一、禽轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文文献综述）
赵伟[1]（2021）在《鸡星状病毒的分离鉴定及其单克隆抗体的制备》文中认为近年来,鸡星状病毒（Chicken Astrovirus,CAstV）的感染在国内外十分普遍,其引发的雏鸡肠炎、肾炎和发育迟缓等疾病对养禽业造成了一定危害。20世纪90年代,研究人员在鸡的粪便中发现和星状病毒类似的病毒颗粒,随后在南非、美国和尼日利亚等国家,研究人员相继发现CAstV的感染情况。虽然国内已经有了一些关于鸡星状病毒的流行情况的调查,但有关国内CAstV流行株的研究仍然较少。本研究对江苏部分地区鸡星状病毒的感染情况进行流行病学调查分析,了解主要国内流行株类型及其分布特征,并使用鸡胚和LMH细胞成功分离了一株鸡星状病毒,命名为CAstV/CZ1801,同时对其进行了全基因序列测定,并分析其遗传进化关系及生物学信息特征。为了了解CAstV分离毒株的致病性,进行了 CAstV的动物攻毒实验;并且通过杆状病毒表达系统表达了鸡星状病毒的衣壳蛋白,以此为免疫原制备了抗鸡星状病毒衣壳蛋白的单克隆抗体,为后续衣壳蛋白生物学特性的研究以及鸡星状病毒检测方法奠定了基础。1.鸡星状病毒的流行病学调查及病毒分离鉴定本研究从江苏部分地区养殖场采集了 98份雏鸡肠道样本,利用分子生物学方法进行了 CAstV感染情况的调查。结果显示总阳性率高达69%,测序结果显示被检样品均为Ⅱ型CAstV。使用鸡胚和LMH细胞成功分离了一株鸡星状病毒,命名为CAstV/CZ1801,同时对其进行了全基因测序测定,并分析了病毒遗传进化关系及生物学信息特征。结果显示此分离株具有典型的星状病毒基因组的结构特征,与本实验室前期分离的CAstV/NJ1701以及其他两株中国星状病毒分离株CAstV/GDYHTJ和CAstV/HBLP具有较高的同源性（97.5%-98.7%）,属同一分支。与GenBank其它已公布的序列比对结果显示,CAstV/CZ1801株的ORF1a和ORF1b氨基酸序列同源性分别为86.4%～87.0%和77.9%～86.9%;ORF2的氨基酸同源性差异明显,在38.8%～95.9%之间,属于Bi族CAstV。2.鸡星状病毒的致病性实验将实验室分离鉴定的两株鸡星状病毒分离株CAstV/CZ1801 和CAstV/NJ1701通过口服和腹腔注射接种1日龄SPF雏鸡。通过观察其生长发育状态,评价其血清抗体水平,检测其排毒情况和病毒在体内不同器官的复制水平,来评价鸡星状病毒的致病性。结果显示,CAstV/NJ1701攻毒组可引起雏鸡明显的生长抑制,而另一组生长状态无异常;在攻毒14天开始产生抗体,21天达到较高水平;在攻毒后首日其排毒量最高,而后排毒量呈波动下降趋势;不同日龄的各器官病毒载量检测结果显示,病毒首先在肠道组织中表现出较高的分布水平,而在攻毒后的3-7天,在肾脏组织中分布水平最高,在攻毒14天以后,病毒主要存在于腺胃组织中,在其他组织中基本检测不到病毒的分布。两组攻毒组雏鸡经解剖,均未见肉眼可见的器官病理变化。3.鸡星状病毒单克隆抗体的制备本研究将鸡星状病毒衣壳蛋白基因克隆到杆状病毒真核表达体质粒中,转座后获得了重组杆状质粒Bacmid-CAstV-Cap,转染至Sf9细胞获得重组杆状病毒rBacmid-CAstV-Cap,成功表达出Ⅱ型CAstV衣壳蛋白,以小鼠多抗血清为一抗,经间接免疫荧光和Western Blot验证,所表达的蛋白具有良好的反应原性。并以此为免疫原免疫小鼠,经细胞融合后筛选出4株能够稳定分泌CAstV衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,均可与天然病毒进行反应,命名为CAstV-Cap-6H3、CAstV-Cap-5A11、CAstV-Cap-3A2、CAstV-Cap-3E12。特异性实验结果显示,四株单抗的杂交瘤上清与实验室常见禽源病毒ALV-J、AIV、IBV、MDV等病毒均无交叉反应。经试剂盒的亚类鉴定,两株单抗为IgG1亚类,一株为IgG2b亚类,还有一株为IgM亚类,轻链均为Kappa链。
常新见[2]（2020）在《华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究》文中认为猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒（porcine rotavirus,Po RV）引起的一种以厌食、腹泻、呕吐、脱水为特征的急性传染病。该病多发于寒冷季节,呈地方性流行,各生长阶段的猪均可感染,感染率最高可达90%～100%,给养猪业带来巨大经济损失。目前,Po RV出现了新的基因型,导致现有疫苗对其保护效果不理想。因此,开展Po RV的分子流行病学调查,明确其流行的病毒基因型,研制安全有效的新型疫苗,对防控该病具有重要的意义。鉴于此,本论文开展了以下三方面的研究内容:1.华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查:采用本实验室已建立的Po RV RT-PCR检测方法对2017～2019年间华东地区35个规模猪场的594份样品进行检测。结果显示,2017～2019年间华东地区Po RV的平均检出率为16.8%（100/594）;在不同类型的样品中,肠道样品的Po RV检出率最高为19.5%（68/349）;在不同生长阶段猪中,仔猪的Po RV检出率最高为18.5%（70/379）。同时,扩增阳性样品的VP7和VP4基因并测序,进行序列比对、同源性比较及遗传进化分析。结果显示,5个Po RV基因型均为A群G9P7型,与参考毒株NMTL相比,VP7蛋白第100、122、180、309位有氨基酸突变;与参考毒株OSU相比,VP4蛋白在30、137、686、774位有氨基酸突变,且两者均无氨基酸位点插入和缺失。遗传进化分析结果显示,不同地区流行毒株基因型相同,表明G9P7型Po RV可能是主要的流行基因型。2.猪轮状病毒VP4蛋白间接ELSA抗体检测方法的建立:针对VP4蛋白的保守区设计并合成引物,通过PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*。将该质粒转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS PAGE和Western blot鉴定了该蛋白的表达,利用Ni柱纯化蛋白。以纯化的重组480-VP4*蛋白为抗原建立间接ELISA方法,确定了该方法的最佳包被浓度为2.56μg/m L,待检血清的最佳稀释度为1:80,酶标二抗最佳稀释度为1:10 000。建立的方法与病毒中和试验的总符合率达80.0%;用该方法初步检测了华东地区的临床血清,结果显示华东地区Po RV抗体阳性检出率为87.8%。通过该试验建立的间接ELISA检测方法为Po RV的血清学调查和后续疫苗免疫后的抗体评价提供了一种新的技术手段。3.猪轮状病毒不同截短VP4蛋白免疫原性研究:VP4蛋白具有较好免疫原性,是疫苗研究的主要靶蛋白,本研究分别构建3种截断的VP4蛋白的原核表达载体,同时将破伤风毒素的通用T细胞表位（P2）作为分子佐剂与三个截断VP4蛋白融合表达,成功构建了6个重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*、p ET28a-618-VP4*、p ET28a-1428-VP4*、p ET28a-P2-480-VP4*、p ET28a-P2-618-VP4*及p ET28a-P2-1428-VP4*,将它们分别转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS-PAGE和Western blot确定了蛋白表达,利用Ni柱纯化6个重组蛋白。将6个纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂以1:1体积混合后制备成亚单位疫苗,通过肌肉注射免疫6周龄小鼠,间隔2周免疫一次,共免疫3次,第3次免疫后2周,扑杀小鼠,并采集免疫前后小鼠血清,利用ELISA检测免疫前后抗体水平的变化,中和试验检测中和抗体水平。结果显示,6个蛋白免疫原性较好,小鼠血清中能产生特异性的抗体,3个截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为618-VP4*、1428-VP4*、480-VP4*,3个融合P2的截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为P2-1428-VP4*、P2-618-VP4*、P2-480-VP4*,但是6个蛋白诱导的中和抗体水平均偏低。将P2导入VP4蛋白后,1428-VP4*的蛋白免疫原性得到增强。通过该试验对不同截断VP4蛋白的免疫原性的研究,为后期研发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了良好的基础。
