一、抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达（论文文献综述）
沈玮忱[1]（2021）在《筛选针对P53.R175H突变位点的蛋白的单链抗体》文中研究说明P53蛋白是一种抑癌蛋白,其主要功能是在肿瘤生长过程中控制细胞周期、DNA复制调控细胞分裂过程。当P53蛋白发生突变或聚集时,会失去抑制癌症的功能,转变为促癌因子从而促进肿瘤的发生和发展。在检测患者体内癌组织样本时发现,超过50%的癌组织均存在P53蛋白的突变体,并且在大多数癌症中,以氨基酸位置为175、245、248、249、273和282处的突变体居多。P53突变体R248Q,R248W和R175H突变在多种肿瘤组织中显示出聚集,形成稳定的蛋白聚集体进而激活其他基因表达程序,促进癌变以及耐药性的产生与被泛素-蛋白酶体系统迅速降解的WT-P53不同,P53突变体蛋白,如P53.R175H具有高度的稳定性,并倾向于形成更高阶的聚集体。鉴于P53突变蛋白在人类癌症中的广泛存在以及在疾病进展中发挥关键作用,靶向P53突变蛋白已经成为癌症潜在的治疗靶点。分子靶向疗法主要依靠靶向特定分子（分子靶标）的药物或其他物质来阻断癌细胞的生长和扩散。理想靶标的发现对于癌症分子靶向疗法的成功开发至关重要。癌症发生的基础之一是基因组的改变,基因组的改变导致其所编码的蛋白质的结构和功能的改变,从而促进细胞存活和增殖。这些可以将癌细胞与正常细胞区分开的特定遗传改变,可以用作分子靶向药物开发中的分子靶标。破坏癌细胞为生存和生长而发展的特定机制是一种有选择地杀死癌细胞而对正常细胞影响最小的合理方法。在这方面,突变型P53是最好的靶标之一,因为一半以上的人类癌症具有P53突变,而正常细胞大多在P53基因中没有突变。利用以上特性,针对P53突变体的癌症靶向治疗策略也相应产生,其中通过靶向耗尽P53突变体蛋白可以作为一种对体内野生型P53蛋白影响最小的潜在策略之一。重组单克隆抗体对细胞表面或细胞内抗原具有高度的特异性和亲和性,尽管其靶向作用显着但目前重组单克隆抗体在人类疾病治疗中应用并不广泛。单链抗体的出现克服了这些缺点。单链抗体是由抗体重链和轻链可变区通过接头（包含15至20个氨基酸）连接后组成的小分子抗体。与完整的单克隆抗体相比,由于单链抗体分子量与体积较小,其具有更好的组织渗透性、更快速的血液清除、显着降低的肾脏摄取以及较低的免疫原性等特性。单链抗体可在多种宿主中轻易生产,包括植物,酵母和微生物表达系统,特别是大肠杆菌。其可以通过常规杂交瘤技术生产,但是从该方法获得的抗体亲和力水平通常不足以有效地用于临床。因此,通过使用酵母、噬菌体、核糖体、m RNA等方法筛选大型组合抗体库,为有效富集特异性和高亲和力克隆提供了强大的平台。目的:本研究首先设计合成P53 R175H位点突变的蛋白以及P53野生型蛋白,通过已经构建好的库容量为1X1013的人源性噬菌体单链抗体库,筛选出具有高亲和力和特异性的针对P53.R175H位点突变的单链抗体,为相关肿瘤的诊断及治疗提供新思路。方法:1、设计序列委托第三方合成P53.R175H位点突变的抗原蛋白及P53野生型表达的抗原蛋白;2、以该抗原为靶抗原,通过液相筛选法,筛选出具有高亲和力的针对P53.R175H位点突变的单链抗体,且这些单链抗体不与野生型P53蛋白结合,具有较高的特异性;3、通过ELISA验证筛选出来的单链抗体,鉴定获得的单链抗体亲和力和特异性。结果:1、合成了P53野生型蛋白及P53.R175H位点突变的蛋白,筛选出4条与P53.R175H突变的蛋白高亲和力的单链抗体,且这些单链抗体与P53野生型蛋白表现出低亲和力2、经测序后判定这4条单链抗体与人源性IgG抗体轻重链可变区序列具有高度同源性。结论:合成了P53野生型抗原蛋白和P53.R175H突变的抗原蛋白。筛选出具有高亲和力和特异性的针对P53.R175H突变位点的蛋白的人源性单链抗体,为相关肿瘤的诊断与治疗提供新的思路。
陈聪[2]（2020）在《c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究》文中研究指明目的:设计靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）,验证其在胃癌中的有效性及安全性,并对c-Met CAR进行PD1/CD28融合受体优化以改善免疫抑制,提高抗肿瘤效果。方法:使用生物信息学的方法分析TCGA中胃癌数据的c-Met表达情况及其与生存预后的关系。收集手术患者的胃癌肿瘤及癌旁组织标本,用免疫组化的方法检测c-Met的表达。并用PCR、WB、流式细胞计数等方法检测6种不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1的基因和蛋白表达情况。构建c-Met CAR和cMet-PD1/CD28 CAR质粒,包装慢病毒、感染T细胞,制备对应的CAR-T。在体外细胞实验中,检测CAR-T细胞不同亚群和表型的变化,及靶细胞刺激对CAR-T激活和PD-1表达的影响。检测CAR-T的细胞因子分泌水平,并通过乳酸脱氢酶释放实验、7-AAD染色、CD107a脱颗粒反应等方法反映c-Met CAR-T、cMet-PD1/CD28 CAR-T对靶细胞的杀伤能力。在体内动物模型中,通过活体小动物成像等方法观测两种CAR-T对小鼠胃癌皮下移植肿瘤的作用,并通过HE染色的方法检测两种靶向c-Met的CAR-T对小鼠正常器官的脱靶毒性。结果:TCGA数据库和胃癌标本免疫组化结果均显示胃癌组织高表达c-Met,c-Met表达较高的胃癌患者的预后较差。通过PCR、WB、FCM等方法筛选出c-Met表达最高的胃癌细胞系MKN-45和最低的细胞系HGC-27,作为实验细胞,并使HGC-27过表达c-Met构建HGC27-OE作为阳性对照。相对于转染空载体质粒的Mock T,c-Met CAR-T细胞的CD3+CD8+亚群和CD62L+CCR7+中央记忆表型增多,PD1/CD28融合受体结构能够进一步增加CAR-T的CD62L+CCR7+中央记忆细胞的比例,但却未明显改变CD4+、CD8+T细胞亚群。靶细胞的刺激可以使c-Met CAR-T的PD-1表达升高,CD69+、CD71+激活表型增多。相对于Mock T,c-Met CAR-T与靶细胞共培养后能够分泌更多的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子,CD107a脱颗粒反应和对靶细胞的杀伤能力均明显提高,且其杀伤活性依赖于靶细胞c-Met的表达。PD1/CD28融合受体结构能够进一步增强c-Met CAR-T对c-Met阳性胃癌细胞的杀伤能力,此外,还可以降低炎性因子IL-6的释放水平。c-Met CAR-T对小鼠皮下移植胃癌模型肿瘤的生长具有明显的抑制作用,并且对小鼠正常的胃、小肠、心、肝、脾、肺、肾等重要器官没有明显的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构还能进一步增强c-Met CAR-T的远期抗肿瘤效果。结论:c-Met CAR-T对高表达c-Met的胃癌细胞具有良好的杀伤活性,能够明显抑制c-Met阳性胃癌肿瘤的生长,且对正常器官没有严重的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构能够通过逆转PD-1免疫抑制信号,进一步增强c-Met CAR-T的抗肿瘤能力,并且可以减少c-Met CAR-T炎性因子IL-6的分泌,降低细胞因子释放综合征的发生率,具有更高的安全性。
王冠,徐文娟,姜国胜[3]（2019）在《纳米抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用及其前景》文中认为纳米抗体（Nb）最早发现于羊驼的外周血液中,与传统抗体相比,Nb具有体积小、稳定性好、免疫原性低、组织渗透性强、易于通过基因工程生产等特点,是目前已知最小的功能性抗原特异性结合片段,因此Nb近年来被认为是一种极具开发价值的蛋白质,在基础研究、新药研发、疾病治疗等多个领域得到了广泛的应用。本文重点综述Nb的结构特点和生化特性、在肿瘤诊断和治疗等领域的研究进展,同时预测Nb的应用前景。
