一、P物质及其受体对成纤维细胞的作用（论文文献综述）
姜玲玲[1]（2021）在《激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究》文中认为肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是公认的致炎细胞因子,可作用于多种细胞。激活素A属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员,被认为是诱导组织纤维化的重要细胞因子,可促进M2型巨噬细胞活化,并抑制细菌脂多糖（LPS）活化M1型巨噬细胞。成纤维细胞是机体参与炎症应答的重要细胞,也是组织创伤修复的主要功能细胞,其异常活化则会导致组织瘢痕形成或纤维化。在机体炎症应答时,组织中TNF-α和激活素A水平均升高。然而,激活素A能否作为TNF-α的天然拮抗剂发挥抗炎作用,以及激活素A与TNF-α能否协同调控成纤维细胞活化,仍不清楚。因此,本研究首先选用TNF-α活性测定靶细胞L929细胞（小鼠成纤维细胞系）探讨激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化的联合作用及相关机制,并进一步应用原代培养细胞确定激活素A与TNF-α对人成纤维细胞活性的联合调控作用。一、研究方法1.小鼠成纤维细胞活性检测CCK-8法和实时细胞分析（RTCA）检测小鼠L929细胞增殖和黏附;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞分泌白细胞介素-6（IL-6）和TGF-β1水平;RT-PCR和Western blotting检测细胞外基质及相关蛋白酶mRNA和蛋白表达水平;Transwell小室法和微流控技术分析细胞迁移能力。2.小鼠成纤维细胞活化机制分析流式细胞术检测L929细胞内钙离子水平及细胞膜相关受体表达水平;RT-PCR和Western blotting检测Smad和MAPK信号通路相关分子mRNA和蛋白表达水平。3.人牙周韧带成纤维细胞培养体外组织块贴壁法培养人牙周韧带细胞（hPDLCs）;采用免疫细胞化学染色鉴定细胞。4.人成纤维细胞活性检测CCK-8法和RTCA分析hPDLCs增殖和黏附;ELISA检测细胞分泌IL-6和TGF-β1水平;RT-PCR和Western blotting检测细胞外基质及相关蛋白酶mRNA和蛋白表达水平;Transwell小室法和微流控技术分析细胞迁移能力。5.人成纤维细胞活化机制分析RT-PCR和Western blotting检测hPDLCs的Smad和MAPK信号通路相关分子mRNA和蛋白表达水平。二、研究结果1.激活素A与TNF-α对小鼠L929成纤维细胞活性影响1.1 TNF-α抑制L929细胞增殖并诱导其凋亡,而激活素A拮抗TNF-α上述作用。1.2 TNF-α诱导L929细胞分泌炎性介质NO和IL-6,但激活素A抑制TNF-α此作用。1.3激活素A促进L929细胞分泌TGF-β1,TNF-α则抑制激活素A诱导的TGF-β1分泌。1.4激活素A上调L929细胞FN、Col I及MMP-2 mRNA表达,而TNF-α下调激活素A诱导的FN和MMP-2 mRNA高表达;TNF-α促进MMP-9 mRNA表达,而激活素A抑制TNF-α诱导的MMP-9 mRNA表达升高。Western blotting证实激活素A上调L929细胞MMP-2蛋白表达,TNF-α则抑制激活素A诱导的MMP-2蛋白表达升高;TNF-α上调L929细胞MMP-9蛋白表达,而激活素A下调TNF-α诱导的MMP-9蛋白高表达。1.5激活素A与TNF-α单独应用均可增强L929细胞黏附能力,两者联合具有协同增强作用。1.6激活素A诱导L929细胞迁移,TNF-α则抑制L929细胞向激活素A趋化迁移。2.激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化机制2.1激活素A诱导L929细胞内钙离子水平升高,而TNF-α可削弱其作用。2.2激活素A对L929细胞膜TNFR1和TNFR2表达无明显影响,但TNF-α下调细胞膜ActRⅡA表达。2.3激活素A对L929细胞Smad信号相关分子表达无显着影响,但显着上调L929细胞p-ERK1/2蛋白水平;TNF-α上调p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平,但激活素A与TNF-α联合作用后,p-ERK1/2蛋白水平较TNF-α单独作用明显降低。2.4 ERK抑制剂FR180204不仅抑制激活素A引起的L929细胞p-ERK1/2蛋白水平升高,也显着削弱激活素A诱导的L929细胞迁移。3.激活素A与TNF-α对人成纤维细胞活性影响3.1体外组织块贴壁法成功培养hPDLCs,免疫细胞化学染色显示细胞抗角蛋白染色呈阴性,抗波形丝蛋白染色呈阳性,符合成纤维细胞特征。3.2 TNF-α抑制hPDLCs增殖并促进其分泌IL-6,而激活素A拮抗TNF-α上述作用。3.3激活素A促进hPDLCs分泌TGF-β1,但此效应可被TNF-α抑制。3.4激活素A促进hPDLCs的FN、Col I和MMP-9 mRNA表达,而TNF-α下调激活素A诱导的MMP-9 mRNA高表达。Western blotting结果同样显示激活素A上调hPDLCs的MMP-9蛋白表达,而TNF-α则下调激活素A诱导的MMP-9蛋白表达升高。3.5激活素A与TNF-α均可提高hPDLCs黏附活性,两者联合具有协同增强作用。3.6激活素A诱导hPDLCs迁移,而TNF-α抑制激活素A诱导的hPDLCs迁移。4.激活素A与TNF-α调控人成纤维细胞活化机制4.1激活素A对hPDLCs的Smad信号相关分子表达无显着影响,而TNF-α下调ActRⅡA表达。4.2激活素A上调hPDLCs的p-ERK1/2和p-p38蛋白水平,而TNF-α拮抗激活素A引起的ERK1/2和p38磷酸化水平升高。三、结论综上所述,激活素A属于新的成纤维细胞趋化因子,并且激活素A与TNF-α对成纤维细胞活性调控作用不同,两者联合作用成纤维细胞主要表现为相互拮抗效应,其拮抗作用不通过经典Smad信号通路,而是通过ERK信号介导。上述结果提示,激活素A可能作为TNF-α的天然拮抗剂在炎症活动期发挥抗炎作用,而TNF-α可能通过拮抗激活素A作用发挥抗纤维化效应,两者的作用平衡可能是影响成纤维细胞活性的关键因素。本研究不仅揭示激活素A与TNF-α共同调控成纤维细胞活化具有重要的生物学意义,也为进一步探索成纤维细胞介导疾病的治疗药物靶点提供新的思路和研究基础。
马骥[2]（2021）在《盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及机制研究》文中研究指明目的:糖尿病慢性难愈性创面修复异常主要表现为新生血管及胶原沉积减少、炎症反应时间延长、氧化应激增强等。盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride,BBR）具有降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗及抗炎、抗氧化等药理作用,对糖尿病及其并发症治疗具有一定作用。本研究拟通过动物及细胞实验探讨盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及主要机制。方法:1.应用STZ腹腔注射SD大鼠（220g-260g）诱导糖尿病大鼠模型,采用背部全层皮肤切除法制备糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面模型。大鼠随机分为正常对照组（NC组）、空白对照组（DM组）、药物溶剂组（BBRSolvent）、药物低剂量组（LBBR）、药物高剂量组（HBBR）,观察创面愈合一般情况及创面面积的变化。在创面愈合过程的第3,8,12,16天切取创面组织进行分析。采用HE和MASSON染色观察创面形态学的变化。ELISA法检测创面晚期糖基化终末产物（AGEs）的生成和堆积。Western Blotting检测创面RAGE受体和Ⅰ型胶原的表达水平。免疫荧光染色检测创面成纤维细胞增殖和凋亡水平。2.分离提取人真皮来源成纤维细胞（HDFs）并鉴定其Vimentin蛋白表达情况。体外制备糖基化白蛋白（AGEs-HSA）,检测其浓度;细胞实验分为对照组,AGEs-HSA组,HSA组,摸索其对HDFs的作用效果及合适的作用浓度。检测RAGE受体的蛋白表达;进一步检测细胞凋亡相关指标,并检测Caspase家族蛋白以明确AGEs-HSA诱导细胞凋亡的信号通路;检测线粒体凋亡信号通路中相关指标的改变,包括Bax/Bcl-2,线粒体膜电位,细胞色素C等,同时检测细胞内ROS的含量。3.探讨BBR是否可以调控AGEs-HSA对成纤维细胞的作用。细胞分为对照组,AGEs-HSA处理组,HSA处理组,BBR溶剂组、低剂量BBR及高剂量BBR处理组。首先通过细胞增殖实验（CCK-8法）及细胞毒性实验（LDH法）摸索合适的BBR浓度;检测RAGE受体的蛋白水平,并通过TUNEL,流式细胞术等方法检测细胞凋亡水平;进一步检测细胞内ROS水平,并通过ROS激活剂代替BBR的方式探索ROS是否为BBR的作用靶点;检测线粒体凋亡信号通路中相关指标的改变,包括线粒体膜电位,细胞色素C,Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达等。结果:1.应用STZ腹腔注射SD大鼠后,糖尿病大鼠血糖明显高于正常大鼠。与NC组相比,DM组大鼠创面愈合延迟（P<0.05）,出现血管生成减少,炎症消散延迟,成纤维细胞及基质沉积减少等特征。BBR可有效促进胶原纤维的增生与成熟,加速创面新生上皮的覆盖。同时,BBR可促进肉芽组织的生长,提高创面愈合率,缩短愈合时间。2.在糖尿病创面愈合的过程中,AGEs处于不断生成和堆积的状态。BBR可抑制糖尿病创面中AGEs的生成和堆积,降低创面中RAGE受体的过度表达。同时,BBR可提高糖尿病创面中Ⅰ型胶原的表达,促进创面细胞外基质的沉积。此外,盐酸小檗碱可提高糖尿病创面中成纤维细胞的增殖能力,降低成纤维细胞的凋亡水平。3.人真皮来源成纤维细胞分离及生长情况良好;150μg/mL以内的AGEs-HSA可以呈剂量依赖性地诱导成纤维细胞凋亡,相同浓度下HSA溶液对成纤维细胞无明显促凋亡作用。AGEs-HSA可以上调RAGE受体蛋白表达水平,增加剪切形式的Caspase-9的表达,进一步实验发现AGEs-HSA可以增加Bax/Bcl-2的比值,引起线粒体膜电位丢失,促进细胞色素C的释放,提示其主要影响线粒体凋亡信号通路。同时,AGEs-HSA可以增加细胞内ROS的水平。4.BBR在75μg/mL浓度以内时,可呈剂量依赖性地拮抗AGEs-HSA的作用,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,降低其细胞毒性。BBR不影响成纤维细胞RAGE受体的表达。BBR可以下调细胞内ROS的水平,提示其可能通过调控ROS发挥拮抗AGEs-HSA的作用。BBR可以调控线粒体凋亡信号通路相关的指标,包括增加线粒体膜电位,减少细胞色素C释放入胞浆,下调Caspase-9和Caspase-3的活化水平。结论:1.盐酸小檗碱外用可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。高浓度的盐酸小檗碱效果更为显着。BBR可抑制糖尿病创面中晚期糖基化终末产物的生成,提高糖尿病创面中成纤维细胞的增殖活性,降低成纤维细胞的凋亡水平。2.AGEs-HSA可以通过结合RAGE受体,激活ROS/细胞色素C/Caspase-9/Caspase-3的线粒体凋亡信号通路,诱导人真皮来源成纤维细胞凋亡,从而影响糖尿病创面的愈合;BBR可以抑制细胞内ROS的生成,阻断AGEs-HSA对线粒体凋亡信号通路的激活,从而逆转AGEs-HSA对成纤维细胞的作用。