孙佳卉[3]（2020）在《基于Cap蛋白的鹅星状病毒遗传进化、单抗制备及定量检测技术研究》文中研究说明自2016年5月以来,安徽、江苏、山东、云南、四川等养鹅场爆发一种以痛风为主要病症的传染病,该病表现为腿关节腔充满白色浆液及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎,5-19日龄雏鹅易感,死亡率高达30%,给养鹅业及相关产业带来严重经济损失。本研究首先对实验室对2016-2019年从各地采集的RT-PCR鹅星状病毒（Goose Astroviruses,GoAstV）阳性临床发病鹅样品,进行回顾性分析,对其中有时间和地区代表性毒株的ORF1b（编码RNA依赖性RNA聚合酶蛋白）,ORF2（编码病毒衣壳蛋白）基因序列比对分析。结果表明,样本LA1605,ZJ1703,ZJ1704,ADY1708,LY1912与中国现已发表的多株鹅星状病毒基因序列同源性高达99.9%。构建GoAstV Cap原核表达载体pET-30a-rCap,转化BL21（DE3）后使用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达,大量表达并纯化带有His标签的rCap重组蛋白,获得浓度为0.74 mg/mL的重组蛋白。将纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测免疫小鼠抗体效价,使用经典的细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过Western blot与免疫荧光试验（Immunofluorescent assay,IFA）对单克隆抗体进行鉴定。结果表明,通过三次亚克隆最终获得5株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5G10、1C11B11、5B7G8、9A12B12、9C3E11,抗体效价ELISA检测均可达1:51,200以上;1A5G10、5B7G8、9C3E11重链为IgG1型,1C11B11、9A12B12重链为IgG2b型,轻链均为κ型;制备的单抗均可与重组蛋白反应或GoAstV发生ELISA反应;其中5B7G8株与GoAstV发生Western blot反应,1C11B11、9A12B12株与GoAstV发生Western blot和IFA反应。以病毒衣壳蛋白（Capsid protein,Cap）序列的5’端保守区为模板,设计荧光定量PCR引物和探针。以19T-Cap重组质粒为阳性标准品模板,通过10倍梯度稀释构建标准曲线,建立GoAstV Taq-Man实时荧光定量RT-PCR绝对定量检测方法。标准曲线线性方程为y=-3.4469x+41.528,R2=0.9948;该方法最低可检测到3.98个拷贝数/μl的病毒,与其他病毒无交叉反应,且变异系数小于2%。通过利用制备的单克隆抗体和建立的荧光定量PCR检测方法,分别对鹅星状病毒的体内外增殖特性展开研究。采用口服、肌肉注射、皮下注射、滴鼻点眼4种不同途径,对6日龄雏鹅进行接种鹅胚增殖的GoAstV-CH16株,于攻毒后1、2、3周对4组雏鹅进行随机剖检,并采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胰脏、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠12个组织。通过使用已建立的方法进行对各个组织样品进行病毒载量的检测。检测结果显示,鹅星状病毒感染雏鹅后1周体内病毒含量达到高峰,以各组织中口服攻毒途径病毒载量最高,其中肾脏病毒载量最高。使用GoAstV-CH16株感染鹅胚原代肾细胞（Goose embryo Kideny Cells,GKC）,对GoAstV感染后的GKC细胞进行Western-blot和IFA试验,收集GoAstV感染后不同时间点的细胞培养液,利用已建立的GoAstV Taq-Man荧光定量PCR绝对定量检测方法进行检测,绘制GoAstV感GKC的一步生长曲线。
武宗仪[4]（2019）在《我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查及绝对定量检测方法的建立》文中研究指明近年来,禽类星状病毒对家禽业的影响受到了世界范围内的广泛关注。其中鸡星状病毒（Chicken astrovirus,CAstV）可单独引起雏鸡肾炎、腹泻性肠炎及发育缓慢等症状,是导致雏鸡腹泻、痛风等疾病的重要病原体之一。目前我国鸡星状病毒病分子流行病学调查的结果还未见公开报道,为了解CAstV在我国鸡群中的流行情况,本研究开展了我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查工作,建立了检测鸡星状病毒的绝对荧光定量方法,同时还分离了一株鸡星状病毒,为进一步研究鸡星状病毒生物学功能提供了技术手段和生物材料。1.我国部分地区鸡星状病毒病流行病学调查本研究自2017～2018年,从江苏省、安徽省、山东省和广东省的7个地区采集了 195份样品,进行PCR检测鸡星状病毒的感染情况。实验结果表明,41份成年鸡样本中仅1份阳性样本,阳性率为2.44%,而154份1日龄雏鸡样本的阳性率高达82.47%（127/154）,综合阳性率为65.64%。测序结果分析比对显示,阳性样品包含7个毒株,全部属于鸡星状病毒。遗传分析结果表明,我国鸡群中同时存在I型和II型鸡星状病毒。从检测结果来看,与以往国外报道相似,低日龄雏鸡更容易检测到病毒,而成年鸡检测率较低。2.鸡II型星状病毒绝对定量qRT-PCR检测方法的建立到目前为止,尚无针对CAstV定量检测方法的相关研究。本研究通过鸡星状病毒RNA酶依赖的RNA聚合酶（RdRp）基因的研究,成功的建立针对II型鸡星状病毒绝对定量qRT-PCR的方法。设计了针对CAstV-RdRp基因特异性的引物并成功制备了阳性质粒标准品,利用该方法检测病毒在LMH细胞中增殖情况。结果表明,CAstV感染LMH细胞早期虽无明显病变,但病毒可以在LMH细胞中生长繁殖。本研究建立的检测CAstV-RdRp基因绝对定量PCR方法为研究病毒致病性以及生物学功能提供了一种检测技术手段。3.鸡星状病毒分离鉴定及全基因组测序分析为了进一步对国内流行CAstV进行更深入的研究,本研究使用鸡肝癌细胞系（LMH）对CAstV病毒进行了分离和鉴定。结果显示,病毒可以在LMH细胞中增殖,并盲传4代后可产生细胞病变。利用LMH细胞分离到了一株CAstV,命名为CAstVNJ1701株,属于II型鸡星状病毒。随后对其近全长基因组进行PCR扩增和测序,结果得到基因组长度为7492核苷酸,其结构特点与已发表的鸡星状病毒基因组结构特点相似,包括ORF1a、ORF1b和ORF2三个开放阅读框。将三个开放阅读框进行遗传进化分析,结果显示本研究分离的CAstV NJ1701株与CAstV FP3株的同源性较高,通过ORF2衣壳蛋白分类,可划分为CAstV B1群;CAstV NJ1701株ORF1a和ORF1b基因序列与其他CAstV的ORF1a和ORF1b序列同源性较低,处于一个相对独立的分支。4.病毒接种鸡胚致病性实验将分离的病毒通过卵黄囊接种6日龄鸡胚,盲传4代后发现鸡胚有明显致弱和致死现象,qRT-PCR检测也证实病毒可以在鸡胚中增殖。病毒接种鸡胚孵化率实验结果表明,30枚病毒接种鸡胚,仅11鸡胚孵化成功,孵化率为36.67%。死亡的鸡胚生长发育出现明显问题,呈现侏儒胚现象,说明鸡星状病毒感染可以导致鸡群孵化率降低。通过研究内容二所建立的方法,检测了 RdRp基因在雏鸡20个组织中的表达情况。结果表明,CAstV病毒基因雏鸡盲肠中表达量最高,其次是肾脏,而在心脏中表达量最低,这一结果为将来临床检测样品的采集提供依据。
崔鑫[5]（2019）在《新疆南疆部分规模奶牛场轮状和冠状病毒流行病学调查》文中认为牛轮状病毒（Bovine Rotavirus,BRV）和牛冠状病毒（Bovine Coronavirus,BCoV）是引起牛消化道疾病中的重要病原之一,这两种病毒所引起的犊牛腹泻临床症状极为相似,难以区分,病牛多表现为精神顿挫,脱水性腹泻,粪便成黄白色或灰白色,严重影响了犊牛的生长发育,对养牛业造成了一定的经济损失。因此,掌握本地区BRV与BCoV的感染情况对其防治有着一定的指导意义。本试验对新疆南疆部分规模奶牛场BRV与BCoV进行了ELISA抗原检测和分子流行病学调查,其结果为:1.在临床诊断、病理组织学检查的基础上,采用荧光定量PCR的方法对新疆南疆某规模奶牛场腹泻犊牛进行检测,其结果表明该规模奶牛场存在BRV感染;2.2018年度对新疆南疆12个规模奶牛场325份粪便样品进行Rota-Corona抗原ELISA检测,其中BRV的抗原阳性率为15.69%,BCoV的抗原阳性率为9.54%,且存在混合感染,两种病毒混合感染抗原阳性率为6.77%;3.2018年,分别从11个经ELISA检测为BRV感染的规模奶牛场中,各选取1份OD值最高的样品进行RT-PCR分型鉴定,结果有10份样品得到1062bp大小的目的条带,7份为715bp大小的目的条带,核苷酸同源性比对确定为G10型BRV;4.2018年,经Rota-Corona抗原ELISA检测为BCoV阳性的样品进行病毒分离培养和RT-PCR鉴定,病毒分离培养出现CPE,在此基础上通过RT-PCR检测,得到730bp大小的目的条带,通过核苷酸同源性比对和遗传进化树构建证实为BCoV,并获得其分离株。本研究采用临床诊断、病理观察、抗原ELISA检测、分子流行病毒调查、病毒分离培养等方法对新疆南疆部分规模奶牛场腹泻犊牛开展了相应研究,掌握了新疆南疆地区BRV与BCoV的感染情况并获得了其流行病学资料,为BRV与BCoV的综合防控提供了参考依据。
