一、大鼠慢性酒精性肝损伤及肝纤维化改变观察（论文文献综述）
张强[1]（2021）在《基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制》文中研究表明肝纤维化（Hverfibrosis,LF）是肝胆系统疾病中的常见病,并且是大多数慢性肝病发展的必然阶段。目前医学界普遍认为早期肝纤维化能够逆转,但如何进行逆转,目前尚未形成普遍的共识。肝纤维化早期产生的诸多病理变化中,人们对肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells,SECs）的病理变化给予的关注逐渐增多,其特征性的细胞学行为改变包括“窗口”尺寸与数量的变化以及连续性基底膜的形成,一旦SECs发生去窗口化后,则肝纤维化的进程难以逆转,目前这已是不争的事实。目前针对肝纤维化的治疗,现代医学尚且只能给予病因治疗,针对肝纤维化本身而言,目前还没有疗效肯定的药物或治疗手段问世。中医药学在治疗肝纤维化方面的经验历史较长,并对其发病机制形成了完整的认识,尤其是在治未病思想指导下,针对慢性肝病给予早期干预,这在一定程度上能够降低患者未来发生肝纤维化、肝硬化的风险。芪术颗粒是姚乃礼教授经过多年的临床经验总结,结合目前中医药学界对肝纤维化的普遍认识基础上创制的治疗肝纤维化常用方,本课题在国家自然基金“基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制”（NO:81774282）的资助下,结合课题组前期的研究成果探讨益气活血方芪术颗粒治疗肝纤维化的机制。1.基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析目的:以Meta分析的方法评价益气活血法治疗肝纤维化的临床疗效。方法:1.以PubMed、中国知识基础设施工程数据库、万方数据知识服务平台为检索资料库,检索时间跨度为自建库到2020年12月31日;以检索词“liver fibrosis”、“hepatic fibrosis”为检索词,然后以“effect”或者“efficacy”作为关键词逐篇进行排除;以“肝纤维化”作为检索词进行检索,然后以“临床观察”、“疗效分析”作为关键词逐篇进行排除。以上数据库没有语言限制。2.纳入随机对照临床研究类文献,以肝纤维化四项、肝脏瞬时弹性成像、肝脾脏的形态、门脾静脉的宽度、不良反应、安全性等结局指标作为考核指标。结果:本次研究共纳入合格文献共93篇,其中有86篇文献以肝纤维化四项作为临床评价指标,两组对比显示中药组的临床疗效比对照组更好,结果对比具有统计学差异[MD=51.15,95%CI（56.95,45.35）,P<0.00001]。15篇文献以肝硬度值作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善肝硬度值方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=3.52,95%CI（4.78,2.26）,P<0.00001]。33 篇文献研究以门静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善门静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.20,95%CI（2.14,0.26）,P=0.01]。31篇文献研究以脾脏厚度作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾脏厚度方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=6.83,95%CI（9.54,4.12）,P<0.00001]。13篇文献研究以脾静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.77,95%CI（3.04,0.49）,P=0.007]。结论:以益气活血为主要功效的中药组方在治疗肝纤维化方面相较于西药而言具有更好的临床疗效。2.基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制目的:（1）研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝脏炎症因子、肝纤维化指标以及病理组织学的调控作用。（2）通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法明确芪术颗粒对肝窦内皮细胞eNOSmRNA、eNOS、NO表达的影响。（3）基于多相多级次多孔介质理论,明确芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学特征。方法:（1）以四氯化碳作为肝纤维化的诱导剂,构建肝纤维化大鼠模型,造模同时给予芪术颗粒进行干预,通过Elisa法、HE以及Masson染色研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠的生化、病理组织学的影响。（2）原位胶原酶灌注+离体消化+梯度密度分离法分离提取肝窦内皮细胞。（3）以10%肝纤维化大鼠血清+5%的胎牛血清作为外在损伤因素作用于体外培养状态的肝窦内皮细胞,模拟体内生化环境,构建肝窦内皮细胞损伤模型。将细胞按照正常对照组、损伤组、正常大鼠血清损伤组、芪术颗粒含药血清低、中、高浓度进行分组。（4）采用 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内eNOSmRNA、eNOS、NO的表达情况。（5）基于多相多级次多孔介质理论,采用原子力显微镜表征芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学属性。结果:（1）芪术颗粒能够改善肝纤维化大鼠生化指标,改善肝脏病理组织形态。（2）经过细胞形态以及免疫荧光鉴定可知,我们所提取的细胞为大鼠肝窦内皮细胞,且纯度较高。（3）经 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内 eNOSmRNA、eNOS、NO显示芪术颗粒含药血清能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达。（4）经过芪术颗粒含药血清干预后,肝窦内皮细胞的骨架模量、粘度均有所提高,使肝窦内皮细胞向正常力学状态转变,而其扩散系数无明显变化。结论:（1）芪术颗粒能够抑制肝脏炎症状态,恢复肝脏正常组织形态。（2）芪术颗粒能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达,从而改善肝窦内皮细胞的病理状态,这可能是其抗肝纤维化的重要机制之一。（3）芪术颗粒能够改善肝窦内皮细胞的力学状态,促进肝窦内皮细胞向正常力学状态恢复,这可能是其发挥抗肝纤维化的另一重要机制。
宋远[2]（2021）在《穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究》文中认为背景酒精性肝损伤是由于酒精所致肝细胞功能受损的动态病理过程,随着其病理变化过程的加重,酒精性肝损伤可逐渐形成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化,甚至肝细胞癌等酒精性肝病,进而导致较为严重的临床结局。目前,酒精性肝损伤发生发展过程的分子机制尚不完全清楚,也无明确的治疗靶点。从流行病学角度看,由过量饮酒所致酒精性肝病的患病率存在明显的地域差异,目前尚无全国性统计数据,如有研究报道辽宁省部分城市酒精性肝病的患病率为6.10%,高于浙江省的4.34%。目前临床上治疗酒精性肝损伤的药物主要包括:糖皮质激素、抗氧化剂、营养补充剂、中药以及天然活性成分、抗体类药物等,药物治疗费用不一,且疗效报道也存在争议。目前明确酒精性肝损伤的病理进程和分子机制以及探索有效的治疗药物仍是需要解决的问题。穿心莲内酯是临床常用的具有抗炎、抗病毒、免疫调节等功效的中药成分,近年来的研究报道,穿心莲内酯还可能具有保肝利胆、保护心脑血管等作用,提示药物作用可能存在某些新功效值得开发,可以产生“老药新用”的生物学效应。作者通过前期课题研究基础以及临床观察发现,穿心莲内酯可能对肝脏酶学指标的改善具有较好的效果,但其具体的作用靶点尚未被明确阐述。因此,本研究首先利用文献计量学描述穿心莲内酯与肝损伤的研究现状,同时收集并分析了某三甲医院应用穿心莲内酯的病例现状,研究探讨穿心莲内酯在临床中的应用情况;其次,本研究构建了酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,从体外和体内两个层面对酒精性肝损伤发生发展的过程和具体的发病机制进行了实验研究,利用穿心莲内酯进行干预,探讨其对酒精性肝损伤的保护作用,从而为阐明酒精性肝损伤的发病机制和探寻新的临床治疗药物提供理论依据和实验数据。目的:（1）通过文献计量学以及分析某三甲医院应用穿心莲内酯成品药物开展临床治疗的病例情况,明确穿心莲内酯的研究热点和临床适应症以及可能的药理作用机制,为深入探寻穿心莲内酯药物在酒精性肝损伤中的应用提供研究路径。（2）分别构建酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,应用穿心莲内酯进行干预,探讨穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的可能机制。方法:（1）以CNKI、GNBR,Drugbank,Hetionet数据库为数据来源,检索主题词为“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”,检索时间范围为2000年1月1日-2020年12月31日,文献类型为期刊文献,提取其中的发表年份、引证关系及关键词等信息,通过自行编制的计算机代码进行可视化分析。（2）回顾性分析吉林省某三甲医院2015年1月至2019年12月期间住院治疗,且在院期间应用穿心莲内酯注射液的患者,通过方差分析、卡方检验、秩和检验等方法比较分析患者入院和出院时的血常规、肝功、肾功、血糖、血脂和血离子水平的变化情况。（3）选择健康成年雄性C57BL/6J小鼠,麻醉后,用75%酒精全身消毒放入超净工作台中,解剖小鼠,取出肝脏,制备小鼠原代肝细胞悬液并进行培养。经酒精染毒,同时应用低、中、高剂量（0.05、0.1、0.2mmol/L）穿心莲内酯进行干预,采用ELISA法检测细胞培养液中炎症相关因子的含量,q RT-PCR和Western Blot方法检测细胞内炎症相关信号通路基因和蛋白的表达变化情况。（4）选择8周龄雄性C57BL/6J小鼠,体重16-20g,随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、穿心莲内酯低、中、高剂量组,共六组,每组15只。空白对照组小鼠给予生理盐水灌胃,模型组小鼠给予市售高度白酒灌胃12w,阳性对照组小鼠给予高度白酒灌胃,同时给予水飞蓟宾灌胃,剂量为0.1g/kg·BW·d-1,穿心莲内酯低、中、高剂量组除给予高度白酒灌胃,同时分别给予穿心莲内酯0.05、0.1、0.2g/kg·BW·d-1灌胃。成模后,检测各组小鼠血清转氨酶、肝脏组织脂质代谢、抗氧化等各项生化指标的变化情况,同时利用q RT-PCR、Western Blot等方法检测小鼠肝组织中炎症相关信号通路基因和蛋白的表达情况。结果:（1）本研究利用文献计量学方法,以“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”为主题词,搜集2000年以来,发表在CNKI、GNBR、Drugbank和Hetionet数据库的全部期刊文献,结果表明,在CNKI数据库中穿心莲内酯与肝损伤相关的研究共34篇,年度发文数量逐渐上升,结合外文数据库研究结果发现,穿心莲内酯与肝损伤研究的作用机制与抗炎信号通路有关。（2）本研究纳入了2015年1月至2019年12月在某三甲医院住院治疗期间应用过穿心莲内酯注射液患者的病历资料,共207例,通过比较用药前后患者血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂及离子水平的变化情况发现,穿心莲内酯对患者血常规指标中白细胞、单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞以及肝功能指标中谷草转氨酶、前白蛋白等的改善具有明显效果,而用药前后患者的肾功能、血脂及离子水平无明显变化,提示穿心莲内酯具有一定的抗炎和保护肝脏的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,且呈现明显的剂量依赖性。酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞24h毒性作用的IC50值约为400 mmol/L,且酒精可导致小鼠原代肝细胞内的炎症反应相关因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平显着升高,而经不同浓度的穿心莲内酯干预表现对肝脏细胞的保护作用,尤以高剂量（0.2mmol/L）组作用效果最为显着。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w后,可诱导小鼠出现肝脏重量和肝脏指数增加,血清转氨酶相关指标AST、ALT和γ-GT的水平显着升高（P<0.05）;肝脏组织氧化应激指标MDA显着升高、SOD和GSH显着下降（P<0.05）;肝组织内总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及ROS蓄积,表明经高度白酒灌胃12w后,小鼠出现明显的肝组织损伤。（5）穿心莲内酯对小鼠酒精性肝损伤具有明显的保护作用。分别给予酒精模型组小鼠不同浓度（0.05、0.1、0.2g/kg·BW）的穿心莲内酯,结果发现,高剂量穿心莲内酯（0.2g/kg·BW）组可显着降低小鼠的肝脏重量和肝脏指数,差异具有统计学意义（P<0.05）;且高剂量穿心莲内酯组小鼠血清转氨酶AST、ALT和γ-GT水平显着低于酒精模型组,而与空白对照组和阳性对照组无明显统计学差异;穿心莲内酯中、高剂量组小鼠肝组织中脂质过氧化指标MDA水平显着低于酒精模型组,差异具有统计学意义（P<0.05）,抗氧化指标SOD和GSH水平在高剂量穿心莲内酯组显着高于模型组,与阳性对照组无明显差异;穿心莲内酯可在一定程度上有效降低酒精诱导的肝组织脂质紊乱,且以高剂量组,即0.2g/kg·BW穿心莲内酯的保护效果最为明显,高剂量组穿心莲内酯组小鼠肝组织中TC和TG水平与阳性对照组相比,无统计学差异（P>0.05）;与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝脏ROS均明显下降,特别是中、高剂量组下降更加明显,差异具有统计学意义（P<0.05）,以高剂量组效果最为明显。且高剂量穿心莲内酯组小鼠肝组织ROS水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。（6）从各组小鼠肝组织病理学（HE染色）结果可以看出,空白对照组和阳性对照组小鼠肝细胞大小一致,肝细胞索以小叶中央动脉为中心呈辐射状排列;胞核大呈圆形,胞浆均匀红染;胆小管细胞结构完整,未见病变。与空白对照组小鼠相比,模型组小鼠肝组织结构紊乱,肝小叶和肝索结构消失,其中有大量脂肪空泡和炎细胞浸润,肝细胞胞浆稀疏,呈纤维化状态。