一、RT-PCR检测非小细胞肺癌骨髓CEA mRNA的表达（论文文献综述）
李小丰[1]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中研究表明背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
栗家平[2]（2020）在《SALL4在非小细胞肺癌中表达的临床意义及作用分子机制的研究》文中研究指明目的:肺癌是临床上常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在我国均居恶性肿瘤的首位,肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占85%以上。目前肺癌的传统治疗方式包括手术切除、放疗和化疗等,但对于晚期肺癌患者,由于癌细胞发生转移、化疗敏感性低等因素,使得其治疗效果并不理想,五年生存率较低。肺癌的发生是一个涉及多种癌基因的异常表达及抑癌基因失活的过程,近年来,根据肺癌患者特定基因突变类型而进行的分子靶向治疗取得了巨大进展,并在一定程度上提高了肺癌患者的生存周期。因此,探究肺癌发生、转移的分子机制,为肺癌的临床治疗提供新的思路和干预靶标,对提高肺癌临床疗效具有重要意义。人类婆罗双树样基因（SALL4）是近年来发现的一种原癌基因,其编码一种锌指蛋白转录因子,在维持胚胎干细胞的自我更新和多能性方面发挥重要作用。SALL4可通过调节不同的信号通路、转录因子和表观遗传修饰等机制发挥其调控功能,参与了多种恶性肿瘤如肝癌、胃癌的发生和进展过程,且其表达水平影响肿瘤患者的预后。目前关于SALL4在肺癌中的调控作用和临床意义尚不多见,因此本研究旨在探讨SALL4在肺癌中的表达,分析SALL4表达水平与肺癌患者临床病理参数和预后的相关性,进而从细胞水平探讨SALL4对肺癌细胞生物学功能的调控作用及其可能的作用机制。方法:（1）采用RT-PCR检测30例肺腺癌患者肿瘤组织中SALL4 mRNA的表达水平,免疫组化（肺癌组织芯片,62例）检测肿瘤组织中SALL4表达并对染色结果进行评分,收集患者完整的临床资料,分析SALL4表达与患者各临床病理参数的相关性。根据回访情况绘制Kaplan-Meier生存曲线,分析SALL4表达对患者总生存周期和无病生存周期的影响,单因素和多因素回归分析SALL4表达对于预后判断的临床意义。（2）采用RT-PCR及Western blot法检测5种肺癌细胞系中S ALL4 mRNA和蛋白的表达水平,构建稳定敲低SALL4表达的肺癌细胞系,采用平板克隆形成实验和MTT法检测SALL4对肺癌细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测SALL4对肺癌细胞的细胞周期和细胞凋亡情况的影响,并采用Western blot检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白的表达。细胞划痕实验检测各组肺癌细胞的迁移情况,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测肺癌细胞EMT相关蛋白的表达。进而建立肺癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察在体内敲低SALL4表达对移植瘤生长的影响,并采用Western blot检测瘤体中相关蛋白的表达水平。（3）Western blot法检测转染后肺癌细胞中STAT3的表达及其磷酸化水平,在敲低表达SALL4的细胞中激活STAT3的表达,采用MTT法、流式细胞术和Transwell法检测共转染siRNA-SALL4和激活STAT3后细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化。结果:（1）SALL4的表达（mRNA）在30例肺癌肿瘤组织显着高于癌旁正常组织（P<0.05）。免疫组化（肺癌组织芯片:62例）结果显示,SALL4在肿瘤组织中的阳性率为67.7%（42/62）,而在癌旁正常组织SALL4表达的阳性率为19.4%（12/62）（P<0.05）,表明SALL4在肺癌组织中表达上调。临床病理资料分析结果显示,SALL4表达与患者TNM分期和淋巴结转移密切相关（P<0.05）,而与患者性别、年龄、吸烟状况、肿瘤大小和分化程度无显着相关性（P>0.05）,其中SALL4高表达组相比于SALL4低表达组具有更多的淋巴结转移例数和更高的TNM分期。预后分析结果显示,SALL4低表达者相比于SALL4高表达者具有更长的总生存期和无病生存期,且SALL4表达是肺癌患者预后的独立危险因子。（2）SALL4 mRNA和蛋白表达在肺癌细胞系中显着上调,与组织中表达情况一致。在A549和H358细胞系中构建稳定敲低SALL4表达的肺癌细胞系,RT-PCR结果显示转染siRNA-SALL4后,A549和H358细胞中SALL4的表达水平显着降低（P<0.05）,表明转染成功。平板克隆实验结果显示,抑制SALL4表达后,克隆形成数显着下降（P<0.05）;MTT结果显示,siRNA-SALL4组细胞从第2天开始生长活性显着低于对照组（P<0.05）,表明敲低SALL4可抑制肺癌细胞的增殖能力。流式细胞实验结果显示,抑制SALL4表达后,肺癌细胞发生凋亡的比例显着升高（P<0.05）,且可将肺癌细胞阻滞在G0/G1期,从而抑制细胞周期的进展。细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,抑制SALL4表达,肺癌细胞的迁移和侵袭能力均显着降低（P<0.05）。Western blot实验结果显示,抑制SALL4表达,肺癌细胞中Bax、Caspase3和Caspase9蛋白的表达增强,而Bcl-2蛋白表达减弱,同样,细胞周期相关蛋白CyclinB,CyclinE和Cyclin D1的表达也显着降低,且细胞EMT过程得到抑制。动物实验结果显示,敲低SALL4表达后,移植瘤体积和重量的增长速度均显着降低,即在体内水平降低SALL4表达可抑制肺癌移植瘤的生长;（3）Westernblot结果显示,敲低SALL4表达后,磷酸化p-STAT3的表达水平均显着下降,表明敲低SALL4可同时抑制STAT3的磷酸化过程。在转染siRNA-SALL4和激活STAT3后,si-SALL4+激活STAT3组肺癌细胞相比于siRNA-SALL4组的生长活性和侵袭能力显着增强,而凋亡能力显着减弱,表明激活STAT3可逆转敲低SALL4对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。结论:SALL4在肺癌组织和细胞系中表达均上调,其表达与患者TNM分期、淋巴结转移和预后明显相关;敲低SALL4表达可显着降低肺癌细胞的增殖活性、迁移和侵袭能力及EMT过程,并阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,其可能机制与SALL4可靶向激活STAT3信号通路有关。本研究为明确肺癌发生发展的分子机制提供了新的思路,并为寻找新的肺癌诊治的作用靶点提供理论基础。
胡孜鸣[3]（2020）在《靶向肺癌LunX的CAR-T细胞治疗》文中研究说明肺癌是目前全球高发的癌症之一,它具有高死亡率以及预后差等特点,然而目前针对于肺癌,并没有非常有效的治疗手段。近些年,随着细胞治疗的发展,CAR-T细胞治疗的研究和临床实验也在如火如荼的进行中。CAR-T细胞治疗是将T细胞从病人外周血中分离出来,经过体外的活化后利用慢病毒,逆转录病毒或者电转染等方式对T细胞进行转染,使其能够过表达CAR序列,而后通过一系列的检测和质控,再回输入病人的体内达到靶向杀伤肿瘤的目的。在过去的一些报道和临床实验中,虽然CAR-T细胞对于血液肿瘤有着良好的杀伤效果,但是对于实体肿瘤的治疗一直效果欠佳,主要原因包括:1、肿瘤微环境是一个免疫抑制的环境,存在大量免疫抑制细胞和细胞因子;2、缺乏特异性有效的靶点。前期研究证实肺癌细胞特异性高表达LunX蛋白,且用LunX单克隆抗体S-35-8治疗肺癌小鼠模型取得了很好的疗效,那么制备针对LunX蛋白的CAR-T细胞可能对肺癌也有着很好的治疗效果。基于此,我们展开了对针对LunX抗原的CAR-T细胞研究,并取得了如下结果:1、LunX特异性CAR-T细胞的构建我们使用SPR检测了 LunX蛋白单克隆抗体S-35-8与LunX抗原蛋白的亲和力,结果显示两者有着很高的亲和力,这也为我们后续的实验提供了充分条件。