庄原[4]（2019）在《无机纳米颗粒与核酸纳米材料在肿瘤细胞诊断及靶向治疗中的应用研究》文中研究说明肿瘤是目前人类致死率最高的疾病之一。传统抗肿瘤药物往往存在靶向能力差、生物相容性差、代谢过快和毒副作用较强等缺点,因此在实际应用中受到了严重限制。此外,针对与肿瘤发生密切相关的肿瘤生物标志物进行检测是目前较为流行的肿瘤早期诊断手段,但这种方式对检测的灵敏度、特异性等都提出了极高的要求。基于以上问题,本文研究了多种无机纳米颗粒与核酸纳米材料在肿瘤标志物检测及肿瘤靶向治疗中的应用,设计和构建了用于检测肿瘤生物标志物端粒酶与miR-21的纳米生物传感器件,并通过研究细胞器靶向性和肿瘤靶向受体的精准排布探究了精确调控纳米颗粒肿瘤细胞靶向性的方法。本文的主要工作如下:（1）利用具有特定序列的端粒酶寡核苷酸引物,构建一系列纳米生物传感器,并将之应用于端粒酶提取物和活细胞内端粒酶的高灵敏度检测,实现了肿瘤细胞提取物内低至5个细胞的端粒酶检测,膀胱癌病人清尿与血尿样本的检出率分别达到100%和89.5%。此外,在肿瘤细胞内成功实现了端粒酶的实时荧光检测。（2）基于具有特殊荧光弛豫时间信号的荧光纳米金刚石（FND）与四氧化三铁磁性纳米颗粒（MNP）,制备了生物传感器FND-DNA-MNP,证实了其对肿瘤标志物miR-21的特异性响应。由于荧光弛豫时间信号在生物体内背景极低,此传感器有望应用于活细胞与活体内的单分子miR-21检测。（3）在作为纳米药物载体的DNA折纸纳米结构表面定点修饰具有肿瘤细胞靶向能力的转铁蛋白（Tf）,探究Tf的分布方式对纳米药物载体的细胞摄取效率的影响。研究发现,Tf的修饰数量对细胞摄取效率的提升效果最好,其次是Tf分子的标记间距,其对载体细胞摄取效率提升的顺序关系是:28 nm>14 nm>>42 nm。此外,Tf在所研究纳米载体上的修饰区域对载体的细胞摄取效率未表现出明显影响。（4）用具有线粒体靶向能力的三苯基膦阳离子（TPP）标记抗癌药物硒纳米颗粒（SeNPs）,将进入细胞内的SeNPs准确定位至线粒体,提升SeNPs产生的活性氧物种（ROS）对线粒体的氧化损伤效率,改善了SeNPs的抗肿瘤效果,使SeNPs的给药量降低以及进一步的正常组织细胞毒副作用降低成为可能。本文希望通过以上研究,构建具有高灵敏度的肿瘤标志物生物传感器,为肿瘤的早期检测与诊断提供参考,同时通过细胞器靶向改性及精准调控肿瘤识别靶向受体的排布,进一步提高抗肿瘤药物的肿瘤靶向能力,以弥补传统抗肿瘤药物对正常组织器官产生高毒性的缺点。
徐文博[5]（2019）在《牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白特异性单域抗体的制备及鉴定》文中研究表明牛传染性鼻气管炎（Infections bovine rhinotracheitis,IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infections bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起。一般情况下 IBRV 容易发生反复感染,导致本病难以清除,严重危害养牛业。目前,疫苗免疫是防治IBR的主要措施,但灭活疫苗不能引起长期持续的体液免疫,弱毒疫苗有残余毒力和返强等危险。为了有效防控IBR,需要开发有效的诊断用抗体。本试验研究通过克隆IBRV gD基因,连接原核表达载体,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达,纯化及鉴定,获得IBRV-gD蛋白;然后以IBRV为抗原免疫成年健康双峰驼,采集全血,提取淋巴细胞总RNA,将其反转录后,扩增VHH基因片段并与载体pCANTAB5E连接,将其转化至大肠杆菌TG1感受态内,成功构建IBRV VHH抗体库。经过鉴定IBRV抗体库库容为7×107。经菌落鉴定,IBRV抗体库转化效率为75%。以gD蛋白作为筛选抗原,利用噬菌体展示技术,从IBRV VHH抗体库内进行筛选,并选取了相对结合能力较强的一株阳性克隆（IB68）,构建表达载体,并对其诱导表达和纯化,从而获得高结合活性的IBRV gD特异性单域抗体。通过ELISA鉴定该单域抗体可以与IBRV或gD蛋白均产生抗原抗体结合反应,具有较高的抗原结合活性。Western-Blot检测证实本试验制备的单域抗体（IB68）的免疫学反应性。为以后的IBRV的快速诊断试剂的研发奠定了基础。
吴梦雪[6]（2019）在《131I标记的RP215 McAb在荷人肺腺癌裸鼠模型中的放射免疫显像及治疗研究》文中指出研究背景及目的:分子靶向治疗为晚期肺癌患者带来了新的希望,其中与分子核医学息息相关的放射免疫治疗（Radioimmunotherapy,RIT）是目前研究的热点。它是以肿瘤细胞表面特异性高表达的抗原为靶点,利用抗原抗体特异性结合的原理,将放射性核素偶联在抗体上运载到肿瘤部位,从而达到肿瘤核素显像或治疗的目的。而提高放射免疫显像或治疗效果的关键在于寻找特异性高表达于肿瘤细胞表面的抗原。CA215（Carbohydrate Antigen 215）是一种肿瘤相关抗原,其在肿瘤的侵袭及转移过程中发挥着十分重要的作用,主要以细胞膜型特异性表达于上皮性肿瘤组织和细胞表面,而正常细胞和组织不表达。相关文献研究表明,CA215在肺癌组织中有较高的表达水平,可能是肺癌特异性诊断或治疗的理想靶点。RP215是针对于CA215的一种小鼠抗人单克隆抗体（Monoclonal Antibody,McAb）,能特异性与CA215结合,且亲和力高。本研究拟使用兼顾显像与治疗特性的放射性核素131I对RP215McAb进行标记,鉴定标记后抗体131I-RP215 McAb的理化性质并评估其用于荷人肺腺癌裸鼠模型放射免疫显像及治疗的可行性,为肺腺癌的早期放射免疫诊断及治疗奠定基础。方法:1.131I-RP215 McAb的制备、纯化及性质鉴定:通过Western blot实验检测不同肺腺癌细胞株中CA215的表达水平;采用氯胺T法对单克隆抗体RP215进行131I标记,Sephadex G25M柱纯化标记抗体,纸层析法测定标记抗体的标记率、放射性化学纯度、室温稳定性及血清稳定性;体外竞争结合实验及饱和实验鉴定标记后抗体的免疫活性。2.131I-RP215 McAb在荷瘤裸鼠体内的生物分布及放射免疫显像:构建荷A549肺腺癌细胞裸鼠模型,尾静脉注射131I-RP215 McAb后4、24、48、72h取肿瘤组织和重要组织器官进行生物分布研究;再取荷瘤裸鼠尾静脉注射131I-RP215 McAb,于注射后4、12、24、48h行SPECT显像。3.131I-RP215 McAb对A549肺腺癌细胞及移植瘤的放射免疫治疗作用:通过MTT试验及流式细胞术检测131I-RP215 McAb对体外培养的A549细胞的增殖抑制作用及促凋亡作用;取荷瘤裸鼠30只,分为3组,分别为生理盐水组、131I-RP215 McAb治疗组、RP215 McAb治疗组,尾静脉给药后通过肿瘤生长曲线、生存分析、肿瘤坏死及凋亡检测,评估131I-RP215 McAb对荷瘤裸鼠的治疗作用。结果:1.Western blot显示A549肺腺癌细胞株CA215的表达水平较高;纸层析法测得131I-RP215 McAb标记率为（91.0±2.36）%,纯化后的放射性化学纯度为（93.1±1.40）%,比活度（3.37±0.42）MBq/ug;131I-RP215McAb单独放于室温下及37℃与血清混合孵育1、6、12、24 h后放化纯稍有降低,但仍大于85%;体外竞争结合实验及饱和实验结果显示标记抗体仍具有较好的免疫活性。2.荷瘤裸鼠体内生物分布显示131I-RP215 McAb在肿瘤组织、肝、肾、肺、血液中具有较高的放射性分布;SPECT显像结果显示131I-RP215McAb能够在肿瘤组织中选择性浓聚,利用ROI技术测得肿瘤组织T/NT值在24 h时达最高为4.74,且瘤体显影最清晰。3.MTT试验显示131I-RP215 McAb抑制A549细胞增殖能力较RP215 McAb进一步增强（P<0.01）;流式细胞术凋亡检测显示131I-RP215 McAb较对照组能明显诱导细胞凋亡（P<0.05）,但与RP215McAb组比较差别无统计学意义（P>0.05）;与生理盐水组相比,131I-RP215 McAb治疗组及RP215 McAb治疗组均能够显着延长荷A549肿瘤裸鼠的生存时间（P<0.05）,但两治疗组内差别无统计学意义（P>0.05）;肿瘤生长曲线显示131I-RP215 McAb较RP215 McAb抑制肿瘤体积增长的能力增强（P<0.05）;肿瘤切片H.E及TUNEL染色显示与对照组和RP215 McAb组相比,131I-RP215 McAb组移植瘤组织中细胞坏死区显着增加,且在未坏死的区域中肿瘤细胞凋亡比例更高。结论:1.成功制备了物理特性、生物学特性理想的放射性核素标记抗体131I-RP215 McAb。2.131I-RP215 McAb在荷A549肿瘤裸鼠模型中有较好的放射免疫显像效果,其有希望成为肺癌的一种新型显像剂。3.131I-RP215 McAb在体内和体外对A549肺腺癌细胞均有一定的放射免疫治疗作用,与RP215 McAb相比,其细胞毒性和抑制肿瘤体积增长的能力更强,但是在诱导细胞凋亡及延长荷瘤裸鼠生存时间等方面是否有优势,还有待进一步研究证实。