与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝组织形态有所改善,尤以高剂量（0.2g/kg·BW）组小鼠表现最为明显,肝组织接近阳性对照组结构,其脂肪空泡、炎细胞浸润和纤维化状态均有明显改善。（7）穿心莲内酯对各组小鼠肝组织NF-κB、TNF-α和CYP2E1蛋白水平的表达均有明显影响,从免疫组化结果看,模型组小鼠肝组织中有大量NF-κB和TNF-α的原位表达。与模型组相比,随着干预剂量的增高,穿心莲内酯各剂量组NF-κB和TNF-α的蓄积逐渐减少,且呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组小鼠肝组织NF-κB和TNF-α的表达量已接近空白对照组和阳性对照组水平。从Western Blot结果看,模型组小鼠肝组织中NF-κB、TNF-α和CYP2E1表达水平均显着升高（P<0.05）,而经穿心莲内酯干预后,NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平均有所下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。穿心莲内酯各剂量组NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。结论:（1）通过文献计量学分析得出,穿心莲内酯与肝损伤相关研究可能的信号通路主要是炎症信号分子,如NF-κB p100、NF-κB p105、TNF-α等。（2）通过对穿心莲内酯的临床应用现状分析得出,穿心莲内酯是目前临床上常用的抗炎药物,对改善肝脏功能具有一定的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组（0.2 mmol/L）对酒精所致原代肝细胞损伤具有明显的保护作用。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,即给予4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w,可诱导小鼠出现血清转氨酶升高、肝脏脂质过氧化、ROS生成等肝脏功能受损及组织病理改变。（5）穿心莲内酯高剂量组（0.2g/kg·BW）可有效降低小鼠酒精性肝损伤时的血清转氨酶水平、氧化应激水平、肝脏脂质水平以及ROS生成。（6）穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用机制可能是通过抑制CYP2E1/ROS/NF-κB信号通路相关蛋白的表达实现的。
吕艳杭[3]（2021）在《基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用》文中研究说明目的:观察柔肝化纤颗粒对四氯化碳（CCl4）复合因素诱导的肝纤维化大鼠模型的干预作用,从PKCα/Nrf2/ROS信号通路方面探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:将48只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗组,每组12只。除正常组外,其余每组大鼠采用皮下注射40%CCl4（第一次使用5ml/kg体重,以后每隔3天以每3ml/kg体重,每周2次,共8周）皮下注射,联合高脂低蛋白食物（以玉米面为饲料,实验第一、二周加用0.5%胆固醇、20%猪油）,为了防止肝纤维化自然修复对实验结果造成的影响,除正常组外,其余各组仍每周腹腔注射一次40%CCl4油剂3ml/kg体重/每次;正常组正常饲养,同时采用同体积花生油皮下注射8周后灌胃给予同体积的生理盐水,肝纤维化模型组造模成功病理模型组于4mg/kg生理盐水灌胃,秋水仙碱组于每日0.11mg/kg体重给予秋水仙碱进行灌胃;柔肝化纤颗粒剂量组予柔肝化纤颗粒溶液4mg/kg灌胃,每周3次,共8周,连续8周取材。各组分别于用药8周后,禁食12h,经1%戊巴比妥麻醉,股静脉采血后处死,开腹剖取肝脏,通过HE染色、Masson染色观察肝脏情况,采用ELLSA检测活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）、超氧化歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量;采用PCR、Western Blot检测平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-Cadherin,E-Cad）、I型胶原蛋白酶（Collagen I,Col I）、III型胶原蛋白酶（Collagen III,Col III）、血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1,HO-1）、醌氧化还原酶1（NAD（P）H:Quinone dehydrogenase1,NQO1）、蛋白激酶C（Protein Kinase C,PKCα）、核因子E2相关因子（NF-E2-related factor 2,Nrf2）m RNA及蛋白表达。结果:1.柔肝化纤颗粒对肝组织的影响正常组大鼠肝组织的肝小叶结构完整,轮廓清晰,肝组织致密,无假小叶结节形成,汇管区及其周围未见小胆管及纤维组织增生,胞核位于中央。病理模型组肝小叶结构被破坏,甚至消失,结节形成,肝索排列紊乱,汇管区大量增生的纤维,呈条索状,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡。秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组均存在肝小叶结构不清晰,汇管区及其周围小胆管可见纤维组织增生,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡,但程度均较病理模型组有明显减轻。2.柔肝化纤颗粒对SOD、GSH-Px、MDA含量的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的MDA含2量显着升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组MDA含量均有不同程度降低（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的SOD、GSH-Px显着降低（P<0.05）;与模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组明显升高（P<0.05）。3.柔肝化纤颗粒对血清ROS的影响与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量明显升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量均降低（P<0.05）。4.柔肝化纤颗粒对α-SMA m RNA、E-Cadherin m RNA、PKCαm RNA、Nrf2mRNA、HO-1 m RNA、NQO1 m RNA、Collagen I m RNA、Collagen III m RNA表达的影响1与正常组相比,病理模型组的PKCαm RNA相对表达量下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的NQO1 m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。?与正常组相比,病理模型组的Collagen I m RNA相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen I m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组Collagen III m RNA相对表达量显着升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen III m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。5.柔肝化纤颗粒对α-SMA、E-Cadherin、HO-1、NQO1、PKCα、Nrf2、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组Nrf2蛋白表达下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组Nrf2蛋白表达无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2蛋白表达明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、柔肝化纤颗粒组的HO-1蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组HO-1蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组的HO-1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒升高不明显（P>0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的α-SMA蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组的E-Cadherin蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组的Collagen I蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组的Collagen III蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。结论:柔肝化纤颗粒可改善CCl4诱导的大鼠的肝纤维化程度,显着降低血清中ROS、MDA含量,升高血清中SOD、GSH-Px的含量,提示柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠具有一定的抗氧化应激作用。柔肝化纤颗粒通过对PKCα的激活,促进Nrf2发生核转移,抑制ROS信号通路的表达以抗氧化应激反应,下调α-SMA、E-cadherin的表达以抑制HSCs活化,减少Collagen I、Collagen III分泌,减少ECM在肝脏中的沉积,从而实现逆转肝纤维化进程。
郑瑞鹏[4]（2020）在《基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究》文中提出慢性肝病是一种由病毒、酒精或药物等不同致病因素引起肝损伤的进行性疾病。慢性肝病的持续性进展,可导致进行性肝脏损伤、炎症和修复的恶性循环,患者通常会经历肝炎、肝纤维化和肝硬化等过程,如疾病不能被有效控制,最终可发展为肝癌。早期的肝炎主要是以肝脏局部炎症反应导致肝细胞受损为特征,炎症的持续存在则可进一步引发慢性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化的发生,患者一旦进入肝硬化阶段将导致肝脏的不可逆性损伤,最终形成肝癌。其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是肝癌的最常见类型。我国是肝病高发国家,据统计,2019年全世界一半以上的肝癌病例发生在中国,且80%的新增病例处于晚期癌症阶段。临床上主要采用手术切除或肝移植等外科手段对肝癌进行治疗,但肝癌患者的五年生存率极低,给社会公共卫生体系和患者身体健康带来了沉重的负担。因此,发现并干预慢性肝病的早期阶段,如肝炎和肝硬化的进程,对于延缓其进展并阻止肝癌的发生发展尤为重要。肠道菌群在机体的免疫调节、代谢平衡以及营养摄入等方面都发挥着重要的作用,被称为是一个被遗忘的代谢“器官”。肝脏通过门静脉、胆道与肠道连接,向肠道输送胆汁酸等生物活性物质维持机体需要,而肠道中的微生物及其代谢产物也会沿着门静脉逆行至肝脏进而对肝脏造成损伤,此通路被称为肠-肝轴。近年来随着高通量测序技术的发展,越来越多的临床研究表明肠道菌群紊乱在酒精性脂肪肝（Alcoholic liver disease,ALD）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）、肝硬化以及肝癌等多种慢性肝病的发生发展中发挥着重要作用。目前的研究多聚焦于肠道菌群与某种特定的肝病之间的关联性,但肠道菌群结构分布与慢性肝病的发生发展的关系有待于深入研究。肠道菌群失衡可导致有害菌增多,产生大量的细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,LPS通过与Toll-like Receptor 4（TLR4）受体结合,激活免疫细胞内MyD88-NF-κB通路,最终促进IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子的基因转录与合成分泌,从而加重炎症反应。益生菌可改善肠道菌群失衡并能延缓慢性肝病的发生和发展,从而降低肝病的恶化和死亡率。但益生菌不能在肠道中长期定殖,且不同菌株间功能差异巨大,对肝病的治疗作用仍具有较大争议。粪菌移植（Fecal microbiota transplantation,FMT）是一种将健康人的肠道菌群整体移植到患者胃肠道内,对肠道菌群进行重塑的方法,已广泛应用于难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、顽固性便秘以及肠道免疫缺陷等疾病。目前应用FMT治疗慢性肝病的研究较少,其原因与慢性肝病的肠道菌群结构特点未被彻底揭示相关。此外,FMT治疗慢性肝病的作用机制也并不明确。为了解多种慢性肝病患者肠道菌群的组成特点,进而探讨FMT对慢性肝病的治疗作用机制。本研究拟使用高通量测序技术（16S rRNA）检测肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康人的肠道菌群,解析不同病因和不同阶段慢性肝病的肠道菌群结构和组成,探讨肠道菌群与慢性肝病疾病进展之间的关系。同时通过构建肝硬化大鼠模型,以FMT对肝硬化大鼠进行干预,并联合微生物组学和代谢组学技术探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制,为临床上慢性肝病的诊治技术开辟新的领域。一、慢性肝病肠道菌群结构多样性研究方法:（1）以肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康个体为研究对象,使用16S rRNA高通量测序技术检测肠道菌群的结构和组成,分析慢性肝病不同阶段肠道菌群的变化;（2）根据HCC患者是否存在肝硬化,分为肝硬化肝癌（LC-HCC:52例）和非肝硬化性肝癌（NLC-HCC:23例）两组,通过与单纯肝硬化组对比,分析肝硬化的并发对HCC患者肠道菌群的影响;（3）根据疾病诱因将HCC分为乙肝病毒诱发的HCC组（HBV-HCC:35例）、丙肝病毒诱发的HCC组（HCV-HCC:25例）和酒精性HCC组（ALD-HCC:15例）,探讨不同病因对HCC患者肠道菌群结构和组成的影响。