刘畅[3]（2021）在《趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究》文中指出肺纤维化（Pulmonary fibrosis,PF）既包括特发性肺纤维化（idiopathic PF,IPF）,也是多种纤维增生性肺病的病理基础。该疾病的特征是肺泡上皮遭受持续性损伤后结构被破坏,过度增殖活化的成纤维细胞分泌过多细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）,导致肺间隔增厚,肺间质重构,患者肺功能受损,最终呼吸衰竭。复杂的发病机制与有限的治疗手段使得肺纤维化病人预后不良,诊断后生存期约为3至5年。早期的标准三联疗法（强的松,硫唑嘌呤,N-乙酰半胱氨酸）非但不能减轻纤维化样病变,甚至会增加患者的入院及死亡风险。FDA在2014年批准了两种药物,吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nintedanib）,这两种药物和肺移植是目前临床上仅有的有效疗法。对于肺移植而言,供体有限,手术操作复杂和伴随的终生免疫抑制治疗都限制了这一疗法的应用。吡非尼酮及尼达尼布虽然能够减少IPF患者最大肺活量的下降程度,减缓疾病进程,但其是否可以延长生存期尚不可知。因此,深入探究肺纤维化的发病机制有助于我们鉴定新的药物靶点,攻克慢性肺病。纤维化作为慢性炎症疾病的终末期病理改变,与肺泡上皮的反复损伤,异常的炎症反应和胶原的过度沉积紧密相关。本文第一部分研究了趋化因子CCL1和肺纤维化效应器细胞成纤维细胞之间的关系。慢性肺损伤导致肺泡巨噬细胞和T细胞中CCL1 的表达上调,CCL1 通过结合 AMFR（autocrine motility factor receptor）受体诱导成纤维细胞活化为肌成纤维细胞。CCL1-AMFR相互作用引起AMFR磷酸化,获得E3连接酶活性,使内源性ERK抑制剂Spry1发生泛素化并移位至胞膜:在细胞膜上,Spry 1结合RasGAP后解除自身对Ras-ERK-p70S6K信号活性的抑制作用,促进促纤维化蛋白合成。在基因水平及药理水平抑制CCL1信号通路可以缓解肺纤维化的病理改变。本研究结果揭示了 CCL1-AMFR-ERK信号轴在纤维化进程中的重要作用,并指出了治疗纤维增生性肺病的潜在靶点。在肺损伤后的修复过程中,肺泡干细胞即肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolarepithelial type 2 cell,AT2）可自我更新或分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞（alveolar epithelial type 1 cell,AT1）以维持呼吸稳态。除了异常的炎症环境和持续堆积的肌成纤维细胞,AT2干性受损和肺泡上皮的再生失败同样密切参与肺纤维化的进程。本文第二部分探究了细胞周期抑制子p21和肺纤维化中肺泡再生失败的关系。在多次博来霉素诱导的肺纤维化模型中,AT2的反复损伤导致其端粒缩短,并时间依赖性地上调p21的表达。p21的堆积不仅诱导AT2细胞周期阻滞,阻碍AT2的自我更新,还会打断p300和β-catenin的相互作用以抑制AT2的分化,即p21上调后老化的AT2不再具有自我更新和分化为AT1的能力。同时,老化的AT2分泌促纤维化的细胞因子以诱导肌成纤维细胞的活化。敲低p21后可以重建肺纤维化模型中由AT2主导的肺泡再生进程。本文的研究结果有助于深入理解肺损伤和肺纤维化的发病机制,也为开发抗纤维化药物提供了新的理论依据。
刘仪[4]（2020）在《硫酸乙酰肝素对骨缺损修复的研究》文中研究表明硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）是高硫酸化结构的线型阴离子多糖,可以通过共价连接于核心蛋白上,组成位于细胞膜表面和细胞基底膜的HS蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPGs）。尽管已有研究表明HSPGs可以与骨折愈合相关的生长因子结合,直接介入生长因子信号转导和骨细胞功能的调节,但目前HS成骨作用的构效关系和机制尚未明确,且HS应用于3D打印的多孔复合支架的研究亦未见报道。为此,本论文通过分离纯化制备了HS,进一步选择性去硫酸化制备了系列衍生物,通过体外实验对其成骨活性、构效关系及相关通路进行了研究,并通过3D打印技术制备新型支架材料用于骨缺损修复的治疗。主要结果如下:（1）通过离子交换色谱技术,从粗品肝素钠中分离和纯化了硫酸乙酰肝素。经过验证其分子量为16.52 k Da,分散度为1.56。采用电导滴定计算HS硫酸根与羧酸根摩尔比为1.35。其次,通过化学修饰法对原料粗品肝素钠进行选择性去硫酸修饰,得到三种选择性去硫酸化肝素,即2-O-DS、6-O-DS和N-DS,分子量分别为87.68 k Da、33.93k Da和9.61 k Da。1H-NMR图谱与标准品一致。（2）成骨增殖方面,HS/DS均具有一定的抑制成骨细胞增殖的作用,并且6-O-DS与N-DS对成骨细胞增殖能力的抑制作用稍强于2-O-DS与HS。HS/DS干预72小时后,成骨细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性与对照组相比有明显的升高,其中HS组较其余去硫酸肝素组ALP的活性更高。ALP活性的升高表明HS/DS在促成骨分化方面有的积极作用,其中HS能够更为明显的促进成骨细胞的分化,作用的适宜浓度为50μg/m L。（3）采用计算机模拟对接的方法和表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）技术进行了虚拟和现实结合力的分析,表明HS可以与雌激素受体β（estrogen receptor-β,ER-β）紧密结合。随后,构建短干扰RNA（short interfering RNAs,si RNAs）下调MC3T3-E1成骨细胞的ER-β蛋白表达水平,并对转染和未转染的成骨细胞进行特定浓度的HS处理。结果表明,ER-β是调控RANKL表达的关键生物标志物,对破骨细胞的生成有一定作用。HS可作为ER-β介导的破骨细胞生成抑制的功能成分,通过影响RANKL/RANK/OPG通路,在调节骨量中起着生理作用,且这种作用很可能通过HS与ER-β的直接结合产生。（4）采用3D打印技术制备的聚己内酯-羟基磷灰石（Polycaprolactone-Hydroxylapatite,PCL-HA）支架具有良好的孔隙率和较高的生物相容性,保证了支架骨界面的稳定生物愈合。此外,所制备的支架具有较高的抗压强度和良好的延展性,能够满足不同骨缺损修复要求。在体外研究中,低浓度HS的PCL-HA支架在促进成骨细胞成熟和促进骨缺损修复方面效果最好;高浓度HS的PCL-HA支架对体外成骨细胞增殖有抑制作用,但在动物体内这种作用不明显。动物实验结果表明,各组支架均未显示出明显的生物毒性,且可以与骨组织形成紧密的生物结合。PCL-HA支架较空白组有一定的促进骨缺损修复作用,负载了两种不同浓度HS的支架促进骨缺损修复的作用均明显高于单纯PCL-HA支架,但两种浓度HS支架间的差异不显着。
邵帅[5]（2020）在《三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响》文中提出[目的]为评价三法三穴对SNI大鼠坐骨神经SC增殖和神经瘢痕形成的影响而开展本实验,本实验从行为学、组织形态学与分子生物学三个层面,评价三法三穴干预能否通过调节TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,影响SNI模型大鼠坐骨神经损伤点SC增殖及神经瘢痕的形成,促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。以期进一步揭示推拿促进坐骨神经损伤后修复的机理,完善推拿治疗周围神经损伤的理论基础,为推拿治疗周围神经损伤疾病提供科学证据。[方法]1 动物分组、造模和干预方法选取健康雄性SD大鼠78只,随机分为假手术组、模型组、三法三穴组,每组各26只。采用坐骨神经夹持损伤法制备SNI模型大鼠。三法三穴组从造模后第8天（d）开始,对大鼠殷门穴、承山穴、阳陵泉穴进行点法、拨法、揉法干预,每穴每手法1min。干预10d休息1d,共干预20次。2行为学检测方法每组每个时间点随机选取6只大鼠进行行为学观察。在造模后7d、14d、21d、28d,检测各组大鼠斜板试验角度。在造模后7d、28d,检测各组大鼠SFI。3组织形态学检测方法每组随机选取4只大鼠,在造模后28d时运用HE染色法,观察SNI大鼠坐骨神经损伤点SC细胞数目和神经瘢痕厚度及染色深度的变化。4蛋白定量检测方法每组每个时间点随机选取4只大鼠,运用免疫荧光标记法,观察造模后7d、28d时坐骨神经损伤点中S100、TGF-β1、Smad2及造模后28d时坐骨神经损伤点Ⅰ/Ⅲ型胶原和FN的表达变化。每组每个时间点随机选取6只大鼠,运用Western-blotting技术,检测坐骨神经损伤点在造模后7d、14d、28d三个时间点TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达变化。5统计方法使用Image J 1.48u软件分析免疫荧光和Western-blotting图像。使用SAS 8.0软件对数据进行统计分析。[结果]1三法三穴干预对SNI大鼠运动功能恢复的影响SFI结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,大鼠SFI显着降低（P<0.01）。三法三穴组与模型组相比,大鼠SFI显着升高（P<0.01）,且接近假手术组水平。斜板实验结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d、21d、28d,大鼠斜板倾斜角度显着降低（均有P<0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后14d、21d,大鼠斜板倾斜角度有升高趋势（P>0.05）,造模后28d,斜板倾斜角度显着升高（P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢精细动作及后肢肌力的恢复,说明三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。2三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经SC增殖的影响HE染色结果:假手术组神经纤维轴索及髓鞘完整、排列紧密,SC核嵌于鞘膜外。模型组神经纤维稀疏、散乱,鞘膜外SC核数量较假手术组减少。三法三穴组坐骨神经可见再生的神经纤维,并有很厚的髓鞘包绕、轴索清晰,鞘膜外SC核数量较模型组明显增多。S100免疫荧光染色结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠坐骨神经损伤点SC标记物S100的平均光密度值明显降低（均有P<0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,坐骨神经S100平均光密度值明显升高（P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够增加神经损伤后期SC的数目。3三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经瘢痕形成的影响HE染色结果:造模后28d,假手术组坐骨神经损伤点神经外膜结缔组织深染,模型组神经外膜结缔组织深染,三法三穴组神经外膜结缔组织染色较模型组明显变浅。Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN免疫荧光染色结果:造模后28d,与假手术组相比,模型组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原、FN表达均明显增多（均有P<0.05）。与模型组相比,三法三穴组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN表达均明显减少（均有P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够抑制SNI大鼠坐骨神经Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN分泌,从而抑制神经外膜瘢痕形成。4三法三穴干预对TGF-β1/Smad2通路蛋白表达的影响免疫荧光染色结果:TGF-β1表达部位与S100高度重合,且在模型组、三法三穴组坐骨神经外膜也出现高表达,Smad2表达在DAPI表达位置附近。模型组与假手术组相比,造模后7d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量明显升高（P<0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异（P>0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异（P>0.05）。模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量明显升高（均有P<0.05）,三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。Western-blotting结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量明显升高（均有P<0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后14d,坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量出现下调趋势（P>0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。以上结果提示:坐骨神经损伤后,TGF-β1主要在SC和损伤神经外膜中表达,Smad2在细胞核周围表达。三法三穴干预在周围神经损伤早期对TGF-β1/Smad2通路蛋白有轻微的下调作用,可能与神经瘢痕形成有关。[结论]三法三穴干预能够增加损伤后期SNI大鼠坐骨神经SC的数目。三法三穴干预能够通过轻微下调TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,抑制SNI大鼠坐骨神经瘢痕的形成,以促进SNI大鼠运动功能恢复。