周兵[7]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中提出感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
王武[8]（2018）在《靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤作用及机制研究》文中提出背景:恶性肿瘤严重威胁人类健康,治疗恶性肿瘤是目前迫切需要解决的医学问题。目前,过继性免疫治疗已经成为手术、放疗、化疗、中医中药治疗之外一种新的恶性肿瘤治疗方法。基于嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）T细胞的过继性免疫治疗是当前研究的热点。由基因工程技术构建的CAR T细胞表面带有识别肿瘤特异性抗原的受体,可不经抗原提呈直接提供细胞活化信号,不受主要组织相容性复合物限制,能实现良好的肿瘤靶向性和细胞活性,发挥强效的抗肿瘤作用。CAR T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了巨大成功,2017年经FDA批准已有两个CAR T细胞类药物上市,用于急性淋巴细胞白血病和特定类型非霍奇金淋巴瘤患者治疗。但CAR T细胞治疗实体肿瘤的研究目前进展缓慢。实体瘤复杂的肿瘤微环境介导的免疫抑制是影响CAR T细胞疗效的主要因素。因此,从打破肿瘤微环境免疫抑制的角度,寻找更合适的肿瘤特异性抗原、更合适的抗体,以提高CAR T细胞的抗实体瘤疗效,具有重大的临床意义。纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）是活化的成纤维细胞胞膜上面一种Ⅱ型膜整合糖蛋白,高度特异性表达于绝大多数恶性肿瘤微环境中增生性的成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAF）,是CAF的特异性标志物之一。FAP具有特殊的生物学特性,在促进肿瘤生长、浸润、侵袭、转移、肿瘤免疫抑制中均扮演了重要角色。以FAP作为靶点针对肿瘤间质治疗实体瘤的免疫治疗正越来越受到关注。纳米抗体是由骆驼血液中发现的重链抗体的可变区组成的一类单域抗体,具有高水溶性、高稳定性、高表达性、高产量、较强的组织穿透性和较弱的免疫原性等优点,在恶性肿瘤免疫靶向治疗方面展现出了广阔的应用前景。本课题组前期研究成功筛选出FAP特异性纳米抗体,命名为F578。该纳米抗体能与肿瘤细胞表面抗原FAP分子特异性性结合,能否应用于构建CAR T细胞实现抗肿瘤作用仍需进一步研究。目的:探索应用抗FAP纳米抗体构建CAR T细胞的方法,验证FAP-CAR T细胞的体外增殖活性和对靶细胞的特异性杀伤作用,以及体内对小鼠皮下肝癌移植瘤的抑制作用,初步探讨FAP-CAR T细胞抗肿瘤作用及机制,为CAR T细胞治疗实体肿瘤提供新的依据。方法:1.设计CAR基因序列,分别为Mock、CD19-CAR和FAP-CAR 3组;双酶切方案切割PLVX慢病毒载体,完成目的基因与载体质粒连接;进行慢病毒的包装和浓缩,以荧光计数法计算慢病毒滴度。2.分离培养人外周血T淋巴细胞,将收获的慢病毒应用于T细胞感染以完成CAR T细胞构建;荧光显微镜观察CAR T细胞的GFP表达情况;流式细胞术检测CAR T细胞表达GFP的比例和CD4+/CD8+比例。3.收集人原发性肝癌组织,以消化差异法分离纯化肝癌组织中的CAF,通过流式细胞术检测FAP/α-SMA表达对CAF进行鉴定。4.以未转染的T细胞（Utd）为对照,流式细胞术检测Utd组、Mock组、CD19-CAR组、和FAP-CAR组的CAR T细胞与靶细胞共孵育后的增殖情况;以及表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L,溶酶体蛋白CD107a和胞内IFN-γ的表达。5.流式细胞术检测FAP-CAR T细胞对FAP+细胞系的体外杀伤情况;ELISA法检测上清液中的细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10）的含量。6.构建HepG2-hFAP细胞小鼠皮下移植瘤模型,随机分为PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR组。经尾静脉分别注射各组CAR T细胞和未转染T细胞后,观察CAR T细胞治疗对小鼠肿瘤的肿瘤体积、瘤重、以及小鼠存活时间的影响。7.肿瘤长径达到15 mm时,处死小鼠剥离肿瘤并制备石蜡切片。免疫组化法检测肿瘤组织的Ki-67抗原和FAP表达;TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡的数量;免疫荧光法检测肿瘤中的血管密度（CD34）。8.构建HepG2-hFAP细胞小鼠皮下移植瘤模型,随机分为PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR组。经尾静脉分别注射各组CAR T细胞和未转染T细胞后,流式细胞术检测各组第7、第14、第28天荷瘤小鼠外周血、脾脏、肿瘤组织中人CD3的表达情况。9.取正常的NOD/SCID小鼠,分为FAP-CAR T组和PBS组。经尾静脉注射FAP-CAR T细胞治疗后,HE染色法检测其对小鼠主要脏器的毒性作用。结果:1.应用双酶切方案成功完成PLVX慢病毒载体切割和基因重组,PCR法验证各组CAR基因均可成功插入载体;重组载体包装成慢病毒并浓缩后,最终收获的慢病毒滴度滴度达到2E+8TU/ml;2.将这些慢病毒应用于T细胞感染后,荧光显微镜下观察到GFP荧光,流式细胞术检测到各组细胞的GFP表达均超过了40%,表明CAR T细胞制备成功。3.流式细胞术对分离纯化后的CAF进行检测,FAP/α-SMA双阳性的细胞比例达到75.7%,提示CAF分离成功,可用于下一步实验。4.FAP-CAR T细胞经FAP+靶细胞刺激后增殖活跃,增殖频率与倍数均明显高于其余对照组别;其细胞表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L,溶酶体蛋白CD107a和胞内IFN-γ表达较其余对照组别均出现明显上调。5.FAP-CAR T细胞可在体外明显杀伤FAP+的靶细胞,并且其杀伤效果随着效靶比的升高而增强,对高表达FAP的CAF和HepG2-hFAP靶细胞杀伤比例高于低表达FAP的U87细胞,对FAP-的肿瘤细胞则没有杀伤作用。当与FAP+靶细胞共培养时,FAP-CAR T细胞上清液中细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的含量明显升高,IL-10的含量没有明显变化。6.体内实验观察到FAP-CAR T细胞治疗可明显抑制HepG2-hFAP皮下移植瘤小鼠的肿瘤发展,并延长小鼠的生存时间、提高存活率;免疫组化法检测到小鼠肿瘤组织表达Ki-67和FAP的细胞比例明显降低;TUNEL法检测到小鼠肿瘤组织中凋亡细胞比例明显增加;免疫荧光法检测到小鼠肿瘤的血管密度明显降低。7.FAP-CAR组小鼠的外周血、脾脏和肿瘤组织中CD3表达在三个时间点均明显高于其余对照组,在第14天时检测到CD3表达上升至峰值,到第28天时仍能保持一定表达。8.HE染色法结果显示FAP-CAR T细胞治疗对小鼠的主要脏器无毒性作用。结论:基于抗FAP纳米抗体构建的FAP-CAR T细胞可在体内外特异性靶向杀伤FAP+靶细胞,这种针对肿瘤微环境的CAR T细胞疗法为实体瘤的免疫治疗提供了新的思路。