接着我们设计了 CARLunX的分子序列,在5’LTR段用信号肽序列来引导跨膜,随后使用S-35-8的单链抗体识别区序列和CD8α铰链区,用来增加CAR分子的灵活性,为了检测整个分子的的跨膜结构,我们在胞外区加入了 c-Myc标签蛋白,在CD28分子的跨膜区后连接着4-1BB共刺激域,同时我们使用另一个启动子EF1α来启动GFP荧光蛋白的表达,用来指征转染效率。我们分别将构建好的质粒直接进行PCR检测以及转染入293T细胞中进行RT-PCR检测,结果显示构建的CAR分子可以成功表达。接下来,为了进一步探究我们构建的CAR分子是否可以跨膜,我们将转染了 CAR分子的293T细胞进行免疫荧光的检测,我们从结果中可以看到,当293T细胞转染了 CAR序列以后,其细胞膜会大量表达C-Myc标签蛋白分子,胞内有GFP荧光蛋白的表达。以上结果说明,我们成功构建了CARLunX质粒。2、LunX抗原可以刺激CARLunX T细胞分泌细胞因子构建好CAR质粒以后,我们包装了慢病毒,并对T细胞进行了感染,通过对GFP以及c-Myc标签蛋白的检测,结果提示T细胞已高效率过表达CAR序列。随后对过表达CAR序列的T细胞进行免疫荧光检测,我们进一步确认CAR序列在T细胞中成功跨膜表达。为了探究CARlunXT细胞与LunX抗原是否有直接的作用,我们分别在铺有LunX的培养板里加入空白对照T细胞,无关对照CARCD19T和CARlunXT细胞进行孵育,经过24小时后,我们发现只有加入CARlunXT细胞的培养上清中有高浓度的效应细胞因子IFN-γ,IL-2和TNF-α。这些表明CARlunXT细胞可以被LunX抗原直接活化,并分泌大量的效应细胞因子。3、CARlunXT细胞可以靶向杀伤LunX抗原阳性的肺癌细胞我们分别用免疫荧光以及流式细胞术检测了肺癌细胞系NCI-H292,NCI-H1650,A549以及正常肺纤维细胞系HFL1表面LunX分子的表达情况,结果表明肺癌细胞系均表达LunX分子。我们使用CARlunXT细胞以及CARCD19T细胞对靶细胞进行杀伤检测,结果显示只有CARlunXT细胞才对LunX蛋白阳性的肺癌细胞系有特异性杀伤作用,而CARCD19T细胞不对肺癌细胞进行特异性的杀伤。4、LunX阳性的肺癌细胞可以特异性的活化CARlunXT细胞我们将肺癌细胞系NCI-H292,NCI-H1650以及A549分别与CARlunXT细胞和CARCD19T细胞共孵育后检测培养体系上清中效应细胞因子的浓度以及效应细胞的增殖情况,我们发现在靶细胞的刺激下,CARlunXT细胞会特异性分泌大量IFN-γ,IL-2和TNF-α,同时也会特异性的活化增殖。5、CARlunXT细胞可以抑制小鼠移植原位瘤模型的生长在之前的结果,我们已经验证了 CARlunXT细胞在体外对靶细胞有特异性杀伤作用,那么CARlunXT细胞在体内是否可以行使杀伤效应呢?于是我们构建了小鼠的移植原位瘤模型,发现经过CARlunXT细胞治疗后,小鼠相比于对照组,肿瘤的大小以及生长速率都得到了很好的抑制,与此同时,CARlunXT细胞治疗组小鼠的生存率也得到了明显的改善,为了观察CARlunXT细胞细胞在肿瘤中的浸润情况,我们对小鼠的肺脏进行了免疫荧光的检测,我们可以看到在肿瘤中有大量CARlunXT细胞的浸润。由此,CARlunXT细胞可以在体内发挥特异性的杀伤功能。6、CARlunXT细胞可以抑制小鼠PDX皮下肿瘤模型的生长为了进一步接近于病人体内肿瘤的真实情况,我们选用了病人来源的肺癌组织,对小鼠进行了皮下移植,经过测量和观察,使用CARlunXT细胞治疗以后,小鼠的PDX肿瘤的大小得到了明显的移植,同时生存率也得到了提升。为了观察CARlunXT细胞在肿瘤中的浸润情况,我们对肿瘤进行了免疫荧光检测,结果显示肿瘤内部存在CARlunXT细胞的浸润。在治疗期间,我们对小鼠的体重进行了统计,与对照组相比,小鼠的体重保持在比较稳定的状态,说明CARlunXT细胞治疗在体重方面不存在副作用。所以,CARlunXT细胞可以有效治疗PDX小鼠模型。综上所述,我们构建了针对于肺癌的CARlunXT细胞,并在体外和体内对其特异性和有效性进行了验证,发现CARlunXT细胞可以对肺癌细胞在体外进行有效的杀伤,同时在小鼠模型中,CARlunXT细胞可以抑制肿瘤的生长,延长小鼠的生存率。该研究中CARlunXT细胞对于治疗肺癌实体瘤具有潜在价值。
唐兴[4]（2020）在《循环肿瘤细胞、经皮肺穿刺活检及18F-FDG PET/CT显像在非小细胞肺癌患中的临床应用》文中认为第一部分 免疫磁珠阴性富集法、靶向荧光定量PCR技术在非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞检测中的运用目的:对非小细胞肺癌患者的外周血循环肿瘤细胞与临床病理资料、手术分期等进行相关性研究,分析其应用于临床早期诊断的可行性。方法:对136例非小细胞肺癌患者、10例肺良性疾病患者和54例健康人外周血进行叶酸免疫磁珠阴性富集法检测循环肿瘤细胞,并用肿瘤特异性叶酸配体寡核苷酸偶合物进行标记,再对其定量PCR扩增,分析年龄、性别、肿瘤大小、组织学分型与TNM分期的相关性。评估其在非小细胞肺癌诊断中的敏感性和特异性,比较与CEA、CA125、CA724、CYFRA21-1、NSE等其他血清肿瘤标志物的诊断效能。结果:（1）健康人组CTC中位数为4.95 FU/3ml,肺良性疾病组为7.55FU/3ml,肺癌组为11.21Fu/3ml。三组间差异有统计学意义（Kruskal-Wallis检验,P=0.000和0.018）,健康组与良性肺疾病组差异也有统计学意义（Mann-Whitney U检验,P=0.000）。（2）肺癌患者 CTC 中位数分别为:Ⅰ 期 11 FU/3ml,Ⅱ 期 13.25 FU/3ml,Ⅲ期14.77 FU/3ml,Ⅳ期17.89 FU/3ml四组间差异有统计学意义（Kruskal-Wallis检验,P<0.05）。不同T分期、分化等级、年龄、性别、肿瘤最大径及病理亚型患者间的CTC水平差异均无统计学意义（Kruskal-Wallis检验:T1 vs T2 vs T3 vs T4,P=0.254;G1 vs G2 vs G3,P=0.424;Mann-Whitney U 检验:<60 岁 vs≥60 岁,P=0.853;男 vs 女,P=0.739;≤3cm vs>3cm,P=0.322;鳞癌 vs 腺癌,P=0.497）。（3）以 CTC=8.70 FU/3mL为cutoff值,此时灵敏度为79.4%,特异度为98.1%,AUC曲线下面积为0.953（95%CI:0.926,0.979）,诊断效能优于 CEA、CA125、CA724、CYFRA21-1、NSE 等其他血清肿瘤标志物。CTC 阳性检出率与患者年龄、性别、肿瘤最大径、分化等级、病理亚型、TNM分期间无明显统计学差异（P值为0.319、0.972、0.341、0.268、0.125和 0.208）。结论:本研究通过以叶酸为靶点的免疫磁珠阴性富集法,靶向荧光定量PCR扩增分析非小细胞肺癌患者外周血CTC,发现该技术具备良好的诊断效能,可用于肺癌筛查。第二部分循环肿瘤细胞、经皮肺穿刺活检结合18F-FDG显像在周围型肺部结节疾病早期诊断中的运用目的:对周围型肺部结节疾病患者手术前行18F-FDG PET/CT显像与经皮肺穿刺活检,比较其与外周血循环肿瘤细胞对周围型肺部结节疾病早期诊断的优劣。方法:对44例周围型肺部结节疾病患者手术前行18F-FDGPET/CT显像测定SUV max值,经皮肺穿刺活检并测定外周血循环肿瘤细胞,比较三者敏感性、特异性、准确性,推断对周围型肺部结节疾病的早期诊断效能。结果:（1）18F-FDG PET SUVmax中位数为2.35<2.5（阳性诊断标准值）,单样本Wilcoxon带符号秩和检验,P=0.469,两组差异无统计学意义,说明该组患者18F-FDG PET检查总体阳性率不高。PET/CT敏感度36%,特异度57.89%,准确度45.45%,kappa=0.058,P=0.680>0.05,PET/CT与最终手术病理结果一致性较差,差异没有统计学意义。（2）本组CTC中位数为9.35FU/3ml,敏感度88%,特异度84.21%,准确度86.36%,kappa=0.722,P=0.00,CTC与最终手术病理结果一致性一般,差异有统计学意义。（3）经皮肺穿刺活检的敏感度84%,特异度100%,准确度90.91%,kappa=0.819,P=0.000,经皮肺穿刺活检与最终手术病理结果一致性较好,差异有统计学意义。（4）以CTC、SUVmax结果绘制ROC曲线,AUC曲线下面积分别为0.965（95%CI:0.916,1.000）和 0.656（95%CI:0.487,0.825）,CTC 诊断效能明显优于PET/CT。结论:由于早期恶性周围型肺部结节疾病,尤其是磨玻璃样病变,18F-FDG PET/CT摄入量偏低,容易造成PET/CT假阴性结果,导致诊断效能不高。经皮肺穿刺活检虽然敏感度、特异度和准确度都很高,却是一种有创操作且容易引起并发症。外周血循环肿瘤细胞检测具有快捷方便、非侵入性、可重复性、诊断效能高等特点,可以弥补前两者的缺点,成为早期周围型肺癌诊断中的有力武器。
