS的表达水平下调。卡托普利干预后上述蛋白的表达水平发生了逆转。结论本研究发现卡托普利可以通过降低NO的浓度抑制过氧化亚硝酸盐的生成、调控脂代谢紊乱,从而减轻DR的氧化损伤,以发挥保护作用。
张华朋[7]（2020）在《PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究》文中认为研究背景脑卒中（cerebral stroke）是各种诱发因素导致脑内动脉闭塞、破裂而造成脑部血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病,分为缺血性、出血性两种。脑卒中作为世界上致死率最高的疾病之一,全球每年新发病例高达1030万,且近来有年轻化的趋势,给社会、家庭和患者带来极大的负担。更严重的是,许多其他疾病会直接或间接导致脑卒中的发生。例如糖尿病就是引起脑血管疾病的独立危险因素,据国外资料显示,有糖尿病史患者同时患脑血管疾病的概率达到了 30～40%,而且糖尿病合并脑卒中的患者已经达到非糖尿病患者的2倍以上。临床上糖尿病合并脑卒中的患者中缺血性脑卒中占到了 80%,糖尿病并发卒中的发病率快速上升。因此如何设计和开发安全有效的脑卒中治疗药物,尤其是糖尿病脑卒中是一个亟待解决的问题。众多研究资料表明,吸入性麻醉药预处理或后处理可以保护神经系统减轻缺血性损伤。有学者发现七氟烷预处理能够减少动脉阻塞导致的脑梗死体积和凋亡细胞。许多脑缺血再灌注损伤动物模型实验证明,七氟烷预处理可以有效减少神经细胞的凋亡、一定程度改善脑梗死体积、神经功能评分、炎性反应等方面从而保护脑神经。但我们并不清楚糖尿病是否会影响七氟烷后处理的神经保护作用,且七氟烷发挥作用的机制也有待研究。有学者发现糖尿病大鼠通过恢复海马突触功能和Na+,K+-ATP酶的活性提高学习和记忆能力,机制可能与PI3K/Akt信号通道有关;Yang和同事发现利拉鲁肽可以激活糖尿病大鼠PI3K/Akt信号通道,促进自噬,最终对慢性2型糖尿病相关的学习记忆障碍提供保护;另有研究已经证实糖尿病大鼠大脑皮层细胞中PI3K/Akt信号通道相关蛋白的表达量明显下降。因此,有必要进行七氟烷对糖尿病大鼠脑缺血后神经损伤影响的研究,以期发现七氟烷后处理对脑缺血再灌注糖尿病大鼠神经功能损害是否有效,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制,为后期降低糖尿病人群脑缺血后神经功能损害及促进脑卒中后神经功能恢复提供理论依据。研究目的本文通过构建脑缺血合并糖尿病大鼠模型,评估七氟烷后处理对合并糖尿病的大鼠在脑缺血再灌注后,脑组织损伤程度及氧化应激和细胞凋亡的影响,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制做初步探究。研究方法1.研究对象及分组:健康Wistar大鼠288只,体重（260±30）g。大鼠饲养于室温20±2℃,相对湿度50%～70%的清洁环境中,自由摄食、摄水,适应性饲养一周后,进行实验分组和脑缺血糖尿病模型制备。首先取其中240只大鼠随机分为6组（每组40只）,正常组（Control）:不做处理;糖尿病组（DM）:选取糖尿病造模成功后大鼠;脑缺血模型组（CI）:采用线栓法将健康大鼠大脑中动脉血流阻断2h后恢复灌注;糖尿病脑缺血模型组（DMCI）:阻断糖尿病大鼠大脑中动脉血流2h后恢复灌注;七氟烷后处理组（SCI）:健康大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min;糖尿病七氟烷后处理组（SDMCI）:糖尿病大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min。Control、DM、CI和DMCI组大鼠均在再灌注开始时给予100%氧气,持续30 min,大鼠再灌注24h后进行相应指标检测。2.建立糖尿病和脑缺血大鼠模型:大鼠高脂高糖饮食,喂养5周后,腹腔注射STZ（链脲佐菌素,Streptozotocin,溶解于柠檬酸缓冲液中,25mg/kg）每天一次,连续2d。72h后尾静脉采血测空腹血糖,以血糖≥16.7mmol/L,并出现多食、多尿、多饮为大鼠糖尿病模型成立。脑缺血大鼠模型构建方法:大鼠术前12h禁食。腹腔内注射10%水合氯醛麻醉大鼠,仰卧位固定,手术暴露右颈总动脉,在分叉处分离颈内动脉和颈外动脉,用4/0尼龙线阻断大脑中动脉,2h后抽出尼龙线,开放大脑中动脉,恢复缺血区灌注。模型成功建立的标志是:大鼠手术后清醒,左侧肢体出现偏瘫,以左上肢较为明显;提尾悬挂时左上肢呈现蜷缩屈曲;下地行走时向左侧转圈跌倒,不能正常直行。3.LY294002脑室内注射给药:为了研究七氟烷治疗脑缺血再灌注中PI3K/Akt通道的作用,用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002预处理七氟烷治疗组大鼠。取其余48只大鼠,将大鼠分为6组（每组8只）,分别构建正常脑缺血加生理盐水组（NS-CI）、糖尿病合并脑缺血加生理盐水组（NS-DMCI）,七氟烷后处理脑缺血加生理盐水组（NS-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加生理盐水组（NS-SDMCI）、七氟烷后处理脑缺血加抑制剂组（LY-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加抑制剂组（LY-SDMCI）大鼠模型。术前将LY294002溶于二甲基亚砜（DMSO）和乙醇中,终浓度为10mM。将大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg,腹腔给药）麻醉。LY-SCI组和LY-SDMCI组在建立缺血模型术前30min,在缺血侧脑室注射10μl LY294002溶液,其他组大鼠麻醉后侧脑室注射10μl生理盐水作为对照。NS-SCI组、NS-SDMCI组、LY-SCI组、LY-SDMCI组缺血2h后恢复灌注时给予给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min:NS-CI组、NS-DMCI组再灌注开始时给予100%氧气,持续30min。4.指标检测:对于神经功能评估,采用Longa的5级4分法,在动物麻醉清醒后24h进行评分并记录神经功能缺失症状;对于脑梗塞体积评估,采用TTC染色法并利用ImageJ软件进行计算;通过计算脑组织干/湿重比值评估大鼠脑水肿程度;对于大鼠大脑组织形态学变化,采用HE染色在光学显微镜下进行观察;对于大鼠神经学习能力的检测,采用Morris水迷宫实验进行测定;对于大鼠血清中的 S100B、Bcl-2、Bax、GSH-PX、Caspase-3 和 SOD 的含量,采用 ELISA试剂盒进行检测;对于大鼠血清中NOS活性和NO含量,采用比色法进行检测;western blot检测脑组织中PI3K/Akt通道相关蛋白的磷酸化水平。5.统计学方法分析:应用SPSS19.0统计学软件对各项检测数据进行数据分析,所有分析数据结果均以均数±标准差（mean±SD）表示,两组间数据分析采用t检验,多组间数据分析采用单因素方差分析（ANOVA）,事后分析采用LSD-t检验,两组间数据采用双变量Pearson进行相关性分析,以P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.七氟烷后处理可以减弱大鼠缺血性脑损伤。