陈伟芝[9]（2017）在《基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究》文中提出由于基因工程和免疫疗法的发展,功能性多肽和蛋白质越来越多的用于肿瘤治疗领域的药物纳米传输系统。类弹性蛋白结构基于哺乳动物的原弹性蛋白,由VPGXG五肽序列重复组成,具有生物相容性好、生物可降解性、低免疫原性、药代动力学优良等一系列优势。更重要的是类弹性蛋白主要由大肠杆菌表达制得,而且可以通过自身的温度敏感可逆相变行为进行非色谱纯化,十分方便。利用基因重组技术,可以将几种功能性多肽片段或者蛋白质在基因水平融合,进而表达出具有多功能的融合蛋白。此外,改变基因编码,可以插入合适的活性位点,用于后期与小分子偶联。肿瘤细胞活动旺盛、生长迅速,因而形成了与正常组织和细胞不同的病理变化。主要表现为新生血管结构不完整,肿瘤血管渗透滞留增强、无氧代谢、细胞转化、生长失控、弱酸环境以及营养物质大量需求形成的肿瘤细胞表面相关受体的表达上调。利用肿瘤组织的微环境的特异性,可以实现药物的选择性靶向输送。本论文采用基因重组技术和分子生物学手段,构建了以类弹性蛋白为基础的纳米药物传输体系,并系统研究了他们的药物传输性能。具体内容如下:（1）利用原位自由基聚合合成了类弹性蛋白苯硼酸纳米粒子,透射电镜和扫描电镜显示其粒径均一,具有良好的球形形貌,动态光散射测得其水合粒径在100 nm左右。接着对纳米粒子的细胞摄取、细胞相容性以及3D细胞中的渗透情况进行了研究。其次,将纳米粒子负载上化疗药物阿霉素,考察了其体外释放情况和细胞毒性。最后在小鼠皮下H22肿瘤模型中评价载药纳米粒子的体内分布情况和抗肿瘤效果。（2）利用基因重组技术将anti-EGFR的纳米抗体和细胞穿膜肽iRGD与类弹性蛋白进行融合表达。圆二色谱测试显示融合蛋白保持了各部分的二级结构。进一步在细胞层面上,相对于类弹性蛋白,融合蛋白显示出优越的进细胞能力和3D细胞的穿透能力。其次在小鼠皮下CT-26肿瘤模型中,考察融合蛋白的体内分布情况和肿瘤的靶向能力以及与阿霉素共给药的抗肿瘤效果。（3）利用酸敏感的腙键将阿霉素偶联到融合蛋白上,形成双靶向蛋白大分子药物。动态光散射显示偶联体以分子状态存在。体外药物释放实验证实药物释放的酸敏感特性。进一步在细胞层面验证双靶向蛋白大分子药物对细胞的选择性以及细胞毒性。在小鼠皮下H22肿瘤模型中,相对于裸药,双靶向蛋白大分子药物达到降低了药物在正常组织中的分布,进而将药物的最大耐受量提高了 4倍,最终在体内抗肿瘤方面显示了显着的效果。
宋丽敏[10]（2008）在《小分子半抗原多价抗体的制备及其活性研究》文中研究指明小分子半抗原单克隆抗体制备通常较复杂,且很多情况下,得到的抗体亲和力较差,效价很低,无法满足作为检测性抗体的要求,在很大程度上限制了单克隆抗体的应用。本研究以对硫磷为对象制备了单链抗体,旨在探索已知基因的半抗原基因工程抗体的构建,同时通过基因工程的方法构建了未知抗体基因的抗微囊藻毒素-LR（microcystin-LR, MC-LR）的单链抗体,并在此基础上构建了四价抗体,为基因工程抗体在小分子半抗原类物质检测方面的应用打下基础。参考GenBank中发表的对硫磷抗体序列,对其进行分析后在重链可变区基因（heavy chain V-region, VH）和轻链可变区基因（light chain V-region, VL）之间加上了45个核苷酸作为连接肽序列,由公司合成。构建单链抗体表达载体,经过原核表达得到了可溶性表达的目的蛋白。SDS-PAGE和Western Blot检测表明表达的单链抗体分子量为28 kD。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,得到的目的蛋白纯度为74.8%,ELISA检测表明该scFv能够与对硫磷特异性结合。本实验为进一步制备高特异性、高亲和力抗体奠定了基础,并且为基因工程抗体在农药检测方面的应用提供依据。以分泌抗微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体的杂交瘤细胞为材料,通过RT-PCR扩增出抗体的重链和轻链全编码区cDNA序列。序列分析表明,PCR得到的抗体重链序列共1473bp,包括部分VH,完整的CH1、CH2、CH3三个恒定区和3’端非编码区,其中VH大小为363bp,编码121个氨基酸,属小鼠IgH-V7183 VH5家族;得到的轻链序列共880bp,包括部分轻链可变区VL,完整的恒定区和3’非编码区,其中VL大小为336bp,编码112个氨基酸,属小鼠IGKV21亚组。VH和VL符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,均含有4个框架区、3个抗原互补决定区及抗体特征性的2个半胱氨酸残基,且基因内无终止密码子,表明得到的序列为小鼠抗体重链和轻链基因序列。分别扩增VH和VL,通过重叠延伸PCR将二者拼接,构建原核表达载体pET-mc。序列分析表明,该scFv基因全长744bp,编码248个氨基酸。将表达载体转化大肠杆菌Origami 2（DE3）进行目的蛋白的诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,单链抗体主要以包涵体的形式在大肠杆菌中表达。在IPTG为0.1 mM,培养温度为15℃时可溶性表达产物含量最高。利用Ni-NTA对可溶性表达产物进行纯化,回收到的目的蛋白浓度为0.115 mg/ml。ELISA检测表明该单链抗体能与MC-LR发生特异性结合。为提高单链抗体的亲和力,利用核心链霉亲和素的四聚化特性对scFv进行多聚化。将scFv基因与核心链霉亲和素基因拼接,并构建四价抗体表达载体pET-teab。经SDS-PAGE和Western Blot分析,四价抗体主要以不溶性的包涵体的形式表达。在IPTG为0.1 mM,培养温度为15℃时可溶性表达产物含量最高。利用Ni-NTA对可溶性表达产物进行纯化,回收到的目的蛋白浓度为0.179 mg/ml。非还原性SDS-PAGE及Western Blot检测表明,回收的目的蛋白以四聚体和单体的形式存在,没有检测到比四聚体分子量大的分子。ELISA检测结果表明,四价抗体与单链抗体和单克隆抗体相比,具有更高的亲和力。
二、抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达（论文提纲范文）
（1）筛选针对P53.R175H突变位点的蛋白的单链抗体（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 TP53 基因突变及在各个实体瘤中的突变情况 |
| 1.1 TP53 基因在胰腺肿瘤中的突变情况 |
| 1.2 TP53 基因在卵巢肿瘤中的突变情况 |
| 1.3 TP53 基因在胃癌中的突变情况 |
| 1.4 TP53基因在其他肿瘤中的突变情况 |
| 2 肿瘤抗原与单链抗体 |
| 3 噬菌体抗体库技术及单链抗体 |
| 3.1 噬菌体展示技术 |
| 3.2 单链抗体技术 |
| 实验 合成抗原、筛选针对P53.R175H位点突变抗原的单链抗体 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 P53野生型抗原生物素标记及标记效率检测 |
| 2.2 野生型P53抗原淘选噬菌体抗体库 |
| 2.3 筛选P53突变型抗原 |
| 2.4 扩增M13K07辅助噬菌体 |
| 2.5 扩增与P53突变型结合的噬菌体抗体 |
| 2.6 沉淀和回收,并测量扩增产物滴度 |
| 2.7 用扩增的抗体库再次筛选P53.R175H突变抗原 |
| 2.8 单克隆ELISA |
| 3 结果分析 |
| 3.1 抗原合成结果 |