陈东芹[5]（2015）在《HDAC1/4负向调控miR-200b表达参与人肺腺癌化疗耐药表型形成的分子机制研究》文中指出一、背景与目的肺癌的发病率和死亡率高居各种恶性肿瘤的首位,严重危害人类健康,是全球范围内的公共卫生问题。肺腺癌是肺癌的主要病理类型。化学治疗是目前临床治疗肺腺癌一线方案的主要组成部分。但是,化疗耐药是肺腺癌临床治疗所面临的重大难题,化疗耐药的形成与肿瘤耐药相关基因的遗传学及表观遗传学修饰的分子调控密切相关。组蛋白乙酰化是表观遗传修饰调控基因表达的重要方式之一,调控基因表达参与多种生理及病理过程。本课题前期研究发现:微小RNA（micro RNA,miR）-200b在肺腺癌耐药细胞中呈现显着的低表达,升高miR-200b表达水平能显着逆转肺腺癌的化疗耐药表型;进一步研究发现抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetyltransferase,HDAC）后,miR-200b表达水平明显上调。本课题拟在前期成功建立人肺腺癌细胞多西他赛耐药模型、miR-200b功能学以及生物信息学分析基础上,通过免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、位点突变、荧光素酶活性试验等实验方法探索HDACs负向调控miR-200b表达的分子机制,从体外和体内等层面探讨miR-200b表达的组蛋白乙酰化调控与肺腺癌化疗耐药之间的关系,从而为肺腺癌的个体化治疗和逆转肺腺癌化疗耐药提供新的策略。二、材料与方法1.运用实时定量RT-PCR法检测人肺腺癌细胞株SPC-A1和H1299及其对应多西他赛耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞miR-200b的表达水平,以及给予DNA甲基转移酶特异性抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR）处理后miR-200b的表达水平变化;焦磷酸测序法检测给予5-Aza-CdR后,两种耐药株miR-200b启动子区甲基化水平变化。2.Western blot法检测HDAC抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）和丙戊酸（valproic acid,VPA）处理后,两种耐药株乙酰化组蛋白H3的蛋白水平变化;实时定量RT-PCR法检测给予HDAC抑制剂TSA和VPA处理后耐药株miR-200b的表达水平变化。3.MTT法测定给予不同浓度HDAC抑制剂TSA和VPA处理后,耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的半数抑制浓度（IC50）值。4.合成针对HDAC1-11 的siRNAs,分别转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,Western blot法验证各种siRNAs的转染效果,实时定量RT-PCR法检测转染后miR-200b的表达水平;实时定量RT-PCR法和Western blot法分别检测人肺腺癌亲本株 SPC-A1 和 H1299 和对应耐药株 SPC-A1/DTX 和 H1299/DTX 中 HDAC1/4 的mRN A和蛋白表达水平。5.分析miR-200b的启动子区,构建含Sp1结合位点的虫荧光素酶报告基因载体[pGL3-promoter-1,pGL3-promoter-2,pGL3-promoter-1（Sp1-1mut）,pGL3-promoter-1（Sp1-2mut）,pGL3-promoter-1（Sp1-1/2mut）,pGL3-promoter-2,pGL3-promoter-2（Sp1mut）],分别构建针对HDAC 1/4基因的干扰质粒（sh-HDAC 1/4）。将上述虫荧光素酶报告基因载体转染或与sh-HDAC 1/4共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,双荧光素酶法检测虫荧光素酶活性。sh-HDAC1/4分别或与siRNA-Sp1共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,实时定量RT-PCR法检测miR-200b的表达水平。6.免疫共沉淀法验证HDAC1以及HDAC4与Sp1在活细胞内的结合,染色质免疫共沉淀法验证Sp1与miR-200b基因启动子结合,染色质免疫共沉淀法验证HD AC1/4与miR-200b基因启动子结合,染色质免疫共沉淀检测sh-HDAC 1/4转染后miR-200b基因启动子区Sp1结合区域组蛋白H3乙酰化水平的变化。7.收集68例使用过含多西紫杉醇化疗方案的晚期肺腺癌患者的肿瘤组织标本,根据治疗反应的不同,分为“敏感组”和“不敏感组”;实时定量RT-PCR法检测上述两组HDAC1/4、miR-200b的mRNA水平;并将HDAC1/4与miR-200b 的mRNA表达水平进行相关性分析;分析HDAC1/4的表达水平与临床预后的关系。8.合成针对miR-200b基因的单链抑制物（miR-200b inhibitor）以及miR-200b的模拟剂（mimics）,从其他研究者手中获得针对HDAC1/4基因的过表达质粒（pcDNA3.1/HD AC 1/4）;将上述质粒或小RNA分别或与sh-HDAC 1/4共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,MTT法测定经上述处理的耐药细胞对DTX和PIX 的 IC50 值。9.将miR-200b inhibitor,sh-HDAC1/4及对照载体分别或共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,克隆形成实验测定细胞体外增殖能力,流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率,Westernblot法测定cleaved-Caspase 3和Caspase 3的蛋白水平变化。10.构建pri-miR-200b基因表达载体（pPG/miR-200b）,将pPG/miR-200b,sh-HDAC 1/4及对照质粒稳定转染到H1299/DTX细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后给予DTX腹腔注射,绘制肿瘤生长曲线,6周时处死裸鼠后获取瘤体组织,实时定量RT-PCR检测miR-200b的表达水平,免疫组化染色检测肿瘤组织Ki67和PCNA的表达水平,Tunel染色法测定各组的凋亡水平差异。11.将miR-200b inhibitor,sh-HDAC1/4及对照载体分别或共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,实时定量RT-PCR检测E2F3、Aurora-A和Survivin的mRNA表达水平,Westernblot检测E2F3、Aurora-A和Survivin的蛋白表达水平;Westernblot检测裸鼠肿瘤组织中HDAC1/4、E2F3、Aurora-A和Survivin的蛋白表达水平,免疫组化染色检测裸鼠肿瘤组织中HDAC1/4、E2F3、Aurora-A和Survivin的表达水平。12.分别分析Aurora-A和Survivin的启动子区,构建含E2F3结合位点的虫荧光素酶报告基因载体[pGL3-Aurora-A,pGL3-Aurora-A（E2F3-1 mut）,pGL3-Aurora-A（E2F3-2 mut）,pGL3-Aurora-A（E2F3-1+2 mut）,pGL3-Survivin,pGL3-Survivin（E2F3 mut）],转染或与 sh-HDAC 1/4、miR-200b inhibitor共转染SPC-A1/DTX细胞,双荧光素酶法检测虫荧光素酶活性。