肖杰[6]（2018）在《河南沿黄绿色奶业发展带奶牛子宫内膜炎细菌流行病学调查及土霉素治疗前后菌群差异的研究》文中指出奶牛子宫内膜炎是生产上对繁殖性能造成影响的主要疾病,在我国发病率高。该病能够导致产奶量下降,空怀期延长、人工授精受胎率低、妊娠风险增加、屡配不孕甚至淘汰,严重影响奶牛养殖业的生产和经济效益。该病的发生主要与病原微生物感染、饲养管理、配种技术、环境卫生、营养、激素水平等与多种因素有关。已有研究表明,致病性细菌是引起奶牛子宫内膜炎的主要原因。临床上常使用抗生素、激素、中草药等药物通过消除或抑制子宫感染,但对药物治疗的深层机制尚不明确。因此,通过流行病学调查,摸清一个地区奶牛子宫内膜炎的感染情况,对该病的治疗具有重要的科学意义。随着生物技术的发展,高通量测序技术因其高通量、读长较短、测序时间短、测序成本低等特点在临床兽医领域得到广泛的应用。为此,本研究以河南省沿黄河流域5个县的部分奶牛场的子宫内膜炎的流行病学进行了调查,并对病原菌进行了分离鉴定。通过体内试验探讨了不同水平土霉素对子宫内膜炎的治疗效果,利用高通量测序技术分析了土霉素治疗前后菌群结构的变化。研究内容主要分为以下三个部分。第一部分:奶牛子宫内膜炎的流行病学调查。调查了沿黄河流域新乡市原阳县、济源市、开封市开封县、郑州市中牟县、洛阳市偃师市5个县市共2656头成年奶牛子宫内膜炎发病情况。五个县市平均发病率12.8%,各地区发病率有差异;全年78月份发病率最高（14.7%和15.3%）,36月份发病率较低（9.6%11.2%）;各地区不同胎次的奶牛子宫内膜炎发病率,均随胎次的增加而上升。第二部分:奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定与土霉素的临床疗效研究。选取子宫内膜炎发病率较高的开封县和原阳县奶牛场采样进行病原菌的分离鉴定。发现参试奶牛场所患子宫内膜炎,混合感染和单一感染同时存在,且混合感染高于单一感染;开封县奶牛场23头患牛子宫内膜炎的主要病原菌是大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌;原阳县奶牛场14头患牛子宫内膜炎的主要病原菌是大肠埃希氏杆菌、溶血葡萄球菌。选取开封县40头子宫内膜炎患牛,随机平均分为四组,分别用0%、10%、15%、20%浓度的土霉素注射液进行子宫灌注治疗。结果发现每次灌注20mL 20%土霉素溶液,隔2 d灌注一次,连用4次,治疗效果相对较好。第三部分:土霉素对子宫内膜炎病奶牛子宫细菌菌群结构的影响。在中牟县某牛场随机选择27个个体的阴道分泌物进行高通量测序,分为健康组、带菌个体组、发病组和土霉素治疗组,通过Illumina HiSeq 2500测序平台及相应设备、软件进行测序和分析。共鉴定出16个门、31个纲、55个目、97个科和212个属。Firmicutes（厚壁菌门）为子宫内膜炎牛和健康牛阴道共有的优势菌门,土霉素治疗后Fusobacteria（梭杆菌门）和Bacteroidetes（拟杆菌门）较发病时分别下降了5.4%和7.2%,说明子宫内膜炎的发生首先是基于菌群动态平衡的破坏,其数量的变化是子宫恢复健康的关键。Bacteroides（拟杆菌属）在发病状态下比例显着增加,说明该属可能是发病的主要原因。
曹禹[7]（2018）在《BRV与BCoV SYBR Green I RT-qPCR检测方法的建立及应用》文中研究表明犊牛腹泻是造成犊牛生长发育不良和死亡的主要疾病之一。病原微生物因素约占犊牛腹泻发病率的75%-95%,其中以牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）和大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）为主。本研究拟建立BRV和BCoV SYBR Green I实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测方法,并对黑龙江地区犊牛腹泻主要病原（BRV、BCoV和E.coli）进行流行病学调查。参照Gen Bank上BRV HQ09株VP6和BCoV 2012/07株N基因序列,分别在保守区域设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增目的基因,胶回收后,将目的基因连接到p MD18-T载体中,制备阳性标准品;以阳性质粒为模板,对RT-q PCR的引物量、模板量、退火温度和溶解温度进行优化,以最优工作条件进行特异性、敏感性和重复性实验;并用建立的RT-q PCR方法和RT-PCR方法同时检测临床样本,验证符合性。利用建立的RT-q PCR方法和细菌分离鉴定方法对黑龙江地区犊牛腹泻主要病原进行流行病学调查,并进行统计分析。BRV和BCoV质粒PCR鉴定结果分别在190 bp和346 bp出现条带,与目的基因片段相符,测序结果经NCBI同源性比对结果显示分别与HQ09 VP6基因和BCoV 2012/07 N基因同源性100%。实验建立的BRV和BCoV RT-q PCR方法具有良好特异性、稳定性和敏感性。BRV RT-q PCR和RT-PCR方法同时抽检46份新生犊牛腹泻粪便样本,阳性率分别为30.4%（14/46）和19.6%（9/46）,BCoV RT-q PCR和RT-PCR方法同时抽检46份新生犊牛腹泻粪便样本,阳性率分别为10.8%（5/46）和19.5%（9/46）。流行病学调查结果显示,BRV、BCoV和致病性E.coli阳性率分别为27.5%（22/80）、11.35%（9/80）和44%（35/80）。含K99和F41毒力因子的E.coli检出率为40%（14/35）和5.7%（2/35）。数据统计分析结果显示养殖规模超过500头的牛场,发生腹泻的机率显着（P<0.05）高于500头规模以下的牛场;犊牛采取单独饲养方式发生腹泻的机率显着（P<0.05）低于混群饲养方式,而且是引起犊牛腹泻的风险因子之一（OR值>1）;寒冷季节腹泻发病率显着（P<0.01）高于温暖季节。本实验建立了BRV和BCoV SYBR Green I RT-q PCR检测方法,可以用于BRV和BCoV的诊断和流行病学调查。
张优[8]（2018）在《海南岛重要动物宿主携带病毒的分子流行病学调查》文中进行了进一步梳理研究目的:对海南岛部分地区重要动物宿主（蝙蝠、啮齿动物和家禽等）携带病毒病原体的情况进行调查和监测,为防控海南岛新发传染病和再发传染病提供病毒病原本底数据和技术支持。研究方法:根据海南岛不同地区生态环境的特点,以及重要动物宿主（蝙蝠和啮齿动物等）栖息的情况,选取具有代表性的生态环境作为样本采集地点。通过病毒高通量基因组测序,获得重要动物携带病毒的宏基因组数据,并对病毒宏基因组数据进行生物信息学分析。了解不同生态环境中重要动物宿主携带病毒病原的情况,分析不同生态环境中病毒组的多样性和特点。针对重要的新发病毒进行分离培养,全基因组扩增、遗传进化分析等方面的研究,对有潜在致病风险的病毒开发高效特异的检测方法与技术。研究结果:蝙蝠、啮齿动物和家禽样本采集自海南岛五个县市地区,样本数量约为740份,采集时间为2015年至2016年。根据各物种和采集地点信息进行分组,情况如下:蝙蝠652只（海口火山口HHB组210只,屯昌县TCB组442只）,啮齿动物85只（海口市HKS组18只,澄迈县CMS组24只,临高县LGS组24只,黎母山LMS组19只）,禽类粪便样本3份（鸡CH组、鸭DU组和鸽PI组）。蝙蝠样本的病毒宏基因组数据结果显示,HHB组和TCB组分别获得34396和241062条病毒测序读长（reads）。经数据库比对和序列注释,HHB组和TCB组的蝙蝠病毒组组成基本相似,包括5个病毒科:浓核病毒科（Densovirinae）、疱疹病毒科（Herpesviridae）、圆环病毒科（Circoviridae）、杆状病毒科（Baculovirida）和肌病毒科（Myoviridae）。其中两组共同注释到的哺乳动物病毒包括:禽疱疹病毒（Gallid herpesvirus）、蝙蝠圆环病毒（Bat circovirus）和隼鸟疱疹病毒（Falconid herpesvirus）。另外,两组都有序列注释到了新发病毒,HHB组中有225条病毒reads注释到了人疱疹病毒7型（Human herpesvirus 7）,TCB组中有880条病毒reads注释到了蝙蝠圆环病毒。人疱疹病毒7型属于新发病毒,于1990年首次在人血清中分离出来。蝙蝠圆环病毒于2011年首次在中国云南地区的蝙蝠中分离到了蝙蝠源性圆环病毒。另外,大部分的昆虫病毒reads都注释到:浓核病毒（Densovirus）和杆状病毒（Granulovirus）。啮齿动物样本的病毒宏基因组结果显示,CMS（澄迈）、LGS（临高）和LMS（黎母山）三组样本分别获得了7515、5221和3503条病毒reads,绝大部分的病毒reads都注释到了哺乳动物病毒（CMS:89.15%,6700/7515;LGS:100%,5221/5221;LMS:98.40%,3447/3503）,以细小病毒（Parvovirus）为主（CMS:88.01%,6614/7515;LGS:97.43%,5087/5221;LMS:90.43%,3168/3503）。三个地区的细小病毒构成各有差异:CMS组中以Bovine hokovirus和鼠博卡病毒（Rat bocavirus）为主,Bovine hokovirus属于在2008年在香港的牛中首次发现的新发病毒,并且与人细小病毒同源性很高;LGS组中以鼠细小病毒（Mouse parvovirus和Rat minute virus）为主,LMS组中以鼠博卡病毒和猪博卡病毒（Porcine bocavirus）为主。另外在CMS组和LMS组中都发现了人腺病毒（Human adenovirus）,在HKS组中发现了一株沙粒病毒。家禽粪便样本的病毒宏基因组数据结果显示,三组样本共获得15707条病毒测序读长（reads）,其中A组、B组（duck）和C组（pigoens）分别获得13063条、1370条和862条病毒reads。三组样本的大部分病毒序列都注释到了哺乳动物病毒（A:99.3%,12975/13063;B:95.3%,1306/1370;C:81.1%,706/862）,大部分为肠道病毒和呼吸道病毒:腺病毒科（Adenoviridae）、疱疹病毒科（Herpesviridae）、逆转录病毒科（Retroviridae）、呼肠孤病毒（Reoviridae）、圆环病毒科（Circoviridae）、星状病毒科（Astroviridae）、杯状病毒科（Caliciviridae）、冠状病毒科（Coronaviridae）、副粘病毒（Paramyxoviridae）、小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）和小双节RNA病毒（Picobirnaviridae）。