各脑缺血组大鼠与Control组相比脑梗死体积、Longa神经缺陷评分和脑含水量均增加（P<0.05）,且DMCI组大鼠的上述指标较CI和DM组大鼠有进一步增加（P<0.05）。七氟烷治疗降低了 SCI和SDMCI组的脑梗死体积、Longa分值和脑含水量（P<0.05）。结果表明七氟烷后处理减弱了 SCI和SDMCI组大鼠的缺血性脑损伤,对神经系统有保护作用。2.七氟烷后处理能改善脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。利用Morris水迷宫来评估大鼠的空间学习和记忆功能,结果显示与Control组相比,其他脑缺血组别的大鼠逃避潜伏期时间明显延长,穿越平台次数显着降低（P<0.05）。而相比于CI和DMCI组,再灌注开始时吸入七氟烷的大鼠（SCI组和SDMCI组）逃避潜伏期时间明显减少,穿越平台次数显着增加（P<0.05）,并且可以在更短的时间内在导航测试中找到平台（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷后处理改善了脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。3.七氟烷后处理减轻了脑缺血糖尿病大鼠的脑组织形态学损伤。HE染色结果显示,对照组的大鼠脑组织由健康神经细胞组成,没有细胞肿胀、膜起泡、核浓缩、破碎溶解。与Control组和DM组相比,CI组的大鼠脑组织切片显示出坏死,神经元丢失,核固缩,神经元收缩和星形细胞肿胀。此外,与CI组相比,DMCI组显示出更严重的损伤。经过七氟烷后处理后,SCI组和SDMCI组的大鼠的组织损伤有明显的改善。4.七氟烷后处理减少脑缺血糖尿病大鼠的氧化应激反应。为了探究七氟烷的神经保护作用是否与其抗氧化特性有关,我们检测了内源性抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性,以及NOS和NO的水平。与Control组相比,CI组的SOD和GSH-PX水平降低（P<0.05）,而DMCI组中二者表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组中SOD和GSH-PX含量明显增加（P<0.05）。七氟烷可以显着增加SCI和SDMCI组的大鼠的SOD和GSH-PX的表达。另一方面,NOS和NO的表达水平在CI组中有所增加（P<0.05）,并在DMCI组中进一步增加（P<0.05）,但经七氟烷后处理二者的表达水平显着降低（P<0.05）,这些结果表明七氟烷可以防御SCI和SDMCI组中大鼠的氧化损伤。5.七氟烷后处理可减弱脑缺血糖尿病大鼠脑组织的细胞凋亡。缺血再灌注后,血清中促凋亡因子Bax和Caspase-3在CI和DMCI组中的表达上调（P<0.05）,但在七氟烷治疗组中表达下调（P<0.05）。另一方面,抗凋亡因子Bcl-2的表达水平在CI组相比于Control组有所降低（P<0.05）,在DMCI组中Bcl-2的表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,七氟烷可以显着提高Bcl-2的表达（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷通过在脑缺血大鼠脑组织中抑制细胞凋亡来减轻缺血性脑损伤。6.七氟烷后处理组大鼠的S100B蛋白水平显着降低。相比与对照组,各脑缺血组大鼠血清中S100B的浓度显着升高（P<0.05）,且DMCI组S100B的含量高于CI组和DM两组（P<0.05）,表明合并糖尿病可以加重大鼠缺血后再灌注造成的脑损伤。经七氟烷吸入治疗后,与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组的S100B水平明显降低（P<0.05）。7.S100B蛋白水平与氧化损伤指标的相关性分析显示:S100B蛋白表达量与Longa神经功能缺陷评分、脑梗死体积、含水量、NOS、NO、Bax和Caspase-3呈正相关（P<0.01）,与SOD、GSH-PX和Bcl-2呈负相关（P<0.01）。说明血清S100B可以作为评价大鼠脑缺血损伤的可靠指标,提示七氟烷后处理可以减轻大鼠脑缺血引起的脑损伤程度。8.七氟烷后处理显着增加PI3K/Akt通道活性。Western blot实验结果显示脑缺血大鼠中PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平与Control组相比明显降低（P<0.05）,DMCI组大鼠p-PI3K、p-Akt的含量低于CI组和DM组（P<0.05）。而与CI和DMCI组相比,用七氟烷后处理后,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比例明显增加（P<0.05）。表明七氟烷可能通过PI3K/Akt信号通道的激活来发挥作用。9.阻断PI3K/Akt信号通道可以减弱七氟烷对氧化应激和凋亡的保护作用。用PI3K/Akt通道抑制剂LY294002注射大鼠,检测血清中氧化应激和细胞凋亡相关因子水平的变化。七氟烷可以使脑缺血和糖尿病合并脑缺血的大鼠血清促凋亡因子Bax、Caspase-3水平降低（P<0.05）,并可以使凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白含量升高（P<0.05）;当同时用LY294002处理大鼠后,七氟烷的作用变得不明显,血清Bax、Caspase-3、Bcl-2的含量与处理前变化不大（P<0.05）。类似地,脑缺血与糖尿病合并脑缺血的大鼠再灌注开始时吸入七氟烷可以改善缺血引起的抗氧化因子SOD和GSH-PX水平下降（P<0.05）,使它们的表达量大幅度升高;且代表氧化程度的NOS和NO水平与未经七氟烷处理的大鼠相比较也有所下降（P<0.05）。而LY294002的引入减弱了七氟烷的这种治疗效果,使血清SOD、GSH-PX、NOS和NO的含量均接近未吸入七氟烷治疗的缺血再灌注大鼠（P<0.05）。说明阻断PI3K/Akt信号通道可以抑制七氟烷的治疗效果,进一步验证了七氟烷是通过激活PI3K/Akt通道发挥保护作用。结论七氟烷后处理可显着改善糖尿病大鼠缺血再灌注时造成的脑损伤并很可能通过激活PI3K/Akt信号通道,抑制脑神经元细胞内的氧化应激反应和细胞凋亡从而发挥对大鼠脑缺血性神经损伤的保护作用。