转染sh-contro1、sh-HDAC1/4到SPC-A1/DTX细胞,染色质免疫共沉淀检测sh-HDAC 1/4X对Aurora-A和Survivin启动子上E2F3结合量的影响。三、结果1.与亲本株SPC-A1和H1299相比,耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平明显降低（p<0.01）;给予足够浓度的5-Aza-CdR后,SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平未见明显变化（p>0.05）;焦磷酸测序发现SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞miR-200b启动子区呈现高甲基化状态;给予20μmol/L的5-Aza-CdR后,其甲基化水平变化未见显着改变。2.给予TSA和VPA处理后,两种耐药株乙酰化组蛋白H3的蛋白表达水平明显升高。给予TSA和VPA后,SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平明显升高（p<0.01）,并呈浓度和时间依赖性。3.HDAC抑制剂TSA和VPA可降低耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞对DTX和PTX的IC50值（p<0.01）,并呈浓度依赖性。4.针对HDAC1-11的siRNAs都可以降低相应HDAC的蛋白表达水平;干扰HDAC1/4后,两种耐药株miR-200b的mRNA表达水平都明显上升（p<0.01）。耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞HD AC 1/4的mRN A和蛋白表达量明显高于相应亲本株SPC-A1和H1299细胞。5.经过分析发现,miR-200b的两个启动子区都含有Sp1结合位点;miR-200b的两个启动子在两种耐药株中都有荧光素酶活性（p<0.01）;干扰HDAC1/4后,miR-200b的两个启动子荧光素酶活性明显升高（p<0.01）;当对启动子区Sp1结合位点进行部分或完全突变后,再给予干扰HDAC1/4后,miR-200b的两个启动子活性升高程度降低或无明显变化（p<0.05或p>0.05）。干扰HDAC1/4后,耐药株miR-200b的mRNA表达水平明显升高（p<0.01）;干扰Sp1可部分逆转干扰HDAC1/4所引起的miR-200b表达水平升高（p<0.05）。6.在活细胞状态下,Sp1既可以与HDAC1结合也可以与HDAC4结合;Sp1、HDAC1/4可以与miR-200b基因启动子区的相应Sp1结合位点结合;下调HDAC1/4表达可以提高miR-200b基因启动子区Sp1结合区域组蛋白H3乙酰化水平。7.在多西紫杉醇化疗方案不敏感的肺腺癌肿瘤标本中,HDAC1/4的mRNA水平较敏感组明显升高（p<0.01）。在临床组织标本中,miR-200b的表达水平既与HDAC1 呈负相关（rho=-0.799,p<0.01）也与HDAC4呈负相关（rho=-0.781,p<0.01）。与低水平HDAC1组相比,高水平HDAC1组的无进展生存期明显缩短（p<0.05）。同样,与低水平HDAC4组相比,高水平HDAC4组的无进展生存期明显缩短（p<0.01）。8.抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的IC50值显着下降（p<0.01）;抑制miR-200b可部分逆转干扰HDAC1/4的上述效应（p<0.05）。过表达HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的IC50值显着上升（p<0.05）;上调miR-200b后,过表达HDAC1/4对耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的IC50值无明显影响（p>0.05）。9.在DTX存在的情况下,抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX的体外增殖能力显着下降（p<0.01）;抑制miR-200b可部分抵消干扰HDAC1/4引起的耐药细胞体外增殖能力的降低（p<0.05）。在DTX存在的情况下,抑制HDAC4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX的细胞周期S期减少,G2/M期增加（p<0.01）;抑制miR-200b可部分抵消干扰HDAC4引起的耐药细胞细胞周期S期减少,G2/M期增加（p<0.05）。在DTX存在的情况下,抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX的早期凋亡率显着增加（p<0.01）;抑制miR-200b可部分减弱干扰HDAC1/4引起的耐药细胞早期凋亡率的增加（p<0.05）。抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX中cleaved-Caspase 3的蛋白表达水平显着增加;抑制miR-200b可部分减弱干扰HDAC1/4对耐药细胞cleaved-Caspase 3的蛋白表达的影响。10.与对照组相比,给予DTX后,抑制HDAC1/4组或过表达miR-200b组的裸鼠皮下移植瘤生长明显减慢（p<0.05）。与对照组相比,HDAC1/4抑制组或miR-200b过表达组的miR-200b的mRNA水平明显升高（p<0.01）。在移植瘤组织中,抑制HDAC1后,Ki67和PCNA的阳性率明显下降,凋亡细胞的阳性率明显增加;抑制HDAC4或过表达miR-200b后,Ki67和PCNA的阳性率明显下降,凋亡细胞的阳性率明显增加。11.在耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX中,抑制HDAC1 后,E2F3和Survivin的mRNA及蛋白表达水平均明显下调（p<0.01）;抑制HDAC4后,E2F3、Survivin和Aurora-A的的mRNA及蛋白表达水平均明显下调（p<0.01）;抑制miR-200b可部分抵消抑制HDAC1/4对E2F3、Survivin或Aurora-A表达水平的影响（p<0.05）。在移植瘤组织中,抑制HDAC1后,E2F3和Survivin的蛋白表达水平明显下调,E2F3和Survivin的阳性率明显下降;抑制HDAC4或过表达miR-200b后,E2F3、Survivin和Aurora-A的蛋白表达水平明显下调,E2F3、Survivin和Aurora-A的阳性率明显下降。12.Aurora-A和Survivin的启动子区有E2F3转录因子的结合位点;在耐药株SPC-A1/DTX细胞中,Aurora-A和Survivin的启动子有荧光素酶活性（p<0.01）;干扰HDAC1后,Survivin的启动子活性明显降低（p<0.01）;当对S urvivin启动子区E2F3结合位点进行突变后,干扰HD AC 1对S urvivin的启动子活性无明显影响（p>0.05）。干扰HDAC4后,Aurora-A和Survivin的启动子活性明显降低（p<0.01）;当对Aurora-A和S urvivin启动子区E2F3结合位点进行突变后,干扰HDAC4对Aurora-A和Survivin的启动子活性无明显影响（p>0.05）,对Aurora-A启动子区E2F3部分结合位点进行突变可减弱干扰HDAC4对Aurora-A启动子活性的影响（p<0.05）。在SPC-A1/DTX细胞中,干扰HDAC1后,Survivin启动子上的E2F3转录因子结合量明显降低（p<0.01）,而Aurora-A启动子上的E2F3转录因子结合量未见明显改变（p>0.05）;干扰HDAC4后,Aurora-A和Survivin启动子上的E2F3转录因子结合量明显降低（p<0.01）。四、结论与意义1.组蛋白乙酰化而非DNA甲基化参与了人肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX miR-200b的表达调控,进而参与调控了人肺腺癌的化疗抵抗。2.在HDAC1-11的亚型中,HDAC1/4参与调控耐药株miR-200b的表达,HDAC1/4和miR-200b表达水平与肺腺癌患者预后密切相关。3.HDAC1/4/miR-200b信号通路可以在体内、体外层面参与调控人肺腺癌的化疗耐药。4.HDAC1/4/Sp1/miR-200b 信号轴通过进一步调控 E2F3/Aurora-A 和E2F3/S urvivin的表达可能是HDAC 1/4/miR-200b信号通路参与调控人肺腺癌化疗耐药的重要分子机制。5.本研究首次报道了 HDAC1/4/Sp1/miR-200b/E2F3/Aurora-A/S urvivin 信号轴参与调控人肺腺癌化疗耐药;揭示了在临床标本中HDAC 1/4与miR-200b表达水平密切相关,并且与肺腺癌患者预后密切相关;本课题从组蛋白乙酰化层面揭示了人肺腺癌细胞中miR-200b基因表达下调的原因,为临床肺腺癌的个体化治疗及逆转人肺腺癌的化疗抵抗提供了新的分子靶点。