结果:（1）与健康组、肝炎组和HCC组相比,肝硬化组肠道菌群的多样性明显降低,疣微菌门和变形菌门的丰度明显增高（p﹤0.05）,软壁菌门丰度显着降低（p﹤0.001）;在属水平上,叶杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、肠球菌属和Erysipelatoclostridium菌属等菌属的丰度显着增高（p﹤0.05）,而青枯菌属、Catenibacterium菌属和Lachnospira菌属等菌属的丰度显着降低（p﹤0.05）。与健康组和肝炎组相比,尽管HCC组肠道菌群的多样性无明显变化（p﹥0.05）,但梭杆菌门的丰度显着增高（p﹤0.05）,同时劳特氏菌属、Clostridiates菌属以及Sarcina菌属等菌属的丰度显着增加（p﹤0.05）。这表明,在四组中,肝硬化组患者肠道菌群失调最为严重,尽管HCC组肠道菌群多样性无显着变化,但菌群种类的比例变化可能与HCC的发生相关。（2）与肝硬化组相比,LC-HCC组肠道菌群多样性无显着变化,而NLC-HCC组肠道菌群多样性显着增加（p﹤0.05）。菌属水平分析结果显示:与肝硬化相比,LC-HCC组中双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属以及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度显着降低（p﹤0.05）,拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS菌属丰度显着增高（p﹤0.05）。结果提示肠道菌群中有益菌的减少以及有害菌的增多可能是肝硬化进展为HCC的原因之一。（3）在HBV-HCC组、HCV-HCC组和ALD-HCC组之间,α多样性和β多样性分析结果表明三组之间没有显着差异（p﹥0.05）。尽管在三组中发现了肠球菌属等18个差异性菌属,但在门水平上没有统计学差异（p﹥0.05）。由此可见,HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。二、FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究方法:使用CCL4和CCL4联合酒精的方法分别构建了两种肝硬化大鼠模型,并每天给予健康大鼠的粪便菌液进行干预治疗。（1）连续造模12周后,比较分析各组大鼠的生活状态、体重、腹水形成时间、生存时间和死亡率;并应用全自动生化分析仪和HE染色技术对各组大鼠的肝功能指标以及肝脏的纤维化程度进行检测,探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用。（2）ELISA检测各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、和TNF-α炎症因子以及血浆中内毒素的含量;对各组大鼠血液、肠系膜淋巴结和肝脏组织中细菌含量以及肠道黏膜屏障的完整性进行检测;RT-PCR和Western-blot分别检测肝脏组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路中相关信号分子的基因和蛋白的表达水平,初步探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗机制。结果:（1）与肝硬化组相比,FMT治疗组大鼠的生活状态得到有效改善,体重增加,腹水形成时间和生存时间明显延长,死亡率显着降低（p﹤0.01）;血清中ALT、AST和GGT等肝功能指标均显着改善（p﹤0.05,p﹤0.01）,而白蛋白指标则明显增高（p﹤0.05）;肝组织表面的结节数量减少,肝组织中假小叶结构减少,结缔组织增生程度减轻。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的生活状态,恢复肝功能并延缓肝硬化的发展进程。（2）ELISA结果显示,FMT治疗组大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β促炎性细胞因子以及内毒素的含量均显着降低（p﹤0.05）;血液、肠系膜淋巴结和肝组织中的细菌菌落数均显着减少（p﹤0.05）,肠道黏膜的结构和屏障功能得到有效改善;大鼠肝组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平均显着降低。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位;FMT可通过下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,减轻肝硬化大鼠的炎症水平。三、FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响方法:（1）应用16S rRNA高通量测序技术对各组大鼠的肠道菌群进行检测,分析比较各组大鼠肠道菌群的结构和组成,探讨FMT能否有效改善肝硬化大鼠肠道菌群的紊乱;（2）使用UPLC-Q/TOF-MS技术对各组大鼠血浆中差异性代谢物进行鉴别和分析,探讨FMT能否通过调节肝硬化大鼠的代谢模式进而发挥保护作用。结果:（1）肝硬化大鼠肠道菌群中乳杆菌科等有益菌属的丰度显着降低,而梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度显着增高,菌群结构和多样性紊乱;FMT治疗后,乳杆菌科等有益菌属的丰度增高,梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度降低,说明FMT可在一定程度上改善菌群结构,维持肠道微生态的平衡,进而通过肠-肝轴延缓肝硬化的进程。（2）肝硬化大鼠血浆中鞘氨醇和LysoPC（18:1（9Z））的含量显着降低,而视黄醇、8,9-环氧二十碳三烯酸、9-顺式视黄醛和花生四烯酸等代谢物的含量显着增高;FMT可调节花生四烯酸和视黄醇代谢通路。以上结果表明,FMT的治疗机制可能是通过改善肝硬化大鼠的肠道菌群的紊乱和调节花生四烯酸和视黄醇的代谢通路,进而延缓肝硬化的发展进程。结论:1.慢性肝病的发生与肠道菌群的紊乱密切相关,肝细胞癌（HCC）患者肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因（如HBV感染、HCV感染或过度饮酒）无显着关联性。肝硬化进展为HCC可能与双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度的降低,且与拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS的菌属丰度的增高有关。2.粪菌移植（FMT）可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位,进而延缓肝硬化发展进程;FMT的作用机制可能与下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,抑制促炎性细胞因子产生有关;FMT可通过调节花生四烯酸和视黄醇等代谢通路,改变大鼠的代谢模式,进而延缓肝硬化大鼠的疾病进程。创新性:1.本研究表征了我国吉林省肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）等慢性肝病患者的肠道菌群结构,发现HCC肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。2.本研究通过构建肝硬化大鼠模型验证了TLR4-MyD88-NF-κB通路相关信号分子在肝硬化发生发展中的作用。发现粪菌移植（FMT）可通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,改善肝硬化大鼠的相关症状。3.本研究联合微生物组学和代谢组学技术阐释了FMT对肝硬化大鼠的治疗机制,发现FMT可通过调整肝硬化大鼠的肠道菌群结构并通过调节花生四烯酸和视黄醇代谢紊乱,延缓肝硬化的发展进程。
成茂源[5]（2020）在《基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响》文中认为目的:观察加减三甲散干预模型大鼠肝纤维化的效果以及对WNT/β-catenin通路的影响,并从lnc RNA和m RNA角度揭示其作用机制,丰富“主客交”学说的现代生物学内涵。方法:1.实验一:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、1号方组（加减三甲散1号方组）、2号方组（加减三甲散2号方组）、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、1号方组、2号方组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油剂的方法制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,1号方组予以加减三甲散全方灌胃,2号方组以去穿山甲的加减三甲散2号方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE染色观察病理形态,检测血清ALT、AST。Western blot法检测空白对照组、模型组、1号方组、阳性对照组WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量。2.实验二:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、加减三甲散组、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、加减三甲散组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油的方式剂制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,加减三甲散组予以加减三甲散全方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE和MASSON染色观察病理形态,ELISA法检测血清HA、LN、PCⅢ、CIV浓度。高通量二代测序法检测空白对照组、模型组、加减三甲散组大鼠肝组织lnc RNA和m RNA表达谱。结果:1.病理切片:HE染色光镜下观察,实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠、1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）,2号方组无明显差异（P﹥0.05）;与1号方组比较,2号方组大鼠肝纤维化程度明显加重（P﹤0.01）。实验二中,与空白对照组相比,模型组、加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组相比,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）;加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度无明显差异,无统计学意义。MASSON染色光镜下观察,实验二中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝纤维化程度明显增大（P﹤0.01）,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度增大（P﹤0.05）;与模型组比较,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度明显减轻（P﹤0.01）;与加减三甲散组比较,阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度相当,无统计学意义（P﹥0.05）。2.肝功能指标:实验一中,与空白对照组相比,模型组、1号方组、2号方组大鼠血清中ALT、AST水平显着升高（P﹤0.01）,阳性对照组大鼠ALT、AST水平相当,无统计学意义（P﹥0.05）;与模型组相比,1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠ALT水平显着降低（P﹤0.01）;与模型组相比,1号方组、2号方组大鼠AST水平降低（P﹤0.05）,阳性对照组大鼠AST水平显着降低（P﹤0.01）;与1号方组相比,阳性对照组大鼠血清中AST水平显着降低（P﹤0.01）。3.信号通路指标:实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin蛋白表达量降低（P﹤0.05）,GSK-3β蛋白表达量显着降低（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白含量无明显变化,无统计学意义（P﹥0.05）。4.肝纤维化指标:实验二中,与空白对照组相比,模型组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度均显着增大（P﹤0.01）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中HA浓度增大,差异明显（P﹤0.05）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中LN、PCⅢ、CⅣ浓度减小（P﹤0.05）。加减三甲散组与阳性对照组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度比较,无统计学意义（P﹥0.05）。5.测序结果:实验二中,预测出新的lncRNA1976条。空白对照组与模型组差异Inc RNA基因共340个（187个上调,153个下调）。空白对照组与加减三甲散组差异Inc RNA基因251个（上调139个,下调112个）。模型组与加减三甲散组差异Inc RNA基因93个（上调48个,45下调）。差异lnc RNA靶基因共同功能主要为:自然杀伤细胞介导免疫,自然杀伤细胞介导的细胞毒性调控等。空白对照组与模型组差异m RNA基因1635个（上调1451个,下调184个）,模型组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）,空白对照组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）。空白对照组、加减三甲散组和模型组m RNA差异基因共同途径为:PPAR信号通路。结论:1.采用四氯化碳诱导法可成功复制大鼠肝纤维化模型。2.加减三甲散1号方减轻模型大鼠肝纤维化程度的效果好于去除穿山甲的加减三甲散2号方。3.加减三甲散（加减三甲散1号方）改善模型大鼠肝纤维化程度不经过WNT/β-catenin通路作用。4.加减三甲散改变肝纤维化模型大鼠lnc RNA和m RNA的表达谱,这可能是加减三甲散改善模型大鼠肝纤维化程度的部分作用机制。