刘中兵[6]（2020）在《川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究》文中提出第一部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体外研究目的:充分探讨川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎免疫应答过程,确定其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,确定川陈皮素在类风湿关节炎发生、发展过程中的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:我们使用的是RASFs细胞系,即MH7A细胞,它来自RA患者,被认为是RA的主要效应细胞。MH7A细胞系使用含10%胎牛血清的1640完全培养基于37℃、5%CO2、100%的恒温培养箱中培养,具体分组如下:Control组（不做处理）;IL-21组（50 ng/ml IL-21处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 25μM组（50ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 50μM组（50ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;MH7A细胞干预结束后,继续培养48小时后进行相关项目分析:细胞因子分析:ELISA检测各组细胞中IL-6、TNF-α、HMGB1、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;各组MH7A细胞ROS（活性氧）检测;各组MH7A细胞4-HNE（4-羟基壬烯醛）检测;RT-PCR检测IL-21R、IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;Western-blot检测IL-21R及JAK1/STAT3信号通路关键蛋白表达分析;统计数据,给出结论。结果:ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;4-HNE检测:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;ROS检测:各组MH7A细胞中的ROS表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;RT-PCR检测:IL-21R:各组MH7A细胞m RNA表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Westwen-blot检测:IL-21R:各组MH7A细胞蛋白浓度表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以靶向IL-21受体对MH7A细胞做出免疫应答过程,明显降低MH7A滑膜细胞内白细胞介素以及基质金属蛋白酶等浓度变化,缓解MH7A滑膜细胞的炎性进展过程,促进其修复过程,且随着川陈皮素浓度增加,这种趋势更加明显。（2）川陈皮素可以靶向IL-21受体对细胞经典信号通路JAK1/STAT3进行调控应答,降低细胞信号通路关键蛋白JAK1及STAT3等蛋白的磷酸化水平,减缓炎症过程,与上文的结论具有一致性。由此可以得知,川陈皮素在类风湿关节炎的发生、发展过程中可能具有潜在的研究价值,为后期临床治疗类风湿关节炎提供靶向研究导向。第二部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体内研究目的:在体外研究的基础上,体内研究进一步探讨了川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎的免疫应答过程,从而明确了其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,表明了川陈皮素在抗类风湿关节炎症作用方向的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:选取48只Wistar大鼠适应性饲养1周后将其随机分成4组,除去对照组大鼠,其余建立CIA模型;具体分组如下:Control组（大鼠不做处理）;IL-21组（CIA模型+50 ng/ml IL-21,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 25μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 50μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;继续饲养6周后将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠模型成功率检测:大体观察、体重指数、关节炎、关节指数分析;形态学分析:各组大鼠HE染色分析;ELISA检测分析:IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13蛋白;RT-PCR检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13m RNA表达分析;Western-blot检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13及JAK1/STAT3通路分析,分析数据,给出结论。结果:模型成功率检测:临床表现:对照组大鼠精神状态较好,体重体现出稳步增长的趋势,毛发光泽性较差;模型组大鼠意志沉迷,进食量逐渐减少,毛发光泽性,2周后处于无法负重的状态;体重变化:两周后各组大鼠的体重变化趋势为IL-21<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21+Nobiletin 50μM<Control,各组之间体重比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;关节炎发病率/关节指数:各组关节炎发病率比较趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,数据分析差异具有统计学意义（P<0.05）.形态学分析:HE染色:对照组大鼠踝关节组织细胞排列密集,形态规则,轮裹明显;模型组大鼠踝关节组织细胞层变厚,白细胞和淋巴细胞大量充斥,连续性减弱;川陈皮素干预后,大鼠的踝关节组织细胞排列密集性加强,细胞形态趋于正常。ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。RT-PCR检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。Westwen-blot检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以较好的改善模型组大鼠关节炎效应,明显改善大鼠的精神状态,降低大鼠的类风湿关节炎症的程度及关节指数,为后续的研究提供帮助。（2）与体外研究结果一致,川陈皮素改善大鼠类风湿关节炎症的作用主要是通过靶向机体IL-21R浓度变化进而调控JAK1/STAT3的活性状态,充分降低白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、高迁移率蛋白表达,逐渐恢复关节软骨基质合成及分解的平衡状态,加速类风湿关节炎疾病的康复过程,达到对类风湿关节炎的治疗效果,给予临床一定启发。
常露[7]（2020）在《Ac-SDKP调节Hedgehog信号抑制AngⅡ介导的皮肤肌成纤维细胞分化的机制》文中认为目的探究取自SD大鼠中,新生幼鼠背部真皮组织体外培养的皮肤成纤维细胞（skin flbroblast,SF）经血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）诱导转化为皮肤肌成纤维细胞（skin myofibroblasts,SMF）的过程中,Hedgehog信号在皮肤肌成纤维化发生、发展中的调控机制,以及研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP）通过调控刺猬（Hedgehog,HH）信号,抑制血管紧张素Ⅱ诱导的皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的作用和机制,从而发挥其抗皮肤纤维化的作用,为以后临床应用提供更加科学的理论依据。方法原代培养新生SD乳鼠背部真皮中分离出SF并进行培养至第二代细胞,予以AngⅡ诱导向肌成纤维细胞分化,并予以Ac-SDKP、SMO阻滞剂（GDC-0449）、GLI阻滞剂（GANT61）预处理。通过划痕实验检测细胞迁移能力。通过免疫组织化学染色法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscleactin,α-SMA）的定位与表达。Western-blotting技术检测表达在肌成纤维细胞内Ⅰ型胶原（ColⅠ）、转入因子蛋白GLI（GLI1,GLI2,GLI3）、跨膜Patched蛋白（PTC）、Smothened原癌基因（SMO）、SHH、α-SMA的水平。统计学方法是将实验中的所得的原始数据先经Excel 2013整理,整理后构建数据库通过SPSS22.0软件包进行统计学分析,数据均以均数±标准差（（?）±s）表示分析所得结果,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异才具有统计学意义。结果1细胞划痕实验显示,采用Ac-SDKP诱导皮肤肌成纤维细胞划痕实验0小时与48小时相比结果显示,AngⅡ诱导的皮肤肌成纤维细胞迁移情况较正常肌成纤维细胞明显增强,AngⅡ与给予的Ac-SDKP相结合,相比结果显示,AngⅡ与Ac-SDKP相结合较Ac-SDKP诱导皮肤肌成纤维细胞迁移情况较明显好转。2免疫细胞化学法结果显示,AngⅡ诱导组细胞中α-SMA的阳性表达较空白对照组增强;而Ac-SDKP预处理组可明显抑制α-SMA的阳性表达。3免疫印迹结果显示,采用SMO受体阻断剂GDC-0449诱导皮肤肌成纤维细胞,与对照组相比,在AngⅡ诱导组中Col I、α-SMA、SHH、SMO、GLI1、GLI2阳性表达分别上调1.9倍、4.3倍、3.5倍、2.4倍、1.7倍、3倍,PTC、GLI3阳性表达分别下调86%和80%,与AngⅡ诱导组相比,在AngⅡ与GDC-0449阻断剂组中Col I、α-SMA、SHH、SMO、GLI1、GLI2阳性表达分别下调50%、55%、49%、52%、43%、45%,PTC、GLI3阳性表达分别上调1.9倍和2.9倍（P<0.05）。采用GLI1/2阻滞剂GANT61诱导皮肤肌成纤维细胞,与对照组相比,在AngⅡ诱导组中Col I、α-SMA、SHH、SMO、GLI1、GLI2阳性表达分别上调2.9倍、5.1倍、4.9倍、3.2倍、5倍、1.7倍,PTC、GLI3阳性表达分别下调82%和69%（P<0.05）,与AngⅡ诱导组相比,在AngⅡ与GANT61阻断剂组中Col I、α-SMA、SHH、SMO、GLI1、GLI2阳性表达分别下调32%、37%、20%、51%、48%、49%,PTC,GLI3阳性表达分别上调5.4倍和1.4倍（P<0.05）。采用Ac-SDKP诱导皮肤肌成纤维细胞,与对照组相比,在AngⅡ诱导组中Col I、α-SMA、SHH、SMO、GLI1、GLI2阳性表达分别上调2.9倍、1.4倍、1.6倍、4.8倍、2倍、1.8倍,PTC、GLI3阳性表达分别下调85%和63%（P<0.05）,与AngⅡ诱导组相比,在AngⅡ与Ac-SDKP组中Col I、α-SMA、SHH、SMO、GLI1、GLI2阳性表达分别下调56%、66%、73%、50%、41%、51%,PTC,GLI3阳性表达分别上调2.7倍和5.6倍（P<0.05）。结论Ac-SDKP可能通过抑制Hedgehog信号从而拮抗AngⅡ介导的皮肤肌成纤维细胞的分化,发挥其抗纤维化的作用。图11幅;表8个;参61篇。
