一、大鼠骨组织P物质与降钙素基因相关肽的分布及意义（论文文献综述）
池玉磊[1]（2021）在《CGRP、OPG/RANKL在大鼠不同程度创伤性颅脑损伤合并股骨骨折中的表达变化及作用研究》文中指出目的:探究大鼠不同程度创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury,TBI）合并股骨骨折中降钙素基因相关肽（Calcitonin Gene-Related Peptide,CGRP）及骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）/核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）系统的表达变化,进一步分析不同程度TBI对骨折愈合的影响及其分子作用机制。方法:建立大鼠不同程度（轻度、中度、重度）TBI合并股骨骨折模型,按照神经功能缺损评分（Neurological Severity Score,NSS）共分为5组:轻度TBI合并左侧股骨骨折组、中度TBI合并左侧股骨骨折组、重度TBI合并左侧股骨骨折组、单纯左侧股骨骨折组、假手术组。造模成功后采用ELISA技术检测各分组大鼠血清中CGRP及OPG/RANKL系统的表达水平,通过X射线和HE染色技术检测骨折愈合情况,进行骨折愈合评分,评估骨折愈合快慢,游标卡尺测量骨痂体积比较分析。结果:本研究共计100只雄性大鼠被纳入统计学分析,同假手术组相比,轻度TBI合并股骨骨折组和单纯股骨骨折组中大鼠血清CGRP和OPG的浓度及OPG/RANKL比值有轻度升高趋势（P<0.05）,中、重度TBI合并股骨骨折组中大鼠血清CGRP和OPG的浓度及OPG/RANKL比值有明显升高趋势（P<0.05）;相比较轻度TBI合并股骨骨折组和单纯股骨骨折组,中、重度TBI合并股骨骨折组大鼠血清CGRP和OPG的浓度及OPG/RANKL比值有明显升高趋势（P<0.05）,骨折端生成的骨痂体积增大（P<0.05）,愈合时间缩短（P<0.05）;而轻度TBI合并股骨骨折组与单纯股骨骨折组相比,大鼠血清CGRP和OPG的浓度、OPG/RANKL比值相似,骨痂体积及愈合时间差异比较均无统计学意义（P>0.05）。结论:中、重度TBI可以有效促进骨折端骨痂生长,缩短骨折愈合时间,这可能与血清中CGRP浓度与OPG/RANKL表达比值升高相关。
黄美能[2]（2021）在《降钙素促CREB磷酸化诱导人牙周膜干细胞成骨分化的作用机制研究》文中认为研究背景口腔临床流调显示我国成年人牙齿丧失的主要原因之一是牙周病,牙周炎促使牙槽骨高度的丧失,进而导致牙体组织的脱落。然而目前牙周治疗的手段较为局限,因此探索牙周炎治疗的新方法是非常有意义。牙周炎不仅导致牙周软组织炎症进而引发疼痛,同时打破口腔内环境的稳定,使牙周组织失去生理性的动态平衡。牙周炎的治疗目的在控制炎症的同时,也要对丧失的牙周组织进行有效的恢复和重建。因此目前研究的热点不仅要从形态上恢复正常的牙周组织,并且在功能上尽量修复到天然健康牙的水平。这一目标依托当前快速发展的干细胞及组织工程技术是很可能实现的。由此可见,探索牙周骨性组织的具体修复机制,无论在临床或是科研意义上都将变得十分迫切。同时开展针对性的生物学研究,也将会为牙周炎的治疗方面提供非常重要的理论依据。牙周膜干细胞（PDLSCs）是具有向多种组织细胞类型分化的干细胞,常存在于人类的牙周膜中。最初PDLSCs是由用酶消化法所得,Seo等[1]发现从人恒牙周组织中分离出的这种细胞,具有向多种牙周组织分化的潜能。此外有研究结果表明诱导PDLSCs可观察到OCN、BSP等表达[2],而这些是细胞成骨分化的标记蛋白;同时,将结合在支架上的PDLSCs种植于动物模型体内,发现细胞逐渐从形态上和功能上都有向成骨方向分化的趋势,表明PDLSCs有向成骨细胞分化的潜力。由此可见,在探索牙周炎愈后恢复方面,可以考虑以PDLSCs为细胞学基础,研究促进牙周组织再生的具体作用与信号通路。目前的研究结果显示,在牙周组织的微环境中PDLSCs成骨分化受到多种细胞因子的调控[3]。而其中降钙素（calcitonin,CT）就引起了注意。CT多用来研究人体骨骼组织中的骨代谢以及血钙浓度的调节。CT最早由Copper等[4]发现并对其进行了报道。随着多年来研究的深入,CT多种生理功能逐渐被人们所熟知。但大多关注于其在破骨细胞功能的抑制上面,而较少关注其对成骨细胞的促进作用。同时CT可以在多种组织细胞中发挥不同的生理功能,故其在临床上的应用也变得越来越广泛。CT是降钙素家族的一员,同属其中的还有人们较熟悉的降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）。他们在细胞内发生效应的信号通路都是相似的,也可结合同一类受体而发挥作用。在骨代谢的动态维持和血钙浓度调节方面都有着非常重要的作用。Tian等[10]体外实验研究发现CGRP可通过c AMP途径促进转录因子CREB的磷酸化,进而调控成骨分化。最新有研究表明CT及其家族成员通过促进CREB磷酸化途径诱导骨折愈合后干细胞的成骨分化。Wei等[21]研究表明CT在牙周炎的再生修复中发挥重要作用,同时CT可促进PDLFs的基质合成及其成骨作用。但迄今为止,关于CT在与PDLSCs成骨分化方面的作用机制研究基本没有,而对于CT诱导PDLSCs在牙槽骨修复再生以及牙周炎治疗方面或许有巨大的研究前景。本研究便是将探讨CT通过促进CREB磷酸化诱导PDLSCs成骨分化的作用及分子机制。研究目的1、探讨降钙素与CREB在PDLSC成骨分化中的作用;2、探讨在PDLSC成骨分化中降钙素与CREB表达及磷酸化的作用关系与机制;3、探讨CREB调控OPN表达促进PDLSC成骨分化的作用机制。研究方法1、传代培养人牙周膜细胞,将细胞进行磁珠分选后,通过免疫荧光染色与流式细胞仪分析鉴定人牙周膜干细胞。2、构建Ad.CT,PDLSCs感染重组腺病毒,Western blot测定骨桥蛋白OPN表达水平,茜素红染色后观察细胞钙沉积情况,探讨CT的表达在PDLSC成骨分化中的作用。3、构建Ad.CREB,PDLSCs感染重组腺病毒,Western blot测定骨桥蛋白OPN表达水平,茜素红染色后观察细胞钙沉积情况,探讨CREB的表达在PDLSC成骨分化中的作用。4、构建Ad.CREB/OPNsi RNA,重组腺病毒共感染PDLSCs,Western blot测定骨桥蛋白OPN表达水平,茜素红染色后观察细胞钙沉积情况,探索CT是否经由CREB的通路调控PDLSCs钙化。5、构建Ad.CT,PDLSCs感染重组腺病毒,Western blot测定各设定时间点CREB和磷酸化CREB蛋白表达水平,探讨在PDLSC成骨分化中CT调控CREB表达及磷酸化的作用关系与时间周期关系。6、构建Ad.CT,PDLSCs感染重组腺病毒,染色体免疫共沉淀（Ch IP）检测CREB对OPN启动子的结合,测序验证CREB结合的OPN启动子区域的DNA序列,双荧光素酶报告实验检测CREB对OPN的转录调控作用,探索PDLSC成骨分化过程中CREB调控OPN表达的具体分子作用机制。结果1、传代培养细胞,分选顺利获得抗体阳性的细胞。流式测定结果为STRO1+比例为16.7%,CD146+比例为21.0%。免疫荧光染色显示波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性。2、腺病毒介导的转基因在PDLSCs中过表达CT后,在不同时间天数使用茜素红染色,对比观察细胞钙沉积情况。结果显示7天及14天时,与空病毒感染组相比过表达CT组茜素红染色显着加深。通过Western blot检测细胞成骨分化标志物OPN表达情况,结果显示过表达CT组的OPN表达水平在7天及14天时显着高于空病毒感染组。