夏茂[6]（2015）在《线粒体自噬调控麻疹病毒疫苗株在非小细胞肺癌中的溶瘤作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景与目的肿瘤已成为危及全人类生命的重大疾病,其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是目前发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一。在肿瘤基因治疗领域,运用病毒治疗肿瘤的溶瘤病毒治疗（Oncolytic virotherapy）备受瞩目。其中溶瘤麻疹病毒疫苗株（MV-Edm）因其可靠的安全性和良好的溶瘤效果已经进入几项临床试验。明确调控MV-Edm瘤内复制及其溶瘤的相关机制对于有效促进病毒复制并提高其溶瘤效果非常关键。本研究首次探讨MV-Edm在NSCLC中,是如何通过诱导细胞线粒体自噬来调控抗病毒固有免疫和凋亡信号通路,以促进病毒的复制,并最终导致NSCLC坏死性细胞死亡的溶瘤新机制。同时,在阐明这些新的调控机制的基础上,提出优化MV-Edm溶瘤治疗的新策略。材料与方法1.细胞自噬的检测:1)将eGFP-LC3质粒分别转染A549和H1299细胞后感染MV-Edm,然后通过激光共聚焦显微镜观察细胞内eGFP-LC3的分布情况;2)单独感染MV-Edm或与氯喹（Chloroquine,CQ）共处理细胞,通过western blot方法检测LC-3Ⅱ和SQSTM1蛋白的表达情况。2.线粒体自噬的检测:1)将eGFP-LC3质粒转染细胞后感染MV-Edm,使用线粒体红色荧光探针（MitoTracker Red）标记细胞内线粒体,最后通过激光共聚焦显微镜观察细胞内线粒体与自噬体是否发生共定位;2)用透射电子显微镜观察MV-Edm感染的细胞内是否存在包裹线粒体的双层膜结构;3)MV-Edm感染细胞后,用线粒体绿色荧光探针（MitoTracker Green）标记细胞内线粒体,通过流式细胞仪检测分析细胞内线粒体数量;4)用MV-Edm感染细胞后,通过western blot方法检测线粒体蛋白--热休克蛋白60（Heat shock protein 60,HSP60）的含量。3.细胞自噬调控固有免疫和凋亡信号通路的检测:在NSCLCs中,利用siRNA介导的基因沉默技术抑制自噬关键靶分子（ATG7、BECN1、SQSTM1以及RAB7）的表达和质粒介导的基因过表达技术上调自噬关键靶分子（ATG5K130R和ATG5）,然后感染MV-Edm,检测细胞内病毒的复制、Ⅰ型干扰素等抗病毒免疫分子表达、DDX58/IFIH1/MAVS通路相关分子的表达、细胞凋亡的特征性变化、Cyto-Cytochrome C、caspase-9、caspase-3、cleaved-PARP蛋白的表达、细胞内损伤线粒体数量的变化等,以明确MV-Edm诱导的自噬对病毒复制的影响以及与凋亡的相互调控关系。4.MV-Edm溶瘤机制的检测:1)用泛caspase抑制剂（z-VAD-fmk）,程序性坏死特异性抑制剂（Necrostatin-1）或ROS抑制剂NAC分别预处理NSCLCs,然后感染MV-Edm,通过台盼蓝计数的方法检测细胞活度;2)用不同MOI的MV-Edm感染NSCLCs,检测细胞活度,LC3-Ⅱ及SQSTM1的表达,分析其相关性;3)用 MV-Edm 感染 NSCLCs,通过 western blot 方法检测 caspase-3、cleaved-PARP水平;4)用MV-Edm感染NSCLCs,检测胞外HMGB1蛋白的表达,细胞内ATP含量,病毒的复制动态水平,分析其相关性;5)用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。结果1.MV-Edm感染NSCLCs可以诱导具有完整功能的细胞自噬,表现为外源转染的LC3发生点状聚集、LC3蛋白发生型别转换即被脂质化、自噬受体蛋白SQSTM1随感染时间的延长减少和溶酶体自噬降解LC3-Ⅱ的过程被氯喹抑制。2.MV-Edm感染NSCLCs诱导线粒体自噬:MV-Edm感染促进细胞内线粒体与自噬体发生共定位;MV-Edm感染的细胞内能观察到大量包裹线粒体的双层膜结构;MV-Edm感染的细胞内线粒体数量随时间延长显着减少;MV-Edm感染的细胞内,线粒体标志蛋白HSP60的含量显着降低。3.抑制细胞自噬后,细胞内病毒的复制降低,Ⅰ型干扰素等抗病毒免疫分子表达增加,DDX58/IFIH1/MAVS通路相关分子的表达增加;细胞内损伤线粒体数量增加,同时Cyto-Cytochrome C、caspase-9、caspase-3、cleaved-PARP凋亡相关蛋白的表达增加,凋亡细胞数量增加,。4.MV-Edm诱导SQSTM1介导的线粒体自噬,一方面导致定位在线粒体外膜上的MAVS减少,减弱细胞内抗病毒固有免疫应答;另一方面降解损伤线粒体抑制损伤线粒体内细胞色素C的释放,抑制细胞凋亡通路激活,同时促进MV-Edm的复制。5.MV-Edm的复制与诱导持续的细胞自噬最终导致胞内ATP的耗竭,引起NSCLCs坏死性死亡。结论与意义1.MV-Edm通过诱导线粒体自噬来抑制细胞的抗病毒固有免疫应答,这个新发现揭示了 MV-Edm抵御细胞抗病毒免疫的新机制。2.MV-Edm通过诱导线粒体自噬抑制细胞凋亡,促进病毒的复制,导致NSCLC坏死性细胞死亡,阐述了以前尚未明确的新的溶瘤机制。3.意义:这些新发现的溶瘤机制和调控抗病毒免疫的机制,为通过调节自噬增强MV-Edm溶瘤效果的进一步研究提供了新思路,为优化MV-Edm溶瘤策略提供新的理论依据和可行方法,同时也为抗病毒治疗提供借鉴。
曾薇,李惠武[7]（2013）在《肺癌微转移检测与分子分期的研究进展》文中进行了进一步梳理目前,国际通用的肺癌TNM分期法对肺癌治疗策略的制定和预后的判断有重要意义,但相同TNM分期的预后存在差异可能由于肿瘤微转移所致。利用分子生物学的技术手段和标记物检测肿瘤微转移以及在TNM分期的基础上进行肺癌分子分期,可以弥补TNM分期的不足,使诊断精确到分子水平。依据肺癌分子分期,制定规范化的治疗方案,对于降低肿瘤复发、转移及改善预后有重要意义。
刘涛[8]（2013）在《RT-PCR检测非小细胞肺癌外周血LUNX和MAGE-1基因的表达及意义》文中进行了进一步梳理目的探讨肺组织特异性基因（LUNX）和黑色素瘤抗原基因-1（MAGE-1）在人非小细胞肺癌（NSCLC）外周血的表达及其意义。方法收集56例NSCLC和30例肺部良性疾病患者以及4例正常人的外周血标本,采用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测外周血LUNX和MAGE-1基因mRNA表达水平,并对非小细胞肺癌患者进行随访。结果①NSCLC患者外周血中的LUNX mRNA、MAGE-1mRNA表达率分别为32/56（57.14%）、33/56（58.93%）,而对照组均无表达;②LUNX mRNA、MAGE-1mRNA基因,两者之一在NSCLC患者外周的表达率为47/56（83.93%）；③外周血LUNX mRNA的表达与NSCLC患者的肿瘤细胞分化程度、临床分期关系密切（P<0.05）,而患者年龄、性别、吸烟、民族、病理类型等无关（P>0.05）；外周血MAGE-1mRNA的表达与NSCLC患者的肿瘤细胞分化程度关系密切（P<0.05）,与临床分期可能关系密切（P=0.049）,而与患者年龄、性别、吸烟、民族、病例类型等无关（P>0.05）；④外周血LUNX mRNA的表达与NSCLC患者的复发（转移）无关（P>0.05）,外周血MAGE-1mRNA的表达与NSCLC患者的复发（转移）无关（P>0.05）,但外周血LUNX mRNA和MAGE-1mRNA均表达与NSCLC患者有复发（转移）密切关系（P<0.05）。结论①LUNX mRNA、MAGE-1mRNA可作为检测非小细胞肺癌患者微转移特异、敏感的分子标志物；②应用RT-PCR检测非小细胞肺癌外周血LUNX和MAGE-1基因mRNA表达可能有助于提高非小细胞肺癌微转移的检出率；③NSCLC外周血LUNX基因mRNA阳性表达与肿瘤复发（转移）无关。NSCLC外周血MAGE-1基因mRNA阳性表达与肿瘤复发（转移）无关。但NSCLC外周血LUNX、MAGE-1基因mRNA均阳性表达者较至少有一基因阴性表达者容易复发（转移）。