刘振兴[8]（2020）在《p75NTR在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景皮肤损伤是临床上的常见病、高发病,损伤后的创面愈合问题更是给患者的生理和心理带来巨大的影响。皮肤的创面愈合一直以来都是国内外临床研究的热点与难点,它是一个复杂、有序、动态的修复过程,分为凝血期、炎症期、肉芽组织形成期以及组织重构期4个相互连贯的阶段。成纤维细胞是创面肉芽组织中主要组成细胞。在正常创面愈合的过程中,成纤维细胞能够被活化并逐渐转分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞能高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,同时可合成并分泌大量的胶原蛋白、多种生长因子及酶类,在创面愈合过程中皮肤组织的重塑及纤维化形成中起关键作用。p75神经营养因子受体（p75 neurotrophinreceptor,p75NTR）是神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）的低亲和力受体,具有多向性功能,参与调控多种细胞的增殖、凋亡、分化、生存、迁移等多种生物学过程。p75NTR生物学功能的发挥主要取决于其配体类型、衔接蛋白及激活的信号传递通路等因素。早期对p75NTR的研究主要集中于神经系统,早期研究发现,其在神经元的发生发育、神经损伤后的修复、再生及神经保护方面具有重要作用。近年来发现,p75NTR还参与调控多种非神经系统组织的功能。研究发现,皮肤损伤时,创面组织中NGF和p75NTR的表达均明显上调,说明其在皮肤创面愈合过程中可能起重要作用。NGF是最为常见的一种神经营养因子,可由神经细胞或非神经细胞合成。在正常的生理状态下,皮肤组织中NGF可由角质形成细胞产生,并积极参与皮肤稳态的维持。在皮肤创面愈合的过程中,NGF可由感觉神经末梢、角质形成细胞及成纤维细胞以旁分泌或自分泌方式产生,并与其受体原肌球蛋白相关激酶A（tropomyosinreceptorkinaseA,TrkA）和/或 p75NTR结合,进而调控细胞的增殖、凋亡及分化等生物学过程。早期研究已证实NGF具有加速成纤维细胞迁移、促进创面再上皮化的作用,其局部应用可明显促进正常创面及糖尿病创面等各类创面的愈合。此外,NGF还可诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,但其作用的分子机制仍不明确。本课题组前期研究发现,p75NTR可以通过促进表皮干细胞的增殖、迁移及分化而加快皮肤创面的愈合。那么p75NTR是否参与调控NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化过程呢?其具体的调控机制是什么?我们通过检测p75NTR的表达模式初步推测其在皮肤组织成纤维细胞中的功能,并通过过表达及敲低p75NTR来进一步探讨其在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化过程中的调控机制。研究目的1.通过检测p75NTR在小鼠皮肤组织成纤维细胞中的表达模式,初步探索其功能;2.通过检测p75NTR对成纤维细胞行为的影响,进一步明确其在成纤维细胞中的主要功能以及其在NGF诱导下成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化中的作用;3.通过过表达、抑制表达等分子生物学手段进一步揭示p75NTR在NGF诱导的肌成纤维细胞转分化过程中的调控机制。材料和方法1.p75NTR在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达模式（1）小鼠皮肤成纤维细胞的原代培养:取C57BL/6乳鼠的背部皮肤,分别采用组织块法和酶消化法来原代培养小鼠皮肤组织成纤维细胞,并采用胰蛋白酶消化-再贴壁法来纯化成纤维细胞。在倒置相差显微镜下来对比观察两种方法获得的原代及传代成纤维细胞的形态特点,进行初步形态学鉴定。分别以小鼠NIH/3T3成纤维细胞、角质形成性细胞作为阳性与阴性对照,采用Western-blot检测Vimentin及Keratin的表达情况,以鉴定所获得的细胞。选用第3代细胞,采用计数法检测并绘制细胞的生长曲线以对比两种方法获得细胞的增殖情况。（2）p75NTR在小鼠皮肤组织成纤维细胞中的表达:分别培养组织块法与酶消化法原代提取的小鼠皮肤组织成纤维细胞及小鼠NIH/3T3成纤维细胞,采用免疫荧光染色、Western-blot检测p75NTR在小鼠成纤维细胞中的表达情况。2.建立p75NTR过表达/敲低稳定转染的成纤维细胞株将构建好的p75NTR过表达/敲低表达的慢病毒载体来转染小鼠NIH/3T3成纤维细胞,用2μg/ml嘌呤霉素来筛选转染后的成纤维细胞,以获得稳定转染的细胞株,并采用免疫荧光染色、Western-blot检测p75NTR在稳定转染的细胞株中的表达情况。3.p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性及肌成纤维细胞转分化的影响（1）p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低表达及正常的小鼠成纤维细胞,检测并分析p75NTR对小鼠成纤维细胞增殖、细胞周期及迁移等生物学特性的影响。采用CCK-8法来检测p75NTR对小鼠成纤维细胞增殖的影响;采用流式细胞术来检测p75NTR对小鼠成纤维细胞周期的影响;采用Transwell技术检测p75NTR对小鼠成纤维细胞迁移的影响。（2）NGF对小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的诱导作用:配制不同NGF浓度的（0,0.1,1,10,100 ng/ml）的培养基,分别诱导小鼠NIH/3T3成纤维细胞,采用Western-blot检测细胞中α-SMA的表达情况,对比分析最佳的诱导浓度。于最佳的诱导浓度下,采用Western-blot、qRT-PCR等实验手段在转录及翻译水平上,检测不同诱导时间（0h,24h,48h,72h）对α-SMA表达的影响。（3）NGF对小鼠成纤维细胞TrkA和p75NTR受体表达的影响:分别于0h、24h、48h及72h四个时间点下,以100 ng/ml NGF刺激小鼠成纤维细胞,采用Western-blot、qRT-PCR检测细胞中TrkA和p75NTR受体在转录及翻译水平上的表达情况。（4）p75NTR对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,并应用100ng/ml NGF诱导其向肌成纤维细胞转分化,采用免疫荧光染色、Western-blot、qRT-PCR检测细胞中α-SMA在转录及翻译水平的表达情况。（5）p75NTR对NGF诱导的I型胶原合成的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,并应用100ng/ml NGF诱导小鼠成纤维细胞,采用Western-blot、qRT-PCR检测细胞中I型胶原在转录及翻译水平的表达情况。4.p75NTR调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究（1）p75NTR对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化中F-actin、MRTF-A表达的影响:以100 ng/mlNGF诱导p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,采用免疫荧光染色检测F-actin、MRTF-A及α-SMA的表达变化情况,采用Western-blot技术检测MRTF-A蛋白的表达情况。（2）CCG-203971对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的抑制作用:采用CCK-8法测定MRTF-A抑制剂CCG-203971的IC50,绘制曲线并计算IC50值。应用100 ng/ml NGF、30μM CCG-203971刺激小鼠成纤维细胞,采用免疫荧光染色、Western-blot检测α-SMA表达情况。5.统计学分析本实验所得数据均使用GraphPad Pro.Prism 7.0软件来进行统计学分析,数据使用均数±标准差（x±s）来表示,每组实验重复3次。数据间比较:两样本之间数据的比较采用单因素方差分析t检验,多样本间的数据比较采用ANOVA检验。P<0.05代表差异具有统计学意义。结果1.p75NTR在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达模式（1）采用两种方法原代培养的细胞经纯化后具有相同的增值能力,经Western-blot鉴定均表达成纤维细胞特征性蛋白Vimentin。相比较而言,酶消化法更为方便、快捷。（2）免疫荧光染色和Western-blot检测结果显示:p75NTR在原代获得的小鼠皮肤成纤维细胞及小鼠NIH/3T3成纤维细胞系中表达水平相似。2.建立p75NTR过表达/敲低的稳定转染细胞株免疫荧光染色和Western-blot结果显示:成功构建了 p75NTR过表达/敲低的稳定转染细胞株。3.p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性及肌成纤维细胞转分化的影响（1）CCK-8法结果显示:p75NTR对小鼠成纤维细胞的增值能力无明显影响;流式细胞术分析结果显示:p75NTR对小鼠成纤维细胞周期无明显影响;Transwell检测结果显示:p75NTR的表达水平与小鼠成纤维细胞的迁移能力呈正相关。（2）Western-blot检测结果显示:NGF诱导下α-SMA蛋白的表达与NGF的浓度呈正相关,其中100 ng/ml NGF具有显着的诱导效果。同时,qRT-PCR和Western-blot检测结果显示:α-SMA的转录和表达均在48h开始进入平台期。（3）qRT-PCR和Western-blot检测结果显示:NGF诱导下小鼠成纤维细胞p75NTR的转录和表达随时间的延长而增多,而TrkA受体的转录和表达随时间的延长无明显变化。（4）qRT-PCR、Western-blot及免疫荧光染色检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中α-SMA的转录及蛋白表达水平显着高于对照组,而敲低组显着低于对照组。（5）qRT-CR和Western-blot检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞I型胶原的转录及蛋白表达水平显着高于对照组,而敲低组显着低于对照组。4.p75NTR调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究（1）免疫荧光染色结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中F-actin、MRTF-A蛋白的表达水平及MRTF-A蛋白核转位水平显着高于对照组,而敲低组显着低于对照组,且其表达变化与α-SMA相一致。Western-blot检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中MRTF-A蛋白的表达水平显着高于对照组,而敲低组中显着低于对照组。（2）免疫荧光染色和Western-blot结果显示:NGF+CCG-203971组成纤维细胞的α-SMA的表达水平明显低于NGF组。结论1.p75NTR在原代培养小鼠皮肤成纤维细胞和小鼠NIH/3T3成纤维细胞中表达水平相似,值得进一步深入研究。2.100 ng/ml NGF在24、48h时可显着诱导小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,且p75NTR可调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化及I型胶原蛋白的合成过程。3.NGF通过p75NTR-F-actin-MRTF-A信号通路诱导小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。