上述结果提示CT处理PDLSCs后7天表现的成骨分化趋势,14天时成骨分化明显。3、通过腺病毒介导的转基因在PDLSCs中过表达CREB后,通过茜素红染色后观察不同天数时的细胞钙沉积变化情况,通过Western blot检测CREB/p CREB/OPN表达水平。Western blot结果显示,PDLSCs感染Ad.CREB后,CREB表达在1、3、7、14天均维持在高水平,且均显着高于空病毒感染组,同时各时间点的CREB表达水平没有显着差异。p CREB表达水平也均较空病毒感染组显着提高,但注意到p CREB的表达高峰出现在第3天。茜素红染色结果显示7天及14天时,与空病毒感染组相比过表达CREB组钙化显着。OPN的Western blot结果同样显示7天及14天时,过表达CREB组中OPN的蛋白表达水平显着高于空病毒感染组。4、为了探索CT是否经由CREB调控PDLSCs钙化,在CT诱导同时加CREB抑制剂Compound 3i（666-15）,Western blot结果显示加入CREB抑制剂Compound3i（666-15）后,对CREB表达无显着影响,但是显着抑制了p CREB的形成。结果显示在第7天及第14天时,与CT干预组相比,CT/CREB抑制组的茜素红染色结果显示其钙沉积情况显着较少。Western blot测定细胞成骨标记物OPN表达情况,结果显示在第7天及第14天时CT干预组的OPN蛋白水平显着高于CT/CREB抑制组。上述结果提示CT可以促进PDLSCs的成骨分化,但可被CREB抑制剂阻断。5、在PDLSCs中过表达CT后,用Western blot测定不同天数时的CREB表达水平,及其磷酸化表达水平。结果显示,在第3天时实验组CREB表达水平较空病毒感染组显着提高,且高表达水平延续至14天;但对于p CREB来说,在1天及3天时CT实验组中p CREB表达水平显着高于空病毒感染组,而7天及14天时的表达水平与空病毒感染组无明显差异。p CREB表达水平在3天到达高峰,随后下降至一个稳定的较高水平。6、染色质免疫共沉淀提示CREB结合人OPN基因AP-1启动子区-1403CRE位点以及-1870和-76AP-1位点。荧光素酶结果显示CREB可促进OPN基因AP-1启动子功能,并通过-1870和-76AP-1发挥促进OPN基因AP-1启动子的功能。结论1、PDLSCs中过表达CT后OPN的蛋白表达水平在7天及14天时明显升高,表明CT具有在人PDLSCs成骨分化中发挥作用。2、PDLSCs中过表达CREB后OPN的蛋白表达水平在7天及14天时显着提高,提示CREB在人PDLSCs成骨分化中发挥作用。3、CT通过CREB作用于PDLSCs,CT可以促进其成骨作用,但可以被CREB抑制剂阻断。4、PDLSCs中过表达CT后CREB表达水平在3天时显着提高且高表达水平延续至14天,但p CREB表达水平在3天时到达高峰,随后下降至一个稳定的较高水平。提示CT对CREB表达及磷酸化有促进作用,并且CREB表达量与其磷酸化水平呈现出不同的时间点变化。5、CREB结合人OPN基因AP-1启动子区-1403CRE位点以及-1870和-76AP-1位点,并通过-1870和-76AP-1发挥促进OPN基因AP-1启动子功能。
谢冬妮[3]（2021）在《感觉神经损伤促发双膦酸盐相关性颌骨坏死的作用及机制初探》文中认为目的:双磷酸盐相关性颌骨坏死（Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw,BRONJ）是长期应用双磷酸盐（Bisphosphonates,BPs）类药物的一个严重副作用,通常难以治疗。BRONJ的发病机制尚未阐明,目前认为主要包括抑制骨重建、抑制血管生成、抑制免疫功能、软组织毒性等。近年来,感觉神经对骨组织代谢及固有免疫的调控作用成为了研究热点之一。研究显示感觉神经通过分泌神经肽,如降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）、P物质（substance P,SP）等,参与调节骨代谢、骨重建、免疫细胞的募集等过程。本研究的目的是探索感觉神经支配在BRONJ发生发展过程中的调控作用,并对其作用机制进行初步探索,为BRONJ的临床防治措施提供一定的理论与实验基础。方法:1.建立大鼠下牙槽神经不同程度损伤模型,通过行为测试与HE染色验证模型;在不同程度神经损伤大鼠中静脉注射BPs,通过HE染色、TRAP染色、Masson染色观察生理状态下感觉神经支配对BPs骨毒性作用的影响。2.建立不同程度神经损伤的大鼠BRONJ模型,用HE染色、TRAP染色分析骨创伤愈合过程中感觉神经支配对BRONJ发生发展的影响。3.通过IHC染色、Western blot分析神经损伤与BPs环境下神经肽表达的变化,通过体内实验分析神经肽对大鼠BRONJ发生和发展的影响,通过体外实验分析神经肽对BPs环境下破骨前体细胞的影响,以初步探索感觉神经损伤对BRONJ作用的机制。结果:1.行为测试和组织学结果显示中度下牙槽神经损伤（alveolar nerve injury,IANI）和重度下牙槽神经损伤（alveolar nerve transection,IANT）模型建立成功,感觉神经损伤增加了BPs的骨毒性作用,破骨细胞数量、骨膜结构紊乱程度随神经损伤程度的增加而增加,成骨细胞数量组间差异不明显。2.大鼠拔牙窝内破骨细胞数目、BRONJ严重程度及发生率随着神经损伤程度的增加而增加,提示神经肽水平的不平衡可能是BRONJ发病机制中的一个破坏性因素。3.神经损伤与BPs环境下神经肽表达失衡,CGRP表达降低、SP表达增加,CGRP/SP比例在IANT/ZOL组显着降低;拔牙窝内注射CGRP后,BRONJ发生率显着降低,而SP作用相反;CGRP和SP联合应用时,增加CGRP以提高CGRP/SP比例降低了BPs对破骨前体细胞的毒性作用,而CGRP或SP单独应用时无此现象。结论:感觉神经损伤通过改变CGRP/SP比例加重了BRONJ的发生,CGRP与SP存在复杂的相互作用,增加CGRP/SP比例可能阻止BRONJ的进展,CGRP与SP促进骨愈合的最佳比例及其相互作用的机制仍需进一步研究。
麦聪英[4]（2021）在《基于软骨-软骨下骨信号交互探讨左归丸调控P物质表达防治绝经后骨关节炎的研究》文中进行了进一步梳理目的观察左归丸对大鼠去卵巢骨关节炎模型软骨下骨神经肽P物质及其受体（NK1-R）mRNA及蛋白水平的影响,探讨左归丸的药效及作用机制,为左归丸防治绝经后骨关节炎的临床实践提供理论参考和实验依据。方法将60只雌性SPF级SD大鼠随机分为假手术组（10只,0.1mL·kg-1·d-1）与造模组（50只）,摘除后者卵巢,术后常规饲养2周,再将50只大鼠随机分为模型组（0.1mL·kg-1·d-1）、阿仑膦酸钠组（63mg·kg-1·d-1）、左归丸低剂量组（2.42g·kg-1·d-1）、左归丸中剂量组（4.84g·kg-1·d-1）、左归丸高剂量组（9.68g·kg-1·d-1）,每组10只。灌胃给药12周后,苏木精-伊红（HE）染色、番红-固绿染色观察大鼠软骨形态学变化;运用显微CT（μ-CT）检测左侧股骨远端软骨下骨局部的骨密度（BMD）;酶联免疫吸附测定（ELISA）检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平;免疫荧光法检测大鼠软骨下骨P物质和Runx2蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠软骨下骨神经肽P物质（SP）及其受体（NK1-R）、OPG、RANKL和Runx2 mRNA表达量;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠软骨下骨SP、NK1-R、OPG和RANK L和蛋白表达量。