翁竞玉[8]（2020）在《基于代谢组学研究地菍总黄酮对糖尿病的干预作用》文中提出目的:以昆明种小鼠为研究对象,通过经口染毒的方式考察地菍总黄酮的急性毒性。分别建立1型糖尿病小鼠及2型糖尿病大鼠模型考察地菍总黄酮的抗糖尿病活性,并利用UHPLC/QTOF-MS技术从血清代谢组学方面探讨地菍总黄酮的降血糖机制,为地菍的开发利用和深入研究提供科学依据。方法:（1）地菍总黄酮对小鼠急性毒性的研究:取昆明种小鼠40只,雌雄各半,随机分为随机分为空白雄性组、空白雌性组、给药雄性组、给药雌性组,每组10只。以最大灌胃体积（0.4 m L/10 g）和最大浓度（140 mg/m L）的地菍总黄酮对给药组小鼠24 h内灌胃给药2次,空白组则给予等体积蒸馏水。给药后14 d内观察给药小鼠毒性反应及一般情况变化（体质量、采食量、饮水量）。14 d后将各组小鼠取血后解剖,检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血肌酐（Scr）及血尿素氮（BUN）水平;称量心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏质量,计算脏器指数。（2）地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠血糖的影响及机制研究:取70只雄性昆明种小鼠随机分为空白组（10只）及造模组（60只）。将造模组小鼠禁食不禁水10 h后腹腔注射1%链脲佐菌素溶液（150 mg/kg）,72 h后测定小鼠空腹血糖（FBG）,取FBG>11.1 mmol/L列入1型糖尿病模型动物。将糖尿病小鼠按体重随机分为模型组、地菍总黄酮高剂量组（1.2 g/kg）、地菍总黄酮中剂量组（0.8 g/kg）、地菍总黄酮低剂量组（0.53 g/kg）及二甲双胍组（0.6 g/kg）,每组10只。给药期间记录各组小鼠一般情况及FBG变化,给药21 d后将各组小鼠取血后解剖,检测血清中胰岛素、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、一氧化氮（NO）、BUN、Scr及24 h尿蛋白水平;计算各脏器指数;制作各组小鼠胰腺HE染色切片并观察病理改变。（3）基于代谢组学研究地菍总黄酮对2型糖尿病大鼠的降血糖作用机制:取60只SD大鼠随机分为空白组（10只）及造模组（50只）。造模组大鼠给予高脂高糖饮食42 d后腹腔注射1%链脲佐菌素溶液（30mg/kg）,72 h后测定FBG并取FBG>11.1 mmol/L列入2型糖尿病模型动物。将糖尿病大鼠按体重随机分为模型组、地菍总黄酮高剂量组（0.6g/kg）、地菍总黄酮中剂量组（0.45 g/kg）、地菍总黄酮低剂量组（0.34g/kg）及二甲双胍组（0.25 g/kg）,每组6只。给药期间记录各组大鼠一般情况及FBG变化,给药35 d后各组大鼠经腹主动脉取血后解剖,检测血清中胰岛素、HDL-C、LDL-C、极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）、TC、TG、MDA、SOD、CAT、NO、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、ALT、AST、BUN及Scr水平;计算各脏器指数;制作各组大鼠胰腺HE染色切片并观察病理改变。以0.1%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱,应用超高液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UHPLC/QTOF-MS）对各组大鼠的血浆代谢物信息进行数据采集。运用主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）筛选空白组、模型组与给药组间大鼠血清中显着差异的内源性化合物,并通过数据库构建代谢通路网络阐明地菍总黄酮对2型糖尿病代谢紊乱的调控机制。结果:（1）地菍总黄酮对小鼠急性毒性的研究:给药组小鼠在两次灌胃地菍总黄酮后均未发生死亡及急性中毒症状。给药14 d后,与空白组小鼠相比,给药组小鼠体质量、饮水量、采食量及各脏器系数无显着性差异（P>0.05）;给药组小鼠血清中ALT、AST、BUN及Scr水平无显着性差异（P>0.05）。地菍总黄酮对昆明种小鼠的单日最大给药量为11.2 g/kg提取物（折合原生药33.6 g/kg）,为临床成人用药量的107倍。（2）地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠血糖的影响及机制研究:对各组小鼠的一般情况进行监测后发现,给药7 d后,各给药组与模型组小鼠比较体质量无显着性差异（P>0.05）,地菍总黄酮高剂量组饮水量及采食量减少（P<0.05）;给药14 d后,各给药组与模型组小鼠比较体质量降低（P<0.01）,各给药组小鼠饮水量减少（P<0.05）,地菍总黄酮高剂量组及二甲双胍组小鼠采食量较模型组减少（P<0.05）;给药21 d后,与模型组小鼠比较地菍总黄酮中剂量组与地菍总黄酮低剂量组小鼠体质量降低（P<0.05）,各给药组小鼠饮水量及采食量减少（P<0.05或P<0.01）。对小鼠的FBG值进行监测后发现,给药1 d后,各给药组小鼠FBG较模型组无显着性差异（P>0.05）;给药10 d后,地菍总黄酮高剂量组、地菍总黄酮中剂量组及二甲双胍组小鼠FBG值降低（P<0.05或P<0.01）;给药20 d后,各给药组小鼠FBG值均降低（P<0.05或P<0.01）。在口服糖耐量实验中,0-2 h内各给药组与模型组小鼠比较血糖值降低（P<0.05或P<0.01）;各给药组小鼠口服糖耐量曲线下面积（AUC）均减小（P<0.05或P<0.01）。在血清生化检测中,模型组与空白组小鼠相比胰岛素水平降低（P<0.01）,各给药组与模型组小鼠相比血清胰岛素水平无差异（P>0.05）;地菍总黄酮高剂量组与模型组小鼠相比TG水平降低（P<0.05）;地菍总黄酮高剂量组与地菍总黄酮中剂量组小鼠HDL-C水平增高（P<0.05）;地菍总黄酮高剂量组与二甲双胍组小鼠LDL-C水平降低（P<0.05）;地菍总黄酮高剂量组与地菍总黄酮中剂量组小鼠SOD水平升高（P<0.05）;各给药组小鼠MDA含量均减低（P<0.05或P<0.01）;地菍总黄酮高剂量组、地菍总黄酮中剂量与二甲双胍组小鼠CAT水平升高（P<0.05或P<0.01）;各给药组小鼠NO水平无差异（P>0.05）;地菍总黄酮高剂量组、地菍总黄酮中剂量组与地菍总黄酮低剂量组小鼠Scr含量升高（P<0.05或P<0.01）;地菍总黄酮高剂量组、地菍总黄酮中剂量组与二甲双胍组小鼠BUN含量升高（P<0.05或P<0.01）。给药20 d后,各给药组与模型组小鼠比较尿蛋白含量均无显着性差异（P>0.05）。病理学观察结果显示各给药组小鼠胰岛因链脲佐菌素破坏呈现空泡,但病变程度略轻于模型组。（3）基于代谢组学研究地菍总黄酮对2型糖尿病大鼠的降血糖作用机制:对各组大鼠的一般情况进行监测后发现,给药7 d后各给药组大鼠体质量与模型组相比无显着性差异（P>0.05）;给药14 d后,二甲双胍组大鼠体质量增高（P<0.05）;给药21 d后,地菍总黄酮高剂量组、地菍总黄酮中剂量组及二甲双胍组大鼠体质量增高（P<0.05或P<0.01）;给药28 d及以后,各给药组大鼠体质量均高于模型组（P<0.05或P<0.01）。对各组大鼠的FBG进行监测后发现,给药前各给药组大鼠FBG较模型组无显着性差异（P>0.05）;给药14 d后地菍总黄酮中剂量组及二甲双胍组大鼠FBG显着性降低（P<0.05）;给药第21 d及35 d,各给药组大鼠FBG较模型组均降低（P<0.05或P<0.01）。在口服糖耐量实验中,与模型组大鼠比较,各给药组血糖在0-2 h下降（P<0.05或P<0.01）;各给药组大鼠AUC均降低（P<0.01）。在血清生化检测中,模型组大鼠与空白组相比胰岛素水平增高（P<0.01）,地菍总黄酮高剂量组、地菍总黄酮中剂量组及二甲双胍组与模型组大鼠相比胰岛素水平降低（P<0.05或P<0.01）;各给药组大鼠与模型组比较TG、TC、LDL-C及VLDL-C水平下降,HDL-C水平极上升（P<0.05或P<0.01）;各给药组大鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT水平升高（P<0.01）,MDA水平降低（P<0.01）;地菍总黄酮高剂量组、地菍总黄酮中剂量组大鼠NO水平降低（P<0.05）;各给药组大鼠BUN、ALT及AST水平降低（P<0.05或P<0.01）。