张鹏[9]（2020）在《多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆促进创面修复的研究》文中研究说明研究的背景及目的创面迁延不愈合是临床医师遇到的最常见、最棘手的问题之一。手术彻底清创是治疗慢性创面的关键,然而去除感染及坏死组织后,如何促进并加快创面愈合是每个外科医生都会遇到的难题。由于自体皮肤或皮瓣移植的有限性和异体皮肤移植的排斥反应,促进人们开始寻找新型的生物替代材料来治疗创面。随着分子生物学技术和材料学的发展,多种天然生物材料已被广泛应用于慢性创面的治疗中,并取得了一定的效果。然而,这些天然支架材料不具备真正皮肤软组织的排泄、吸收等生理功能,而且在降解过程中避免不了化学残留及异物蛋白污染等缺点。因此,深入研究创面愈合过程中的具体机制,研发新型创面材料是目前亟需解决的问题。富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）因富含血小板及高浓度的各种细胞因子、纤维蛋白而被广泛应用于多种疾病的治疗。腺苷是血小板代谢产物的一种重要成分,通过激活腺苷受体,从而影响细胞的多种生物学活性。近年来研究表明,腺苷通过激活成纤维细胞中的A2A受体来促进成纤维细胞的活性。虽然富血小板血浆已被证明具有促进创面愈合的作用,然而其是否通过释放腺苷,激活A2A受体来影响成纤维细胞的活性,目前尚不得知。除此之外,由于富血小板血浆在体外的生物活性周期短,是否可以通过多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆,延长富血小板血浆的生物活性周期,从而更好的促进创面愈合。因此,在本次研究中,我们主要探讨富血小板血浆对成纤维细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其具体分子机制。此外,我们将检测负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶的性能,并通过体外实验验证负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶对大鼠创面的治疗效果。第一部分富血小板血浆对成纤维细胞的影响目的:观察富血小板血浆在体外对成纤维细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法:1.富血小板血浆的制备:4周龄大小体重约100～110g SD大鼠,从每只大鼠心脏中用含0.5 m L柠檬酸钠抗凝剂的注射器抽全血至5 m L,充分混匀后,离心管500x g下离心10 min,可见血液分成三层。取最上层的液体移至新的离心管中,在2200x g下离心10 min,可见液体分成两层,上层上清液为贫血小板血浆（platelet-poor plasma,PPP）,下层为血小板浓缩物（platelet concentrate,PC）。吸取大部分上清液弃掉,剩余约1.2 m L摇匀,即可得到PRP。2.利用CCK8检测不同浓度富血小板血浆对成纤维细胞活性的影响。实验分为6组:Control组（PBS）、10%PRP组、20%PRP组、30%PRP组、40%PRP组和50%PRP组。在96孔中植入5x103/100 m L的细胞,每组设立5个复孔,分别培养0 h、24 h、48 h、72 h后,加入10μL的CCK8试剂,96孔板孵育2 h后,检测各孔的吸光光度值。3.通过Western blot,PCR和流式细胞周期的方法观察富血小板血浆对成纤维细胞增殖能力的影响。实验分为2组:Control组（PBS）和50%PRP组。对6孔板中生长状态良好的成纤维细胞分别给予PBS和50%PRP干预,24 h后通过流式细胞技术对细胞的周期进行评估,并采用Western blot和q RT-PCR技术对细胞的周期蛋白Cyclin D1和Cyclin D3进行检测。4.通过Transwell迁移实验检测不同浓度富血小板血浆对成纤维细胞迁移能力的影响。实验分6组:Control组（PBS）、10%PRP组、20%PRP组、30%PRP组、40%PRP组和50%PRP组。按在12孔板的每孔中加入1 m L含上述浓度PRP的无血清培养基,然后将成纤维细胞用DMEM配置成浓度为5x105/m L的细胞悬液,将100μL此细胞悬液加入到Transwell小室内,置于上述12孔板内。在培养箱中孵育24 h后,通过结晶紫染色观察迁移到Transwell小室滤膜下层细胞。5.通过流式凋亡的方法探索富血小板血浆对成纤维细胞凋亡的影响。实验分为6组:Control组（PBS）、10%PRP组、20%PRP组、30%PRP组、40%PRP组和50%PRP组。6孔板中生长状态良好的成纤维细胞分别给予PBS和50%PRP干预,24 h后通过流式细胞技术对细胞的凋亡进行评估。6.通过生化检测的手段分别检测普通血浆和富血小板血浆中腺苷的水平。分别收集正常血浆和富血小板血浆,通过ELISA试剂盒检测两种血浆中腺苷的水平。7.观察腺苷A2A受体抑制剂和富血小板血浆对成纤维细胞功能的影响。实验分为两组:PRP组、PRP+A2A受体抑制剂组两组。通过CCK8,western blot,q RT-PCR,transwell小室和流式细胞仪检测细胞的增殖、迁移和凋亡情况。结果:1.富血小板血浆可以促进成纤维细胞增殖和迁移,抑制成纤维细胞凋亡。2.富血小板血浆中腺苷的表达水平明显升高。富血小板血浆促进成纤维细胞的功能在加入腺苷A2A受体抑制剂后,其对成纤维细胞的正向调控作用明显减弱。结论:富血小板血浆可通过释放腺苷,激活成纤维细胞中的A2A受体,从而促进细胞的增殖、迁移,抑制细胞凋亡。然而,由于富血小板血浆中还含有多种丰富的细胞因子,这些细胞因子对成纤维细胞功能的影响,尚需进一步研究。第二部分多肽纳米纤维水凝胶的制备及负载富血小板血浆的缓释性能检测目的:制备多肽纳米纤维水凝胶,并检测其负载富血小板血浆后的缓释性能。方法:1.制备多肽纳米纤维水凝胶:IKVAV、FGL-PA和RGD三种多肽购买自上海波泰生物科技有限公司。将三种多肽混合溶液（0.1 m L）加入到蒸馏水中,随后稀释到0.6 mg/m L。取0.1 m L的混合溶液,加入0.1 m L的DMEM/F12,引发自组装。2.观察多肽纳米纤维水凝胶的形态:取10μL多肽纳米纤维水凝胶至铜网上,透视电镜下观察水凝胶的形态。3.检测多肽纳米纤维水凝胶的粒径:蒸馏水稀释多肽纳米纤维水凝胶50倍后,通过Nanosight粒度分析仪检测水凝胶的粒径。4.制备载有富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶:按1:1的比例,向多肽纳米混合液中加入等体积的PRP,加入0.1 m L的DMEM/F12,引发自组装。将载有PRP的多肽纳米纤维水凝胶复合物用蒸馏水稀释100倍。通过紫外分光光度计,检测上清和沉淀的吸光度,计算药物的包封率。5.检测多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆的缓释性能:取0.1 m L负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶置于12孔细胞培养板中,每孔加入1 m L PBS,在不同时间段使用紫外分光光度仪检测每孔的吸光光度值,计算累积释放率。结果:通过透射电镜观察,证实了我们成功合成了多肽纳米纤维水凝胶;通过Nanosight粒度分析仪检测,发现我们制备的多肽纳米纤维水凝胶的平均粒径为186.1±7.2 nm,符合纳米级的要求。经紫外分光光度仪检测后,我们发现富血小板血浆的包封率为95.73±3.21%;在第96 h后,我们发现上清中的富血小板血浆的含量基本达到了所负载的含量。结论:负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶具有较高的载药量和较长的缓释时间,可以作为一种较好的复合材料。第三部分多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆在创面修复中的作用目的:评估多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆对大鼠背部创面愈合的影响。方法:1.建立大鼠背部皮肤创面模型:40只重量约为320 g的SD雄性大鼠。大鼠给予50 mg/kg,1%的戊巴比妥钠腹腔注射后,刮除大鼠背部毛发。在大鼠的背部正中做一直径1.5 cm约圆形创面。2.创面给予不同的干预措施:将大鼠随机分为四组,分别于术后第0 d、3 d、5 d、7 d分别给予PBS,富血小板血浆、多肽纳米纤维水凝胶以及负载富血小板血浆的多肽纳米水凝胶处理,动态观察大鼠背部创面愈合情况。3.计算大鼠背部创面的愈合速度:在术后第0 d、3 d、7 d、10 d和14 d,使用数码照相机对创面进行拍照,并通过Image J软件计算创面的面积。4.通过多普勒超声观察创面血流灌注情况:在术后第10 d,使用点状激光成像技术评估创面血流灌注情况。随后使用PIMSoft软件分析创面的图像,以计算MPU的比率。5.检测创面中相关蛋白的表达情况:在术后第14 d,麻醉状态下处死大鼠后,切取部分大鼠创面的组织,提取组织中的总蛋白,检测胶原蛋白I、胶原蛋白III、金属基质蛋白酶3、金属基质蛋白酶9以及α-平滑肌激动蛋白的表达水平。6.对创面局部组织进行石蜡包埋,并行HE染色和CD31染色:在术后第14 d,收集每组大鼠创面处的组织,进行石蜡包埋,随后对组织进行切片,行HE染色和CD31免疫组化染色,评估创面的宽度和创面处新生血管情况。结果:通过动态观察大鼠背部创面的面积、收缩度等指标,我们发现富血小板血浆、多肽纳米纤维水凝胶和负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶均可以促进创面愈合,其中负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面愈合最佳。Western blot结果显示负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组增殖相关蛋白表达水平最高;多普勒观察到负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面血流灌注量最大;HE染色和CD 31免疫组化显示负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面增生最佳,局部创面新生血管最丰富。结论:富血小板血浆、多肽纳米纤维水凝胶和负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶均可以促进创面愈合。负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面愈合效果更好,可以作为创面修复的治疗提供一种新型材料。
邱伟[10]（2019）在《FGF-2协同TGF-β1上调成纤维细胞PD-L1调控创面炎症促进愈合的作用及机制研究》文中研究表明研究背景创面愈合是一个高度协调的病理生理学过程,通常经历凝血、炎症、增殖和重塑四个阶段。正常的创面愈合需成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞等多种细胞参与,并分泌各种细胞因子,有序地调节修复细胞的增殖、迁移和凋亡等;同时维持细胞外基质的沉积与降解之间的动态平衡,最终完成创面愈合。然而,某些因素可导致创面经久不愈或过度愈合而形成瘢痕,属于临床治疗中棘手的问题。炎症反应对创面愈合的调控是一把双刃剑。在创面炎症反应过程中,单核细胞和肥大细胞等炎症细胞清除病原菌等有害物质,并释放细胞因子,协调作用促进创面愈合;而创面炎症调控紊乱则是导致慢性难愈创面发生的主要原因,已证实创面若发生持续性炎症反应,则无法从炎症期过渡到增殖期,而出现难愈。另外,持续的慢性炎症则会诱发过度愈合而产生病理性瘢痕。因此,研究创面愈合过程中的炎症调控机制,对难愈创面及病理性瘢痕的治疗有重要的科学意义和临床价值。创面炎症反应的消退是一个复杂的过程,需要中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等多种细胞协同作用。成纤维细胞作为创面修复过程中主要功能细胞,除了分泌细胞外基质（ECM）参与肉芽组织形成之外,还参与了炎症的调控。创伤早期,成纤维细胞分泌细胞因子募集白细胞,并促进其浸润和活化。另外,成纤维细胞可直接与中性粒细胞接触,参与控制创面炎症。由此提示,成纤维细胞通过分泌因子和直接接触两种途径,既参与创面早期炎症形成,又参与后期炎症消退,但具体的调控机制,特别是炎症消退的调控机制尚不完全清楚。机体免疫应答或者炎症反应是免疫调控动态平衡的结果,近来发现的免疫检查点（immune checkpoint）是机体对抗过度免疫应答或者炎症反应的负性调控机制,在肿瘤逃避免疫监视和自身免疫性疾病发生起重要作用。其中PD-1/PD-L1通路是免疫检查点通路中的关键通路之一,参与维持外周免疫耐受。而目前关于免疫检查点是否参与创伤愈合中的炎症消退调控仍不清楚。我们前期研究发现,创面愈合过程中,成纤维细胞可表达PD-L1,由此提出成纤维细胞可能通过PD-L1信号参与创面愈合过程中炎症调控的假说,但成纤维细胞在创面愈合过程中上调PD-L1表达的机制以及PD-L1信号参与创面愈合中的炎症调控作用机制尚待探明。在创面愈合过程中存在多种细胞因子（如TGF-β、PDGF、EGF、FGF-2、IL-1和TNF等）,对修复细胞进行精确调控以促进伤口愈合。而创面愈合过程中成纤维细胞表达PD-L1是否受部分因子调控仍需进一步探索。同时,已证实,PD-L1的表达主要通过翻译水平调控,那么创面愈合过程中成纤维细胞表达PD-L1是否依赖蛋白质翻译调控也需进一步研究。