结果（1）骨形态:HE染色示,与假手术组相比,模型组大鼠软骨表面破坏,结构不清晰,软骨细胞排列紊乱;与模型组相比,阿仑膦酸钠组软骨表面较完好,软骨细胞排列较规则;左归丸低剂量组软骨表面尚完整、平滑,软骨细胞排列尚规则;左归丸中、高剂量组软骨表面较完整、平滑,层次及结构较明晰,软骨细胞排列较规则。番红-固绿染色示,与假手术组相比,模型组软骨表面不完整、毛糙,软骨基质红染区减少;与模型组相比,阿仑膦酸钠组软骨表面尚完整,软骨基质红染区较多,软骨细胞排列较有序;左归丸低剂量组软骨表面完整、平滑,软骨细胞排列规则;左归丸中、高剂量组软骨表面尚完整、平滑,软骨细胞排列尚规则。（2）骨密度:与假手术组相比,模型组大鼠软骨下骨骨密度显着降低（P<0.01）;与模型组相比,各给药组BMD显着上升（P<0.01）。（3）血清炎症因子:与假手术组相比,模型组大鼠血清TNF-α和IL-1β含量显着上升（P<0.01）;与模型组相比,阿仑膦酸钠组、左归丸低、中、高剂量组TNF-α和IL-1β含量显着降低（P<0.01）。（4）免疫荧光:红色荧光表示Runx2表达,绿色荧光表示SP表达。与假手术组相比,模型组软骨下骨Runx2、SP蛋白表达均减少;与模型组相比,阿仑膦酸钠组、左归丸低剂量组软骨下骨Runx2、SP表达均增多,左归丸中剂量组软骨下骨Runx2表达略增多,SP表达略减少,左归丸高剂量组软骨下骨Runx2表达无明显变化,SP表达略增多。（5）mRNA表达:qPCR结果发现,模型组大鼠软骨下骨SP、NK1-R、OPG和Runx2 mRNA表达量显着下降（P<0.01）,同时RANKL mRNA表达量显着升高（P<0.01）。而各给药组SP、NK1-R、OPG和Runx2mRNA表达量除左归丸高剂量组OPG mRNA表达差异无统计学意义外,其余均升高（P<0.05;P<0.01）。（6）蛋白表达:Western blot结果发现,模型组大鼠软骨下骨SP、NK1-R、OPG蛋白表达量显着下降（P<0.01）,同时RANKL蛋白表达量显着上升（P<0.01）。而各给药组SP、NK1-R、OPG蛋白表达量升高（P<0.05;P<0.01）,RANKL蛋白表达量显着降低（P<0.01）。结论（1）女性绝经后因软骨下骨质疏松,引起关节软骨损伤而致骨关节炎。（2）绝经后骨关节炎的形成与软骨下骨中神经肽SP及其受体NK1水平降低有关。（3）左归丸可以通过抑制溶骨作用、促进成骨作用改善或逆转绝经后骨关节炎软骨下骨重建失衡的状态,改善软骨下骨密度,防治绝经后骨关节炎。（4）左归丸可通过抑制血清炎症因子TNF-α、IL-1β表达,减缓关节软骨分解,促进关节软骨修复。（5）阿仑膦酸钠防治绝经后骨关节炎的作用机制可能与神经肽有关。
龙域丰,朱古力,易伟宏,杨大志[5]（2020）在《神经肽类物质在骨代谢与骨再生中的调控作用》文中研究表明骨组织是神经系统重要的靶器官,神经元可整合机体内外环境因素从而调节骨的重建。神经系统在骨的正常代谢以及骨折愈合过程中发挥着重要的作用,它们被认为在参与间充质细胞包括骨髓干细胞有丝分裂和（或）骨形成发挥重要作用。骨髓腔为各类调节因子提供发挥作用的生物环境,并且现有的研究已证实神经系统在其中发挥着至关重要的作用。无论是外周神经系统还是中枢神经系统,通过释放神经肽物质,如神经肽Y（NPY）、血管活性肠肽（VIP）、降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）、瘦素（Leptin）以及5-羟色胺（5-HT）等,与特定的受体结合并作用于特定的信号通路,从而调节人体的成骨细胞及破骨细胞增殖分化,钙化及重吸收等生理作用,达到调节机体成骨与破骨之间的平衡。通过对相关信号通路的深入研究,将会对临床治疗成骨/破骨相关疾病,骨组织工程研究等方面提供新的思路。本文就相关神经肽物质研究进展作一综述。
夏梦楠[6]（2020）在《感觉神经支配在牙槽窝愈合过程中的调控作用及机制研究》文中研究表明目的:近年来,感觉神经支配对组织中固有免疫反应的调控作用成为了研究热点。在骨组织代谢过程中,感觉神经以及固有免疫反应都发挥着重要的作用。但是这两者的交联作用尚未得到明确的结论。在牙槽窝组织及衬里黏膜中分布着大量的感觉神经纤维和固有免疫细胞,感觉神经末梢的神经元胞体能够释放以降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）为代表的感觉神经肽,体外实验表明,CGRP有各种抗炎作用,能调控固有免疫细胞的募集。本研究的目的是探索生理状态下,感觉神经支配在牙槽窝愈合过程中的调控作用,揭示神经-免疫交联机制与骨重建的关系,为骨相关疾病的临床预防和治疗提供一定的理论与实验基础。方法:1.建立小鼠失下牙槽神经模型,利用钙黄绿素-茜素红荧光双标记法以及HE染色、TRAP染色观察新生骨的变化。2.采用外科手术的方法拔除右下颌第一磨牙,用骨组织形态学测量,免疫组织化学染色,流式细胞术等方法分析去感觉神经支配对小鼠牙槽窝内固有免疫反应以及骨组织改建的影响。3.在拔牙后的牙槽窝内加入降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide,CGRP）,利用骨组织形态学分析,免疫组织化学染色以及马松染色分析去感觉神经支配后牙槽窝内新生骨以及固有免疫的变化。结果:1.外科手术切断下牙槽神经后,双荧光标记结果显示下颌第一磨牙颊舌侧骨板的骨皮质新生骨量明显减少,差异具有统计学意义。免疫组化结果显示牙槽窝衬里的黏膜内中性粒细胞的数量增多,巨噬细胞的表型发生改变,差异具有统计学意义。2.拔除右下颌第一磨牙后,Micro-CT数据显示截断神经后拔牙处颊舌侧剩余牙槽骨高度降低,免疫组织化学以及流式分析结果显示拔牙后第1周截断神经组牙槽窝衬里的黏膜内中性粒细胞和巨噬细胞数量增多,差异有统计学意义。免疫组化结果表明第8周巨噬细胞的伸长率降低,表型发生变化。3.在拔牙窝内局部加入降钙素基因相关肽（CGRP）后,马松染色结果表明牙槽窝内有新生骨形成,而人为去除巨噬细胞后,牙槽窝内新生骨量明显减少,证明巨噬细胞是连接神经-免疫的关键靶点细胞。结论:感觉神经可能是通过感觉神经肽,如CGRP,来调控固有免疫反应,从而维持牙槽窝内骨环境的稳态。
王蕾[7]（2019）在《Calca基因启动子区DNA甲基化影响2型糖尿病大鼠ASCs成骨功能的研究》文中研究表明糖尿病是继心血管疾病之后的第二大慢性疾病,其中2型糖尿病（Type 2diabetes mellitus,T2DM）占据90%-95%。糖尿病的高血糖毒性,异常胰岛素及细胞因子水平、氧化应激等,导致了以低骨量和骨组织微结构破坏为特征糖尿病性骨质疏松的形成。对于口腔种植而言,血糖控制较差的患者早期骨整合能力下降,周围软组织愈合时间延长,感染几率增加。近年来,干细胞的发现为各种组织修复带来了新的希望,干细胞具有多向分化、自我更新以及分泌多种细胞因子能力,可参与损伤组织与器官修复和再生。干细胞可分为全能干细胞,多能干细胞和单能干细胞,分化潜能逐级下降。组织工程技术利用干细胞来提高糖尿病患者的成骨能力,也得到多个实验证实。来源于自体的干细胞,由于临床易得、能促进长期的移植生存和移植耐受等优点,成为理想的种子细胞。其中,骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）及脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ASCs）应用最为广泛。但考虑到临床应用中,BMSCs获取困难,同时糖尿病患者来源的BMSCs相比正常BMSCs数量减少,再生能力减弱,增殖和存活能力降低,成骨分化显着下降,限制了其在再生方向的应用。而T2DM来源的ASCs（ASCs-T2DM）获取简便,且获取数量并未减少,生长曲线和对照组类似,故而ASCs成为更具有应用前景的细胞。