其中,A组鸡和B组鸭的粪便病毒组成较为相似,大部分病毒reads都注释到了禽冠状病毒（Avian coronavirus）;而C组鸽子的病毒组则与A组鸡B组有比较大的差别,大部分病毒reads大多数注释到了可引起免疫性疾病的圆环病毒。并且,我们注意到有病毒序列注释到轮状病毒A型和甲型流感病毒,在后续的PCR检测中,轮状病毒检测为阳性,流感病毒为阴性,在鸡胚分离培养中流感病毒培养结果也为阴性。基于宏基因组分析数据,海口棚户区来源的褐家鼠病毒组中,有病毒序列注释到了新型沙粒病毒科的温州病毒。经PCR验证,其中一只褐家鼠的PCR检测结果为强阳性,通过基因组扩增和克隆成功获得了该毒株的全基因组序列,并命名为HMU（Hainan Medical University）virus。其全基因组同源进化分析显示,HMU virus与2014年首次发现的褐家鼠源的温州病毒浙江株（Wenzhou Virus,WENV）和不明原因发热病人源的柬埔寨株（Cardomones virus）的同源性分别是92%和82%。HMU virus的完整基因组序列已提交至GenBank,登录号为MF595889.1和MF595888.1。另外,在海口活禽市场鸽子粪便病毒组中发现有轮状病毒A（Rotavirus A,RVA）,通过PCR扩增和克隆成功获得了用于轮状病毒主要流行型别的VP4和VP7基因片段,按照国际病毒分类学委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）对轮状病毒分类的标准,该RVA海口株的分型和命名确定为RVA/Pigeon-haikou/CHN/2016/G18P[17],与可致狐狸共济失调等神经系统疾病的RVA/Fox-tc/ITA/288356/2011/G18P[17]和鸽源跨越物种屏障感染哺乳动物的PO-13株同源性为分别为92%和85%。该RVA的VP7和VP4基因组序列已提交至GenBank,登录号为MG518479和MG518480。经基因组分析,这两株病毒都对人类具有潜在致病风险,为进一步了解HMU virus和RVA/Pigeon-haikou/CHN/2016/G18P[17]的在动物宿主和人群中的流行情况,为防控和诊断提供有效的检测方法。本研究建立了基于SYBR Green I的温州病毒和轮状病毒A的实时定量荧光PCR的检测方法,本方法特异性和灵敏性良好,最低检测下限为1.0×102 copies/μl,可用于相关病原的监测和流调工作。结论:蝙蝠、啮齿动物和家禽是许多病毒的天然宿主,随着人类活动范围不断扩大,这些宿主动物与人类接触的机会也越来越大,人类感染病毒病原的风险也不断增大。因此,开展海南岛重要动物宿主携带病毒的本底调查,对防控海南岛新发、再发病毒传染病的爆发和流行具有重要的公共卫生学意义。本研究利用高通量测序技术和生物信息学分析的调查方法,获得了海南岛部分地区（包括海口、澄迈、屯昌、临高、黎母山）的蝙蝠、啮齿动物和家禽携带病毒的宏基因组本底情况。生物信息学分析结果显示,海口和屯昌地区的蝙蝠分别携带的新发病毒是人疱疹病毒和蝙蝠圆环病毒,为这两种新发病毒在海南的流行情况提供了基础的数据。提示这两个地点附近的人群,有潜在感染和传播疱疹病毒和圆环病毒的风险,为我们下一步蝙蝠病毒的研究工作提供了方向和思路。另外,种类丰富的昆虫病毒在两地的蝙蝠种群中广泛流行,一定程度上反映了两地蝙蝠的生态环境情况。本研究中,屯昌、临高和黎母山地区的啮齿动物病毒组中细小病毒的丰度非常高（>98%）,携带细小病毒的啮齿动物可能通过污染水源、食物等方式将病毒传播给人,因此在以上地区的啮齿动物经常出没的区域,特别是在景区和居民区等人口来往频繁的地区,应该密切监测与预防肠道疾病的发生。除了细小病毒,我们还鉴定了一株沙粒病毒HMU virus,为沙粒病毒在亚洲地区的广泛流行提供了证据,为海口防控鼠源沙粒病毒进行了科学预警。为将来深入了解其在全岛的分布流行情况、探究其致病性、科学监测和防控沙粒病毒的爆发流行,提供基础数据和检测技术手段。随着海南岛双创事业的长足发展,岛内对活禽食品安全问题越来越重视。本次研究中,海口活禽市场家禽粪便的病毒组中的哺乳动物病毒种类十分丰富,提示对家禽的养殖和流通的各个环节应该加大病毒携带问题的关注,但本次调查中尚未发现有甲型流感病毒的存在。此外,我们鉴定了一株A型轮状病毒,与可致神经系统疾病的RVA/Fox-tc/ITA/288356/2011/G18P[17]和可以穿过宿主屏障感染哺乳动物的PO-13株同源性很高。这株海口流行株毒株是否也存在中枢神经系统的侵染致病能力,是否存在跨越物种屏障导致哺乳动物致病的能力,这些问题仍有待深入的探索。本研究获得了海南岛部分地区重要动物宿主病毒组的本底基础数据,对不同地区的宿主动物的病毒病原谱进行深入的比较和分析,对两株对人畜共患的新发病毒:HMU virus和RVA/Pigeon-haikou/CHN/2016/G18P[17]进行了深入的基因组学分析和高效的检测技术的开发。为全面了解海南岛重要动物宿主携带病毒的生态情况和防控新发病毒传染性疾病的爆发和流行,提供了科学的数据支撑,为下一步其他重要病毒的验证与鉴定和未来新发传染病研究工作的开展提供了科学的方向和思路。
王楷宬,王素春,庄青叶,邱源,侯广宇[9]（2018）在《G群轮状病毒鸽群分离株的全基因分析》文中研究指明为分析鸽轮状病毒中国分离株的特性,采用高通量测序方法,测定从山东省青岛市某活禽交易市场采集的肉鸽粪便样品中分离的轮状病毒基因组,并对其进行特性分析与比较基因组研究。结果显示,G群轮状病毒鸽群分离株全基因包含11个节段,总长度为17 803 bp,具有与其他轮状病毒相似的结构和基因顺序。与24株轮状病毒代表性毒株的VP6氨基酸序列进化分析结果,以及其他5个结构蛋白氨基酸序列遗传进化分析结果均证实,该病毒属G群轮状病毒。该毒株与2011年从香港鸽群中分离的G群轮状病毒同源性最高,但衣壳糖蛋白VP7的氨基酸序列同源性仅为71.7%,抗原性存在较大差异。
张贺伟[10]（2015）在《猪轮状病毒的分离鉴定及其环介导等温扩增反应检测方法的建立》文中进行了进一步梳理轮状病毒（Rotavirus）作为一种重要的肠道微生物,能造成多种小动物和新生婴幼儿腹泻。PoRV与PEDV、TGEV并称为引起腹泻的三大病毒。目前,在世界上许多国家和地区均发现轮状病毒可引起相关腹泻疾病,对农业带来了巨大的经济损失。本实验室自2013年到2014年,在全国不同省市和地区采集腹泻样品362份,进行流行病学调查,检测结果显示,362份样品中,PEDV的阳性样品数为223份,阳性率为61.6%,TGEV的阳性样品数为2份,阳性率为0.55%;PoRV的阳性样品数为8份,阳性率为2.2%;PKV的阳性样品数为66份,阳性率为18.23%。将来自江苏省某发病猪场的轮状病毒阳性样品处理并与20ug/mL胰酶等体积混合后接种至MA-104细胞上,盲传8代,细胞出现变圆、拉网、脱落等病变。PCR及测序结果显示为猪轮状病毒,命名为JS株。三次蚀斑克隆纯化后测定TCID50为10-6.875/mL,中和试验用病毒的最佳稀释倍数为150倍,并建立抗体检测方法。JS分离株的VP4基因型与P[7]基因型同源性最高,VP7基因型与G[9]基因型同源性最高。根据A群轮状病毒最新分类方法,JS分离株属于P[7]G[9]型。采用环介导等温扩增技术,建立了一种快速检测轮状病毒的实验方法。结果显示,当反应体系中甜菜碱浓度为0.8M,镁离子浓度为2mM,最佳反应温度为63℃时反应60min,扩增可达最佳效果。且该方法特异性良好,灵敏度为RT-PCR的100倍。可用于现场检测,具有良好的应用前景。
二、禽轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文提纲范文）
（1）鸡星状病毒的分离鉴定及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 星状病毒概况 |
| 1. 病原学 |
| 1.1 星状病毒的形态结构 |
| 1.2 星状病毒的分型 |
| 1.3 理化性质 |
| 2 流行病学 |
| 3 发病机制和致病性 |
| 4 鸡星状病毒的诊断与预防 |
| 4.1 病毒的分离 |
| 4.2 间接免疫荧光实验 |
| 4.3 电子显微镜观察诊断 |
| 4.4 酶联免疫吸附试验 |
| 4.5 分子生物学检测方法 |
| 4.6 CAstV的预防和控制 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 研究内容一 鸡星状病毒的流行病学调查及病毒的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 主要试剂与生物材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡星状病毒的流行病学调查 |
| 2.2 鸡星状病毒的分离鉴定 |
| 2.3 全基因测序及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.2 阳性样品测序及遗传变异分析 |
| 3.3 病毒分离与IFA检测 |
| 3.4 分离病毒的纯粹性鉴定 |
| 3.5 分离株病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.6 CAstV/CZ1801分离株的基因测序及遗传进化分析 |