许皖[6]（2020）在《葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究》文中研究表明研究背景:“酒精滥用”和“酒精依赖”是造成酒精性肝病高发病率和死亡率的主要危险因素,已成为仅次于病毒性肝病的第二大肝病,严重危害人类健康。酒精性肝脏疾病是由急性或慢性饮酒引起的肝脏代谢疾病,早期以单纯性脂肪肝病变为主,继而向脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等不可逆病变发展。尽管酒精性肝脏疾病对全球的经济和健康产生了深远的影响,但目前对于该病治疗药物的研究进展甚微,除戒酒和营养支持外,尚无令人满意的治疗策略。酒精性肝病当属中医“酒疸”、“酒痨”、“酒癖”、“酒臌”、“伤酒”、“酒中毒”等范畴。急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于酒食不节,酒毒湿热之邪蕴阻中焦,继而伤及脾胃,致运化失司,水湿失运,变生痰浊,而后湿热搏结,阻滞中焦或土雍木郁,致肝脾同病。其病位在肝,涉及胆、脾、胃,酒毒湿热之邪蕴结体内是根本病机。葛花和枳椇子为我国传统解酒中药,古代医药文献有对两药同用解酒毒的记载。葛花发散宣透,引湿热从肌表而散枳椇子渗泄利尿,使湿热之邪从小便而下,二者配伍,散渗结合,分消湿浊,因势利导,使酒湿邪气排出体外,起到解酒保肝的作用。课题组前期已经完成单味中药葛花、枳椇子对急性酒精中毒性治疗,并进行了葛花枳椇子不同比例配伍对慢性酒精性肝损伤的实验研究,研究明确了二者配伍对酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,可以不同程度地改善相关指标,起到解酒护肝的作用。研究目的:酒精性肝损伤是全球亟待解决的公共卫生问题之一,是疾病晚期难以治愈的进行性疾病,若早期阶段能及时防治,可阻止其向不可逆病变发展,故防治急性酒精性肝损伤尤为迫切,但目前相关研究较薄弱。乙醛介导的毒性,氧化应激和脂质代谢失衡通常认为与酒精性肝病的发病密切相关。转录因子Nrf2是防治氧化应激介导疾病的关键治疗靶标,Keap1-Nrf2-ARE信号通路是调控细胞保护酶的关键调节剂,在酒精性肝损伤的早期发挥着重要作用。故本课题在前期研究的基础上,以葛花和枳椇子配伍为研究对象,开展二者配伍对酒精引起的急性肝脏损伤保护作用的实验研究。采用白酒灌胃复制动物模型,动态观察肝损伤情况,通过生物化学、组织病理学、分子生物学等技术方法,探讨二者配伍能否激活Keap1-Nrf2-ARE通路诱导抗氧化酶活性而保肝。中医理论认为急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于湿热毒邪蕴结体内,损伤及脾,致脾之运化功能失司,累及肝胆,诱发“伤酒”。越来越多的证据显示,水通道蛋白AQPs的正常表达可能是运化水湿,津液输布,维持体内水代谢稳态的分子生物学基础,而AQP表达异常可能是湿热证病理机制之一。酒精诱导的氧化应激在急性酒精性肝病的早期阶段发挥着重要作用,是引发脂质代谢异常,促进脂质过氧化,造成肝脏脂质蓄积的关键因素。水甘油通道蛋白AQP9是参与甘油和甘油三酯代谢的重要通道蛋白,在调控脂质代谢,维持甘油代谢平衡方面发挥着重要作用。故本研究同时尝试结合中医发病机制,探讨二者配伍能否影响水-甘油通道蛋白AQP9表达而调节肝中脂质代谢,从而研究药物对急性酒精性肝损伤的保护作用,为临床用药提供科学依据,并为开展其他酒精性相关疾病的研究提供思路和借鉴。研究方法:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠乙醇代谢的影响:小鼠按体重随机分成模型组、阳性对照药（水飞蓟宾）组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ（1:1）组、葛花枳椇子配伍Ⅱ（1:2）组、葛花枳椇子配伍Ⅲ（2:1）组,共计7组,每组15只。采用56%（V/V）红星二锅头白酒,一次大量灌胃（模型Ⅰ组）和连续多次灌胃（模型Ⅱ组）两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据酒精在体内的代谢特点,分别于酒后不同时间点（1h、4h和10d）取材,运用顶空气相色谱法和紫外-可见分光光度法检测血液中乙醇浓度和肝中乙醇脱氢酶活性。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能、血脂水平和肝组织病理形态的影响:小鼠按体重随机分成空白组、模型组、阳性对照药（水飞蓟宾）组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ（1:1）组、葛花枳椇子配伍Ⅱ（1:2）组、葛花枳椇子配伍Ⅲ（2:1）组,共计8组,每组15只。采用56%（V/V）红星二锅头白酒,一次大量灌胃（模型Ⅰ组）和连续多次灌胃（模型Ⅱ组）两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据血清酶学改变特点,分别于酒后不同时间点（4h、6h、12h、16h和10d）取材,检测肝功能（ALT、AST、ALP、ALB和TP含量）、血脂水平（TG和CHO含量）及肝组织形态变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织氧化应激的影响:运用紫外分光光度法检测酒后不同时间点（4 h、6 h、12 h、16 h和10 d）小鼠肝脏组织中SOD、MDA和GSH的吸光度,荧光分光光度法测定肝组织中ROS的吸光度,并计算其在组织中的活力。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用机制的探讨:运用RT-PCR和Western blot方法,分析检测酒后不同时间点（12 h和10 d）小鼠肝脏组织中Keap 1、Nrf2和AQP9 mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血液乙醇浓度与肝中乙醇脱氢酶的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后1h和4h）:与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着降低血液中乙醇浓度,并升高肝脏乙醇脱氢酶活性,其中葛花-枳椇子（2:1）组在促进乙醇的代谢方面具有较好的治疗作用,显现出较好的解酒作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10d）:与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）血清中乙醇含量显着降低,肝组织中乙醇脱氢酶活性增强,即各给药组通过调控ADH脱氢酶系统,促进乙醛的消除,并减轻乙醇诱导的肝脏损伤,显现出一定的解酒作用。其中,葛花-枳椇子（2:1）组在加速酒精代谢方面,显现出较好的治疗作用,具有出较好的解酒作用。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能与肝组织病理形态学的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4h、6h、12h和16h）:与空白组相比,模型组小鼠血清AST、ALT和ALP水平显着升高,TP和ALB含量显着降低,光镜下肝小叶和肝索结构紊乱,肝细胞水肿或空泡变性,并伴有炎性细胞浸润、脂肪滴的形成,即酒精造成肝脏组织及功能受损,提示模型复制成功。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均可显着降低小鼠血清中AST、ALT和ALP水平,升高小鼠血清TP和ALB含量,从而改善小鼠的肝脏功能。葛花-枳椇子（2:1）组在改善酒精（酒后12h）造成的肝脏血清转氨酶及肝脏蛋白质合成功能异常方面优于其它各给药组。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的微泡样脂肪变性、脂质滴积聚、肝细胞水肿和炎性损伤等病理改变,对酒精诱发的急性肝损伤具有保护作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:与空白组相比,模型组小鼠血清ALT、AST和ALP含量显着升高,TP和ALB水平明显降低,表明酒精引起小鼠肝脏功能异常,造成了急性肝脏损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均不同程度地改善肝脏功能和蛋白合成功能。葛花-枳椇子（2:1）组在改善肝脏功能及蛋白合成功能方面优于其它各给药组,即该配伍组对酒精诱导的肝损伤具有较好的肝保护作用。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的肝细胞肿胀、微泡样脂肪变性、炎性细胞浸润和脂质滴积累等病理变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血脂水平及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4h、6h、12h和16h）:与空白组相比,模型组小鼠血清TG和CHO水平显着升高,即酒精造成小鼠血脂功能的异常。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着改善血清脂质代谢紊乱。葛花-枳椇子（2:1）组在降低酒精（酒后12h）引起的血清TG和CHO水平升高方面优于其他各给药组。此外,葛花、枳椇子及其各配伍组（1:1、1:2和2:1）均能抑制AQP9的表达,减少肝细胞对甘油的摄入,改善脂质代谢,从而有效缓解肝脏脂肪变性,起到保护肝脏的作用。各给药组在调控AQP9表达,缓解酒精引起的脂质代谢异常方面,均无显着差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:模型组小鼠血清TG和CHO水平显着高于空白组,即急性酒精摄入造成小鼠脂质代谢紊乱。葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着降低血清TG和CHO的水平,并抑制AQP9的表达,对酒精造成的血脂异常具有一定的改善作用,起到保护肝脏的作用。葛花-枳椇子（2:1）组在改善急性酒精摄入造成的高脂血症方面优于其他各给药组,即该配伍组在减少肝脂质积累,缓解脂质代谢异常方面显现出较好的治疗作用。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏氧化与抗氧化平衡及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4 h、6 h、12 h和16 h）:与空白组相比,模型组小鼠肝脏SOD和GSH水平均明显降低,MDA和ROS活力均显着升高,即表明单次大剂量酒精灌胃会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均可增强抗氧化酶活性,促进肝细胞对脂质过氧化产物的清除,即各给药组均具有抗氧化应激作用,对酒精诱导的肝脏损伤具有潜在的保护作用。其中葛花-枳椇子（2:1）组在增强抗氧化活性,抑制脂质过氧化作用,缓解酒精（酒后12 h）介导的肝细胞氧化应激损伤方面显现出较好的治疗作用,即该配伍组可显着预防酒精引起的急性肝损伤。此外,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）可通过抑制Keap1表达,激活Nrf2表达,从而有效地抑制自由基的产生和脂质过氧化,缓解小鼠氧化应激反应,保护肝脏免受酒精诱导的肝细胞损伤。各给药组在调控Keap1-Nrf2-ARE信号传导通路,保护肝组织免受酒精诱导的氧化损伤方面,均无显着差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:与空白组相比,模型组小鼠在白酒连续灌胃10天后,肝脏SOD和GSH活性均明显降低,MDA和ROS含量均显着升高,即表明连续大量酒精摄入会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强肝脏内抗氧化酶的表达（SOD和GSH）,加快脂质过氧化物（MDA和ROS）分解代谢,减少酒精对小鼠肝组织的损害。此外,葛花-枳椇子（2:1）组在增强小鼠抗氧化能力,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤方面优于其他各给药组,即该配伍组对缓解酒精诱导的肝损伤表现出积极作用。研究结论:综上所述,本研究证实葛花、枳椇子及各配伍组（1:1,1:2和2:1）对酒精诱导的急性肝损伤具有保护作用。首先,各给药组通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强抗氧化酶活性,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤,从而缓解酒精对小鼠的肝脏损害,发挥保护肝脏的作用。其次,各给药组通过调控水-甘油通道蛋白AQP9的表达,降低甘油的渗透性,减少甘油的摄入,改善肝脏脂质代谢异常,从而缓解酒精诱导的氧化应激和肝脂肪变性,起到保护肝细胞的作用。值得注意的是,葛花-枳椇子（2:1）组在促进酒精代谢,改善肝脏功能,减轻肝脏脂肪变性,提高小鼠抗氧化能力方面显现出积极作用,即该配伍组对酒精诱导的肝脏损伤具有较好的保护作用。因此,本研究证实葛花枳椇子配伍对急性酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,并明确了二者配伍产生相须为用、协同增效的功用,具有增强解酒保肝的效果,是治疗酒精性肝病的天然解酒保肝药物,为临床应用葛花枳椇子防治急性酒精性肝损伤提供了科学依据。