病理学观察结果显示各给药组大鼠胰岛病变程度轻于模型组。代谢组学共筛选出17种潜在的生物标记物,包括牛磺酸,烟酸,胆酸,磷酸羟基丙酮酸,马尿酸,花生四烯酸,酪氨酸,苯丙氨酸,葡糖醛酸,PGE2,肉碱,磷脂酰胆碱（PC）,磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）。涉及通路包括苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成通路、甘油磷脂代谢通路、花生四烯酸代谢通路、牛磺酸和牛磺酸的代谢通路、胆汁酸的生物合成通路及烟酸和烟酰胺代谢通路。结论:地菍总黄酮最大给药量为11.2 g/kg,未发现对重要器官产生靶毒性,安全性较高。地菍总黄酮能够降低1型糖尿病小鼠及2型糖尿病大鼠血糖,改善血脂及氧化应激紊乱,缓解糖尿病病程发展引起的肝肾功能损伤及胰腺病理损伤,提示地菍总黄酮具有良好的抗糖尿病活性。代谢组学研究结果表明苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成通路、甘油磷脂代谢通路、花生四烯酸代谢通路、牛磺酸和牛磺酸的代谢通路、胆汁酸的生物合成通路及烟酸和烟酰胺代谢通路可能是地菍总黄酮发挥抗糖尿病药理活性的主要作用途径。
曹乃龙[9]（2020）在《神经源性尿道功能损害的5-羟色胺治疗靶点与一氧化氮机制研究》文中研究指明背景和目的大多数腰骶髓节段以上的急性脊髓损伤和糖尿病引起的慢性神经损伤,都能干扰正常的排尿神经控制导致神经源性的膀胱和尿道功能损害。前期研究发现静脉给予5-羟色胺2A和2C受体激动剂DOI可能通过加强脊髓损伤和糖尿病大鼠尿道外括约肌活动进而提高排尿效率,但药物作用的具体靶点还需要进一步明确。此外,利用低剂量胰岛素建立一种新型糖尿病大鼠动物模型,进一步探讨一氧化氮介导尿道松弛机制在糖尿病尿道功能损害中的作用。方法建立脊髓损伤大鼠模型,8周后在大鼠腰骶髓髓腔内给予不同浓度的DOI后检测尿动力学参数改变,并取大鼠腰骶髓切片组织行免疫组化和Western Blot检测。建立I型糖尿病大鼠模型,8周后取糖尿病大鼠腰骶髓切片组织行免疫组化和Western Blot检测,并取膀胱和尿道组织做5-羟色胺亚神经元的免疫组化染色。使用低剂量胰岛素（～2u,24h）将I型糖尿病大鼠血糖控制在200-300mg/d L,即为造模成功。第一步:检测不同时间点糖尿病大鼠尿道功能改变。第二步:分成正常大鼠（A组）、8周胰岛素治疗的糖尿病大鼠（B组）和8周糖尿病大鼠（C组）三组,静脉给予L-精氨酸（100mg/kg）和N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME,50mg/kg）检测给药前后尿道压改变。体外实验记录给予L-NAME前后尿道松弛幅度改变。结果腰骶髓髓腔内给予DOI可以加强尿道外括约肌活动,提高脊髓损伤大鼠的排尿效率。免疫荧光和Western Blot发现脊髓损伤大鼠腰骶髓运动神经元中5-羟色胺2A和2C受体数量明显增多。免疫荧光和Western Blot发现8周糖尿病大鼠腰骶髓运动神经元中5-羟色胺2A和2C受体明显增多、尿道5-羟色胺亚神经元的数量明显减少。低剂量胰岛素可以改善8周糖尿病大鼠的尿道松弛功能障碍。静脉给予L-精氨酸后,A组和B组的尿道压最低点明显降低,C组未见明显变化。静脉给予L-NAME后,三组尿道压变化值都明显减小,而给药前后尿道压松弛幅度差值C组小于其它两组。体外浴漕实验发现,给予L-NAME前后电刺激诱导的尿道松弛幅度差值和给予L-NAME前尿道松弛幅度的比值,C组明显低于其它两组。结论DOI可以改善脊髓损伤和糖尿病大鼠的排尿功能障碍,推测药物作用的靶点位于腰骶髓运动神经元,即DOI和腰骶髓增多的5-羟色胺2A和2C受体发生特异性结合,通过加强大鼠尿道外括约肌的活动进而提高排尿效率。低剂量胰岛素治疗的糖尿病大鼠模型可以用于模拟自然病程下糖尿病病人的排尿功能障碍,而一氧化氮介导尿道松弛机制损害在8周糖尿病大鼠尿道平滑肌功能障碍中起重要作用。
余哲[10]（2020）在《S100A1基因治疗改善糖尿病大鼠勃起功能及其机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分糖尿病ED大鼠模型的建立及基因表达谱初筛【目的】建立糖尿病ED大鼠模型,筛选其与正常大鼠阴茎海绵体组织中差异表达的血管新生相关基因。【方法】采用腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型,8周后对存活的大鼠进行阿扑吗啡（APO）筛选。出现明显勃起的大鼠标记为APO-positive大鼠;反之为APO-negative大鼠。随后采用电刺激海绵体神经法检测各组大鼠海绵体内压,定量评估勃起功能。收集阴茎海绵体组织标本,用免疫组化、免疫荧光、western blot等方法检测相关蛋白的表达。提取阴茎海绵体组织RNA,采用Affymetrix Rat Gene 2.0ST芯片,对已知的22000个基因进行检测。通过比较正常对照大鼠、APO-positive大鼠和APO-negative大鼠阴茎组织m RNA的表达谱,筛选并验证差异表达的血管新生相关基因。【结果】与正常对照组相比,糖尿病大鼠的勃起功能显着下降,但APO-negative大鼠勃起功能受损更加严重。与APO-positive大鼠相比,APO-negative大鼠阴茎组织中晚期糖基化终产物（AGEs）及其受体RAGE表达增高,丙二醛（MDA）水平升高而超氧化物歧化酶（SOD）降低,内皮细胞凋亡比例升高,内皮型一氧化氮合酶（e NOS）及其磷酸化蛋白p-e NOSSer1177表达降低,一氧化氮（NO）及环磷酸鸟苷（c GMP）含量降低。在正常对照大鼠、APO-positive大鼠、APO-negative大鼠中呈逐步下调表达的血管新生基因有7个,逐步上调表达的基因共1个。在m RNA和蛋白水平对阴茎中S100A1的表达进行验证,结果与芯片一致。体外实验中,原代大鼠主动脉内皮细胞受高糖刺激后,S100A1的表达水平明显下调。【结论】糖尿病大鼠成模后,有必要进一步进行APO筛选ED。阴茎组织中S100A1的低表达可能在糖尿病ED的发生发展中起重要作用。第二部分S100A1对糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及机制研究【目的】探讨过表达S100A1可否改善糖尿病ED大鼠勃起功能的影响及机制。【方法】以腺病毒（ad）为载体,构建过表达病毒ad-S100A1及其对照病毒ad-GFP,转染原代大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）。RAECs在高糖30 m M环境下培养2天后,加入细胞内吞抑制剂dynasore,第3天收集细胞。以腺相关病毒（AAV）为载体,构建过表达病毒AAV-S100A1其对照病毒AAV-GFP。链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠成模后,利用阿扑吗啡实验筛选ED大鼠。采用阴茎海绵体内局部注射的方法,以1010 parts/70μl AAV-S100A1或AAV-GFP的剂量治疗糖尿病ED大鼠。