但是,T2DM个体来源的ASCs相比健康个体来源ASCs（ASCs-Control,ASCs-C）成骨能力减弱,应用于骨组织修复时不能满足需要,主要是因为2型糖尿病的机体环境可改变ASCs成骨及增殖能力。换而言之,对于单独糖尿病患者,其患病前后的不同的机体状态也会影响基因的表达,但个体本身的基因序列并未发生改变,而此种现象可能与表观遗传有关。DNA甲基化是表观遗传中研究最为广泛的部分,往往基因启动子区的DNA甲基化会抑制基因的表达。考虑到研究单独个体时建模前后的不稳定性,因此,我们选择研究T2DM来源的ASCs同健康大鼠来源ASCs在基因启动子区DNA甲基化水平的差异,寻找差异基因,以明确T2DM机体环境对ASCs成骨能力影响的具体机制。第一部分ASCs-T2DM与ASCs-C对比研究目的:建立T2DM大鼠模型,比较ASCs-T2DM及ASCs-C体外成骨及增殖能力。方法:高脂高糖饲料喂养结合小剂量STZ腹腔注射构建T2DM模型;建模成功后,利用酶消化法提取健康及2型糖尿病大鼠ASCs,培养至P3细胞待用;流式细胞术检测细胞表面分子的表达;克隆形成实验检测克隆形成能力;CCK-8方法检测细胞增殖能力;成骨成脂诱导验证多向分化能力;q-PCR检测成骨相关基因的表达,Western Blot检测成骨相关蛋白的表达。结果:成模后大鼠体重降低,血糖持续维持高于16.7mmol/L;流式检测显示两种细胞均阳性表达干细胞相关的表面标志物（CD29和CD90）,不表达血细胞相关的表面标志物（CD34和CD45）;相比ASCsC,ASCs-T2DM克隆形成能力以及增殖能力显着下降;成脂诱导后染色发现:两种干细胞经诱导均可产生脂滴;成骨诱导碱性磷酸酶（ALP）染色可见:ASCs-T2DM细胞ALP的表达量明显低于ASCs-C;茜素红染色显示:ASCs-T2DM形成的矿化结节较少;q-PCR及Western Blot结果表明,ASCs-T2DM成骨相关基因及相关蛋白表达也低于ASCs-C。结论:ASCs-T2DM增殖能力,克隆形成及成骨分化能力显着低于ASCs-C。第二部分ASCs-T2DM与ASCs-C全基因组DNA甲基化测序及差异基因的筛选目的:筛选ASCs-T2DM与ASCs-C中与成骨相关的启动子区DNA甲基化差异基因。方法:提取ASCs-T2DM与ASCs-C的DNA,做全基因组甲基化测序;选取与成骨相关,并且p值小于0.05的GO term,选出相关基因;结合DNA甲基化及q-PCR结果分析,筛选甲基化水平与基因表达水平成负相关的基因;结合IGV软件和文献阅读,确定目的基因。结果:全基因组甲基化结果显示,两者在DNA甲基化水平上确实存在差异。启动子区甲基化差异基因,共有253个。与成骨相关,并且p值小于0.05的GO term基因有:C3（补体C3,complement C3）,Calca（降钙素基因相关肽,alcitonin-related polypeptide）,Ereg（上皮调节蛋白,epiregulin）,il20rb（白细胞介素20受体亚基,interleukin 20 receptor subunit beta）;其中C3及Calca的表达水平与DNA甲基化水平呈负相关。最终确定差异最为显着基因:Calca。结论:ASCs-T2DM与ASCs-C在启动子区DNA甲基化水平上确实存在差异,其中Calca在ASCs-T2DM中的DNA甲基化水平高于ASCs-C,而其表达水平低于ASCs-C。第三部分CGRP促进ASCs-T2DM成骨分化的功能验证目的:探究体外药物CGRP对ASCs-T2DM的形态、增殖和成骨能力的影响。方法:配制含CGRP不同浓度（10-7mol/L,10-8 mol/L,10-9 mol/L,0 mol/L）的完全培养基及成骨诱导培养基,鬼笔环肽染色检测CGRP对细胞形态的影响;CCK-8检测CGRP对细胞增殖能力的影响;成骨诱导染色后检测不同浓度CGRP对ASCs-T2DM体外成骨能力的影响;q-PCR检测其对ASCs-T2DM成骨相关基因表达的影响。结果:不同浓度CGRP对细胞形态无明显影响;但其可影响糖尿病大鼠ASCs的增殖能力,其中10-7-10-8mmol/L浓度培养基可显着提升其增殖能力;ALP染色显示:在此因子的干预下,ALP的表达量显着升高,且呈浓度依赖;茜素红染色显示,CGRP能促进ASCs-T2DM中钙结节的形成,同样呈浓度依赖;q-PCR结果显示:在CGRP的干预下,成骨相关基因表达显着上升。结论:在一定范围内,Calca基因编码产物CGRP不影响ASCs-T2DM的细胞形态,但能提升其体外成骨分化和增殖能力。第四部分Calca基因DNA甲基化改变的位点及功能验证目的:反向验证ASCs-T2DM中Calca基因启动子区DNA目的片段的甲基化水平与基因表达的关系,并研究其具体机制。方法:用甲基化抑制剂5-氮胞苷对ASCsT2DM进行体外干预,鬼笔环肽染色检测5-氮胞苷对细胞形态的影响;亚硫酸氢盐扩增子测序检测5-氮胞苷对ASCs-T2DM目的片段DNA甲基化水平的影响;q-PCR检测5-氮胞苷干预后ASCs-T2DM中Calca及DNMT1的表达。结果:5-氮胞苷可显着改变ASCs细胞形态;测序结果表明:5-氮胞苷可降低的ASCs-T2DM中Calca基因启动子区目的片段DNA甲基化水平;q-PCR结果显示:5-氮胞苷干预后的ASCs-T2DM中Calca表达量上升,同时甲基化转移酶DNMT1表达量下降。结论:5-氮胞苷可降低ASCs-T2DM中Calca基因的启动子区目的片段DNA甲基化水平,此过程可能是通过降低DNMT1的表达来介导,进而提升Calca基因的表达。
张帅帅[8]（2019）在《Transwell共培养体系中背根神经节对骨髓间充质干细胞的作用及其机制研究》文中研究表明【背景】严重创伤等引起的大段骨缺损的治疗一直是骨科临床上的难题。组织工程骨的迅速发展为大段骨缺损的治疗提供了一种可行的方案。然而,目前组织工程骨（TEB）并没有广泛应用于临床大段骨缺损的治疗,主要因为植入体内的组织工程骨缺乏血管和神经的支配,致使组织工程骨体内成骨效果不佳。课题组前期在动物实验研究中发现感觉神经束植入组织工程骨可以显着促进组织工程骨成骨。然而目前感觉神经促组织工程骨成骨的体外细胞学机制并不明确。【目的】1.探究感觉神经促进组织工程骨成骨的体外细胞学机制;2.探究共培养体系中背根神经节（DRG）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖分化的影响;3.探究共培养体系中DRG对BMSCs作用的内在机制。【方法】1.通过全骨髓冲洗贴壁培养法提取BMSCs,并从细胞形态、多向分化潜能、特异性CD分子三方面鉴定提取的BMSCs;2.Transwell共培养体系的构建。取新生SD大鼠背根神经节（DRG）与绿色荧光大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs构建Transwell共培养体系。实验组为DRG与BMSCs Transwell共培养（可表示为DRG+BMSCs组）,DRG神经细胞位于Transwell小室内,BMSCs正常接种于6孔板内。对照组为BMSCs单独培养组（可表示为BMSCs组）;3.通过CCK8方法检测BMSCs增殖情况;通过茜素红、油红O、阿利辛蓝染色评估BMSCs成骨、成脂、成软骨三向分化的能力;4.通过克隆形成实验（CFU）检测BMSCs自我更新能力并通过RT-PCR实验检测BMSCs干性基因的表达以明确BMSCs干性是否增强;5.通过免疫荧光染色和Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3的表达并采用透射电镜观察自噬小体的形成和数量探究细胞自噬的变化;6.