单佳铃[7]（2020）在《短穗兔耳草基于炎症信号通路对慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎治疗作用研究》文中认为目的:本课题通过建立大鼠慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎模型,分别考察藏药短穗兔耳草（Lagotisbrachystachys Maxim）总提物及不同极性部位异病同治慢性酒精性肝损伤及急性痛风性关节炎的作用;通过网络药理学的方法系统全面的分析藏药短穗兔耳草异病同治两种疾病的共同分子机制,寻找其可能的活性成分并为进一步研究其作用机制提供思路。方法:（1）采用梯度酒精灌胃8周建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型,研究藏药短穗兔耳草提取物(0.5g·kg-1、1 g·kg-1、2g·kg-1)对Toll样受体（TLR）/髓样分化因子88（My D88）/核转录因子κB（NF-κB）和NOD样受体蛋白3（NALP3）信号通路的影响。检测血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、甘油三酯（TC）,总胆固醇（TG）、白介素-1β（IL-1β）水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝脏中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察肝脏病理学形态改变。（2）采用梯度酒精灌胃8周建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型,研究藏药短穗兔耳草不同极性部位（水部位、30%乙醇部位、50%乙醇部位、95%乙醇部位）对TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路的影响。同前检测血清中AST等指标水平,检测肝匀浆中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平;Western blot法检测肝脏中TLR2、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察肝脏病理学形态改变。（3）通过向大鼠右后踝关节注射尿酸钠结晶（MSU）建立大鼠急性痛风性关节炎模型,研究藏药短穗兔耳草提取物(0.8g·kg-1、1.6 g·kg-1、3.2g·kg-1)对大鼠TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路的影响。足趾容积测量仪检测大鼠右后踝关节的关节肿胀度;检测血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1β水平;Western Blot法检测关节滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察关节滑膜病理学形态改变。（4）通过向大鼠右后踝关节注射尿酸钠结晶（MSU）建立大鼠急性痛风性关节炎模型,研究藏药短穗兔耳草不同极性部位（水部位、30%乙醇部位、50%乙醇部位、95%乙醇部位）对大鼠TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路的影响。足趾容积测量仪检测大鼠右后踝关节的关节肿胀度;Western Blot法检测关节滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3的表达;苏木素-伊红（HE）染色观察关节滑膜病理学形态改变。（5）采用网络药理学的方法,预测藏药短穗兔耳草有效的活性成分、作用靶点及疾病靶点,探究短穗兔耳草―异病同治‖慢性酒精性肝损伤及急性痛风性关节炎的共同作用机制。通过TCMSP、Pharm Mapper Server、Swiss Target Prediction、CTD数据库检索并结合本课题组前期分离鉴定获得短穗兔耳草有效成分及其作用靶点;通过Gene Cards、OMIM、TTD数据库得到两种疾病的相关作用靶点;采用Cytoscape绘制有效成分-疾病-共有靶点网络图及共有靶点蛋白互作网络。通过DAVID网站对短穗兔耳草的GO过程和KEGG通路进行富集分析。结果:（1）短穗兔耳草提取物各剂量组能降低慢性酒精性肝损伤模型大鼠血清AST、ALT、TC、TG、IL-1β水平,其中高剂量效果尤为显着;Western Blot结果显示短穗兔耳草高剂量组均能使肝组织中TLR2,My D88,NF-κB和NALP3表达水平显着下调,对TLR4的蛋白表达无显着影响;病理切片显示短穗兔耳草各剂量组能不同程度改善肝组织的病理形态变化。（2）短穗兔耳草30%、50%、95%乙醇部位及阳性药组能显着降低血清中ALT、AST水平,30%和50%乙醇部位能显着降低血清中TG、IL-1β水平,而对TC水平无明显影响;30%和50%乙醇部位能使肝匀浆中GSH水平显着下降,50%乙醇部位能使肝匀浆中SOD水平显着下降而MDA各组无显着性差异;Western Blot结果显示短穗兔耳草30%乙醇部位能使肝组织中My D88水平下调,30%和50%乙醇部位均能使肝组织中TLR2,NF-κB和NALP3表达水平显着下调;病理切片结果显示30%和50%乙醇部位能改善大鼠肝组织病理变化。（3）尿酸钠造模48h后,短穗兔耳草各剂量组及秋水仙碱组大鼠踝关节肿胀度均显着下降;短穗兔耳草各剂量组能显着降低大鼠血清中TNF-α水平而各组IL-1β水平无显着性差异;Western Blot结果显示短穗兔耳草中、高剂量组能使滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3蛋白表达水平显着下调;病理切片显示短穗兔耳草能不同程度改善大鼠滑膜组织病理变化。（4）尿酸钠造模48h后,秋水仙碱组、30%乙醇部位低剂量组和50%乙醇部位的低、高剂量组大鼠踝关节肿胀率均明显下降;Western Blot结果显示秋水仙碱组及30%乙醇部位低、高剂量组均能使滑膜组织中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB和NALP3蛋白表达量下调。同时,滑膜病理切片显示30%乙醇部位更能改善大鼠滑膜组织病理变化。（5）网络药理学结果显示:从短穗兔耳草中共筛选出7个有效化合物,涉及5027个靶点;从数据库中搜寻两个疾病相关靶点4212个,取交集共得到化合物与疾病共有靶点253个。253个共有靶点主要通过作用于44条信号通路发挥其―同治‖的药效作用,其中主要涉及脂肪细胞因子信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号传送途径、FcεRI信号通路、PPAR信号通路、T细胞受体信号通路等。结论:短穗兔耳草对慢性酒精性肝损伤及急性痛风性关节炎具有一定的保护作用,其对两种疾病的治疗皆与TLR/My D88/NF-κB和NALP3信号通路有关;其中30%、50%的乙醇部位为短穗兔耳草抗慢性酒精性肝损伤的有效部位,30%的乙醇部位为短穗兔耳草抗痛风性关节炎的有效部位。同时,网络药理学结果也表明短穗兔耳草中化合物发挥药效可能与Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路等相关。
万岳梦[8]（2020）在《小鼠骨髓间充质干细胞对酒精性肝损伤的疗效及机制研究》文中研究指明[目 的]酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是一种严重危害人类健康的疾病,其患病率在世界范围内逐年增加,是一个全球性的公共卫生问题。为此,深入研究ALD的发病机制和探索其干预策略具有十分重大的意义。骨髓间充质干细胞（Bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs）是一种来源于中胚层的多能成体细胞,其具有高度自我更新和多向分化的潜能,被广泛用于多种疾病的基础和临床研究。本研究旨在探讨小鼠BM-MSCs移植对酒精性肝损伤小鼠的疗效及其相关的分子机制。[方 法]本研究分为两个部分:第一部分:小鼠BM-MSCs的分离、培养、鉴定及慢病毒转染1.采用全骨髓贴壁法,从4～6周龄的雄性C57BL/6N小鼠后肢骨髓中分离出干细胞;2.采用流式细胞仪检测所分离出的干细胞表面的免疫分子标志物,包括CD29、CD45、CD90 和 CD105;3.对所分离出的干细胞进行成骨和成脂诱导分化培养,判断其多向分化潜能;4.采用慢病毒转染的方法将小干扰核糖核酸（Small interfering ribonucleic acid,siRNA）导入所分离出的BM-MSCs中,并通过逆转录定量聚合酶链式反应（Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）和蛋白质印迹（Westem-blot,WB）方法检测肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）α刺激基因/蛋白（TNF-α stimulating gene/protein,TSG）6的表达,制备稳定的BM-MSCs转染株。第二部分:小鼠BM-MSCs对小鼠酒精性肝损伤的疗效及机制研究1.实验动物与分组:8～10周龄、体重17～21克、雌性C57BL/6N小鼠70只,随机分成以下七组:正常组、模型组、MSCs组、sc-MSCs组、siTSG6-MSCs组、rmTSG-6组和AG490组,每组10只小鼠,分别给予对照液体饲料和酒精液体饲料喂养;2.酒精性肝损伤模型:本研究根据美国国立卫生院酒精滥用与成瘾研究所（National institute of alcohol abuse and alcoholism/national institute of health,NIAAA）的方法建立酒精性肝损伤模型,即通过慢性酒精液体饲料喂养10天联合三次高剂量酒精灌胃的方法诱导雌性小鼠酒精性肝损伤模型;3.干细胞移植:在造模期第10天,正常组、模型组、MSCs组、sc-MSCs组、siTSG6-MSCs组、rmTSG-6组和AG490组实验小鼠分别给予腹腔注射无菌生理盐水（正常组、模型组）、正常BM-MSCs（MSCs组）、转染对照慢病毒的BM-MSCs（sc-MSCs组）、转染干扰慢病毒的BM-MSCs（siTSG6-MSCs组）、重组小鼠TSG-6（rmTSG-6 组）、正常 BM-MSCs 联合 AG490（AG490 组）;4.取材:在造模期第11天,将所有小鼠灌胃处理9小时后,再行吸入麻醉后采集血液和肝组织标本;5.标本检测:对各组小鼠血清和肝组织标本进行生化、组织病理学、流式细胞术、RT-qPCR及WB等检测。[结果]第一部分:小鼠BM-MSCs的分离、培养、鉴定及慢病毒转染1.采用全骨髓贴壁法分离出的干细胞,形态为三角形、梭形、纺锤形,呈放射状或漩涡状生长;细胞表面免疫标志物CD45表达率仅为0.65%,而CD29、CD90和CD105的表达率分别高达82.84%、85.27%、84.17%;细胞能被诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞,经油红O染色和茜素红染色后呈阳性,符合BM-MSCs的鉴定标准。2.小鼠BM-MSCs经干扰慢病毒转染后,TSG-6基因在转录和翻译水平显着下调,提示小鼠BM-MSCs TSG-6稳定转染株成功建立。第二部分:小鼠BM-MSCs对酒精性肝损伤的疗效及机制研究1.与正常组小鼠相比,模型组小鼠肝/体重比、血清谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、血清和肝组织总胆固醇（Total cholesterol,TC）和甘油三酯（Triglyceride,TG）、肝组织脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、血清和肝组织促炎性介质白介素（Interleukin,IL）6和TNF-α的水平显着升高,肝组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显增加,而肝组织抗氧化剂还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、抗炎性细胞因子IL-10和TSG-6的水平显着降低,这些结果提示酒精性肝损伤小鼠造模成功。2.经BM-MSCs治疗后,小鼠肝/体重比、血清转氨酶（ALT、AST）、血清和肝组织脂质（TC、TG）、肝组织MDA、血清和肝组织促炎性介质（IL-6、TNF-α）的水平、肝组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显降低,而肝组织GSH、血清和肝组织抗炎性介质（IL-10、TSG-6）的水平明显升高,这些结果均提示小鼠BM-MSCs移植能有效治疗小鼠酒精性肝损伤。3.MSCs组、sc-MSCs组和siTSG6-MSCs组小鼠肝组织中仅有少数BM-MSCs归巢、定植。4.转染干扰慢病毒、下调TSG-6基因表达导致BM-MSCs对酒精性肝损伤的疗效显着降低,而转染对照慢病毒、不影响TSG-6基因表达对BM-MSCs的疗效没有影响,且外源性注射重组小鼠TSG-6（recombinant mouse TSG-6,rmTSG-6）的疗效与注射正常BM-MSCs的相似,提示TSG-6分子是小鼠BM-MSCs治疗酒精性肝损伤小鼠的关键分子。5.与正常组小鼠相比,模型组小鼠肝组织中的磷酸化信号转导子和转录激活子3（Phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3）蛋白水平显着升高;经正常BM-MSCs治疗后,小鼠肝组织中的p-STAT3蛋白水平显着降低;转染干扰慢病毒、下调TSG-6基因表达导致BM-MSCs对小鼠肝组织p-STAT3蛋白水平的抑制作用消失,而转染对照慢病毒、不影响TSG-6基因表达对BM-MSCs的这一作用没有影响,且外源性注射rmTSG-6也能显着抑制小鼠肝组织中的p-STAT3蛋白水平,这些结果证实小鼠BM-MSCs是通过TSG-6分子来抑制小鼠肝组织中STAT3信号通路活化的。6.与MSCs组相比,AG490组小鼠肝组织中的p-STAT3蛋白水平显着降低;AG490组小鼠血清转氨酶（ALT、AST）、血清和肝组织脂质（TC、TG）、肝组织MDA水平显着降低,而肝组织抗氧化剂GSH水平显着增高,这些结果提示进一步抑制肝组织中的STAT3信号通路活化可以提高小鼠BM-MSCs对酒精性肝损伤小鼠的疗效。[结论]1.采用全骨髓贴壁法,能从小鼠后肢骨髓成功分离、提取BM-MSCs。2.通过慢病毒转染的方法,能成功建立稳定的TSG-6基因干扰株BM-MSCs。3.小鼠BM-MSCs移植能有效治疗小鼠酒精性肝损伤。4.小鼠BM-MSCs主要通过旁分泌机制、产生TSG-6分子发挥对酒精性肝损伤小鼠的疗效。5.小鼠BM-MSCs是通过TSG-6分子抑制小鼠肝组织中STAT3信号通路活化的,进一步抑制该信号通路活化可提高BM-MSCs的疗效。