| 3.7 CAstV/CZ1801生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 Ⅱ型鸡星状病毒致病性的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 实验动物和饲养设施 |
| 1.3 主要试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 realtime-PCR引物设计与合成 |
| 2.2 标准品的制备 |
| 2.3 动物实验设计 |
| 2.4 攻毒实验效果评定 |
| 3 结果 |
| 3.1 生长状态及临床症状的观察 |
| 3.2 主要免疫器官相对重量的变化 |
| 3.3 排毒情况分析 |
| 3.4 不同日龄各器官病毒载量动态分布 |
| 3.5 血清抗体水平检测 |
| 3.6 病理组织学病变 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 鸡星状病毒单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达 |
| 2.2 抗鸡星状病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组杆状病毒的制备 |
| 3.2 单克隆抗体的制备 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（2）华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 轮状病毒形态及分子生物学特征研究 |
| 1.1 轮状病毒形态 |
| 1.2 轮状病毒分子生物学特征 |
| 2 猪轮状病毒的诊断方法研究进展 |
| 2.1 猪轮状病毒的临床诊断方法 |
| 2.2 猪轮状病毒实验室诊断方法 |
| 3 猪轮状病毒病流行现状 |
| 4 猪轮状病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 猪轮状病毒灭活苗 |
| 4.2 猪轮状病毒弱毒活疫苗 |
| 4.3 猪轮状病毒新型疫苗 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 RT-PCR检测 |
| 1.4 数据处理与分析 |
| 1.5 VP7 和VP4 基因克隆与序列鉴定 |
| 1.6 VP7 基因和VP4 基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 华东地区猪轮状病毒病流行病学调查 |
| 2.2 VP7 和VP4 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 PoRV480-VP4*基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.4 重组480-VP4*蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 1.5 重组480-VP4*蛋白浓度测定 |
| 1.6 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.7 间接ELISA的临界值 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 重复性试验 |
| 1.11 与中和抗体检测的比对试验 |
| 1.12 间接ELISA检测临床猪血清样品 |
| 2 结果 |
| 2.1 Po RV480-VP4*基因原核表达载体的构建 |
| 2.2 重组Po RV480-VP4*蛋白SDS PAGE和 Western Blot试验 |
| 2.3 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 2.4 间接ELISA的临界值 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 与中和抗体检测的比对试验结果 |
| 2.9 间接ELISA检测临床猪血清样品结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪轮状病毒不同截短VP4 蛋白免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计及目的基因扩增 |
| 1.4 不同的重组基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.5 重组蛋白诱导表达、纯化及鉴定 |
| 1.6 纯化的重组蛋白浓度测定 |
| 1.7 疫苗制备 |
| 1.8 试验动物及免疫接种 |
| 1.9 血清ELISA抗体检测 |
| 1.10 血清中和抗体检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒RT-PCR产物及双酶切产物电泳结果 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.3 重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.4 纯化的重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.5 纯化的重组蛋白浓度测定结果 |
| 2.6 血清ELISA抗体检测结果 |
| 2.7 血清中和抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）基于Cap蛋白的鹅星状病毒遗传进化、单抗制备及定量检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 星状病毒分类及生物学特性 |
| 1.1.1 病毒的分类 |
| 1.1.2 分子生物学特征 |
| 1.1.3 星状病毒衣壳蛋白的结构及功能 |
| 1.2 禽星状病毒感染概述 |
| 1.2.1 鸡星状病毒 |
| 1.2.2 鸭星状病毒 |
| 1.2.3 火鸡星状病毒 |
| 1.2.4 禽肾炎病毒 |
| 1.2.5 鹅星状病毒 |
| 1.3 星状病毒诊断方法研究现状 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 鹅星状病毒流行病学调查及遗传进化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 样本处理 |
| 2.2.3 提取组织总RNA |
| 2.2.4 cDNA合成 |
| 2.2.5 样本PCR检测 |
| 2.2.6 目的片段胶回收 |
| 2.2.7 目的片段连接T载体 |
| 2.2.8 连接产物转化 |
| 2.2.9 阳性质粒的鉴定与提取 |
| 2.2.10 遗传变异的分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 样本PCR检测结果 |
| 2.3.2 T克隆产物检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 GoAstV rCap基因质粒的构建 |
| 3.2.2 GoAstV rCap蛋白原核表达及纯化 |
| 3.2.3 GoAstV rCap蛋白浓度测定 |
| 3.2.4 小鼠免疫实验 |
| 3.2.5 MAbs的制备及分析 |
| 3.2.6 MAbs的初步应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rCap基因质粒的构建 |
| 3.3.2 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3.3.3 间接ELISA检测免疫小鼠的效价 |
| 3.3.4 MAbs分析鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 鹅星状病毒绝对定量检测方法的建立与体内外增殖特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与毒株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 引物、探针的设计与合成 |
| 4.2.2 阳性标准品制备 |
| 4.2.3 绝对定量检测方法的建立及标准曲线的绘制 |
| 4.2.4 敏感性实验 |
| 4.2.5 特异性实验 |
| 4.2.6 重复性和稳定性实验 |
| 4.2.7 试验分组与攻毒 |
| 4.2.8 病料采集、制备与病毒载量的测定 |
| 4.2.9 细胞准备和病毒接种 |
| 4.2.10 RT-PCR检测GoAstV CH16 株在GKC细胞上的增殖 |
| 4.2.11 GoAstV CH16 株间接免疫荧光检测(IFA) |
| 4.2.12 GoAstV CH16株Western-blot检测 |
| 4.2.13 一步生长曲线的绘制 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 阳性标准品制备 |
| 4.3.2 Taq man Real-time PCR绝对定量方法的建立 |
| 4.3.3 试验样品的病毒载量检测 |
| 4.3.4 GKC细胞感染CH16株形态观察 |
| 4.3.5 RT-PCR的检测 |
| 4.3.6 IFA的检测 |
| 4.3.7 Western-blot的检测 |