| 3.2 生物素标记抗原效率检测 |
| 3.3 噬菌体库2轮富集筛选结果 |
| 3.4 单克隆ELISA结果分析 |
| 3.5 阳性克隆测序分析 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（2）c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胃癌CAR-T及c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CAR-T在胃癌中的研究现状 |
| 1.2.1 胃癌CAR-T的基础研究 |
| 1.2.2 胃癌CAR-T的临床实验注册 |
| 1.3 c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.3.1 c-Met CAR-T的基础研究现状 |
| 1.3.2 c-Met CAR-T临床实验注册 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 MET基因在胃癌中表达及功能的生物信息学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 数据获取及分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 c-Met在胃癌组织及细胞系中表达的检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 胃癌组织c-Met免疫组化表达分析 |
| 3.1.2 胃癌细胞培养 |
| 3.1.3 提取细胞RNA |
| 3.1.4 PCR反应 |
| 3.1.5 提取细胞总蛋白 |
| 3.1.6 聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳 |
| 3.1.7 流式细胞计数检测胃癌细胞系c-Met、PD-L1 表达 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 c-Met在胃癌中的表达水平高于癌旁组织 |
| 3.2.2 qRT-PCR分析不同胃癌细胞系中MET、PD-L1 基因转录水平 |
| 3.2.3 WB分析不同胃癌细胞系中c-Met表达水平 |
| 3.2.4 FCM分析不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1 的细胞膜表面表达水平 |
| 3.2.5 CCLE数据库中MET、PD-L1 表达验证 |
| 3.3 结论 |
| 第四章 MET过表达慢病毒及CAR慢病毒的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒构建 |
| 4.1.2 载体酶切 |
| 4.1.3 目的基因片段扩增 |
| 4.1.4 酶连重组 |
| 4.1.5 转化 |
| 4.1.6 质粒抽提 |
| 4.1.7 重组质粒基因测序 |
| 4.1.8 质粒转染与慢病毒收获 |
| 4.1.9 慢病毒感染293T |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CAR序列结构 |
| 4.2.2 载体酶切、目的片段扩增、酶连重组验证 |
| 4.2.3 慢病毒的验证 |
| 4.3 结论 |
| 第五章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体外验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 MET-OE慢病毒感染HGC-27 细胞 |
| 5.1.2 CAR-T细胞制备 |
| 5.1.3 慢病毒CAR-T感染效率的检测 |
| 5.1.4 CAR-T细胞增殖检测 |
| 5.1.5 CAR-T细胞亚群及表型检测 |
| 5.1.6 靶细胞刺激对CAR-T激活的影响 |
| 5.1.7 靶细胞刺激对CAR-T中 PD-1 表达的影响 |
| 5.1.8 细胞因子分泌检测 |
| 5.1.9 LDH释放实验 |
| 5.1.10 7-AAD杀伤实验 |
| 5.1.11 CD107a脱颗粒反应 |
| 5.1.12 高内涵成像分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 MET-OE慢病毒感染可使HGC-27 细胞过表达c-Met |
| 5.2.2 c-Met CAR和 c Met-PD1/CD28 CAR慢病毒感染以成功构建对应的CAR-T |
| 5.2.3 CAR-T细胞中CD8~+T细胞、中央记忆T细胞的比例升高 |
| 5.2.4 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中激活表型增多 |
| 5.2.5 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中 PD-1 表达升高 |
| 5.2.6 PD1/CD28 融合受体能刺激CAR-T中 IFN-γ、TNF-α分泌,抑制IL-6分泌 |
| 5.2.7 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T对靶细胞的杀伤 |
| 5.2.8 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T的脱颗粒水平 |
| 5.2.9 高内涵成像显示CAR-T识别并杀伤肿瘤 |
| 5.3 结论 |
| 第六章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体内验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 实验细胞 |
| 6.1.5 皮下成瘤及活体小动物成像 |
| 6.1.6 HE染色 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 c-Met CAR-T及 c Met-PD1/CD28 CAR-T对 c-Met~+胃癌模型具有明显的抑制作用 |
| 6.2.2 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对正常器官没有明显的脱靶毒性 |
| 6.3 结论 |
| 第七章 讨论、结论与展望 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 嵌合抗原受体T细胞的新型设计方案 |
| 参考文献 |
| HGF/c-Met信号通路及其在胃和胃食管交界癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 附图 技术路线图 |
| 附表 |
| 附缩略词简表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）纳米抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用及其前景（论文提纲范文）
| 1 Nb概况 |
| 2 Nb在肿瘤诊断中的应用 |
| 3 Nb在肿瘤治疗中的应用 |
| 3.1 针对经典靶标的肿瘤治疗 |
| 3.2 针对其他新型靶标的肿瘤治疗 |
| 3.3 用作新型药物递送载体 |
| 3.4 应用于放射性核素与光动力联合的放射免疫疗法（RIT) |
| 3.5 修饰免疫效应细胞的抗肿瘤作用 |
| 4 Nb用于肿瘤诊疗存在的问题 |
| 5 展望 |
（4）无机纳米颗粒与核酸纳米材料在肿瘤细胞诊断及靶向治疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 无机纳米材料与肿瘤诊断 |
| 1.2.1 生物传感器概述 |
| 1.2.2 金纳米材料与肿瘤诊断 |
| 1.2.3 量子点与肿瘤诊断 |
| 1.2.4 纳米金刚石与肿瘤诊断 |
| 1.2.5 磁性纳米材料与肿瘤诊断 |
| 1.3 核酸纳米材料与肿瘤诊断 |