采用Western blot方法检测BMSCs中AMPK/mTOR和AKT/mTOR信号通路的激活情况以确定本实验中介导自噬的信号通路;7.采用AMPK抑制剂Compound C阻断AMPK/mTOR通路。通过Western blot、免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3,通过透射电镜观察自噬小体的形成,比较加入Compound C前后共培养组自噬强度和干性基因表达的变化,以明确AMPK/mTOR信号通路对BMSCs自噬和干性基因表达的调节作用;8.采用神经激肽1受体（NKIR）抑制剂阿瑞匹坦阻断DRG产生的P物质（SP）对BMSCs的作用,通过Western blot检测共培养组自噬相关蛋白LC3的变化并通过RT-PCR检测其干性基因的变化,以明确共培养体系中DRG作用于BMSCs的细胞因子。【结果】1.BMSCs的鉴定。细胞形态学观察发现:P3代细胞形态为典型的纺锤形或梭形并含绿色荧光;茜素红染色、油红O染色、阿利辛蓝染色均为阳性;细胞表面低表达造血细胞表面的标志分子CD34（2.3±0.37%,n=5）、CD45（2.4±0.19%,n=5）以及髓系细胞标志CD11b/c（1.4±0.13%,n=5）,高表达间充质干细胞的标志之一CD90（99.6±0.24%,n=5）。因此,所培养的细胞为骨髓间充质干细胞,并且细胞纯度较高。2.共培养体系中BMSCs增殖和分化实验结果。（1）CCK8实验结果显示:Transwell共培养实验第2、4、6、8、10天,共培养组BMSCs CCK8检测的吸光度值均高于对照组BMSCs（P值<0.05）,即共培养组BMSCs增殖能力强于对照组BMSCs,其中共培养第8天时两组增殖能力差异最显着。CCK8实验说明DRG与BMSCs共培养可促进BMSCs增殖。（2）茜素红染色结果显示:成骨诱导14天后,共培养组BMSCs比对照组BMSCs所形成的钙结节面积更大而且颜色更深;油红O染色结果显示:成脂诱导24天后,共培养组BMSCs比对照组BMSCs组所形成的脂滴更加饱满,脂滴数量更多;阿利辛蓝染色结果显示:成软骨诱导20天后,共培养组BMSCs比对照组BMSCs所形成的软骨基质团更大更饱满。共培养组BMSCs成骨、成脂、成软骨能力均强于对照组BMSCs,即BMSCs三向分化潜能在与DRG共培养后得到维持或增强。3.CFU实验和干性基因RT-PCR结果。（1）CFU实验结果显示:共培养组BMSCs克隆形成率显着高于对照组BMSCs（P值<0.05）,即共培养组BMSCs克隆形成能力强于对照组BMSCs。（2）RT-PCR结果显示:共培养组BMSCs Sox2、Nanog、Oct4三种干性因子基因表达较对照组BMSCs均上调（P值<0.05）。DRG与BMSCs共培养可以增强BMSCs的细胞干性。4.BMSCs自噬检测结果。（1）激光共聚焦显微镜观察免疫荧光染色结果可见共培养组BMSCs中细胞自噬相关蛋白LC3的荧光强度强于对照组BMSCs。Image J荧光强度半定量分析发现:共培养组BMSCs细胞自噬相关蛋白LC3荧光强度平均OD值大于对照组BMSCs（P值<0.05）;（2）Western blot条带半定量分析显示,共培养组BMSCs其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值大于对照组BMSCs（P值<0.05）;（3）透射电镜观察发现:共培养组BMSCs细胞自噬小体的形成数量显着多于对照组BMSCs。共培养组BMSCs自噬强度大于对照组BMSCs。5.Western blot检测AMPK/mTOR通路和AKT/mTOR通路。Western blot结果显示:与对照组BMSCs相比,共培养组BMSCs中AMPK/mTOR信号通路中P-AMPK表达上调且P-mTOR表达下调,而AKT/mTOR信号通路中P-AKT表达没有变化。共培养过程中BMSCs自噬的增强伴随着AMPK/mTOR信号通路激活,而AKT/mTOR信号通路无明显变化。6.AMPK阻断实验。Compound C抑制AMPK的激活,阻断AMPK/mTOR信号通路的传导后,（1）Western blot结果显示:DRG+BMSCs+Compound C组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达量以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均小于DRG+BMSCs组（P值<0.05）,大于对照组（P值<0.05）。（2）RT-PCR结果显示:DRG+BMSCs+Compound C组Sox2、Nanog、Oct4三种干性基因的表达量小于DRG+BMSCs组（P值<0.05）,大于对照组（P值<0.05）。（3）透射电镜观察发现DRG+BMSCs+Compound C组自噬小体形成数量明显少于DRG+BMSCs组,多于对照组。AMPK特异性抑制剂Compound C可以显着降低共培养组中BMSCs的自噬水平以及干性基因的表达,AMPK/mTOR信号通路的激活介导了共培养体系中BMSCs自噬水平的增强。同时,本实验中DRG+BMSCs+Compound C组干性基因表达水平显着低于DRG+BMSCs共培养组进一步证明了自噬增强介导了共培养组BMSCs细胞干性的增强。7.NK1R抑制实验。NK1R特异性抑制剂阿瑞匹坦加入共培养体系后,（1）Western blot结果显示:DRG+BMSCs+aprepitant组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值较DRG+BMSCs组显着下降（P值<0.05）,但仍高于对照组（P值<0.05）。（2）RT-PCR结果显示:DRG+BMSCs+aprepitant组干性基因的表达水平较DRG+BMSCs组显着下降（P值<0.05）,但高于对照组（P值<0.05）。DRG来源的SP对于BMSCs自噬水平升高以及干性基因表达的上调具有重要作用。【结论】DRG和BMSCs组成的Transwell共培养体系中,DRG可通过激活AMPK/mTOR通路促进BMSCs自噬水平增强,进而维持或增强BMSCs的干性。在这一过程中,DRG产生的感觉神经肽SP起到重要作用。本研究对于揭示感觉神经促组织工程骨成骨体外细胞学机制具有重要意义。
王诗尧[9]（2019）在《失神经支配大鼠胫骨骨折愈合过程中降钙素基因相关肽与RANK/RANKL/OPG系统的作用机制研究》文中研究说明目的:降钙素基因相关肽（CGRP）作为一种神经肽物质对于骨折的愈合发挥着重要调控作用,核因子κB受体活化因子（RANK）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/骨保护蛋白（OPG）系统对于骨折的愈合也具有重要意义。在临床中发现脊髓损伤合并骨折的患者相比于单纯骨折患者,其骨痂形成速度快,骨痂体积大但生物力学强度差,即为一种病理性骨痂。本实验将研究CGRP、RANK/RANKL/OPG系统与失神经支配下形成病理性骨痂之间的关系。方法:本研究将96只8-10周龄健康成年雌性SD大鼠随机分为失神经+胫骨骨折+CGRP组（A组）,失神经+胫骨骨折+生理盐水组（B组）,单纯胫骨骨折+生理盐水组（C组）,每组各32只。A组和B组大鼠均建立T10脊髓离断下胫骨骨折模型,A组术后给与腹腔注射1mlCGRP溶液,浓度5μg/ml,B组术后给与腹腔注射等剂量生理盐水,C组建立单纯胫骨骨折模型,术后给与腹腔注射等剂量生理盐水。分别于术后7天、14天、21天和28天行胫骨X线拍片,术后28天行骨密度检测,并取胫骨标本常规脱钙、包埋并制成切片,每组每个时间点取8只。通过HE染色、Masson染色观察切片,通过免疫组织化学染色对CGRP、RANKL、OPG进行定位、定量检测,并进行统计学分析。