| 4.3.8 GoAstV CH16 株在GKC细胞中的一步生长曲线 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 GoAstV Taq-Man荧光定量PCR绝对定量检测方法的建立 |
| 4.4.2 GoAstV-CH16 株体内增殖特性 |
| 4.4.3 GoAstV-CH16 株体外增殖特性 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查及绝对定量检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 星状病毒概述 |
| 1.1 星状病毒基因组结构 |
| 1.2 星状病毒分类 |
| 1.3 星状病毒研究现状 |
| 1.4 星状病毒分离检测技术 |
| 1.5 星状病毒病的预防及治疗手段 |
| 2 禽星状病毒概述 |
| 2.1 鸡星状病毒 |
| 2.1.1 鸡星状病毒历史及流行情况 |
| 2.1.2 鸡星状病毒基因组结构及分类 |
| 2.1.3 鸡星状病毒的致病性 |
| 2.1.4 鸡星状病毒检测技术及分离方法 |
| 2.1.5 鸡星状病毒病的防治 |
| 2.2 鸭星状病毒 |
| 2.3 火鸡星状病毒 |
| 2.4 禽肾炎病毒 |
| 2.5 鹅星状病毒病毒 |
| 3 本研究目的与意义 |
| 研究内容一 我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料采集 |
| 1.2 主要试剂与生物材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 样本处理 |
| 2.3 组织中总RNA的提取 |
| 2.4 cDNA的合成 |
| 2.5 样本PCR检测 |
| 2.6 阳性样本的胶回收 |
| 2.7 目的片段的T载体连接 |
| 2.8 连接产物的转化 |
| 2.9 阳性质粒的鉴定 |
| 2.10 遗传变异分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡星状病毒RT-PCR检测结果 |
| 3.2 鸡星状病毒部分RdRp基因测序比对分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 鸡Ⅱ型星状病毒绝对定量检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 阳性标准品制备 |
| 2.3 绝对定量检测方法的建立及标准曲线的绘制 |
| 2.4 绝对定量检测方法的特异性试验 |
| 2.5 绝对定量检测方法重复性和稳定性试验 |
| 2.6 CAstV感染LMH细胞后CAstV-RdRp基因拷贝数检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 阳性标准品的制备 |
| 3.2 CAstV-RdRp绝对定量检测方法的建立 |
| 3.2.1 CAstV-RdRp绝对定量检测方法标准曲线的建立 |
| 3.2.2 绝对定量real-time PCR方法的特异性分析 |
| 3.3 CAstV感染LMH细胞RdRp基因表达的绝对定量检测 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 鸡星状病毒分离鉴定及全基因组测序分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离与增殖 |
| 2.1.1 样品处理 |
| 2.1.2 肠道组织中常见家禽病毒的检测 |
| 2.1.3 利用鸡肝癌细胞系分离病毒 |
| 2.1.4 病毒的浓缩 |
| 2.1.5 多抗血清的制备 |
| 2.1.6 激光共聚焦实验 |
| 2.2 NJ1701株基因组测序 |
| 2.2.1 PCR引物设计 |
| 2.2.2 病毒总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA合成 |
| 2.2.4 病毒基因组片段扩增 |
| 2.2.5 PCR产物粘性末端制备 |
| 2.2.6 目的片段的胶回收、连接与转化 |
| 2.2.7 阳性质粒的挑选与鉴定 |
| 2.3 病毒基因组测序结果分析 |
| 2.3.1 遗传进化分析 |
| 2.3.2 生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.1.1 病毒分离与IFA检测 |
| 3.1.2 分离病毒的RT-PCR鉴定 |
| 3.2 CAstV NJ1701基因组测序及比对分析 |
| 3.2.1 CAstV NJ1701基因组不同片段RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.2 CAstV基因组片段克隆及酶切鉴定结果 |
| 3.3 CAstV NJ1701基因组序列比对分析 |
| 3.3.1 CAstV NJ1701基因组的遗传进化分析 |
| 3.3.2 CAstV NJ1701的生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容四 鸡星状病毒鸡胚接种试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒悬液处理 |
| 2.2 病毒接种鸡胚增殖实验 |
| 2.3 病毒对鸡胚孵化率的影响 |
| 2.4 雏鸡不同组织脏器中病毒基因拷贝数检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡胚传毒结果 |
| 3.2 病毒对鸡胚生长发育的影响 |
| 3.3 雏鸡不同组织脏器中病毒基因拷贝数检测结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）新疆南疆部分规模奶牛场轮状和冠状病毒流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 概述 |
| 1.1 牛轮状病毒（BRV）研究概况 |
| 1.1.1 BRV简介 |
| 1.1.2 临床表现 |
| 1.1.3 流行情况 |
| 1.1.4 生物学分类及特性 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.1.6 防控措施 |
| 1.2 牛冠状病毒（BCo V）研究概况 |
| 1.2.1 BCo V简介 |
| 1.2.2 临床表现 |
| 1.2.3 流行情况 |
| 1.2.4 生物学分类及特性 |
| 1.2.5 诊断方法 |
| 1.2.6 防控措施 |
| 第2章 新疆南疆某规模奶牛场BRV荧光定量PCR检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料来源及样品采集 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验器材 |
| 2.1.4 样本处理 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 组织病理切片的制作 |
| 2.2.2 样本RNA的提取 |
| 2.2.3 荧光定量PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 临床症状 |
| 2.3.2 病理解剖 |
| 2.3.3 组织病理变化 |
| 2.3.4 荧光定量PCR扩增结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 新疆南疆部分规模奶牛场BRV与BCoV抗原ELISA检测 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验样品来源 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验器材 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验步骤 |
| 3.2.2 计算方法 |
| 3.2.3 结果判定 |
| 3.3 试验结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 新疆南疆部分规模奶牛场BRV分子流行病学调查 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验器材 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.1.5 参考毒株 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样本RNA的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 PCR产物回收 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RT-PCR扩增结果 |
| 4.3.2 RT-PCR检测结果 |
| 4.3.3 BRV-VP7基因核苷酸同源性分析 |
| 4.3.4 遗传进化树的构建 |
| 4.3.5 BRV-10T基因分型分析 |
| 4.3.6 BRV-10T与疫苗参考株KC-1xUK VP7基因核苷酸及推导氨基酸序列同源性比较 |
| 4.3.7 BRV-10T与疫苗参考株KC-1xUK 52-337 位肽段VP7基因的氨基酸比较 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 新疆南疆BCo V分离及基因型鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 样本来源 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 试验器材 |