| 1.3.1 核酸纳米材料概述 |
| 1.3.2 核酸适配体与肿瘤诊断 |
| 1.3.3 核酸引物与肿瘤诊断 |
| 1.4 无机纳米材料与肿瘤治疗 |
| 1.4.1 金纳米材料与肿瘤治疗 |
| 1.4.2 硒纳米材料与肿瘤治疗 |
| 1.4.3 硅纳米材料与肿瘤治疗 |
| 1.5 核酸纳米材料与肿瘤治疗 |
| 1.5.1 DNA折纸结构与肿瘤治疗 |
| 1.5.2 核酸枝状大分子(Dendrimer)与肿瘤治疗 |
| 1.5.3 基于滚环扩增(RCA)的DNA纳米结构与肿瘤治疗 |
| 1.6 选题思路 |
| 第二章 检测端粒酶活性的DNA纳米传感器研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 端粒酶与肿瘤诊断 |
| 2.1.2 聚集诱导发光(AIE)分子 |
| 2.1.3 本章研究目标 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 端粒酶提取 |
| 2.3.2 引物延伸反应 |
| 2.3.3 体系荧光测试 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附(Elisa)测试 |
| 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测试 |
| 2.3.6 端粒酶延伸反应特异性测试 |
| 2.3.7端粒酶活性抑制实验 |
| 2.3.8 S1 核酸酶降解实验 |
| 2.3.9 细胞内端粒酶水平检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 实验原理 |
| 2.4.2 AIE效应验证 |
| 2.4.3 端粒酶延伸反应条件优化 |
| 2.4.4 检测体系背景荧光优化 |
| 2.4.5 检测特异性对比 |
| 2.4.6 端粒酶提取物荧光响应测试 |
| 2.4.7 细胞内端粒酶活性检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于荧光纳米金刚石的生物传感器设计及其应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 MicroRNA与肿瘤诊断 |
| 3.1.2 荧光纳米金刚石概述 |
| 3.1.3 本章研究目标 |
| 3.2 实验仪器与材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法与步骤 |
| 3.3.1 双链制备 |
| 3.3.2 吸收、荧光光谱测定 |
| 3.3.3 FND-C1 的制备 |
| 3.3.4 MNP-C2 的制备 |
| 3.3.5 生物传感器FND-DNA-MNP的自组装 |
| 3.3.6 传感器对靶标miR-21 的响应 |
| 3.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测试 |
| 3.3.8 动态光散射(DLS)表征颗粒粒径变化 |
| 3.3.9 纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)表征 |
| 3.3.10 荧光弛豫时间测试 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 实验原理 |
| 3.4.2 链置换反应的荧光与凝胶电泳表征 |
| 3.4.3 自组装反应优化 |
| 3.4.4 FND与 MNP的投料比优化 |
| 3.4.5 传感器FND-DNA-MNP的表征 |
| 3.4.6 荧光弛豫时间表征 |
| 3.4.7 传感器对靶标miR-21 的原位响应表征 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于DNA折纸技术探究肿瘤细胞靶向因子的最佳分布 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 药物载体 |
| 4.1.2 转铁蛋白受体 |
| 4.1.3 DNA折纸纳米技术 |
| 4.1.4 本章研究目标 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法与步骤 |
| 4.3.1 DNA折纸结构制备 |
| 4.3.2 DNA折纸结构纯化 |
| 4.3.3 生物素的NHS化修饰 |
| 4.3.4 转铁蛋白(Tf)的生物素化修饰 |
| 4.3.5 DNA折纸结构的转铁蛋白定点修饰 |
| 4.3.6 DNA折纸结构的Cy5 荧光基团杂交 |
| 4.3.7 琼脂糖凝胶电泳测试 |
| 4.3.8 DNA折纸结构的透射电子显微镜(TEM)表征 |
| 4.3.9 DNA折纸结构的原子力显微镜(AFM)表征 |
| 4.3.10细胞摄取实验 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 实验原理 |
| 4.4.2 DNA折纸结构ONR的设计与表征 |
| 4.4.3 ONR-Tf结构的表征 |
| 4.4.4 ONR结构的Cy5 标记表征 |
| 4.4.5 不同ONR结构的细胞摄取效率对比 |
| 4.4.6 Tf-TfR识别过程抑制实验 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 线粒体靶向无机硒纳米颗粒的抗肿瘤研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.1.1 硒纳米颗粒 |
| 5.1.2 ROS与细胞凋亡 |
| 5.1.3 本章研究目标 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法与步骤 |
| 5.3.1 HSA蛋白的TPP功能化修饰 |
| 5.3.2 HSA与 HSA-TPP的荧光标记 |
| 5.3.3 cHSA的制备与标记 |
| 5.3.4 硒纳米颗粒(SeNPs)的制备 |
| 5.3.5 蛋白质的Maldi-Tof-MS表征 |
| 5.3.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试 |
| 5.3.7 SeNPs的透射电子显微镜(TEM)成像表征 |
| 5.3.8 功能化修饰蛋白与SeNPs的细胞毒性测试 |
| 5.3.9活细胞内线粒体共定位实验 |
| 5.3.10 活细胞内ROS水平测试 |
| 5.3.11 活细胞内线粒体膜电位变化测试 |
| 5.3.12活细胞内ROS抑制实验 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 实验原理 |
| 5.4.2 蛋白质HSA的正电荷化修饰与表征 |
| 5.4.3 cHSA@SeNPs的表征与胞内测试 |
| 5.4.4 蛋白质HSA的功能化修饰与表征 |
| 5.4.5 HSA-TPP靶向修饰蛋白的生物相容性探究 |
| 5.4.6 SeNPs的制备与表征 |
| 5.4.7 靶向基团修饰对SeNPs抗肿瘤效果提升的机理研究 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间已发表与待发表论文目录 |
（5）牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白特异性单域抗体的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 牛传染性鼻气管炎概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 致病机理 |
| 1.1.4 症状 |
| 1.1.5 诊断 |
| 1.1.6 防控 |
| 1.2 抗体的概述 |
| 1.2.1 抗体 |
| 1.2.2 单域抗体 |
| 1.2.3 抗体库 |
| 1.3 噬菌体展示技术 |
| 1.4 试验的目的与意义 |