单亮[9]（2020）在《ATP-CD39-CD73通路调控肝星状细胞炎症因子和纤维化因子分泌在酒精性肝病中的作用》文中进行了进一步梳理酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝,进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。其分子机制和病理机制不明,临床上没有确切的药物用于ALD。研究发现嘌呤能信号（Purinergic signalling）参与肝脏疾病的病理生理调节过程。乙醇等外界刺激下,细胞将胞内三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）释放至胞外,提示机体启动免疫防御。当细胞应激或受损时ATP释放至细胞外,立即被胞外酶CD39（ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase,NTPDase1）水解为一磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate,AMP）,而胞外CD73（Ecto-5’-Nucleotidase,NT5E）将AMP水解为腺苷（Adenosine）。腺苷脱氨酶（Adenosine Deaminase,ADA）可水解灭活腺苷。因此,胞外酶CD39-CD73共同调控腺苷浓度。肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）也表达CD39和CD73,但是到目前为止还没有相关文献对其在ALD炎症和纤维化中的作用进行系统的报道。本课题组前期研究发现HSCs的腺苷受体（Adenosine Receptors,ARs）在乙醛（Acetaldehyde,Ace）作用下激活后通过c AMP-PKA（Proteinkinase A）-CREB（c AMP-Response Element Binding Protein）信号通路促进HSCs活化增殖。此外,ARs拮抗剂及Caffeine可减轻酒精性肝纤维化中HSCs活化增殖。进一步证实腺苷信号通路调控ALD纤维化。研究目的:本项研究中,按照课题组前期发表的文献分别复制急性酒精性肝损伤小鼠模型和细胞模型,慢性酒精性肝纤维化小鼠模型和细胞模型,研究ATP-CD39-CD73信号通路调控HSCs炎症因子和纤维化因子分泌在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中的作用。研究方法:（1）参考本课题组以前发表文章中的方法,分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化小鼠模型。提取HSCs,参考本课题组以前发表文章中的方法分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型。（2）计算平均体重和肝比重,全自动生化分析仪检测动物血清生化指标和纤维化指标,取肝组织做病理切片,分别做Hematoxylin-Eosin（HE）染色、Masson三基色染色、Van Gieson（VG）染色和天狼星红（Sirius red）染色,免疫组化法分析肝组织α-Smooth Muscle Actin（α-SMA）蛋白表达,荧光免疫双染检测肝组织CD39和CD73表达,HE染色POM-1高中低三个剂量组的肝组织病理切片。阐明CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物模型中发挥重要作用。（3）Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction（RTq PCR）法检测CD39,CD73,炎症因子和纤维化因子的基因表达。Western blotting法检测CD39、CD73、炎症因子和纤维化因子的蛋白表达,生物发光法检测ATP浓度和高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）法检测腺苷含量。阐明CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥重要作用。（4）分别建立急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化HSC模型,检测CD39和CD73的激动剂和拮抗剂对细胞模型炎症因子和纤维化因子蛋白表达的影响,同时检测HSCs培养上清液中ATP和腺苷含量变化。阐明ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中的作用。（5）使用小干扰RNA/沉默RNA（Small interfering RNA/silencing RNA,si RNA）分别沉默CD39基因和CD73基因,检测基因沉默后对急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化HSC模型的影响。阐明CD39和CD73沉默在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥作用。SPSS（Statistical Product and Service Solutions）17.0软件统计数据,Graphpad prism 8.0软件做图。结果:（1）急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物实验中两个模型组的平均体重、肝比重、血清生化指标、血清肝纤四项指标、肝组织病理、免疫组化、荧光免疫双染结果均较对照组有明显变化,HE染色结果显示POM-1大剂量可减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化,荧光免疫双染结果发现急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化模型组小鼠肝组织CD39和CD73表达增加。提示急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化动物模型建立成功。（2）在体外实验中,模型组胞外酶CD39和CD73、炎性细胞因子和成纤维细胞因子的表达均明显增加,提示CD39和CD73可能在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中发挥调控作用。（3）体外实验中,CD39拮抗剂ARL67156和CD73拮抗剂APCP可以显着降低CD39和CD73蛋白的表达,二者均可以降低炎性细胞因子和成纤维细胞因子的蛋白表达,同时,细胞培养上清液中ATP和腺苷的浓度也发生了相应的变化。提示ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥调控作用。（4）CD39 si RNA和CD73 si RNA可分别降低急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中CD39和CD73的蛋白表达,二者均可降低细胞模型炎症因子和纤维化因子的蛋白表达,细胞培养上清液中ATP和腺苷浓度也有相应的变化。提示ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化细胞模型中发挥调控作用。结论:（1）ATP-CD39-CD73信号通路在急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化过程中发挥作用。（2）抑制或沉默CD39可以减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化。（3）抑制或沉默CD73可以减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化。
宋晓改[10]（2020）在《ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究》文中研究表明目的本研究利用CRISPR/Cas9技术,进行基因编辑ADAM9序列,抑制其基因表达,旨在研究ADAM9在小鼠酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究。方法（一）ADAM9-sg RNA3转染大鼠肝星状细胞HSC-T6:将本实验室前期筛选的有活性的ADAM9-sg RNA3质粒转染大鼠肝星状细胞HSC-T6,经过嘌呤酶素筛选,提取转染成功的细胞DNA进行PCR扩增、电泳、胶回收,然后进行测序,以此来验证有效sg RNA3蛋白。（二）体外实验:培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,分为四组,正常HSC-T6对照组:不做任何处理;正常HSC-T6+酒精组:直接用酒精诱导培养;ADAM9-sg RNA3+酒精组:将有效sg RNA3进行稳定转染后给予酒精诱导培养;JNK抑制剂+酒精组:将JNK抑制剂SP600125和培养液混匀加入细胞温育24小时,再和酒精一起诱导细胞培养。免疫印迹检测相关因子表达:解整合素-金属蛋白酶ADAM9,c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路磷酸化蛋白p-c-Jun,平滑肌肌动蛋白α-SMA,增殖细胞核抗原PCNA,细胞凋亡相关蛋白Caspase-3。（三）体内实验:健康清洁的C57BL/6J雄性小鼠220只,随机分为4组:A组:正常对照组（10只）:采用对照Lieber-De Carli饲料TP4030C喂养;B组:生理盐水+酒精组（70只）:尾静脉注射生理盐水;C组:ADAM9-sg RNA3+酒精组（70只）:尾静脉注射有效ADAM9-sg RNA3质粒;D组:JNK抑制剂+alcohol组（70只）:尾静脉注射JNK抑制剂SP600125;B、C、D组分别采用Lieber-De Carli酒精饲料TP4030A喂养4周,之后联合腹腔注射5%CCl4橄榄油溶液2ml/kg,2次/周,直到第8周,建立小鼠酒精性肝纤维化动物模型,第8周集中处死,摘除眼球取血,分离小鼠血清检测AST、ALT这两个酶的数值;肝脏处理后,进行石蜡切片苏木精-伊红染色（HE染色）检测小鼠肝脏损伤情况;天狼星红染色检测小鼠肝脏纤维化程度;Hoechst33258细胞凋亡染色检测肝细胞的凋亡情况;免疫印迹检测相关因子表达:ADAM9,PCNA,血管内皮生长因子VEGF,细胞凋亡相关蛋白Bax,应激蛋白HSP70,代谢关键酶细胞色素P4502E1（CYP2E1）,肿瘤坏死因子TNF-α,α-SMA,p-c-Jun。结果DNA测序结果显示sg RNA3组基因序列与正常基因序列相比,差异大,蛋白免疫印迹结果显示:转染ADAM9-sg RNA3质粒的HSC-T6细胞ADAM9蛋白表达量较正常HSC-T6+酒精组细胞的表达量明显降低（P<0.01）,差异具有显着统计学意义,因此确定sg RNA3为有效向导RNA。体外实验:1.蛋白免疫印迹实验结果:与正常HSC-T6+酒精组相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组细胞ADAM9,p-c-Jun,α-SMA,PCNA的蛋白表达量显着降低（P<0.01）,而Caspase-3的蛋白表达量显着上升（P<0.05或P<0.01）。体内实验:1.血清转氨酶变化情况:生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组、JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平较正常组明显升高（P<0.01或P<0.05）,其中ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平显着低于生理盐水+酒精组（P<0.01或P<0.05）,JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比降低更加明显（P<0.05）。2.苏木精-伊红染色情况:与正常组相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组以及JNK抑制剂+酒精组小鼠均出现显着肝损伤（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死显着降低（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死降低更明显（P<0.05）。3.苦味酸-天狼星红染色结果:与正常组小鼠相比,其余三组小鼠都发生了显着的肝纤维化（P<0.01或P<0.05）,与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加显着（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加明显（P<0.05）。4.Hoechst33528染色结果:与正常组小鼠相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组及JNK抑制剂+酒精组小鼠都发生了显着的肝细胞凋亡（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目有所减少（P<0.05或P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组小鼠相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目更显着（P<0.05）。5.蛋白免疫印迹实验结果:与生理盐水+酒精组相比较,尾静脉注射ADAM9-sg RNA3+酒精组和尾静脉注射JNK抑制剂+酒精组肝内CYP2E1,Bax,TNF-α,ADAM9,α-SMA,p-c-Jun的蛋白表达量显着降低（P<0.05或P<0.01）;而VEGF,PCNA,HSP70的蛋白表达量显着升高（P<0.05或P<0.01）。结论在小鼠酒精性肝纤维化中,ADAM9起到促进肝纤维化的作用,ADAM9通过激活JNK信号通路促进小鼠酒精性肝纤维化。
二、大鼠慢性酒精性肝损伤及肝纤维化改变观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠慢性酒精性肝损伤及肝纤维化改变观察（论文提纲范文）
（1）基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药学治疗肝纤维化的研究进展 |
| 综述二 现代医学对肝纤维化的研究进展 |
| 综述三 益气活血法对肝窦内皮细胞细胞生物学影响的研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠的影响研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 结论 |
| 实验二 大鼠肝窦内皮细胞的原代分离与提取 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成酶、一氧化氮的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
| 中医药科技查新报告书 |
（2）穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏疾病 |
| 1.2 酒精性肝损伤 |
| 1.2.1 酒精消费的现状 |
| 1.2.2 长期饮酒的危害 |
| 1.2.3 酒精性肝病的临床诊断 |
| 1.2.4 酒精性肝病的流行病学特征 |
| 1.2.5 酒精性肝损伤的危险因素 |
| 1.2.6 酒精性肝损伤的发生机制 |
| 1.2.7 酒精性肝损伤的药物治疗 |
| 1.3 穿心莲内酯 |
| 1.3.1 穿心莲内酯的生物学活性 |
| 1.3.2 穿心莲内酯的临床应用研究 |
| 1.4 选题内容、目的及创新点 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 本论文的研究目标 |
| 1.4.3 本论文的特色及创新之处 |
| 第2章 穿心莲内酯的文献研究及临床应用现状分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 穿心莲内酯相关研究的文献计量分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 穿心莲内酯临床应用的病例分析 |
| 2.3.1 对象与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用及其机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 细胞学实验 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酒精性肝损伤的模型 |
| 3.4.2 酒精性肝损伤的判定指标 |
| 3.4.3 酒精性肝损伤的分子机制 |
| 3.4.4 酒精性肝损伤的保护药物 |
| 3.5 不足与展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对肝纤维化的认识与研究 |
| 1.1 现代医学对肝纤维化流行病学的认识 |
| 1.2 现代医学对肝纤维化发病机制的研究 |
| 1.2.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 1.2.2 肝细胞与肝纤维化 |
| 1.2.3 枯否细胞与肝纤维化 |