有证据表明,巨噬细胞全程参与创面愈合过程中炎症反应,特别是在炎症反应后期。巨噬细胞既要吞噬凋亡细胞,又要进行表型和功能上的转变,由M1型（促炎型）极化为M2型（抑炎型）,而PD-1/PD-L1通路在巨噬细胞极化调控中发挥重要作用,为此我们进一步推测创面愈合过程中成纤维细胞通过表达PD-L1,介导巨噬细胞极化,参与创面炎症消退调控,最终促进伤口愈合。二甲基亚砜（DMSO）是一种广泛使用的溶剂,归因于其高度极性亚基的存在,能够溶解多种溶解度低的化合物,如药物,抑制剂等。DMSO作为一种潜能药物,曾经也应用于多种肿瘤和急慢性炎症的治疗。然而,由于DMSO的安全性一直未得到充分的肯定,因此,其体内数据依然较少,尚且不能在临床上得到广泛的应用。有研究证实,DMSO能够通过降低促炎因子水平,进而减轻炎症水平,而且,DMSO能够促进创面愈合,但是机制尚不完全清楚。前期我们采用了DMSO作为溶剂来溶解eIF4E抑制剂4EGI-1,惊奇的发现了DMSO单独加入竟有效的促进成纤维细胞的增殖。因此我们提出假设,DMSO可能通过促进成纤维细胞增殖,而增殖的成纤维细胞在细胞因子的刺激下高表达PD-L1,进而调控创面炎症消退,最终促进伤口愈合。研究目的:旨在阐明成纤维细胞在创面愈合过程中通过表达免疫检查点受体PD-L1介导炎症消退,参与创面愈合的作用机制,具体如下:（1）明确创面愈合过程中PD-L1表达的规律,及其在创面愈合中的作用;（2）明确成纤维细胞表达PD-L1的调控因素;（3）探明成纤维细胞表达PD-L1参与创面炎症消退调控的作用机制;（4）研究DMSO促进难愈性创面愈合的具体机制。最终为因炎症调控紊乱所致的难愈创面或者病理性瘢痕的治疗提供新的靶点和理论依据。研究方法:1.制备WT小鼠背部创面模型,采用免疫组化、WB和qRT-PCR检测伤口不同天数PD-L1蛋白和mRNA表达水平,分析PD-L1在创面愈合过程表达规律;WT小鼠和PD-L1-/-小鼠皮下注射LPS制备创面慢性愈合模型,分析PD-L1在创面愈合过程的功能。2.FACS及免疫荧光检测创面组织中PD-L1主要表达细胞;免疫荧光分析PD-L1阳性成纤维细胞和巨噬细胞空间定位;qRT-PCR分析炎性因子TNF-a和IL-6、FACS检测巨噬细胞数目、WB检测巨噬细胞表面标志CD16和CD206随着创面愈合进程动态变化。3.FACS检测创面渗液或联用TGF-β1和FGF-2中断抗体处理MEF细胞PD-L1表达;FACS、WB与qRT-PCR检测TGF-β1和FGF-2处理MEF细胞PD-L1蛋白和mRNA表达;TGF-β1和FGF-2处理MEF细胞与LPS激活的巨噬细胞共培养,FACS和免疫荧光检测巨噬细胞CD16和CD206的表达,ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-10的表达;PD-L1-/-小鼠慢性创面愈合模型中,利用RECELL技术回补TGF-β1和FGF-2协同处理的MEF细胞,分析创面愈合进程。4.利用Polyribosome检测TGF-β1和FGF-2协同处理的MEF细胞的多聚核糖体上的PD-L1 mRNA含量变化,IP检测eIF4F的形成,WB检测翻译通路关键蛋白活化及表达,并结合特异性通路抑制剂,探讨TGF-β1和FGF-2翻译水平调控PD-L1表达的机制。5.通过CCK-8检测和划痕试验探究成纤维细胞在不同浓度的DMSO处理后的其增殖和迁移情况,并探讨其相关机制。6.利用7m-GTP的Pull-down实验,探索DMSO对通路蛋白和翻译起始复合物等的影响,并结合特异性通路抑制剂,揭示DMSO发挥作用的机制。7.制备小鼠背部难愈创面模型,分析不同浓度的DMSO对伤口愈合进程的影响。研究结果:1.PD-L1在创面愈合进程中呈现动态表达,而敲除PD-L1显着抑制创面愈合。2.创面组织PD-L1蛋白表达随着愈合进程呈现先升高后降低的动态改变,于伤后5天达到高峰,而PD-L1 mRNA水平无明显变化;3.LPS刺激导致小鼠急性炎性创面愈合速度明显减慢,其中,PD-L1-/-小鼠伤口愈合速度显着延缓,说明PD-L1敲除加重了炎症所致的慢性难愈程度。4.PD-L1在创面愈合炎症调控中发挥重要作用。1)与DC和巨噬细胞相比较,小鼠伤后5天组织PD-L1阳性的成纤维细胞数量明显增多,说明在创面愈合的炎症期向增殖期转化过程中,PD-L1主要定位于成纤维细胞,而且巨噬细胞和成纤维细胞在这个过程中存在空间相关性;2)在创面愈合过程中,与WT小鼠相比,PD-L1-/-小鼠创面组织中炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA水平和募集的巨噬细胞数目显着增加,说明PD-L1参与调控伤口愈合过程的炎症反应;另外,PD-L1-/-小鼠创面组织中CD16表达升高且消退时间延后,而CD206表达则减少,说明PD-L1对巨噬细胞极化扮演着重要的角色。5.TGF-β1协同FGF-2上调MEF细胞PD-L1表达,影响巨噬细胞极化,参与创面炎症调控。1)第5天的创面渗液上调MEF细胞PD-L1表达,联合应用TGF-β1和FGF-2中和抗体显着逆转PD-L1的表达;TGF-β1和FGF-2上调MEF细胞PD-L1蛋白水平表达,而mRNA表达水平则无明显变化;2)TGF-β1和FGF-2预处理的MEF愈巨噬细胞共培养后,能够降低巨噬细胞M1比率,升高M2型比率,促炎因子TNF-α和IL-6表达降低,抑炎因子IL-10表达升高,说明TGF-β1和FGF-2处理的MEF能够促使巨噬细胞从M1型向M2型转换;相反,TGF-β1和FGF-2处理PD-L1-/-MEF细胞明显减弱了巨噬细胞从M1型向M2型转换能力,说明TGF-β1和FGF-2刺激成纤维细胞调控巨噬细胞极化依赖PD-L1信号;将预处理的WT和PD-L1-/-MEF细胞固定后降低了其对巨噬细胞极化的调控能力,说明成纤维细胞可能还通过其他途径调控巨噬细胞极化,如释放可溶性因子,然而,其调控水平仍具有显着性差异,说明PD-L1通路在调控巨噬细胞极化中发挥重要作用。3)回补TGF-β1和FGF-2预处理MEF细胞促进炎症条件下PD-L1-/-小鼠伤口愈合,证实了TGF-β1和FGF-2上调MEF细胞PD-L1表达,调控炎症反应,促进伤口愈合。6.FGF-2协同TGF-b通过eIF4E蛋白质翻译通路上调成纤维细胞PD-L1表达。1)通过polyribosome检测TGF-β1和FGF-2联合处理的成纤维细胞,发现多聚核糖体中PD-L1 mRNA的含量明显升高,提示PD-L1的表达调控主要依赖翻译调节;2)FGF-2联合TGF-b显着上调成纤维细胞PI3K-AKT-mTOR和P38-ERK-MNK信号通路相关蛋白的活化和表达,及磷酸化eIF4E表达,而加入eIF4E阻断剂显着抑制上述上调现象,提示TGF-β1和FGF-2通过激活翻译信号调控PD-L1的表达。7.DMSO通过Akt/mTOR激活蛋白质翻译促进成纤维细胞增殖1)成纤维细胞在不同浓度的DMSO刺激后,低浓度的DMSO导致成纤维细胞增殖能力在不同时间点均显着增强,且在5mM时其促增殖能力最强;但是DMSO未影响成纤维细胞的迁移能力。提示了DMSO可以促进成纤维细胞增殖2)DMSO刺激成纤维细胞24h后,发现AKT/mTOR的磷酸化水平显着上升。提示,DMSO能够通过AKT/mTOR信号通路促进成纤维细胞增殖。加入mTOR/AKT信号通路的抑制剂Rapamycin后,发现,p70S6K的磷酸化水平得到了抑制。提示,DMSO能够通过AKT/mTOR信号通路促进成纤维细胞增殖。3)通过7M GTP的Pull-down实验表明,DMSO诱导了4EBP1的磷酸化,促进了翻译起始复合物eIF4F的形成,而加入Rapamycin同时也抑制了DMSO对4EBP1磷酸化和形成活性翻译起始复合物eIF4F形成。提示了,DMSO能够通过AKT/mTOR信号通路激活蛋白质翻译从而促进成纤维细胞增殖。8.DMSO促进小鼠难愈性创面的愈合,而加入mTOR信号通路的抑制剂Rapamycin能够抑制其促愈的作用。研究结论:1.在创面愈合进程中,尤其在炎症期向增殖期转化过程中,PD-L1阳性的成纤维细胞通过接触巨噬细胞调控炎症反应而影响创面愈合;2.TGF-β1和FGF-2是诱导成纤维细胞表达PD-L1关键因素,TGF-β1协同FGF-2在翻译水平上调成纤维细胞PD-L1表达,促进巨噬细胞由M1转化为M2,导致炎症期向增殖期转化,促进伤口愈合;3.本研究证明在伤口愈合过程中,PD-L1通过调控炎症反应,促进伤口愈合,为因炎症调控紊乱所致的难愈创面或者病理性瘢痕的治疗提供新的靶点和理论依据。4.DMSO通过Akt/mTOR信号通路激活蛋白质翻译,显着促进成纤维细胞增殖,而大量增殖的成纤维细胞可以通过其表面高表达的PD-L1配体调控创面炎症,从而促进伤口的愈合。为创面愈合的调控提供了新的机制。
二、P物质及其受体对成纤维细胞的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、P物质及其受体对成纤维细胞的作用（论文提纲范文）
（1）激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献回顾 |
| 1.1 激活素 |
| 1.1.1 激活素分子特征 |
| 1.1.2 激活素受体及信号转导 |
| 1.1.3 激活素生物学作用 |
| 1.2 肿瘤坏死因子-α |
| 1.2.1 TNF-α来源 |
| 1.2.2 TNF-α受体及信号转导 |
| 1.2.3 TNF-α生物学活性 |
| 1.3 成纤维细胞 |
| 1.3.1 成纤维细胞形态 |
| 1.3.2 成纤维细胞功能 |
| 1.3.3 成纤维细胞原代培养 |
| 1.4 本课题研究内容和意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第2章 激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞增殖分析 |
| 2.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.3 细胞形态学分析 |
| 2.2.4 RTCA检测细胞黏附 |
| 2.2.5 NO含量分析 |
| 2.2.6 ELISA |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 Western blotting |
| 2.2.9 细胞迁移分析 |
| 2.2.10 钙离子流量分析 |
| 2.2.11 细胞膜受体表达分析 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 激活素A与TNF-α对L929细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 激活素A与TNF-α对L929细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 激活素A与TNF-α对L929细胞形态的影响 |
| 2.3.4 激活素A与TNF-α对L929细胞NO产生的影响 |
| 2.3.5 激活素A与TNF-α对L929细胞IL-6产生的影响 |
| 2.3.6 激活素A与TNF-α对L929细胞分泌TGF-β1 的影响 |
| 2.3.7 激活素A与TNF-α对L929细胞生成细胞外基质的影响 |
| 2.3.8 激活素A与TNF-α对L929细胞黏附的影响 |
| 2.3.9 激活素A与TNF-α对L929细胞迁移的影响 |
| 2.3.10 激活素A与TNF-α对L929细胞内钙信号的影响 |
| 2.3.11 激活素A与TNF-α对L929细胞膜相关受体表达的影响 |
| 2.3.12 激活素A与TNF-α对L929细胞Smad通路相关信号分子表达的影响 |
| 2.3.13 激活素A与TNF-α对L929细胞MAPK信号通路蛋白表达的影响 |
| 2.3.14 ERK抑制剂对激活素A诱导L929 细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 激活素A与TNF-α对L929细胞的生物学作用 |
| 2.4.2 激活素A与TNF-α调控L929细胞活性的信号转导机制 |
| 第3章 激活素A与TNF-α调控人成纤维细胞活化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 hPDLCs体外培养 |
| 3.2.2 hPDLCs的增殖分析 |
| 3.2.3 hPDLCs的形态学分析 |
| 3.2.4 RTCA检测hPDLCs黏附活性 |
| 3.2.5 ELISA |
| 3.2.6 RT-PCR |
| 3.2.7 Western blotting |
| 3.2.8 细胞迁移分析 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 体外培养hPDLCs生长、形态及鉴定 |
| 3.3.2 激活素A与TNF-α对hPDLCs增殖的影响 |