2周后采用电刺激海绵体神经法检测各组大鼠海绵体内压,定量评估勃起功能,采用免疫荧光、western blot等方法检测RAECs及阴茎海绵体组织中相关蛋白的表达及定位。【结果】成功构建了腺病毒介导的过表达病毒ad-S100A1,转染进入RAECs后,S100A1基因的m RNA和蛋白水平均显着升高。过表达S100A1的RAECs中,血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）活化,蛋白激酶B（Akt）-内皮型一氧化氮合酶（e NOS）通路上调。S100A1对VEGFR2、Akt的激活作用可被dynasore完全抵消,但e NOS的活化水平仍高于对照组。免疫荧光双标法证明S100A1与e NOS在RAECs中存在共定位现象,且不受dynasore影响。此外,过表达S100A1的RAECs中凋亡相关蛋白表达下调。糖尿病ED大鼠接受AAV-S100A1基因治疗后,勃起功能明显改善,阴茎海绵体组织中VEGFR2-Akt-e NOS通路上调,内皮含量增加,一氧化氮（NO）、环磷酸鸟苷（c GMP）含量增多。【结论】过表达S100A1可能通过激活VEGFR2-Akt-e NOS通路或与e NOS的直接作用,促血管新生,改善糖尿病相关性内皮功能障碍;S100A1还具有抗凋亡作用,保护阴茎海绵体内皮含量,从而改善糖尿病ED大鼠的勃起功能。
二、糖尿病大鼠血清一氧化氮浓度的变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、糖尿病大鼠血清一氧化氮浓度的变化（论文提纲范文）
（1）基于代谢组学的刺五加叶治疗缺血性脑卒中作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 缺血性脑卒中 |
| 1.1.1 缺血性脑卒中概述 |
| 1.1.2 缺血性脑卒中发病机制及主要病理环节 |
| 1.1.3 缺血性脑卒中与肠道菌群的关系 |
| 1.1.4 缺血性脑卒中常用药物 |
| 1.2 刺五加叶主要化学成分及药理作用 |
| 1.2.1 刺五加叶概述 |
| 1.2.2 刺五加叶主要化学成分 |
| 1.2.3 刺五加叶主要药理作用 |
| 1.3 代谢组学 |
| 1.3.1 代谢组学概述 |
| 1.3.2 代谢组学研究方法 |
| 1.3.3 脂质组学研究方法 |
| 1.3.4 代谢组学在缺血性脑卒中研究中的应用 |
| 1.3.5 基于高效同位素标记衍生化的代谢组学研究 |
| 1.4 本论文的研究思路、研究目的及意义 |
| 1.4.1 研究思路 |
| 1.4.2 研究目的及意义 |
| 第2章 刺五加叶治疗缺血性脑卒中的血清脂质组学及其神经保护作用研究 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 药品、试剂及仪器 |
| 2.1.2 刺五加叶主要活性组分的制备及成分分析 |
| 2.1.3 缺血性脑卒中大鼠模型建立 |
| 2.1.4 样品采集及处理 |
| 2.1.5 组织病理学检查 |
| 2.1.6 血清脂质代谢轮廓采集 |
| 2.1.7 数据分析 |
| 2.1.8 基于UPLC-TQ/MS的神经递质定量分析 |
| 2.1.9 基于UPLC-TQ/MS的神经递质定量分析方法学考察 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 刺五加叶主要活性组分成分分析 |
| 2.2.2 组织病理学检查 |
| 2.2.3 血清脂质组学代谢轮廓分析 |
| 2.2.4 血清脂质组学潜在的生物标记物鉴定 |
| 2.2.5 血清脂质组学通路分析 |
| 2.2.6 神经递质定量研究 |
| 2.2.7 炎症因子和氧化应激水平研究 |
| 2.3 小结 |
| 第3 章 刺五加叶治疗缺血性脑卒中粪便代谢组学研究及其对微生物-肠-脑轴的影响 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 药品、试剂及仪器 |
| 3.1.2 缺血性脑卒中大鼠模型建立 |
| 3.1.3 样品采集及处理 |
| 3.1.4 粪便代谢轮廓采集 |
| 3.1.5 数据分析 |
| 3.1.6 基于UPLC-TQ/MS的大鼠粪便胆汁酸定量分析 |
| 3.1.7 粪便菌群的16S r RNA测序 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 粪便非靶向代谢组学代谢轮廓分析 |
| 3.2.2 粪便非靶向代谢组学潜在的生物标记物鉴定 |
| 3.2.3 粪便非靶向代谢组学通路分析 |
| 3.2.4 基于靶向代谢组学的大鼠粪便胆汁酸的定量研究 |
| 3.2.5 刺五加叶对大鼠粪便菌群组成的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 刺五加叶通过对益生菌的调节作用治疗缺血性脑卒中的机制验证 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 药品、试剂及仪器 |
| 4.1.2 菌群培养及菌液制备 |
| 4.1.3 缺血性脑卒中大鼠模型建立 |
| 4.1.4 样品采集及处理 |
| 4.1.5 粪便菌群的16S r RNA测序 |
| 4.1.6 大鼠脑组织中神经递质的含量测定 |
| 4.1.7 炎症因子及氧化应激等生化指标检测 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 益生菌对缺血性脑卒中大鼠粪便菌群组成的影响 |
| 4.2.2 益生菌对缺血性脑卒中大鼠脑组织中神经递质水平的影响 |
| 4.2.3 益生菌对缺血性脑卒中大鼠脑组织及血清炎症因子和氧化应激水平的影响 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 刺五加叶治疗缺血性脑卒中的尿液代谢组学研究 |
| 5.1 实验部分 |
| 5.1.1 药品、试剂及仪器 |
| 5.1.2 缺血性脑卒中大鼠模型建立 |
| 5.1.3 样品采集及处理 |
| 5.1.4 尿液代谢轮廓采集 |
| 5.1.5 数据分析 |
| 5.1.6 ELISA法对通路分析进行验证 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 尿液非靶向代谢组学代谢轮廓分析 |
| 5.2.2 尿液非靶向代谢组学潜在的生物标记物鉴定 |
| 5.2.3 尿液非靶向代谢组学通路分析 |
| 5.2.4 刺五加叶治疗缺血性脑卒中对体内代谢通路的影响验证 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 基于高效同位素标记衍生化的刺五加叶治疗缺血性脑卒中尿液代谢组学研究 |
| 6.1 实验部分 |
| 6.1.1 药品、试剂及仪器 |
| 6.1.2 缺血性脑卒中大鼠模型建立 |
| 6.1.3 样品采集及处理 |
| 6.1.4 尿液样本同位素标记衍生化 |
| 6.1.5 尿液代谢轮廓采集 |
| 6.1.6 数据分析 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 尿液高效同位素标记衍生化代谢组学代谢轮廓分析 |
| 6.2.2 尿液高效同位素标记衍生化代谢组学潜在的生物标记物鉴定 |