| 1.3 西医治疗 |
| 1.3.1 药物治疗 |
| 1.3.2 肝脏移植 |
| 2 中医药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.1 中医学对肝纤维化病名的沿革 |
| 2.2 中医学中肝纤维化的病因病机 |
| 2.3 中医学对肝纤维化的辨证论治 |
| 2.4 中药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.4.1 单味中药 |
| 2.4.2 中药复方 |
| 2.4.3 针灸治疗及其他 |
| 第二部分 实验内容 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 1.4.1 药物 |
| 1.4.2 50%的CCl4 溶液配制 |
| 1.4.3 制备秋水仙碱 |
| 1.4.4 制备10%的水合氯醛 |
| 1.4.5 制备4%多聚甲醛固定液 |
| 1.4.6 封闭液 |
| 1.4.7 2XSDS蛋白上样缓冲液 |
| 1.4.8 电泳液 |
| 1.4.9 1X转膜液 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 肝纤维化大鼠模型的制备及给药方法 |
| 2.1.1 分组方法 |
| 2.1.2 造模方法 |
| 2.1.3 给药方法 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.2.1 血清标本的采集 |
| 2.2.2 肝脏病理切片制备 |
| 2.3 HE染色制备 |
| 2.4 Masson染色制备 |
| 2.5 血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量的测定 |
| 2.6 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达 |
| 2.6.1 肝组织样本的采集 |
| 2.6.2 肝组织内总RNA的提取 |
| 2.6.3 RNA浓度的测定 |
| 2.6.4 反转录反应 |
| 2.6.5 Real-time q PCR扩增 |
| 2.7 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、CollagenI、Collagen III蛋白的表达 |
| 2.7.1 组织样本的采集 |
| 2.7.2 肝组织内总蛋白的提取 |
| 2.7.3 总蛋白的保存 |
| 2.7.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.7.5 转膜 |
| 2.7.6 封闭 |
| 2.7.7 孵育抗体 |
| 2.7.8 发光显影 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠肝脏病理学形态的影响 |
| 3.1.1 大鼠一般情况 |
| 3.1.2 肝脏组织肉眼变化 |
| 3.1.3 肝组织病理学观察 |
| 3.2 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px的影响 |
| 3.2.1 柔肝化纤颗粒对血清中ROS表达的影响 |
| 3.2.2 柔肝化纤颗粒对血清中MDA含量的影响 |
| 3.2.3 柔肝化纤颗粒对血清中SOD含量的影响 |
| 3.2.4 柔肝化纤颗粒对血清中GSH-Px含量的影响 |
| 3.3 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达的影响 |
| 3.3.1 柔肝化纤颗粒对PKCαmRNA表达的影响 |
| 3.3.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 mRNA表达的影响 |
| 3.3.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA mRNA表达的影响 |
| 3.3.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin mRNA表达的影响 |
| 3.3.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I mRNA表达的影响 |
| 3.3.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III mRNA表达的影响 |
| 3.4 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响 |
| 3.4.1 柔肝化纤颗粒对PKCα蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA蛋白表达的影响 |
| 3.4.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin蛋白表达的影响 |
| 3.4.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I蛋白表达的影响 |
| 3.4.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的理论基础 |
| 4.1.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的疗效研究 |
| 4.1.2 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的机制研究 |
| 4.2 氧化应激反应与肝纤维化 |
| 4.3 PKCα/Nrf2/ROS信号通路与肝纤维化 |
| 4.4 α-SMA、E-cadherin与肝纤维化 |
| 4.5 Collagen I、Collagen III表达与肝纤维化 |
| 4.6 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化应激在肝脏疾病中的作用及相关治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及发表论文和参加科研情况说明 |
（4）基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 慢性肝病的研究进展 |
| 1.1.1 病毒性肝病 |
| 1.1.2 酒精性肝病 |
| 1.1.3 非酒精性脂肪肝 |
| 1.1.4 药物性肝病 |
| 1.1.5 自身免疫性肝病 |
| 1.2 肠道微生态与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.1 肠道菌群的概念 |
| 1.2.2 肠-肝轴学说 |
| 1.2.3 肠道菌群与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.4 FMT在肝病治疗中的应用进展 |
| 1.3 本课题的设计思路 |
| 第2章 慢性肝病患者肠道菌群结构多样性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 研究对象与分组 |
| 2.1.2 粪便样本采集与DNA提取 |
| 2.1.3 16S rRNA V4 区扩增与纯化 |
| 2.1.4 16S rRNA测序和生物信息学分析 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者临床信息统计 |
| 2.2.2 16SrRNA测序深度 |
| 2.2.3 慢性肝病患者肠道菌群物种多样性的差异分析 |
| 2.2.4 慢性肝病患者肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.5 肝硬化组、LC-HCC组和NLC-HCC组中肠道菌群物种多样性分析 |
| 2.2.6 肝硬化组、LC-HCC组,NLC-HCC组肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.7 肠道菌群紊乱与临床因素之间的关系 |
| 2.2.8 肠道菌群紊乱与HCC病因的关联分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 FMT改善了各组大鼠的生活状态和生存时间 |
| 3.2.2 FMT延缓了各组大鼠的体重下降和腹水形成时间 |
| 3.2.3 FMT减轻肝损伤保护肝功能 |
| 3.2.4 FMT可改善肝硬化大鼠的肝纤维化发展进程 |
| 3.2.5 FMT可降低肝硬化大鼠血清中炎性细胞因子和内毒素含量 |
| 3.2.6 FMT可减少肝硬化大鼠肠道菌群的移位 |
| 3.2.7 FMT可改善肝硬化大鼠肠道粘膜的屏障功能 |
| 3.2.8 FMT抑制了肝硬化大鼠肝组织中TLR4 信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 16SrRNA测序深度 |
| 4.2.2 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 4.2.3 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群门和属水平的影响 |
| 4.2.4 UPLC-Q/TOF-MS的稳定性评估 |
| 4.2.5 FMT对肝硬化大鼠体内代谢组学的影响 |
| 4.2.6 FMT治疗后差异性代谢物鉴别 |
| 4.2.7 FMT对肝硬化大鼠相关代谢通路的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录图 |
| 附录表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 祖国医学对肝纤维化的认识 |
| 1.1 病名探讨 |
| 1.2 病因病机探究 |
| 1.3 治法探讨 |
| 2 现代医学对肝纤维化的认识 |
| 2.1 肝纤维化的病因 |
| 2.2 肝纤维化的诊断 |
| 2.3 肝纤维化的治疗 |
| 3 本研究的理论基础 |
| 3.1 “主客交”学说 |
| 3.1.1 “主客交”学说的创立 |
| 3.1.2 “主客交”含义 |
| 3.1.3 “主客交”学说的发展 |
| 3.1.4 “主客交”学说的特点 |
| 3.2 “主客交”与肝纤维化 |
| 3.3 “主客交”之治疗——三甲散及加减运用 |
| 3.4 加减三甲散及其运用 |
| 4 肝纤维化与Wnt/β-catenin信号转导通路 |
| 4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 4.2 Wnt信号转导通路 |
| 4.3 Wnt/β-catenin与肝纤维化 |
| 5 LncRNA与肝纤维化 |
| 5.1 LncRNA概况 |
| 5.2 LncRNA在肝纤维化中的研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 实验一 加减三甲散功效对比及wnt信号通路研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验主要仪器和设备 |
| 1.1.4 实验药物 |
| 1.1.5 实验场地 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组 |
| 1.2.2 干预用药的用法用量及制备方法 |
| 1.2.3 造模方法 |
| 1.2.4 药物干预方法 |
| 1.2.5 血清标本采集与处理 |
| 1.3 观察指标及方法 |
| 1.3.1 大鼠肉眼下观察 |
| 1.3.2 大鼠肝脏组织形态 |
| 1.3.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量观测 |
| 1.5 统计学处理方法 |
| 1.6 实验结果 |
| 1.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 1.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 1.6.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.6.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量变化 |
| 1.7 讨论 |
| 1.7.1 加减三甲散2号方的由来 |
| 1.7.2 对肝纤维大鼠模型的评价 |
| 1.7.3 对大鼠一般情况的影响 |
| 1.7.4 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 1.7.5 对大鼠血清肝功能指标的影响 |
| 1.7.6 对肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量的影响 |
| 2 实验二加减三甲散干预肝纤维化大鼠lnc RNA和 m RNA表达谱的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 实验药物 |
| 2.1.5 实验场地 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 造模方法 |
| 2.2.3 干预用药的制备及用法用量 |
| 2.2.4 药物干预方法 |
| 2.2.5 标本采集与处理 |
| 2.3 观察指标及方法 |
| 2.3.1 大鼠肉眼下形态观察 |
| 2.3.2 小鼠肝脏组织形态 |
| 2.3.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.4 高通量测序肝脏组织m RMA和 lnc RNA |
| 2.4.1 RNA抽提和质检 |
| 2.4.2 文库构建 |
| 2.4.3 上机测序 |
| 2.4.3.1 获得reads |
| 2.4.3.2 数据预处理 |
| 2.4.3.3 基因组比对(Mapping genome) |
| 2.4.4.4 基因饱和度分析 |
| 2.4.4.5 mRNA和lncRNA差异基因筛选 |
| 2.4.4.6 GO 富集分析和 KEGG pathway 富集分析 |
| 2.5 统计学处理方法 |
| 2.6 实验结果和分析 |
| 2.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 2.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 2.6.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.6.4 大鼠肝脏组织mRNA表达谱的变化 |
| 2.6.5 大鼠肝脏组织lnc RNA表达谱的变化 |
| 2.7 讨论 |
| 2.7.1 对大鼠一般情况的影响 |
| 2.7.2 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 2.7.3 对大鼠血清肝纤维化指标的影响 |