| 2 试验一 IBRV gD蛋白的表达及鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 培养基及缓冲液配制方法 |
| 2.1.3 试验仪器和设备 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 试验内容和方法 |
| 2.2.1 IBRV gD蛋白的表达 |
| 2.2.2 IBRV gD蛋白的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 IBRV gD基因扩增结果 |
| 2.3.2 诱导表达的IBRV gD蛋白SDS-PAGE及Westem-Blot检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 试验二 IBRV特异性抗体库的构建及其富集与筛选 |
| 3.1 试验材料与试剂 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要培养基及缓冲液配制方法 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.2 试验内容和方法 |
| 3.2.1 IBRV抗体库的构建 |
| 3.2.2 IBRV gD蛋白特异性单域抗体的富集和筛选 |
| 3.2.3 提取IBRV单域抗体阳性克隆质粒 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 VHH基因PCR扩增结果 |
| 3.3.2 骆驼血清ELISA检测抗体效价结果 |
| 3.3.3 抗体库菌落鉴定结果 |
| 3.3.4 重组噬菌体单域抗体ElISA鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 试验三 IBRV特异性单域抗体的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验内容和方法 |
| 4.2.1 表达质粒的构建 |
| 4.2.2 重组IB68-pET-25b-SBP蛋白的表达及纯化 |
| 4.2.3 表达纯化的IB68蛋白特异性单域抗体的鉴定 |
| 4.2.4 IBRV gD蛋白特异性单域抗体(IB68)抗原结合特性鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 IB68菌落鉴定 |
| 4.3.2 IB68的SDS-PAGE检测及Western-Blot鉴定结果 |
| 4.3.3 ELISA鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）131I标记的RP215 McAb在荷人肺腺癌裸鼠模型中的放射免疫显像及治疗研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 ~(131)I-RP215 McAb的制备、纯化及性质鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 ~(131)I-RP215 McAb在荷瘤裸鼠体内的生物分布及放射免疫显像 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 ~(131)I-RP215 McAb的体内、体外放射免疫治疗作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述：放射免疫治疗的临床应用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（7）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（8）靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.全文小结 |
| 7.参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
（9）基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.前言 |
| 2.类弹性蛋白 |
| 2.1 ELPs单聚体 |
| 2.2 ELPs胶束 |
| 2.3 ELPs的热靶向 |
| 2.4 ELPs凝胶 |
| 3.纳米抗体 |
| 3.1 纳米抗体与癌症治疗 |
| 3.1.1 纳米抗体直接用作拮抗剂 |
| 3.1.2 纳米抗体与活性分子连接 |
| 3.1.3 纳米抗体修饰的药物传输体系 |
| 3.2 纳米抗体与体内医学成像 |
| 4.其他靶向配体 |
| 5.现存的蛋白纳米药物传输体系存在的问题 |
| 6.本论文的主要内容及创新点 |
| 6.1 本论文的主要内容 |
| 6.2 本论文的创新之处 |
| 参考文献 |
| 第二章 含苯硼酸的类弹性蛋白纳米粒子药物传输系统 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料、细胞系以及动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 基因编码合成ELP |
| 2.3.1 含ELP基因的重组质粒构建 |
| 2.3.2 ELP的表达纯化 |
| 2.4 ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 2.4.1 N-3-丙烯酰胺氨基苯硼酸(APBA)的合成 |
| 2.4.2 ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 2.5 载药量和包封效率 |
| 2.6 药物的体外释放 |
| 2.7 FITC和NIR-797标记的纳米粒子的制备 |
| 2.8 体外细胞毒性 |
| 2.9 体外细胞摄取 |
| 2.10 3D细胞中的渗透 |
| 2.11 活体近红外成像 |
| 2.12 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.13 体内分布 |
| 2.14 体内抗肿瘤效果 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 ELP和ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 3.2 体外药物释放 |
| 3.3 细胞毒性和细胞摄取 |
| 3.4 在SH-SY5Y 3D细胞中的渗透 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 体内抗肿瘤效果 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 联合使用双靶向融合蛋白增强阿霉素的抗肿瘤效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料以细胞、动物 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 重组质粒的构建 |
| 2.4 蛋白表达与纯化 |
| 2.5 蛋白性质表征 |
| 2.6 癌细胞的EGFR表达量分析 |
| 2.7 FITC和NIR-797标记的蛋白质的制备 |
| 2.8 细胞毒性实验 |
| 2.9 细胞摄取 |
| 2.10 3D细胞中的渗透 |
| 2.11 实时近红外成像 |
| 2.12 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.13 体内分布 |
| 2.14 体内抗肿瘤 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 三种蛋白质的表征 |
| 3.2 细胞毒性实验 |
| 3.3 细胞摄取实验 |