| 5.1.4 引物 |
| 5.1.5 参考毒株 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 样品处理 |
| 5.2.2 病毒分离培养 |
| 5.2.3 RNA的提取 |
| 5.2.4 RT-PCR |
| 5.2.5 PCR产物回收 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 病毒分离结果 |
| 5.3.2 RT-PCR扩增结果 |
| 5.3.3 BCoV-5T株N基因核苷酸同源性分析 |
| 5.3.4 遗传进化树的构建 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）河南沿黄绿色奶业发展带奶牛子宫内膜炎细菌流行病学调查及土霉素治疗前后菌群差异的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 奶牛子宫内膜炎的研究进展 |
| 1.1 奶牛子宫内膜炎的分类 |
| 1.1.1 根据子宫内膜炎病程长短分类 |
| 1.1.2 根据子宫黏膜损伤程度及分泌物性质分类 |
| 1.1.3 根据临床症状分类 |
| 1.1.4 其他分类方法 |
| 1.2 奶牛子宫内膜炎的危害及发病情况 |
| 1.2.1 奶牛子宫内膜炎的危害 |
| 1.2.2 奶牛子宫内膜炎的发病情况 |
| 1.3 奶牛子宫内膜炎的病因 |
| 1.3.1 病原微生物感染 |
| 1.3.2 饲养管理因素 |
| 1.3.3 内分泌紊乱 |
| 1.3.4 其他因素 |
| 1.4 奶牛子宫内膜炎的诊断方法 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 实验室诊断 |
| 1.5 奶牛子宫内膜炎的发病机理 |
| 1.5.1 子宫内膜上皮的防御屏障 |
| 1.5.2 生殖道微生物屏障 |
| 1.5.3 围产期激素免疫 |
| 1.5.4 子宫内膜炎的发病机理 |
| 1.6 奶牛子宫内膜炎的治疗方法 |
| 1.6.1 子宫局部治疗 |
| 1.6.2 全身治疗 |
| 1.6.3 中药治疗 |
| 1.6.4 中西医结合治疗 |
| 1.6.5 其它疗法 |
| 1.7 奶牛子宫内膜炎的综合防控措施 |
| 1.7.1 注意营养平衡 |
| 1.7.2 科学饲养管理 |
| 1.7.3 做好卫生消毒和防疫工作 |
| 1.7.4 预防用药 |
| 第2章 高通量测序技术在临床兽医中的应用 |
| 2.1 测序技术的发展历程 |
| 2.1.1 第一代测序技术 |
| 2.1.2 第二代测序技术 |
| 2.1.3 第三代测序技术 |
| 2.2 高通量测序技术平台 |
| 2.2.1 454高通量测序 |
| 2.2.2 HiSeq高通量测序 |
| 2.2.3 SOLiD高通量测序 |
| 2.3 高通量测序技术的流程 |
| 2.4 高通量测序技术在临床兽医中的应用 |
| 2.4.1 高通量测序技术在疫病监测体系中的应用 |
| 2.4.2 高通量测序技术在疫病诊断中的应用 |
| 2.4.3 高通量测序技术在病理研究中的应用 |
| 2.4.4 高通量测序技术在兽药筛选中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 奶牛子宫内膜炎的流行病学调查 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 发病情况调查 |
| 1.1.3 生产管理情况调查 |
| 1.1.4 子宫内膜炎的诊断 |
| 1.1.5 数据分析 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 奶牛场基本情况 |
| 1.2.2 调查地区奶牛子宫内膜炎发病情况 |
| 1.2.3 调查地区奶牛子宫内膜炎月份发病规律 |
| 1.2.4 调查地区奶牛子宫内膜炎与胎次之间的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 奶牛子宫内膜炎地区的差异 |
| 1.3.2 奶牛子宫内膜炎的发病率与季节的关系 |
| 1.3.3 奶牛子宫内膜炎的发病率与胎次的关系 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定与土霉素临床疗效研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 仪器设备与材料 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 开封县奶牛场细菌的分离 |
| 2.2.2 原阳县奶牛场细菌的分离 |
| 2.2.3 分离的细菌生化鉴定结果 |
| 2.2.4 开封县奶牛场子宫内膜炎感染类型及病原菌鉴定结果 |
| 2.2.5 原阳县奶牛场子宫内膜炎感染类型及病原菌鉴定结果 |
| 2.2.6 不同水平土霉素治疗效果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 土霉素对子宫内膜炎病奶牛子宫细菌菌群结构的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 子宫内容物的采集 |
| 3.1.3 实验设备及软件 |
| 3.1.4 研究方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 测序数据质量评估 |
| 3.2.2 OTU数量及分析 |
| 3.2.3 菌群Alpha多样性分析 |
| 3.2.4 菌群Beta多样性分析 |
| 3.2.5 菌群结构及丰度的Metastats分析结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）BRV与BCoV SYBR Green I RT-qPCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 轮状病毒的研究进展 |
| 1.1.1 轮状病毒基本特性 |
| 1.1.2 轮状病毒引起的腹泻及其检测手段 |
| 1.2 牛冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 临床特征 |
| 1.2.2 发病机理 |
| 1.2.3 流行病学 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 BRV与BCoVSYBRGreenIRT-qPCR检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和毒株 |
| 2.1.2 试剂盒 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 主要试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒增殖 |
| 2.2.2 BRV和BCoVRNA制备及cDNA合成 |
| 2.2.3 BRVVP6基因和BCoVN克隆 |
| 2.2.4 RT-qPCR反应条件的优化 |
| 2.2.5 敏感性实验 |
| 2.2.6 特异性实验 |
| 2.2.7 重复性实验 |
| 2.2.8 RT-qPCR与RT-PCR方法的比较 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BRVVP6基因和BCoVN基因阳性质粒的构建结果 |
| 2.3.2 RT-qPCR反应条件的优化结果 |
| 2.3.3 RT-qPCR标准曲线的建立结果 |
| 2.3.4 敏感性实验结果 |
| 2.3.5 特异性实验结果 |
| 2.3.6 重复性实验结果 |
| 2.3.7 RT-PCR方法检测新生犊牛腹泻样本结果 |
| 2.3.8 RT-qPCR方法检测新生犊牛腹泻样本结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 黑龙江部分地区犊牛腹泻流行病学调查 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样本 |
| 3.1.2 BRV和BCoV阳性毒株 |
| 3.1.3 试剂盒 |
| 3.1.4 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 大肠杆菌分离鉴定 |
| 3.2.2 病毒检测 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）海南岛重要动物宿主携带病毒的分子流行病学调查（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、海南岛重要动物宿主携带病毒宏基因组学研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 动物样本采集 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 生物信息学软件 |
| 2.方法 |
| 2.1 动物宿主样本采集与解剖 |
| 2.2 宏基因组学前处理 |
| 2.2.1 离心去除细胞碎片 |
| 2.2.2 外源核酸消化 |
| 2.2.3 病毒样本RNA提取 |