结果:影像学检查可发现A组、B组较C组骨痂形成速度快、体积大,但骨小梁呈疏松无序排列,骨痂密度不均匀,A组骨痂形态略好于B组。HE染色可发现术后7天、14天,A组、B组较C组纤维骨痂和软骨痂形成速度快,但软骨细胞排列相对疏松;术后21天软骨痂逐渐被新生骨小梁取代,B组骨小梁数量少且排列疏松,A组骨小梁数量及排列略好于B组,C组可见大量骨小梁形成且排列紧密;术后28天C组骨折愈合良好,A组骨折基本愈合,骨小梁排列相对疏松,新生骨外侧边缘有少量纤维骨痂覆盖,B组骨折基本愈合,骨小梁排列较A组疏松且排列紊乱,新生骨外缘中的纤维骨痂量略多。Masson染色显示,术后各时间点,B组成熟骨百分比均低于A组,A组低于C组,尤其在术后14天、21天和28天,各组成熟骨的百分比差异显着,差异均有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色提示,术后14天和21天,A组可见CGRP呈中低水平表达,B组可见CGRP呈极低水平表达,C组CGRP高表达,差异有统计学意义（P<0.05）。术后14天,B组观察到RANKL高表达,A组RANKL中高水平表达,C组RANKL表达较低,与A组和B组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。术后21天,三组RANKL表达量降低,C组RANKL表达量仍较A组和B组低,差异有统计学意义（P<0.05）。术后7天,OPG在A组呈中高水平表达,在B组呈低表达,在C组呈高表达,B组与C组OPG表达量差异有统计学意义（P<0.05）。术后14天,三组OPG表达量均有不同程度的下降,C组OPG表达量高于A组和B组,A组高于B组,差异均有统计学意义（P<0.05）。术后21天,三组OPG表达略有增加,C组OPG表达量高于A组和B组,差异有统计学意义（P<0.05）。术后28天,三组OPG表达量有所升高,B组与C组OPG表达量差异有统计学意义（P<0.05）。结论:CGRP与RANK/RANKL/OPG系统在骨折愈合过程中发挥着重要作用,CGRP对RANK/RANKL/OPG系统具有一定的调控能力。失神经支配骨折愈合期间形成大量病理性骨痂,这可能与骨折断端周围CGRP的低表达以及CGRP对RANK/RANKL/OPG系统调控能力减弱有关。
陈齐勇,林煜,梁硅清,刘伯龄[10]（2017）在《脊髓半横断损伤对大鼠骨折愈合的影响》文中指出背景:研究证明,神经系统显着影响骨折的愈合过程,神经不同层面、不同成分对骨痂影响各不相同。目的:制备脊髓半横断损伤并骨折的大鼠模型,观察神经完整性不同的骨折,愈合时骨痂量的不同和组织形态学变化,探讨其对骨痂生成的影响。方法:雄性SD大鼠48只,分2组,制备单纯骨折模型及脊髓半横断损伤并骨折模型,切断右半侧脊髓。于术后14,28 d分批取材,取胫骨,称量湿质量,X射线观察骨折愈合情况,苏木精-伊红染色观察骨痂组织形态变化,q PCR SYBR GREEN法检测骨折断端骨组织降钙素基因相关肽、骨形态发生蛋白2 m RNA的表达。结果与结论:（1）脊髓半横断损伤并骨折组,对侧胫骨湿质量大于患侧（P<0.05）,均大于单纯骨折组（P<0.05）;（2）X射线显示脊髓半横断损伤并骨折,对侧骨痂最大,患侧次之,单纯骨折骨痂最小;（3）苏木精-伊红染色显示,28 d脊髓半横断损伤并骨折组,对侧细胞排列紊乱;患侧纤维骨痂为主,细胞排列较规则;单纯骨折,骨性骨痂为主,细胞排列规则。（4）q PCR SYBR GREEN法结果显示,单纯骨折组降钙素基因相关肽、骨形态发生蛋白2表达较脊髓半横断损伤并骨折组高（P<0.05）;（5）结果提示,完整神经支配是骨折愈合的必须因素。
二、大鼠骨组织P物质与降钙素基因相关肽的分布及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠骨组织P物质与降钙素基因相关肽的分布及意义（论文提纲范文）
（1）CGRP、OPG/RANKL在大鼠不同程度创伤性颅脑损伤合并股骨骨折中的表达变化及作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 创伤性颅脑损伤对骨折愈合影响的研究进展及前景展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（2）降钙素促CREB磷酸化诱导人牙周膜干细胞成骨分化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:降钙素与CREB在 PDLSC成骨分化中的作用研究 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分:降钙素上调CREB表达并促CREB磷酸化的作用研究 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分:CREB通过转录上调OPN表达促进PDLSC成骨分化的作用机制研究 |
| 引言 |
| 一、材料与试剂 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 降钙素基因相关肽对骨稳态、骨再生以及牙周组织影响的研究进展 |
| 一、降钙素基因相关肽在骨组织中生理和病理作用的基础 |
| 二、降钙素基因相关肽的空间分布 |
| 三、降钙素基因相关肽促进成骨 |
| 四、降钙素基因相关肽抑制破骨细胞形成 |
| 五、CGRP和 CT等降钙素家族在牙周组织中的研究 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（3）感觉神经损伤促发双膦酸盐相关性颌骨坏死的作用及机制初探（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 生理状态下感觉神经支配对双膦酸盐骨毒性作用的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 骨创伤愈合过程中感觉神经支配对BRONJ发生发展的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 感觉神经损伤通过改变CGRP/SP比例促发BRONJ的机制初探 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 CGRP与SP在骨代谢与血管再生中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（4）基于软骨-软骨下骨信号交互探讨左归丸调控P物质表达防治绝经后骨关节炎的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一 骨关节炎发生的主要原因 |
| 1 遗传因素 |
| 2 过劳损伤 |
| 3 衰老退变 |
| 二 软骨-软骨下骨信号交互是骨关节炎形成的重要机制 |
| 1 软骨下骨重建失衡是软骨退变的启动因素 |
| 1.1 软骨与软骨下骨之间存在信号交互 |
| 1.2 软骨下骨通过信号交互影响软骨功能 |
| 2 神经肽干预骨代谢影响软骨下骨重建 |
| 2.1 神经肽类物质对骨代谢的调控作用 |
| 2.2 神经肽P物质调节骨代谢影响软骨下骨重建 |
| 3 绝经后骨关节炎的病机特点 |
| 3.1 以软骨下骨质疏松为先导 |
| 3.2 以雌激素水平下降为特征 |
| 三 绝经后骨关节炎的中医防治思路 |
| 1 补肾益精是防治绝经后骨关节炎的基本大法 |
| 1.1 补肾益精 |
| 1.2 养肝健脾 |
| 1.3 活血祛湿 |
| 2 左归丸是防治绝经后骨关节炎的代表方剂 |
| 2.1 左归丸的立方本旨 |
| 2.2 左归丸的组方分析 |