| 6.2.3 尿液高效同位素标记衍生化代谢组学结果的科学解释 |
| 6.3 小结 |
| 第7章 结论 |
| 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）miR-489调控心肌纤维化的机制及人参皂苷Re的干预作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 心肌纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 人参皂苷Re药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 研究一 miR-489调节心肌纤维化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 CFs形态学观察与纯度检测 |
| 2 过表达miR-489抑制CFs分化和分泌 |
| 3 过表达miR-489抑制myd88/NF-κB通路的活化 |
| 4 抑制miR-489促进CFs分化和分泌 |
| 5 抑制miR-489促进myd88/NF-κB通路活化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究二 人参皂苷Re调节心肌梗死后心肌纤维化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 人参皂苷Re改善AMI后心脏功能 |
| 2 人参皂苷Re抑制AMI后心肌代偿性肥厚 |
| 3 人参皂苷Re减轻AMI后心肌损伤 |
| 4 人参皂苷Re改善AMI后心脏组织病理学改变 |
| 5 人参皂苷Re抑制AMI后纤维化相关蛋白的表达 |
| 6 人参皂苷R调控AMI后miR-489和myd88 mRNA的表达 |
| 7 人参皂苷Re抑制AMI诱导的myd88/NF-κB通路活化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究三 人参皂苷Re干预AngⅡ诱导CFs生物学行为改变的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 人参皂苷Re干预CFs的浓度筛选 |
| 2 人参皂苷Re抑制AngⅡ诱导的CFs分化 |
| 3 人参皂苷Re抑制AngⅡ诱导的CFs迁移 |
| 4 人参皂苷R抑制AngⅡ诱导的CFs中胶原蛋白的表达 |
| 5 人参皂苷Re抑制AngⅡ诱导的CFs中myd88/NF-κB通路活化 |
| 6 人参皂苷Re调节CFs中miR-489和myd88 mRNA的表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究结语 |
| 创新点 |
| 基金项目 |
| 主要仪器设备 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（3）人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 人乳牙牙髓干细胞经不同输注途径治疗糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分 人乳牙牙髓干细胞治疗不同血糖水平糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第三部分 人乳牙牙髓干细胞治疗糖尿病大鼠机制初探 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第四部分 SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗1型糖尿病的机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）灯盏乙素抑制海马神经元细胞凋亡减轻2型糖尿病认知功能障碍的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物来源 |
| 1.3 主要仪器及来源 |
| 1.4 主要试剂名称及来源 |
| 1.5 抗体信息及工作浓度表 |
| 2 方法 |
| 2.1 药品与主要试剂的配制 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 分组与模型制备 |
| 2.4 口服葡萄糖耐量实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT) |
| 2.5 行为学实验 |
| 2.5.1 Morris水迷宫(Morris water maze,MWM) |
| 2.5.2 旷场实验(Open field test,OFT) |
| 2.6 灌注取材及标本制备 |
| 2.7 大鼠生化指标检测 |
| 2.7.1 酶联免疫法(ELISA)测定血清胰岛素(INS)、活性氧簇(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的浓度 |
| 2.7.2 赖氏微板法测定血清丙氨酸转移酶(ALT)的浓度 |
| 2.7.3 赖氏比色法测定血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度 |
| 2.7.4 COD-PAP单试剂微板法测定血清总胆固醇(TC)的浓度 |
| 2.7.5 乙酰丙酮微板法测定血清甘油三酯(TG)的浓度 |
| 2.7.6 TBA微板法测定丙二醛(MDA)的浓度 |
| 2.7.7 DTNB速率微板法测定还原型谷胱甘肽(GSH)的浓度 |
| 2.7.8 钼酸铵微板法测定过氧化氢酶(CAT)的浓度 |
| 2.8 石蜡包埋切片 |
| 2.9 苏木素-伊红(HE)染色 |
| 2.10 尼氏染色(Nissl染色、亚甲蓝法) |
| 2.11 TUNEL染色 |
| 2.12 免疫组织化学染色 |
| 2.13 Western blotting检测蛋白质的表达 |
| 2.13.1 海马总蛋白的制备 |
| 2.13.2 海马蛋白质定量 |
| 2.13.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.13.4 转膜 |
| 2.13.5 酶联免疫反应 |
| 2.13.6 化学发光 |
| 2.13.7 结果分析 |
| 二、结果 |
| 1 形态学观察 |
| 1.1 大鼠大体形态学观察 |
| 1.2 根据HE染色结果评估糖尿病模型建立后神经元细胞情况 |
| 2 Scu对糖尿病大鼠学习记忆及探究行为的影响 |
| 2.1 大鼠水迷宫行为学观察 |
| 2.1.1 定位航行实验各组游泳轨迹和逃避潜伏期、总路程变化 |
| 2.1.2 空间探索实验中各组游泳轨迹和穿越平台次数等指标变化 |
| 2.2 大鼠旷场实验行为学观察 |
| 3 大鼠8W体重变化趋势分析 |
| 4 大鼠空腹血糖(FBG)、口服葡萄糖耐量实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT) |
| 4.1 大鼠空腹血糖(FBG)变化 |
| 4.2 口服葡萄糖耐量实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT) |