| 2.2.4 Viral Meta反转录和SISPA-PCR扩增 |
| 2.2.4.1 Viral Meta反转录 |
| 2.2.4.2 病毒dsc DNA合成 |
| 2.2.4.3 SISPA-PCR |
| 2.2.4.4 SISPA-PCR产物纯化和电泳 |
| 2.2.5 宏基因组测序 |
| 2.2.6 宏基因组学注释 |
| 3.结果 |
| 3.1 核酸SISPA扩增结果 |
| 3.2 病毒宏基因组学测序结果 |
| 3.2.1 蝙蝠病毒文库 |
| 3.2.2 啮齿动物病毒文库 |
| 3.2.3 活禽市场家禽粪便的病毒文库 |
| 4.讨论 |
| 二、温州病毒海口株的基因组分析和检测方法建立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒分离培养 |
| 1.2.2 引物设计和合成 |
| 1.2.3 病毒RNA的提取 |
| 1.2.4 cDNA的逆转录合成 |
| 1.2.5 温州病毒PCR验证 |
| 1.2.6 温州病毒基因组扩增 |
| 1.2.7 扩增产物纯化克隆和Sanger测序 |
| 1.2.8 病毒基因组注释与进化分析 |
| 1.2.9 检测方法建立 |
| 1.2.9.1 质粒标准品的制备 |
| 1.2.9.2 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 1.2.9.3 荧光定量PCR敏感性试验及标准曲线的建立 |
| 1.2.9.4 荧光定量PCR的初步应用 |
| 2.结果 |
| 2.1 病毒分离培养 |
| 2.2 温州病毒基因组全长扩增结果 |
| 2.3 温州病毒基因组序列比较结果 |
| 2.3.1 基因组结构分析 |
| 2.3.2 温州病毒同源性分析 |
| 2.4 温州病毒进化树分析 |
| 2.5 温州病毒检测方法建立 |
| 2.5.1 靶基因的扩增 |
| 2.5.2 敏感性试验及标准曲线的建立 |
| 2.5.3 熔解曲线的分析 |
| 2.5.4 疑似WENV感染的家鼠肝组织中病毒含量的检测 |
| 3.讨论 |
| 三、禽类轮状病毒海口株的基因组分析和检测方法建立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计和合成 |
| 1.2.2 病毒RNA的提取 |
| 1.2.3 cDNA的逆转录合成 |
| 1.2.4 轮状病毒PCR验证 |
| 1.2.5 轮状病毒基因组扩增 |
| 1.2.6 扩增产物纯化克隆和Sanger测序 |
| 1.2.7 病毒基因组注释与进化分析 |
| 1.2.8 检测方法建立 |
| 1.2.8.1 质粒标准品的制备 |
| 1.2.8.2 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 1.2.8.3 荧光定量PCR敏感性试验及标准曲线的建立 |
| 2.结果 |
| 2.1 轮状病毒VP7和VP4基因全长扩增结果 |
| 2.2 轮状病毒基因组序列比较结果 |
| 2.3 轮状病毒进化树分析 |
| 2.4 轮状病毒检测方法建立 |
| 2.4.1 靶基因的扩增 |
| 2.4.2 敏感性试验及标准曲线的建立 |
| 2.4.3 熔解曲线的分析 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 蝙蝠和蝙蝠病毒 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）G群轮状病毒鸽群分离株的全基因分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 核酸提取 |
| 1.3 高通量测序 (NGS) 文库构建 |
| 1.4 NGS测序 |
| 1.5 测序数据分析 |
| 1.6 基因组特性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因组解析 |
| 2.2 基因组比较分析 |
| 3 讨论与结论 |
（10）猪轮状病毒的分离鉴定及其环介导等温扩增反应检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 1.5 基因组学研究进展 |
| 1.6 轮状病毒检测方法的研究进展 |
| 1.6.1 免疫学方法 |
| 1.6.2 分子生物学技术 |
| 1.7 轮状病毒的疫苗研究进展 |
| 1.7.1 灭活苗 |
| 1.7.2 弱毒活疫苗 |
| 1.7.3 多价重配疫苗 |
| 1.7.4 基因工程疫苗 |
| 1.7.5 植物基因工程技术 |
| 第二章 猪腹泻病毒的流行病学调查 |
| 摘要 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 物品准备 |
| 2.3 实验仪器及试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 样品采集 |
| 2.4.2 无害化处理 |
| 2.4.3 样品保存 |
| 2.4.4 样品编号、采样单填写 |
| 2.4.5 样品处理 |
| 2.4.6 腹泻四联引物设计 |
| 2.4.7 RT-PCR检测 |
| 2.4.8 PCR的扩增 |
| 2.4.9 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 PCR检测结果 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三章 猪轮状病毒的分离与鉴定 |
| 摘要 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 病料的接种 |
| 3.4 引物设计 |
| 3.5 病毒RNA提取、反转录、PCR |
| 3.6 感受态的制备 |
| 3.7 PMD-18T-VP4、PMD-18T-VP7阳性质粒的构建与鉴定 |
| 3.8 猪轮状病毒蚀斑克隆纯化 |
| 3.9 猪轮状病毒TCID50的测定 |
| 3.9.1 细胞制备 |
| 3.9.2 滴定 |
| 3.9.3 接种 |
| 3.9.4 计算感染量 |
| 3.10 猪轮状病毒抗体检测方法的建立 |
| 3.10.1 猪轮状病毒中和试验用病毒的制备 |
| 3.10.2 猪轮状病毒抗体检测（中和试验） |
| 3.11 结果 |
| 3.11.1 猪轮状病毒分离与鉴定 |
| 3.11.2 PMD-18T-VP4、PMD-18T-VP7重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 3.11.3 JS分离株VP4基因型别分析 |
| 3.11.4 JS分离株VP7基因型别分析 |
| 3.11.5 猪轮状病毒的噬斑克隆纯化 |
| 3.11.6 TCID50测定 |
| 3.11.7 猪轮状病毒抗体检测方法的建立 |
| 3.12 讨论 |
| 第四章 猪轮状病毒LAMP检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验用毒株 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 猪轮状病毒JS分离株RNA的提取 |
| 4.2.2 病毒cDNA的制备 |
| 4.2.3 LAMP引物的设计 |
| 4.2.4 LAMP反应体系的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 最佳甜菜碱浓度的摸索 |
| 4.3.2 最佳Mg2+浓度的摸索 |
| 4.3.3 最佳反应温度的摸索 |
| 4.3.4 LAMP扩增产物的序列测定 |
| 4.3.5 LAMP引物特异性检测 |
| 4.3.6 LAMP引物灵敏性检测 |
| 4.3.7 临床样本检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、禽轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文参考文献）
- [1]鸡星状病毒的分离鉴定及其单克隆抗体的制备[D]. 赵伟. 扬州大学, 2021
- [2]华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究[D]. 常新见. 西藏大学, 2020(12)
- [3]基于Cap蛋白的鹅星状病毒遗传进化、单抗制备及定量检测技术研究[D]. 孙佳卉. 中国农业科学院, 2020(01)
- [4]我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查及绝对定量检测方法的建立[D]. 武宗仪. 扬州大学, 2019
- [5]新疆南疆部分规模奶牛场轮状和冠状病毒流行病学调查[D]. 崔鑫. 塔里木大学, 2019(07)
- [6]河南沿黄绿色奶业发展带奶牛子宫内膜炎细菌流行病学调查及土霉素治疗前后菌群差异的研究[D]. 肖杰. 吉林大学, 2018(04)
- [7]BRV与BCoV SYBR Green I RT-qPCR检测方法的建立及应用[D]. 曹禹. 黑龙江八一农垦大学, 2018(08)
- [8]海南岛重要动物宿主携带病毒的分子流行病学调查[D]. 张优. 海南医学院, 2018(08)
- [9]G群轮状病毒鸽群分离株的全基因分析[J]. 王楷宬,王素春,庄青叶,邱源,侯广宇. 中国动物检疫, 2018(01)
- [10]猪轮状病毒的分离鉴定及其环介导等温扩增反应检测方法的建立[D]. 张贺伟. 中国农业科学院, 2015(01)