| 2.3 左归丸的制方特点 |
| 2.4 左归丸的临床应用 |
| 四 左归丸防治绝经后骨关节炎的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 模型建立 |
| 2.2 动物分组及处理 |
| 3 指标检测 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 左归丸对去卵巢大鼠骨病理形态学的影响 |
| 4.2 左归丸对去卵巢大鼠骨密度的影响 |
| 4.3 左归丸对去卵巢大鼠炎症因子水平的影响 |
| 4.4 左归丸对去卵巢大鼠软骨下骨SP及RUNX2蛋白表达的影响 |
| 4.5 左归丸对去卵巢大鼠软骨下骨SP、NK1-R、OPG、RANKL和RUNX2 MRNA表达的影响 |
| 4.6 左归丸对去卵巢大鼠软骨下骨SP、NK1-R、OPG和RANKL蛋白表达的影响 |
| 五 讨论 |
| 1 绝经后骨关节炎动物模型与选择 |
| 2 左归丸补肾壮骨的机制 |
| 3 肾--髓-骨-脑与神经肽的联系 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
（6）感觉神经支配在牙槽窝愈合过程中的调控作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 生理状态下感觉神经支配对牙槽骨改建及黏膜免疫状态的影响.. |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 骨愈合过程中感觉神经支配对固有免疫反应以及骨再生的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 感觉神经调控骨稳态的免疫机制初探 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文及参与科研情况 |
（7）Calca基因启动子区DNA甲基化影响2型糖尿病大鼠ASCs成骨功能的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1.2型糖尿病影响种植修复的原因 |
| 1.1 异常代谢水平 |
| 1.2 氧化应激 |
| 1.3 血管病变 |
| 1.4 成骨异常 |
| 1.5 改善措施 |
| 2.脂肪干细胞的应用前景 |
| 2.1 细胞膜片技术 |
| 2.2 Sema3A分子 |
| 3.DNA甲基化的影响 |
| 3.1 DNA甲基化原理 |
| 3.2 DNA甲基化抑制基因转录的机制 |
| 3.3 DNA甲基化与T2DM的关系 |
| 4.降钙素基因相关肽的生理作用 |
| 4.1 降钙素基因相关肽简介 |
| 4.2 α-CGRP分子的功能 |
| 第一部分 ASCs-T2DM与 ASCs-C对比研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物及饲料配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 |
| 2.2 ASCs提取、分离与培养 |
| 2.3 细胞表面标志物的检测 |
| 2.4 细胞克隆形成率测定 |
| 2.5 细胞生长曲线检测 |
| 2.6 多向分化能力检测 |
| 2.7 qPCR检测成骨相关基因表达 |
| 2.8 Western Blot检测成骨相关蛋白表达 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 2型糖尿病大鼠模型 |
| 3.2 细胞形态观察 |
| 3.3 细胞表面标志鉴定 |
| 3.4 克隆形成率 |
| 3.5 细胞生长曲线测定 |
| 3.6 多向分化能力 |
| 3.7 qPCR结果 |
| 3.8 Western Blot结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 ASCs-T2DM与 ASCs-C全基因组DNA甲基化测序及差异基因的筛选 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 ASCs-T2DM及 ASCs-C培养 |
| 2.2 ASCs DNA的提取 |
| 2.3 样本全基因组DNA的甲基化测序及结果分析 |
| 2.4 DNA启动子区差异化基因的筛选 |
| 2.5 差异基因的表达对比及最终基因筛选 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 细胞形态观察 |
| 3.2 DNA提取结果 |
| 3.3 样本全基因组DNA的甲基化测序结果 |
| 3.4 IGV软件DNA启动子区差异化基因的筛选 |
| 3.5 差异基因的表达对比及最终基因筛选 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 CGRP促进ASCs-T2DM成骨分化的功能验证 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 ASCs-T2DM培养 |
| 2.2 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM形态的影响 |
| 2.3 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨功能的影响 |
| 2.4 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨相关基因表达的影响 |
| 2.5 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM增殖能力的影响 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM形态的影响 |
| 3.2 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨染色的影响 |
| 3.3 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM成骨相关基因表达的影响 |
| 3.4 不同浓度CGRP对 ASCs-T2DM增殖能力的影响 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 Calca基因启动子区DNA甲基化改变的位点及功能验证 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验试剂与材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 ASCs-T2DM培养 |
| 2.2 甲基化抑制剂对ASCs-T2DM形态的影响 |
| 2.3 亚硫酸氢盐扩增子测序 |
| 2.4 q-PCR检测Calca及 DNMT1 的表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 ASCs-T2DM形态观察 |
| 3.2 亚硫酸氢盐扩增子测序验证 |
| 3.3 q-PCR检测相关基因表达及机制探讨 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）Transwell共培养体系中背根神经节对骨髓间充质干细胞的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1.组织工程骨研究现状和制约因素 |
| 2.周围神经(尤其是感觉神经和交感神经)对骨组织生理病理过程的影响 |