| 3.4 3D细胞中的渗透 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 体内抗肿瘤效果 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 双靶向融合蛋白大分子药物的合成及其抗肿瘤效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料以细胞、动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 重组质粒构建与蛋白表达 |
| 2.4 腙键DOX的合成 |
| 2.4.1 2-羧乙基2'-吡啶基二硫化物的合成 |
| 2.4.2 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼基甲酸叔丁酯的合成 |
| 2.4.3 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的合成 |
| 2.4.4 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素的合成 |
| 2.5 双靶向融合蛋白大分子药物的合成 |
| 2.6 双靶向融合蛋白大分子药物的表征 |
| 2.7 药物的体外释放 |
| 2.8 细胞毒性实验 |
| 2.9 细胞摄取 |
| 2.10 实时近红外成像 |
| 2.11 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.12 体内分布 |
| 2.13 最大耐受剂量 |
| 2.14 体内抗肿瘤 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 双靶向融合蛋白大分子药物的合成与表征 |
| 3.2 药物的体外释放 |
| 3.3 细胞毒性实验 |
| 3.4 细胞摄取 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 最大耐受剂量 |
| 3.9 体内抗肿瘤效果 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 今后的工作及展望 |
| 已发表论文 |
| 致谢 |
（10）小分子半抗原多价抗体的制备及其活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因工程抗体的研究进展 |
| 1.1.1 基因工程抗体的类型 |
| 1.1.2 抗体可变区基因克隆 |
| 1.1.3 基因工程抗体的宿主表达系统 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 研究思路和内容 |
| 第二章 已知抗体基因序列的单链抗体的构建、表达及初步鉴定 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 抗对硫磷scFv 基因的合成 |
| 2.2.2 抗对硫磷scFv 表达质粒的构建 |
| 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.4 连接产物转化大肠杆菌 |
| 2.2.5 碱裂解法提取质粒 |
| 2.2.6 重组质粒的酶切及PCR 验证 |
| 2.2.7 抗对硫磷scFv 基因的表达及SDS-PAGE 分析 |
| 2.2.8 scFv 的Western Blot 检测及其纯化 |
| 2.2.9 scFv 的ELISA 反应活性初步鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 抗对硫磷scFv 基因的合成 |
| 2.3.2 抗对硫磷scFv 表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.3 抗对硫磷scFv 基因的表达和融合蛋白的纯化 |
| 2.3.4 scFv 的ELISA 反应活性初步鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 未知抗体基因的单链抗体构建及其活性研究 |
| 3.1 材料和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗体重链及轻链基因的扩增 |
| 3.2.2 抗MC-LR 单链抗体表达载体的构建及表达 |
| 3.2.3 scFv 的纯化及抗原结合活性测定 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 抗体重链和轻链基因的扩增 |
| 3.3.2 抗MC-LR 单链抗体表达载体的构建及表达 |
| 3.3.3 scFv 的纯化及抗原结合活性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 半抗原四价抗体的构建及生物学活性的研究 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 核心链霉亲和素基因的分析及合成 |
| 4.2.2 scFv 基因的PCR 扩增 |
| 4.2.3 sa 基因的PCR 扩增 |
| 4.2.4 四价抗体TeAb 编码基因的拼接 |
| 4.2.5 四价抗体表达载体的构建 |
| 4.2.6 四价抗体的表达和Western Blot 检测 |
| 4.2.7 四价抗体的纯化及定量 |
| 4.2.8 四价抗体的SDS-PAGE 及Western Blot 检测 |
| 4.2.9 单链抗体、单克隆抗体及四价抗体的生物学活性比较 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 核心链霉亲和素基因的分析及合成 |
| 4.3.2 scFv 及sa 基因的PCR 扩增 |
| 4.3.3 四价抗体TeAb 编码基因的拼接及其表达载体的构建 |
| 4.3.4 四价抗体的表达和Western Blot 检测 |
| 4.3.5 四价抗体的回收及其单体分子多聚化的检测 |
| 4.3.6 单链抗体、单克隆抗体及四价抗体的生物学活性比较 |
| 第五章 结论及讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达（论文参考文献）
- [1]筛选针对P53.R175H突变位点的蛋白的单链抗体[D]. 沈玮忱. 西安医学院, 2021
- [2]c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究[D]. 陈聪. 兰州大学, 2020(01)
- [3]纳米抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用及其前景[J]. 王冠,徐文娟,姜国胜. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2019(10)
- [4]无机纳米颗粒与核酸纳米材料在肿瘤细胞诊断及靶向治疗中的应用研究[D]. 庄原. 华中科技大学, 2019(03)
- [5]牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白特异性单域抗体的制备及鉴定[D]. 徐文博. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [6]131I标记的RP215 McAb在荷人肺腺癌裸鼠模型中的放射免疫显像及治疗研究[D]. 吴梦雪. 重庆医科大学, 2019(01)
- [7]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [8]靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤作用及机制研究[D]. 王武. 广西医科大学, 2018(07)
- [9]基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究[D]. 陈伟芝. 南京大学, 2017(01)
- [10]小分子半抗原多价抗体的制备及其活性研究[D]. 宋丽敏. 中国农业科学院, 2008(10)