| 5 血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感性指数(ISI) |
| 6 血清学指标 |
| 6.1 Scu降低DACD大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量 |
| 6.2 Scu降低DACD大鼠血清总胆固醇(TC)和血清甘油三酯(TG)浓度 |
| 6.3 大鼠氧化应激代谢指标的测定 |
| 6.3.1 SCU降低DACD大鼠血清和海马组织匀浆中活性氧（ROS)含量 |
| 6.3.2 Scu降低DACD大鼠血清和海马组织匀浆中丙二醛（MDA)含量 |
| 6.4 大鼠抗氧化应激代谢指标的测定 |
| 6.4.1 SCU上调DACD大鼠血清和海马组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD)活力 |
| 6.4.2 Scu上调DACD大鼠血清和海马组织匀浆中还原型谷胱甘肽（GSH)含量 |
| 6.4.3 Scu上调DACD大鼠血清和海马组织匀浆中过氧化氢酶（CAT)含量 |
| 6.5 大鼠炎性因子的测定 |
| 6.5.1 Scu下调DACD大鼠血清和海马组织匀浆中肿瘤坏死因子（TNF-α)含量 |
| 6.5.2 Scu下调DACD大鼠血清和海马组织匀浆中白细胞介素1β(IL-1β)含量 |
| 6.5.3 Scu下调DACD大鼠血清和海马组织匀浆中白细胞介素6 (IL-6)含量 |
| 7 海马HE染色 |
| 8 海马组织尼氏染色 |
| 9 海马TUNEL染色 |
| 10 大鼠海马中Scu对BDNF/TrkB和PI3K/Akt/CREB信号通路及细胞凋亡相关因子的影响 |
| 10.1 Scu上调DACD大鼠海马中BDNF、TrkB蛋白表达 |
| 10.1.1 Scu上调DACD大鼠CA1区中BDNF蛋白表达 |
| 10.1.2 Scu上调DACD大鼠CAl区中TrkB、p-TrkB蛋白表达 |
| 10.2 Scu上调DACD大鼠海马中PI3K、Akt和CREB蛋白表达 |
| 10.2.1 Scu上调DACD大鼠CA1区中PI3K、p-PI3K蛋白表达 |
| 10.2.2 Scu上调DACD大鼠CA1区中Akt、p-Akt Thr308、p-Akt Ser473蛋白表达 |
| 10.2.3 Scu上调DACD大鼠海马中CREB、p-CREB蛋白表达 |
| 10.3 大鼠海马中细胞凋亡相关因子表达 |
| 10.3.1 Scu下调DACD大鼠海马中Procaspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白表达 |
| 10.3.2 Scu下调DACD大鼠海马中Procaspase-8、Cleaved-Caspase-8蛋白表达 |
| 10.3.3 Scu下调DACD大鼠海马中Procaspase-9、Cleaved-Caspase-9蛋白表达 |
| 10.3.4 Scu下调DACD大鼠海马中Procaspase-12蛋白表达 |
| 10.3.5 Scu下调DACD大鼠海马中Bax蛋白表达、上调DACD大鼠CA1区中Bcl-2蛋白表达 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 灯盏乙素缓解神经退行性疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）小分子IR-61改善STZ诱导的糖尿病大鼠排尿功能的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 IR-61 在糖尿病大鼠器官、膀胱组织及亚细胞的分布研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 IR-61 改善糖尿病大鼠排尿功能以及膀胱平滑肌组织损伤的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 IR-61 对糖尿病环境下BSMCs保护作用的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 糖尿病膀胱功能障碍的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（6）卡托普利通过抑制氧化损伤和血脂异常治疗糖尿病视网膜病变（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 早产儿视网膜病变的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English Paper One |
| English Paper Two |
（8）基于代谢组学研究地菍总黄酮对糖尿病的干预作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 地菍总黄酮对小鼠急性毒性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药材的鉴定 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 地菍总黄酮的提取纯化 |
| 2.2 地菍总黄酮含量测定 |
| 2.3 地菍总黄酮的最大给药量测定 |
| 2.4 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 地菍总黄酮含量测定结果 |
| 3.2 地菍总黄酮的最大给药量测定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二部分 地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠血糖的影响及机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验药物的配制 |
| 2.2 1型糖尿病小鼠模型的建立 |
| 2.3 分组及给药方法 |
| 2.4 样品的采集与处理 |
| 2.5 指标检测 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠一般状态的影响 |
| 3.2 地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠糖代谢的影响 |
| 3.3 地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠血脂的影响 |
| 3.4 地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠氧化应激的影响 |
| 3.5 地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠肾功能的影响 |
| 3.6 地菍总黄酮对1型糖尿病小鼠脏器系数的影响 |
| 3.7 小鼠胰腺组织病理学的观察 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三部分 基于代谢组学研究地菍总黄酮对2型糖尿病大鼠的降血糖作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验药品的配制 |