| 3.3.3 激活素A与TNF-α对hPDLCs形态学变化的影响 |
| 3.3.4 激活素A与TNF-α对hPDLCs产生IL-6 的影响 |
| 3.3.5 激活素A与TNF-α对hPDLCs分泌TGF-β1 的影响 |
| 3.3.6 激活素A与TNF-α对hPDLCs生成ECM的影响 |
| 3.3.7 激活素A与TNF-α对hPDLCs黏附的影响 |
| 3.3.8 激活素A与TNF-α对hPDLCs迁移的影响 |
| 3.3.9 激活素A与TNF-α对hPDLCs的Smad通路相关信号分子表达的影响 |
| 3.3.10 激活素A与TNF-α对hPDLCs的MAPK信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 人牙周韧带细胞的体外培养及实验细胞的选择 |
| 3.4.2 激活素A与TNF-α对hPDLCs的生物学作用 |
| 3.4.3 激活素A与TNF-α调控hPDLCs活性的信号转导机制 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 创面的修复过程 |
| 1.1 凝血期 |
| 1.2 炎症期 |
| 1.3 增殖期 |
| 1.4 重塑期 |
| 2. 糖尿病创面的修复异常 |
| 2.1 糖尿病创面血管生成减少 |
| 2.2 糖尿病创面炎症消退延迟 |
| 2.3 糖尿病创面氧化应激增强 |
| 3. 糖尿病创面的治疗现状及盐酸小檗碱的应用 |
| 3.1 盐酸小檗碱对葡萄糖代谢的影响 |
| 3.2 盐酸小檗碱对脂质代谢的影响 |
| 3.3 盐酸小檗碱对胰岛素抵抗的影响 |
| 3.4 盐酸小檗碱对血管内皮细胞的影响 |
| 3.5 盐酸小檗碱对炎症反应的影响 |
| 3.6 盐酸小檗碱对氧化应激的影响 |
| 第二部分 盐酸小檗碱外用对糖尿病大鼠创面愈合的作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验结果 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 糖尿病大鼠一般状态的观察 |
| 2.2 各组大鼠的血糖变化 |
| 2.3 各组大鼠的体重变化 |
| 2.4 创面模型制备后各组创面愈合情况的观察 |
| 2.5 各组大鼠创面愈合率的比较 |
| 2.6 各组大鼠创面愈合时间的比较 |
| 2.7 各组大鼠创面组织HE染色 |
| 2.8 各组大鼠创面组织Masson染色 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 盐酸小檗碱外用对糖尿病创面AGEs及成纤维细胞的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠创面AGEs的含量 |
| 2.2 各组大鼠创面胶原及RAGE受体的蛋白表达情况 |
| 2.3 各组大鼠创面中成纤维细胞增殖及凋亡水平的差异 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 盐酸小檗碱对人成纤维细胞的影响及作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 AGEs-HSA对糖尿病创面愈合过程中人真皮来源成纤维细胞的影响 |
| 2.2 盐酸小檗碱对AGEs刺激的成纤维细胞的影响及作用机制 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述一 CC家族趋化因子在特发性肺纤维化疾病中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 肺再生参与肺纤维化发生发展的机制 |
| 参考文献 |
| 第一章 CCL1-AMFR相互作用通过活化成纤维细胞促进肺纤维化发病 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 趋化因子CCL1促进肺纤维化发生发展 |
| 1.CCL1在肺纤维化病理状态下表达上调 |
| 2.CCL1促进肺纤维化进展 |
| 3.CCL1主要由肺泡巨噬细胞分泌 |
| 第二部分 CCL1募集和活化成纤维细胞 |
| 4.CCL1主要结合成纤维细胞 |
| 5.CCL1促进成纤维细胞迁移与活化 |
| 第三部分 CCL1-CCR8募集成纤维细胞 |
| 6.成纤维细胞表达CCR8受体 |
| 7.CCL1-CCR8相互作用募集成纤维细胞 |
| 8.CCL1对成纤维细胞的活化作用不依赖于CCR8 |
| 第四部分 CCL1-AMFR活化成纤维细胞 |
| 9.成纤维细胞膜上表达AMFR |
| 10.CCL1结合成纤维细胞膜上的AMFR |
| 11.CCL1-AMFR相互作用位点的确定 |
| 12.CCL1通过AMFR活化成纤维细胞 |
| 13.CCL1通过PKCα磷酸化AMFR |
| 14.PKCα介导的AMFR磷酸化参与活化成纤维细胞 |
| 第五部分 CCL1激活ERK-p70S6K通路以促进促纤维化蛋白合成 |
| 15.CCL1不改变促纤维化基因的RNA水平 |
| 16.CCL1通过激活ERK通路活化成纤维细胞 |
| 17.CCL1通过ERK-p70S6K通路活化成纤维细胞 |
| 第六部分 CCL1-AMFR解除Spry1对ERK通路的抑制作用 |
| 18.CCL1-AMFR通过Spry1激活ERK通路 |
| 19.CCL1-AMFR通过膜转位Spry1活化Ras-ERK级联信号 |
| 第七部分 AMFR诱导Spry1泛素化以解除其对ERK的抑制 |
| 20.CCL1激活ERK通路依赖于AMFR的E3连接酶活性 |
| 21.AMFR作为E3泛素连接酶泛素化Spry1 |
| 22.AMFR催化Spry1的K27位多聚泛素化 |
| 23.PKCα介导的磷酸化使AMFR获得E3酶活性 |
| 24.膜AMFR泛素化Spry1以活化ERK通路 |
| 第八部分 CCL1中和抗体改善肺纤维化进展 |
| 25.CCL1中和抗体抑制成纤维细胞活化 |
| 26.CCL1中和抗体改善肺纤维化进展 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 细胞周期抑制子p21通过抑制肺泡再生促进肺纤维化发生发展 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 反复BLM损伤导致不可逆的肺纤维化病变 |
| 1.反复的BLM损伤导致不可逆的病理改变 |
| 第二部分 BLM所致的端粒缩短和ROS堆积导致AT2中p21上调 |
| 2.反复的BLM损伤诱导依赖于p21的AT2老化 |
| 3.反复的BLM损伤诱导AT2的端粒缩短 |
| 4.持续的ROS堆积诱导AT2中的p21上调 |
| 第三部分 p21堆积抑制AT2的自我更新和分化 |
| 5.mBLM损伤抑制AT2的再生 |
| 6.p21抑制AT2的自我更新 |
| 7.p21抑制AT2-AT1的分化 |
| 第四部分 p21诱导细胞周期阻滞并阻断p300-β-catenin结合抑制再生 |
| 8.p21诱导细胞周期阻滞以抑制AT2的自我更新 |
| 9.p21打断p300-β-catenin相互作用以抑制AT2-AT1分化 |
| 第五部分 敲低p21改善肺纤维化进展 |
| 10.敲低p21改善mBLM诱导的肺纤维化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）硫酸乙酰肝素对骨缺损修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstact |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HS的结构特点与生物合成方式 |
| 1.1.1 HS的结构特点 |
| 1.1.2 HS的生物合成方式 |
| 1.2 HS的生理功能 |
| 1.2.1 胞外基质HS的生理功能 |
| 1.2.2 细胞膜表面HS的生理功能 |
| 1.2.3 细胞内HS的生理功能 |
| 1.3 HS对骨代谢的作用 |
| 1.3.1 HS对成骨细胞系的作用 |
| 1.3.2 HS对破骨细胞系的作用 |
| 1.3.3 HS在成骨支架中的应用 |
| 1.4 HS在成骨信号通路方面的干预 |
| 1.4.1 TGF-β信号通路 |
| 1.4.2 FGF信号通路 |
| 1.4.3 Wnt信号通路 |
| 1.4.4 OPG/RANKL/RANK信号通路 |
| 1.4.5 HH信号通路 |
| 1.4.6 BMP信号通路 |
| 1.5 HS与疾病 |
| 1.5.1 肿瘤性疾病 |
| 1.5.2 炎症和感染性疾病 |
| 1.5.3 自身免疫性疾病 |
| 1.5.4 淀粉样蛋白病 |
| 1.5.5 骨科相关疾病 |
| 1.6 骨缺损相关研究进展 |
| 1.7 本论文的研究思路与内容 |
| 1.7.1 立项背景与研究思路 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第二章 硫酸乙酰肝素/选择性去硫酸肝素的制备及其对成骨细胞作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 硫酸乙酰肝素的制备 |
| 2.3.2 硫酸乙酰肝素的表征 |
| 2.3.3 去硫酸肝素的制备 |
| 2.3.4 去硫酸肝素的表征 |
| 2.3.5 成骨细胞分离培养及鉴定 |
| 2.3.6 成骨细胞的复苏及传代 |
| 2.3.7 成骨细胞增殖实验 |
| 2.3.8 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 硫酸乙酰肝素分子量的测定 |
| 2.4.2 硫酸乙酰肝素硫酸根与羧酸根摩尔比 |
| 2.4.3 去硫酸肝素分子量的测定 |
| 2.4.4 去硫酸肝素核磁共振分析 |
| 2.4.5 原代成骨细胞的形态学分析及化学染色鉴定 |
| 2.4.6 成骨细胞复苏后形态观察 |
| 2.4.7 硫酸乙酰肝素/去硫酸肝素对成骨细胞增殖情况影响比较 |
| 2.4.8 硫酸乙酰肝素/去硫酸肝素对成骨细胞碱性磷酸酶活性影响比较 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞活性影响的比较研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 成骨细胞增殖实验 |
| 3.3.2 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测实验 |
| 3.3.3 茜素红染色法检测矿化能力 |
| 3.3.4 成骨细胞相关功能蛋白表达 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞增殖的影响 |
| 3.4.2 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞分化的影响 |
| 3.4.3 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞矿化能力的影响 |
| 3.4.4 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨相关功能蛋白表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 硫酸乙酰肝素通过结合小鼠成骨细胞雌激素受体β选择性调控OPG/RANK/RANKL通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 HS与ER-β计算机模拟对接 |
| 4.3.2 SPR实验分析结合亲和力 |
| 4.3.3 成骨细胞分离和培养 |
| 4.3.4 siRNA转染 |
| 4.3.5 RNA提取和qRT-PCR分析 |
| 4.3.6 Western Blot检测相关蛋白 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 HS和ER-β的模拟对接分析 |
| 4.4.2 结合亲和力的SPR实验分析 |
| 4.4.3 siRNAs转染MC3T3-E1细胞ERβ的表达 |
| 4.4.4 HS对OPG和RANKL表达的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 3D打印HA-PCL支架负载HS修复兔股骨缺损研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 PCL-HA材料的制备及性能检测 |
| 5.3.2 PCL-HA材料体外生物相容性的测定 |