邵丰[9]（2013）在《Ⅰ期非小细胞肺癌淋巴结中肺特异性蛋白X mRNA表达与微转移及预后的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的：本研究采用实时荧光定量PCR法检测Ⅰ期非小细胞肺癌肺门（N1）及隆突下（N2）淋巴结中肺特异性蛋白X （lung specific X protein, LUNX） mRNA的表达,作为淋巴结微转移标记物并分析其表达与患者预后的相关性,为临床治疗研究提供实验依据。方法：选取2005-2010年南京市胸科医院胸外科160例术后经病理证实为Ⅰ期非小细胞肺癌（NSCLC）患者,分别选取患者肿瘤组织、肺门（N1）及隆突下（N2）淋巴结各160枚；另取10例术后证实为肺良性疾病患者淋巴结10枚作为对照组,采用实时荧光定量（real-time quantitative） RT-PCR的方法检测肿瘤及淋巴结组织中肺特异性蛋白X mRNA的表达,并分析其表达与肿瘤大小、病理分期、病理类型及预后等相关性。结果：LUNX mRNA在160例患者的肿瘤组织中均有表达,在10例良性疾病患者淋巴结中未见表达。在160枚N1淋巴结中有19枚表达,其中腺癌患者淋巴结12枚,鳞癌患者淋巴结7枚；IA期患者淋巴结6枚,IB期患者淋巴结13枚。在160枚N2淋巴结中17枚表达,其中腺癌患者淋巴结14枚,鳞癌患者淋巴结3枚；IA期患者淋巴结5枚,IB期患者淋巴结12枚。7例患者N1、N2淋巴结均有表达,且患者病理类型均为腺癌,7例患者中IA期患者2人,IB期患者5人。统计分析显示,腺癌患者淋巴结微转移率明显高于鳞癌患者,IB期患者淋巴结微转移率明显高于IA期。腺癌患者N2淋巴结微转移率明显高于鳞癌患者,IB期患者N2淋巴结微转移率明显高于IA期。与鳞癌患者相比,腺癌患者发生N2淋巴结微转移率较高。生存分析显示,存在淋巴结微转移患者其生存率较不存在淋巴结微转移患者降低,预后较差。Ⅰ期非小细胞癌患者存在N1淋巴结微转移并不影响患者的生存率,而存在N2淋巴结微转移患者其生存率则显着降低,预后明显较差,而N1、N2淋巴结均存在微转移患者与仅N2淋巴结微转移患者相比生存率无明显差别。结论：腺癌和IB期患者淋巴结微转移率均高于鳞癌和IA期患者。腺癌和IB期患者N2淋巴结微转移率高于鳞癌和IA期患者。与鳞癌患者相比,腺癌患者发生N2淋巴结微转移率较高。Ⅰ期NSCLC患者存在N1淋巴结微转移并不影响患者的生存率,但存在N2淋巴结微转移患者其生存率则显着降低,预后明显较差,而N1、N2淋巴结均存在微转移患者与仅N2淋巴结微转移患者相比生存率无明显差别。腺癌患者淋巴结微转移率明显高于鳞癌患者,尤其是N2淋巴结微转移率高于鳞癌患者,可能是腺癌患者预后相比鳞癌患者较差的原因。IB期患者淋巴结微转移率明显高于IA期患者,尤其是N2淋巴结微转移率高于IA期患者,可能是IB期患者预后相比IA期患者较差的原因。
宋平平[10]（2013）在《非小细胞肺癌血行微转移以及基因多态性的相关研究》文中提出第一部分CD44V6和CK19基因表达与非小细胞肺癌血行微转移的相关研究目的：检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）癌组织和外周血中CD44V6和CK19基因的表达,探讨CD44V6和CK19基因表达与NSCLC外周血微转移的关系及其临床意义。方法：随机选择56例NSCLC患者,应用免疫组织化学技术检测NSCLC组织中CK19、CD44V6基因表达,同时采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测NSCLC外周血中CK19mRNA、CD44V6mRNA表达情况；采集20例肺部良性病变患者正常肺组织和外周血作对照。结果：1.CD44V6基因在NSCLC组织中表达显着高于良性病变正常肺组织（P<0.001）,CD44V6高表达与TNM分期（P=0.005）、淋巴结转移（P=0.024）有关。CK19在NSCLC组织和良性病变肺组织均为高表达,与临床病理特征未见相关性,无统计学差异。2. NSCLC患者外周血中CD44V6mRNA及CK19mRNA的阳性表达率分别为64.29%（36/56）、57.14%（32/56）,均显着高于对照组（P<0.05）。CD44V6mRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期NSCLC中阳性表达率分别为35.71%、66.67%、86.67%,其阳性表达率与临床分期（P=0.016）、淋巴结转移（P=0.02）有关；CK19mRNA在ⅠⅡ、Ⅲ期NSCLC中阳性表达率分别为28.57%、59.30%、80.0%,其阳性表达与临床分期有关（P=0.019）。3.CD44V6和CK19在NSCLC组织中表达与外周血中表达均呈正相关（P<0.05）, NSCLC外周血中CD44V6mRNA与CK19mRNA表达成正相关（P=0.002）；CD44V6mRNA与CK19mRNA联合检测阳性率为75.0%,优于单基因检测。结论：CD44V6和CK19基因在NSCLC癌组织和外周血中表达较高,CD44V6高表达与NSLCL的侵袭转移特性相关,CD44V6mRNA和CK19mRNA联合检测有助于提高阳性率,可作为检测NSCLC患者外周血循环肿瘤细胞的分子标志物。第二部分手术操作对非小细胞肺癌术中血行微转移的影响目的：探讨NSCLC肺静脉血中循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）定量检测方法,以及手术操作对非小细胞肿癌血行微转移的影响。对象和方法：随机选择30例可手术NSCLC患者,随机分为先结扎肺静脉组和先结扎肺动脉组,以CD44V6和CK19基因作为检测标志物,采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RTPCR）技术检测手术前、后期肺静脉血中,CK19mRNA和CD44V6mRNA表达情况,同时采集15例健康志愿者外周血作对照。结果：1.NSCLC患者肺静脉血中,CD44V6mRNA和CK19mRNA分别为7.93±1.7010.76±2.74,显着高于对照组外周血,差异有统计学意义（P<0.05）。2.肺动脉先结扎组CD44V6mRNA和CK19mRNA在手术前、后期分别为7.92±1.97vs5.67±2.11和11.21±3.14vs8.60±4.02,肺静脉先结扎组CD44V6mRNA和CK19mRNA在手术前、后期分别为7.95±1.91vs7.74±2.10和10.60±3.15vs10.30±2.98。肺静脉先结扎组在手术前后CD44V6和CK19,两者表达均无差异性（P>0.05）,肺动脉先结扎组CD44V6mRNA、CK19mRNA表达在手术后期均显着高于手术前期（P≤0.05）结论：非小细胞肿癌患者肺静脉血中可检测到循环肿瘤细胞,手术操作可能促进了血行微转移,先结扎肺静脉后结扎肺动脉一定程度可减少血行微转移。第三部分非小细胞肺癌细胞毒T淋巴细胞抗原-4基因多态性以及与血行微转移的相关研究目的：探讨NSCLC患者细胞毒T淋巴细胞抗原4（Cytotoxic T-lymphocyte antigen-4, CTLA-4）基因多态性的特点以及与血行微转移的关系。方法：采用PCR-RFLP方法检测158例NSCLC患者（包括第二部分30例NSCLC患者）和72例健康对照者CTLA-4+49A>G基因分型。结果：1.CTLA-4+49A>G基因多态的分布CTLA-4+49A>G基因多态的3种基因型在肺癌NSCLC患者中分布分别为：GG型44.30%（70/158）,GA型41.77%（66/158）和AA型13.92%（22/158）,对照组分布为：GG型48.6%（34/72）,GA型41.7%（31/72）和AA型9.7%（7/72）。NSCLC患者中携带CTLA-4+49AA基因型者频率高于对照组（P=0.046）,与GG基因型相比,携带AA型基因型者的相对危险度为1.489（95%CI,0.977-2.060）2. CTLA-4+49A>G基因多态与NSCLC临床病理特征以及血行微转移的关系CTLA-4+49A>G多态与NSCLC患者性别、病理类型、临床分期、肿瘤标记物（CEA、CYFRA21-1）、CK19mRNA以及CD44V6mRNA表达均无显着相关（P>0.05）。结论：CTLA-4+49A>G基因多态与NSCLC临床病理特征及血行微转移未见明显相关,CTLA-4+49AA基因型可能是NSCLC的遗传易感基因,与NSCLC的发生有关。