| 2.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 |
| 2.3 分组及给药方法 |
| 2.4 样品的采集与处理 |
| 2.5 生化指标及胰腺组织病理学切片的检测 |
| 2.6 代谢组学检测 |
| 2.7 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 生化指标的检测结果 |
| 3.2 大鼠胰腺组织病理学的观察 |
| 3.3 代谢组学多元统计分析 |
| 3.4 生物标记物的鉴定与分析 |
| 3.5 代谢通路分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 结论 |
| 结语和展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 天然黄酮类化合物防治糖尿病肾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（9）神经源性尿道功能损害的5-羟色胺治疗靶点与一氧化氮机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写词表 |
| 绪论 |
| 1 脊髓损伤导致排尿功能障碍的研究进展以及5-羟色胺的治疗作用 |
| 2 糖尿病导致排尿功能障碍的研究进展以及5-羟色胺的治疗作用 |
| 3 糖尿病导致尿道功能损害的研究进展以及一氧化氮机制改变 |
| 第一部分 5-羟色胺2A/2C受体激动剂DOI改善脊髓损伤大鼠排尿功能障碍的作用及机制研究 |
| 1.研究的理论基础 |
| 1.1 脊髓损伤引起神经可塑性改变理论 |
| 1.2 药物-靶点结合理论(药物-受体特异性结合理论) |
| 1.3 神经-肌肉靶向调控理论 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 脊髓损伤大鼠模型的建造 |
| 2.2.2 髓腔内置管 |
| 2.2.3 膀胱内置管 |
| 2.2.4 髓腔内给药记录尿动力学参数改变 |
| 2.2.5 腰骶髓运动神经元中5-羟色胺2A和2C受体免疫荧光染色 |
| 2.2.6 腰骶髓腹侧角5-羟色胺2A和2C受体的Western Blot检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 脊髓损伤大鼠膀胱组织学改变 |
| 3.2 腰骶髓髓腔内给药后尿动力参数改变 |
| 3.3 免疫荧光和Western Blot检测结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 5-羟色胺2A/2C受体激动剂DOI改善糖尿病大鼠排尿功能障碍的作用及其机制研究 |
| 1.研究的理论基础 |
| 1.1 糖尿病引起神经可塑性改变理论 |
| 1.2 5-HT类物质在糖尿病及其相关并发症中的作用及其机制 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 糖尿病大鼠膀胱和尿道组织学染色 |
| 2.2.2 腰骶髓运动神经元中5-羟色胺2A和2C受体免疫荧光检测 |
| 2.2.3 腰骶髓运动神经元中5-羟色胺2A和2C受体的Western blot检测 |
| 2.2.4 膀胱和尿道5-羟色胺亚神经元的免疫荧光检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 糖尿病导致膀胱和尿道的组织学改变 |
| 3.2 糖尿病大鼠腰骶髓运动神经元中5-羟色胺受体数量改变 |
| 3.3 糖尿病大鼠尿道的5-羟色胺亚神经元数量改变 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 低剂量胰岛素治疗糖尿病大鼠尿道功能损害和一氧化氮机制改变 |
| 1.研究的理论基础 |
| 1.1 高血糖诱导渗透性利尿 |
| 1.2 糖尿病诱导氧化应激损害 |
| 1.3 糖尿病导致下尿路平滑肌的收缩和松弛机制改变 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 代谢笼检测 |
| 2.2.2 膀胱等容收缩条件下的尿道灌注压检测 |
| 2.2.3 浴漕实验检测尿道肌肉特性 |
| 2.2.4 静脉给予L-精氨酸和L-NAME后尿道灌注压检测 |
| 2.2.5 给予L-NAME前后体外浴漕实验检测尿道肌肉特性 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 不同糖尿病病程大鼠排尿参数的改变 |
| 3.2 不同糖尿病病程大鼠尿道灌注压参数的改变 |
| 3.3 不同糖尿病病程大鼠尿道对EFS和 KCL收缩反应特性改变 |
| 3.4 静脉给予L-精氨酸和L-NAME后大鼠尿道灌注压改变 |
| 3.5 给予L-NAME前后电场力诱导大鼠尿道肌肉松弛幅度改变 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（10）S100A1基因治疗改善糖尿病大鼠勃起功能及其机制研究（论文提纲范文）
| 博士学位论文主要研究成果的发表或获奖情况 |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 糖尿病ED大鼠模型的建立及基因表达谱初筛 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 S100A1对糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 糖尿病勃起功能障碍的基因治疗进展 |
| 参考文献 |
| 附录 在校期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
四、糖尿病大鼠血清一氧化氮浓度的变化（论文参考文献）
- [1]基于代谢组学的刺五加叶治疗缺血性脑卒中作用机制研究[D]. 汪戎锦. 吉林大学, 2021(01)
- [2]miR-489调控心肌纤维化的机制及人参皂苷Re的干预作用研究[D]. 孙敬辉. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究[D]. 谢俊豪. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]灯盏乙素抑制海马神经元细胞凋亡减轻2型糖尿病认知功能障碍的机制研究[D]. 崔恩宁. 昆明医科大学, 2021(02)
- [5]小分子IR-61改善STZ诱导的糖尿病大鼠排尿功能的实验研究[D]. 王建武. 重庆医科大学, 2021(01)
- [6]卡托普利通过抑制氧化损伤和血脂异常治疗糖尿病视网膜病变[D]. 高翔. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究[D]. 张华朋. 山东大学, 2020(10)
- [8]基于代谢组学研究地菍总黄酮对糖尿病的干预作用[D]. 翁竞玉. 广西中医药大学, 2020
- [9]神经源性尿道功能损害的5-羟色胺治疗靶点与一氧化氮机制研究[D]. 曹乃龙. 上海交通大学, 2020
- [10]S100A1基因治疗改善糖尿病大鼠勃起功能及其机制研究[D]. 余哲. 华中科技大学, 2020(02)