| 5.3.3 兔股骨髁缺损修复实验 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 3D打印PCL-HA支架结构及其物理特性分析 |
| 5.4.2 体外细胞实验分析 |
| 5.4.3 动物实验分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 推拿治疗周围神经损伤的机理研究进展 |
| 1 推拿能够促进SNI大鼠损伤神经超微结构修复 |
| 2 推拿能够促进SNI大鼠运动功能的恢复 |
| 3 推拿能够促进SNI大鼠感觉功能的恢复 |
| 4 推拿对SNI大鼠干预的最佳刺激参数 |
| 参考文献 |
| 综述二 转化生长因子-β1对周围神经损伤后修复的研究进展 |
| 1 转化生长因子-β1蛋白概述 |
| 2 TGF-β1参与周围损伤后修复 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 三法三穴对SNI大鼠行为学及坐骨神经瘢痕和SC的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 三法三穴对SNI大鼠TGF-β1/Smad2通路蛋白的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 附件1 三法三穴干预后坐骨神经HE染色结果 |
| 附件2 坐骨神经S100在不同时间点的表达情况 |
| 附件3 三法三穴干预后坐骨神经Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN的表达情况 |
| 附件4 三法三穴干预后坐骨神经TGF-β1的表达情况 |
| 附件5 三法三穴干预后坐骨神经Smad2的表达情况 |
| 附件6 三法三穴干预前后坐骨神经TGF-β1的表达变化 |
| 附件7 三法三穴干预前后坐骨神经Smad2的表达变化 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1.类风湿关节炎 |
| 1.1 疾病介绍 |
| 1.2 滑膜成纤维细胞代谢与类风湿关节炎 |
| 1.3 细胞因子与类风湿关节炎 |
| 2.IL-21/IL-21R信号转导途径 |
| 2.1 IL-21/IL-21R产生及来源 |
| 2.2 IL-21/IL-21R对疾病的调节 |
| 2.3 IL-21/IL-21R与类风湿关节炎 |
| 3.JAK/STAT信号通路与类风湿关节炎 |
| 3.1 JAK/STAT信号通路 |
| 3.2 基本过程及调节 |
| 3.3 JAK/STAT与类风湿关节炎 |
| 4.川陈皮素药理性作用 |
| 4.1 名称介绍 |
| 4.2 药代动力学 |
| 4.3 药理作用 |
| 5.本研究的目的和内容 |
| 第一部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体外研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验过程 |
| 1.4 实验分析 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 川陈皮素对MH7A细胞活力的影响 |
| 2.2 川陈皮素能够抑制IL-21受体的表达 |
| 2.3 川陈皮素抑制IL-21诱导的氧化应激反应 |
| 2.4 川成皮素抑制促炎细胞因子的表达 |
| 2.5 川陈皮素抑制IL-21 诱导的基质金属蛋白酶(MMPs)表达 |
| 2.6 川陈皮素的作用通过JAK1/STAT3 信号通路介导 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 第二部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体内研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验试剂配置 |
| 1.4 实验过程 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 模型成功率检测 |
| 2.2 形态学分析表明川陈皮素对类风湿关节炎的改善作用 |
| 2.3 ELISA检测IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13 提示川陈皮素对类风湿关节炎炎症的的抑制效应 |
| 2.4 RT-PCR检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13从m RNA水平进一步表明川陈皮素抑制类风湿关节炎炎症的水平 |
| 2.5 Western-blot检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13、JAK1/STAT3从蛋白水平进一步充分表明川陈皮素的类风湿关节炎炎症抑制作用 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素21在类风湿关节炎中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）Ac-SDKP调节Hedgehog信号抑制AngⅡ介导的皮肤肌成纤维细胞分化的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要材料及试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 药物配制 |
| 1.1.4 细胞实验 |
| 1.1.5 实验技术与方法 |
| 1.1.6 检测指标 |
| 1.1.7 实验技术与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 SMO受体阻断剂GDC-0049对AngⅡ诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转化和迁移的影响 |
| 1.2.2 GLI转录因子阻断剂GANT61对AngⅡ诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细转化和迁移的影响 |
| 1.2.3 Ac-SDKP对AngⅡ诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、迁移及HH信号活化的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 AngⅡ可激活成纤维细胞向肌成纤维细胞转化及其SHH信号 |
| 1.3.2 SMO受体阻断剂GDC-0449 通过调节Hedgehog信号,调控肌成纤维细胞的迁移和转化 |
| 1.3.3 GLI转录因子阻断剂GANT61 通过调节Hedgehog信号,调控肌成纤维细胞的迁移和转化 |
| 1.3.4 Ac-SDKP通过调节Hedgehog信号,调控肌成纤维细胞的迁移和转化 |
| 1.4 小结 |
| 1.5 不足及展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 心血管系统疾病 |
| 2.2 脑血管系统疾病 |
| 2.3 肿瘤疾病 |
| 2.4 免疫系统疾病 |
| 2.5 泌尿系统疾病(肾脏) |
| 2.6 消化系统疾病 |
| 2.7 呼吸系统疾病 |
| 2.8 皮肤疾病 |
| 2.9 其他疾病 |
| 2.10 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（8）p75NTR在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一部分 p75~(NTR)在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达及p75~(NTR)过表达/敲低稳定转染细胞株的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 p75~(NTR)对成纤维细胞生物学特性和肌成纤维细胞转分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 p75~(NTR)调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 神经生长因子及其受体在创面愈合中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（9）多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆促进创面修复的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 富血小板血浆对成纤维细胞的影响 |
| 引言 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多肽纳米纤维水凝胶的制备及负载富血小板血浆的缓释性能检测 |
| 引言 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆复合物在创面修复中的作用 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶的设计及应用进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 博士期间发表的文章、主持的课题及申请的专利 |
| 致谢 |
（10）FGF-2协同TGF-β1上调成纤维细胞PD-L1调控创面炎症促进愈合的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 伤口愈合过程中PD-L1的动态表达规律及其对创面愈合的影响研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PD-L1在创面愈合炎症调控中的作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PD-L1阳性成纤维细胞通过影响巨噬细胞极化参与创面炎症调控的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 FGF-2 协同TGF-b促进成纤维细胞通过e IF4E蛋白质翻译通路上调PD-L1表达的机制研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 DMSO通过Akt/m TOR激活蛋白质翻译促进难愈创面愈合的研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 创面愈合过程中不同细胞的功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、P物质及其受体对成纤维细胞的作用（论文参考文献）
- [1]激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究[D]. 姜玲玲. 吉林大学, 2021(01)
- [2]盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及机制研究[D]. 马骥. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究[D]. 刘畅. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]硫酸乙酰肝素对骨缺损修复的研究[D]. 刘仪. 江南大学, 2020(06)
- [5]三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响[D]. 邵帅. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究[D]. 刘中兵. 苏州大学, 2020(06)
- [7]Ac-SDKP调节Hedgehog信号抑制AngⅡ介导的皮肤肌成纤维细胞分化的机制[D]. 常露. 华北理工大学, 2020(02)
- [8]p75NTR在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化中的作用及机制研究[D]. 刘振兴. 山东大学, 2020(01)
- [9]多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆促进创面修复的研究[D]. 张鹏. 苏州大学, 2020(06)
- [10]FGF-2协同TGF-β1上调成纤维细胞PD-L1调控创面炎症促进愈合的作用及机制研究[D]. 邱伟. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(01)