二、RT-PCR检测非小细胞肺癌骨髓CEA mRNA的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RT-PCR检测非小细胞肺癌骨髓CEA mRNA的表达（论文提纲范文）
（1）PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）SALL4在非小细胞肺癌中表达的临床意义及作用分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 SALL4在肺癌中表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 SALL4对NSCLC细胞生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 SALL4调控NSCLC细胞生物学功能分子机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 SALL4在恶性肿瘤中调控作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（3）靶向肺癌LunX的CAR-T细胞治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤的细胞治疗发展 |
| 1.1.1 干细胞治疗 |
| 1.1.2 CIK细胞治疗 |
| 1.1.3 NK细胞治疗 |
| 1.1.4 T细胞治疗 |
| 1.1.4.1 肿瘤浸润T细胞 |
| 1.1.4.2 TCR-T细胞 |
| 1.2 CAR-T细胞治疗 |
| 1.2.1 CAR-T细胞的研究现状 |
| 1.2.1.1 CD28与4-1BB共刺激的比较 |
| 1.2.1.2 第一代CAR-T |
| 1.2.1.3 第二代CAR-T |
| 1.2.1.4 第三代CAR-T |
| 1.2.1.5 第四代CAR-T |
| 1.2.2 CAR-T治疗血液瘤 |
| 1.2.3 CAR-T治疗实体瘤 |
| 1.2.3.1 CAR-T治疗实体瘤的现状 |
| 1.2.3.2 CAR-T治疗实体瘤面临的挑战 |
| 1.3 肺癌 |
| 1.3.1 导致肺癌的原因 |
| 1.3.1.1 吸烟 |
| 1.3.1.2 氡气 |
| 1.3.1.3 石棉 |
| 1.3.1.4 空气污染 |
| 1.3.1.5 遗传因素 |
| 1.3.2 肺癌的诊断 |
| 1.3.2.1 胸部X光检查 |
| 1.3.2.2 电子计算机体层扫描(CT) |
| 1.3.2.3 核磁共振(MRI) |
| 1.3.2.4 痰脱落细胞的检查 |
| 1.3.2.5 纤维支气管检查(纤支镜) |
| 1.3.2.6 开胸手术检查 |
| 1.3.2.7 其他检查 |
| 1.3.3 肺癌分类 |
| 1.3.4 肺癌相关的基因突变 |
| 1.3.4.1 RAS |
| 1.3.4.2 MYC |
| 1.3.4.3 BCL-2 |
| 1.3.4.4 NOTCH-3 |
| 1.3.4.5 AIS |
| 1.3.5 目前肺癌的治疗方法 |
| 1.3.5.1 手术 |
| 1.3.5.2 放疗 |
| 1.3.5.3 化疗 |
| 1.3.5.4 靶向抗体治疗 |
| 1.3.6 肺癌和LunX |
| 1.3.7 目前针对于肺癌的CAR-T细胞治疗 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 实验材料与方法 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 小鼠实验相关试剂 |
| 3.2.2 T细胞分离以及活化相关试剂 |
| 3.2.3 细胞系 |
| 3.2.4 细胞培养相关试剂 |
| 3.2.5 流式细胞术相关试剂 |
| 3.2.6 细胞增殖检测相关试剂 |
| 3.2.7 提取RNA以及逆转录PCR相关试剂 |
| 3.2.8 分子克隆技术相关试剂 |
| 3.2.9 转染以及包装浓缩病毒相关试剂 |
| 3.2.10 免疫荧光相关试剂 |
| 3.2.11 蛋白质分子生物学相关试剂 |
| 3.2.12 免疫组化相关试剂 |
| 3.2.13 ELISA相关试剂 |
| 3.3 实验器材 |
| 3.3.1 通用实验器材 |
| 3.3.2 细胞培养实验器材 |
| 3.3.3 分子克隆实验器材 |
| 3.3.4 Western blot实验器材 |
| 3.3.5 动物实验实验器材 |
| 3.3.6 流式细胞术相关器材 |
| 3.3.7 免疫组织化学相关器材 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 细胞分离,复苏,培养和冻存 |
| 3.4.1.1 人外周血T细胞分离 |
| 3.4.1.2 人外周血T细胞培养与活化 |
| 3.4.1.3 细胞系的复苏 |
| 3.4.1.4 贴壁细胞的培养 |
| 3.4.1.5 细胞冻存 |
| 3.4.1.6 Cell trace violet标记细胞 |
| 3.4.2 质粒的提取 |
| 3.4.3 RNA的提取 |
| 3.4.4 逆转录 |
| 3.4.5 PCR |
| 3.4.6 感受态转化及阳性克隆筛选 |
| 3.4.7 慢病毒的包装、收集以及浓缩 |
| 3.4.8 T细胞的活化以及慢病毒的感染 |
| 3.4.9 Western Blotting |
| 3.4.10 免疫组化 |
| 3.4.11 RTCA检测杀伤 |
| 3.4.12 流式细胞术 |
| 3.4.13 免疫荧光 |
| 3.4.14 细胞因子的检测 |
| 3.4.15 小鼠模型构建 |
| 3.4.16 提取小鼠基因组DNA |
| 3.4.17 抗体的制备与纯化 |
| 3.4.17.1 收集培养上清 |
| 3.4.17.2 制备腹水 |
| 3.4.17.3 纯化抗体 |
| 3.4.18 统计分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 实验结果 |
| 4.1.1 构建CAR~(LunX)表达载体 |
| 4.1.2 慢病毒成功感染CAR~(LunX)T细胞 |
| 4.1.3 LunX抗原可以刺激CAR~(LunX)T细胞产生细胞因子 |
| 4.1.4 非小细胞肺癌细胞膜表达LunX蛋白 |
| 4.1.5 CAR~(LunX)T细胞可以靶向杀伤非小细胞肺癌细胞 |
| 4.1.6 LunX~+细胞可以特异性活化CAR~(LunX) T细胞效应功能 |
| 4.1.7 CAR~(LunX) T细胞抑制肺癌的生长 |
| 4.1.8 CAR~(LunX) T细胞抑制PDX模型肿瘤的生长 |
| 4.2 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
（4）循环肿瘤细胞、经皮肺穿刺活检及18F-FDG PET/CT显像在非小细胞肺癌患中的临床应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 免疫磁珠阴性富集法、靶向荧光定量PCR技术在非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞检测中的运用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 结果 |
| 一、非小细胞肺癌患者检测外周血CTC的意义 |
| 二、正常健康人、肺良性疾病和肺癌患者外周血CTC数值的比较 |
| 三、CTC诊断肺癌的ROC曲线及诊断的灵敏度与特异度 |
| 四、不同临床特性非小细胞肺癌患者的CTC 阳性检出率的差异 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 循环肿瘤细胞、经皮肺穿刺活检结合~(18)F-FDG显像在周围型肺部结节疾病早期诊断中的运用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 结果 |
| 一、受试者的一般特征 |