| 3.感觉神经和交感神经在软骨生理和发育中的作用 |
| 4.感觉神经和交感神经在骨关节炎病理中的作用 |
| 5.骨组织中感觉神经和交感神经的支配 |
| 6.骨组织中感觉神经肽和儿茶酚胺及其受体对骨重建及骨代谢的作用 |
| 7.本课题组前期的研究基础 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器和器械 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 PCR引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 GFP大鼠BMSCs的分离提取培养 |
| 2.2 SD大鼠籽鼠DRG的提取与处理 |
| 2.3 DRG与 GFP-BMSCs共培养的方法 |
| 2.4 流式细胞检测 |
| 2.5 BMSCs成骨诱导及茜素红染色 |
| 2.6 BMSCs成脂诱导和油红O染色 |
| 2.7 BMSCs成软骨诱导和阿利辛蓝染色 |
| 2.8 CCK8 检测细胞增殖 |
| 2.9 克隆形成实验(CFU) |
| 2.10 RT-PCR |
| 2.11 蛋白电泳检测(Western blot) |
| 2.12 免疫荧光染色及观察 |
| 2.13 透射电镜观察自噬变化 |
| 2.14 药物处理 |
| 2.15 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 绿色荧光BMSCs和背根神经节细胞的培养 |
| 3.2 GFP-BMSCs的鉴定 |
| 3.3 DRG与 BMSCs共培养对BMSCs黏附的影响 |
| 3.4 DRG与 BMSCs共培养促进BMSCs的增殖和三向分化潜能的维持 |
| 3.5 DRG与 BMSCs共培养促进BMSCs的克隆形成能力和干性基因的表达 |
| 3.6 DRG与 BMSCs共培养可提高BMSCs的自噬水平 |
| 3.7 共培养过程中BMSCs内 AMPK/mTOR信号通路被激活 |
| 3.8 Compound C可降低共培养体系中BMSCs的自噬水平和干性基因的表达量 |
| 3.9 Compound C单独作用对BMSCs自噬和干性基因表达无影响 |
| 3.10 NK1R特异性抑制剂阿瑞匹坦可降低共培养体系中BMSCs的自噬水平和干性基因表达量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 共培养体系中DRG促进BMSCs的增殖与三向分化潜能的维持 |
| 4.2 共培养体系中BMSCs除成骨、成脂、成软骨分化潜能增强外,其他方向分化潜能也可能增强 |
| 4.3 共培养体系中DRG通过增强BMSCs自噬水平维持BMSCs干性 |
| 4.4 共培养体系中AMPK/mTOR信号通路介导了BMSCs自噬增强 |
| 4.5 共培养体系中DRG分泌的SP对 BMSCs自噬和干性维持起到重要作用 |
| 4.6 BMSCs旁分泌功能及共培养体系的中DRG与 BMSCs动态相互作用的观点 |
| 4.7 本研究对于组织工程骨构建的意义 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（9）失神经支配大鼠胫骨骨折愈合过程中降钙素基因相关肽与RANK/RANKL/OPG系统的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨折修复重建的基本过程 |
| 1.2 脊髓损伤对骨折愈合的影响 |
| 1.3 降钙素基因相关肽概述 |
| 1.4 核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨保护蛋白系统概述 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂与实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 建造动物模型 |
| 2.2.3 标本的制备 |
| 2.2.4 石蜡的包埋与切片 |
| 2.2.5 HE染色 |
| 2.2.6 Masson染色 |
| 2.2.7 免疫组化 |
| 2.2.8 影像学检查 |
| 2.2.9 骨密度测定 |
| 2.2.10 BBB评分 |
| 2.2.11 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 动物模型建造结果 |
| 3.2 影像学检查 |
| 3.3 HE染色 |
| 3.4 Masson染色 |
| 3.5 免疫组织化学染色 |
| 3.5.1 CGRP的表达 |
| 3.5.2 RANKL的表达 |
| 3.5.3 OPG的表达 |
| 3.6 骨密度测定 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）脊髓半横断损伤对大鼠骨折愈合的影响（论文提纲范文）
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 建立胫骨骨折模型及脊髓半横断损伤模型 |
| 1.4.2 观察骨折愈合情况 |
| 1.4.3 苏木精-伊红染色 |
| 1.4.4 q PCR SYBR GREEN法检测骨折端骨组织中降钙素基因相关肽 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 胫骨湿质量 |
| 2.3 胫骨影像学 |
| 2.4 骨痂苏木精-伊红染色 |
| 2.5 骨折端骨组织中降钙素基因相关肽.骨形态发生蛋白2 m RNA的表达 |
| 3 讨论Discussion |
四、大鼠骨组织P物质与降钙素基因相关肽的分布及意义（论文参考文献）
- [1]CGRP、OPG/RANKL在大鼠不同程度创伤性颅脑损伤合并股骨骨折中的表达变化及作用研究[D]. 池玉磊. 济宁医学院, 2021(01)
- [2]降钙素促CREB磷酸化诱导人牙周膜干细胞成骨分化的作用机制研究[D]. 黄美能. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [3]感觉神经损伤促发双膦酸盐相关性颌骨坏死的作用及机制初探[D]. 谢冬妮. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]基于软骨-软骨下骨信号交互探讨左归丸调控P物质表达防治绝经后骨关节炎的研究[D]. 麦聪英. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]神经肽类物质在骨代谢与骨再生中的调控作用[J]. 龙域丰,朱古力,易伟宏,杨大志. 中华实验外科杂志, 2020(11)
- [6]感觉神经支配在牙槽窝愈合过程中的调控作用及机制研究[D]. 夏梦楠. 重庆医科大学, 2020(12)
- [7]Calca基因启动子区DNA甲基化影响2型糖尿病大鼠ASCs成骨功能的研究[D]. 王蕾. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [8]Transwell共培养体系中背根神经节对骨髓间充质干细胞的作用及其机制研究[D]. 张帅帅. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [9]失神经支配大鼠胫骨骨折愈合过程中降钙素基因相关肽与RANK/RANKL/OPG系统的作用机制研究[D]. 王诗尧. 兰州大学, 2019(09)
- [10]脊髓半横断损伤对大鼠骨折愈合的影响[J]. 陈齐勇,林煜,梁硅清,刘伯龄. 中国组织工程研究, 2017(32)