| 二、肺结节疾病患者~(18)F-FDG PET/CT检测结果 |
| 三、CTC组检测结果 |
| 四、经皮肺穿刺活检病理结果 |
| 五、CTC、PET/CT对早期NSCLC的诊断效能比较 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述一 液体活检在肺癌精准医疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 综述二 ~(18)F-FDG PET/CT显像在肺癌诊疗中的进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文及奖项 |
| 致谢 |
（5）HDAC1/4负向调控miR-200b表达参与人肺腺癌化疗耐药表型形成的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 表观遗传机制对人肺腺癌耐药细胞miR-200b表达及化疗耐的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 HDAC1/4对人肺腺癌耐药株miR-200b表达的影响及临床标本相关性研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 HDAC1/4/miR-200b通路对人肺腺癌耐药细胞体内外化疗敏感性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 HDAC1/4/miR 200b通路调控人肺腺癌耐药细胞化疗敏感性的分子机制研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（6）线粒体自噬调控麻疹病毒疫苗株在非小细胞肺癌中的溶瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 MV-Edm诱导线粒体自噬调控RLRs固有免疫信号通路 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 MV-Edm诱导并维持细胞自噬 |
| 3.2 细胞自噬促进MV-Edm的复制及扩散 |
| 3.3 MV-Edm诱导自噬抑制细胞抗病毒固有免疫反应 |
| 3.4 MV-Edm诱导自噬抑制DDX58/IFIH1/MAVS固有免疫信号通路 |
| 3.5 MV-Edm诱导NSCLCs形成线粒体自噬 |
| 3.6 MV-Edm通过SQSTM1介导的线粒体自噬调节DDX58/IFIH1/MAVS通路 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章总结 |
| 6. 参考文献 |
| 第二章 线粒体自噬调控MV-Edm介导的溶瘤机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 MV-Edm的溶瘤作用与细胞自噬密切相关 |
| 3.2 MV-Edm诱导自噬抑制caspase依赖的凋亡通路并促进病毒的复制 |
| 3.3 线粒体自噬通过控制细胞色素C的释放拮抗凋亡信号的激活 |
| 3.4 MV-Edm诱导NSCLCs坏死性死亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章总结 |
| 6. 参考文献 |
| 文献综述: 溶瘤麻疹病毒的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）肺癌微转移检测与分子分期的研究进展（论文提纲范文）
| 1 肺癌分子分期 |
| 2 肺癌分子分期的常用技术 |
| 2.1 苏木精-伊红(HE)染色法 |
| 2.2 免疫组织化学技术(IHC) |
| 2.3 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.4 流式细胞术(FCM) |
| 2.5 蛋白质组学技术(Proteomics) |
| 2.6 基因表达谱技术(GEP) |
| 2.7 免疫磁性分离技术 |
| 2.8 其他方法 |
| 3 肺癌分子分期的常用标志物 |
| 3.1 组织特异性蛋白质(TSPs) |
| 3.1.1 细胞角蛋白家族(CKs) |
| 3.1.2 组织多肽抗原(TPA) |
| 3.1.3 上皮特异性抗原(EPA) |
| 3.2 组织特异性基因(TSG) |
| 3.2.1 肺泡表面蛋白(SP) |
| 3.2.2 粘蛋白基因(MUC) |
| 3.2.3 CKs mRNA |
| 3.2.4 癌胚抗原(CEA)mRNA |
| 3.2.5 肺组织特异性基因(Lunx) |
| 3.3 癌基因和抑癌基因 |
| 4 肺癌分子分期的临床意义 |
| 4.1 精确临床分期 |
| 4.2 指导临床治疗 |
| 4.3 复发转移的早期判断 |
| 4.4 预后判断 |
| 5 展望 |
（8）RT-PCR检测非小细胞肺癌外周血LUNX和MAGE-1基因的表达及意义（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文目录 |
（9）Ⅰ期非小细胞肺癌淋巴结中肺特异性蛋白X mRNA表达与微转移及预后的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 LUNX MRNA在Ⅰ期NSCLC患者肺门(N1)及隆突下(N2)淋巴结中的表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 Ⅰ期NSCLC患者肺门(N1)及隆突下(N2)淋巴结中LUNX MRNA的表达与预后的相关性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 致谢 |
（10）非小细胞肺癌血行微转移以及基因多态性的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 前言 |
| 第一部分 CD44V6和CK19基因表达与非小细胞肺癌血行微转移的相关研究 |
| 研究对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 手术操作对非小细胞肺癌术中血行微转移的影响 |
| 研究对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 非小细胞肺癌细胞毒T淋巴细胞抗原-4基因多态性以及与血行微转移的相关研究 |
| 研究对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附表、附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及学术成果 |
| 学位论文评阅及答辩表 |
| Appending PaperⅠ |
| Appending Paper Ⅱ |
四、RT-PCR检测非小细胞肺癌骨髓CEA mRNA的表达（论文参考文献）
- [1]PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究[D]. 李小丰. 吉林大学, 2021(01)
- [2]SALL4在非小细胞肺癌中表达的临床意义及作用分子机制的研究[D]. 栗家平. 苏州大学, 2020(06)
- [3]靶向肺癌LunX的CAR-T细胞治疗[D]. 胡孜鸣. 中国科学技术大学, 2020(06)
- [4]循环肿瘤细胞、经皮肺穿刺活检及18F-FDG PET/CT显像在非小细胞肺癌患中的临床应用[D]. 唐兴. 苏州大学, 2020(06)
- [5]HDAC1/4负向调控miR-200b表达参与人肺腺癌化疗耐药表型形成的分子机制研究[D]. 陈东芹. 南京大学, 2015(01)
- [6]线粒体自噬调控麻疹病毒疫苗株在非小细胞肺癌中的溶瘤作用及机制研究[D]. 夏茂. 南京大学, 2015(01)
- [7]肺癌微转移检测与分子分期的研究进展[J]. 曾薇,李惠武. 临床肿瘤学杂志, 2013(09)
- [8]RT-PCR检测非小细胞肺癌外周血LUNX和MAGE-1基因的表达及意义[D]. 刘涛. 广西医科大学, 2013(S1)
- [9]Ⅰ期非小细胞肺癌淋巴结中肺特异性蛋白X mRNA表达与微转移及预后的相关性研究[D]. 邵丰. 苏州大学, 2013(05)
- [10]非小细胞肺癌血行微转移以及基因多态性的相关研究[D]. 宋平平. 山东大学, 2013(09)