| 2.7.4 对大鼠肝脏组织lncRNA和mRNA的影响及与“主客交”的联系 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 1:附图 部分原始图片 |
| 附件 2:文献综述 中成药治疗肝纤维化的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件 3:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（6）葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 急性酒精肝损伤发病机制及治疗研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 葛花、枳椇子化学成分和药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 酒精性肝损伤动物模型制备的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏保护作用的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠乙醇浓度及乙醇脱氢酶活性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏抗氧化作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理形态的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏Keap1和Nrf2基因及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验六葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏AQP9基因及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（7）短穗兔耳草基于炎症信号通路对慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎治疗作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 注释表 |
| 引言 |
| 第一章 TLR/MyD88/NF-κB及 NALP3 信号通路参与不同疾病病理机制研究进展 |
| 1 TLR/MyD88/NF-κB信号通路的构成 |
| 1.1 TLR |
| 1.2 MyD88 |
| 1.3 NF-κB |
| 1.4 NALP3 |
| 2 TLR/MyD88/NF-κB信号通路与疾病 |
| 2.1 自身免疫性疾病 |
| 2.1.1 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE) |
| 2.1.2 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS) |
| 2.1.3 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA) |
| 2.2 感染性疾病 |
| 2.2.1 细菌性感染 |
| 2.2.2 真菌性感染 |
| 2.2.3 病毒感染 |
| 3 过敏性疾病 |
| 4 总结与展望 |
| 第二章 炎症信号通路探讨藏药短穗兔耳草提取物抗慢性酒精性肝损伤大鼠的作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组、模型复制及给药 |
| 2.2 指标检测 |
| 2.2.1 血清指标检测 |
| 2.2.2 HE染色法检测肝组织病理学变化 |
| 2.2.3 Western blot法测大鼠肝组织TLR2,MyD88,NF-κB和 NALP3 蛋白表达 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中TC,TG,ALT,AST的影响 |
| 3.2 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中 IL-1β 含量的影响 |
| 3.3 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理学的影响 |
| 3.4 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织中 TLR2,TLR4,MyD88,NF-κB和NALP3 蛋白表达的影响 |
| 4、讨论 |
| 第三章 基于炎症信号通路对藏药短穗兔耳草抗慢性酒精性肝损伤大鼠作用有效部位研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组、模型复制及给药 |
| 2.2 指标检测 |
| 2.2.1 血清指标检测 |
| 2.2.2 HE染色法检测肝组织病理学变化 |
| 2.2.3 Western blot法测大鼠肝组织TLR2,MyD88,NF-κB和 NALP3 蛋白表达 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中TG,TC,ALT,AST的影响 |
| 3.2 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织中 GSH,SOD,MDA 含量的影响 |
| 3.3 对慢性酒精性肝损伤大鼠血清中 IL-1β 含量的影响 |
| 3.4 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理学的影响 |
| 3.5 对慢性酒精性肝损伤大鼠TLR2/MyD88/NF-κB和 NALP3 信号通路蛋白表达的影响 |
| 4、讨论 |
| 第四章 基于炎症信号通路探讨藏药短穗兔耳草提取物抗急性痛风性关节炎大鼠的作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物造模、分组及给药 |
| 2.2 尿酸钠晶体的制备 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.3.1 踝关节肿胀度检测 |
| 2.3.2 血清指标检测 |
| 2.3.3 滑膜组织病理学检测 |
| 2.3.4 大鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和 NALP3 蛋白表达检测 |
| 2.4 统计学方法处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 短穗兔耳草提取物对急性痛风性关节炎大鼠不同时间踝关节肿胀度的影响 |
| 3.2 短穗兔耳草提取物对急性痛风性关节炎大鼠血清中 TNF-α,IL-1β含量的影响 |
| 3.3 短穗兔耳草对急性痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜病理学的影响 |
| 3.4 短穗兔耳草提取物对急性痛风性关节炎滑膜组织中 TLR2,TLR4,MyD88,NF-κB 和 NALP3 信号通路蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第五章 基于炎症信号通路对藏药短穗兔耳草抗急性痛风性关节炎大鼠作用有效部位研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物造模、分组及给药 |
| 2.2 尿酸钠晶体的制备(同第四章2.2) |
| 2.3 指标检测 |
| 2.3.1 踝关节肿胀度检测 |
| 2.3.2 滑膜组织病理学检测 |
| 2.3.3 大鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和 NALP3 蛋白表达检测 |
| 2.4 统计学方法处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 短穗兔耳草不同极性部位对急性痛风性关节炎大鼠不同时间踝关节肿胀度的影响 |
| 3.2 短穗兔耳草不同极性部位对急性痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜病理学的影响 |
| 3.3 短穗兔耳草不同极性部位对急性痛风性关节炎滑膜组织中 TLR2,TLR4,MyD88,NF-κB 和 NALP3 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第六章 藏药短穗兔耳草“异病同治”慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎的网络药理学作用机制研究 |
| 1 方法 |
| 1.1 短穗兔耳草有效化学成分 |
| 1.2 有效化学成分靶点的预测 |
| 1.3 疾病靶点的预测 |
| 1.4 有效成分-疾病-共有靶点网络及共同靶蛋白互作(PPI)的构建 |
| 1.5 共有靶点的GO富集分析与通路注释分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 短穗兔耳草有效化合物的获取 |
| 2.2 作用靶点的预测结果 |
| 2.3 共有靶点的网络分析 |
| 2.4 共有靶点的GO富集分析与通路注释分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结语 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（8）小鼠骨髓间充质干细胞对酒精性肝损伤的疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠BM-MSCs的分离、培养、鉴定及慢病毒转染 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 小鼠BM-MSCs对酒精性肝损伤的疗效及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 间充质干细胞可能通过分涵TS6-6治疗酒精性肝病 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）ATP-CD39-CD73通路调控肝星状细胞炎症因子和纤维化因子分泌在酒精性肝病中的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 2.实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 急性酒精性肝损伤小鼠模型建立 |
| 3.2 慢性酒精性肝纤维化小鼠模型建立 |
| 3.3 体内外模型中CD39、CD73基因表达 |
| 3.4 CD39拮抗剂POM-1减轻小鼠急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化 |
| 3.5 CD39/CD73拮抗剂降低急性酒精性肝损伤细胞模型炎症因子蛋白表达 |
| 3.6 CD39/CD73激动剂和拮抗剂调控慢性酒精性肝纤维化细胞模型蛋白表达 |
| 3.7 沉默CD39减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化 |
| 3.8 沉默CD73减轻急性酒精性肝损伤和慢性酒精性肝纤维化 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 7.附录 |
| 8.致谢 |
| 9.综述 |
| 参考文献 |
（10）ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 酒精性肝纤维化概述 |
| 1.1.1 酒精性肝纤维化病因及发病机制 |
| 1.1.2 酒精性肝纤维化病理特点 |
| 1.1.3 酒精性肝纤维化动物模型 |
| 1.2 酒精性肝纤维化过程中分子调控机制研究 |
| 1.2.1 酒精及其代谢产物对肝脏的影响 |
| 1.2.2 CYP2E1与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.3 热休克蛋白与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.4 细胞凋亡与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.5 c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径与酒精性肝纤维化 |
| 1.3 解整合素-金属蛋白酶ADAM9 |
| 1.3.1 ADAM9概述 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 技术概述 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9 系统的发展历程及分类 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 系统的结构 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统的实验原理 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas9 系统在各个方面的应用 |
| 第2章 前言 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞和质粒 |
| 3.1.2 实验动物准备 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要实验试剂 |
| 3.1.5 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 利用CRISPR/Cas9 技术构建ADAM9 三合一质粒 |
| 3.2.3 细菌培养 |
| 3.2.4 提取质粒 |
| 3.2.5 细胞培养 |
| 3.2.6 筛选HSC-T6细胞最佳嘌呤酶素浓度 |
| 3.2.7 嘌呤酶素筛选和细胞转染 |
| 3.2.8 PCR技术检测 |
| 3.2.9 胶回收DNA |
| 3.3 体外实验 |
| 3.3.1 免疫印迹蛋白检测 |
| 3.4 体内实验 |
| 3.4.1 血清AST、ALT酶活性的检测 |
| 3.4.2 组织包埋及切片 |
| 3.4.3 HE染色检测各组小鼠的肝脏坏死情况 |
| 3.4.4 苦味酸-天狼星红染色法检测各组小鼠肝脏纤维化的情况 |
| 3.4.5 Hoechst33258 染色法检测小鼠的肝细胞凋亡状况 |
| 3.4.6 免疫印迹蛋白检测 |
| 3.5 实验数据的统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 CRISPR/Cas9 技术靶向突变小鼠ADAM9 基因三合一质粒 |
| 4.2 免疫印迹法检测细胞蛋白表达结果 |
| 4.3 小鼠血清ALT、AST酶活性的检测结果 |
| 4.4 肝脏组织HE染色结果 |
| 4.5 肝脏组织苦味酸-天狼星红染色结果 |
| 4.6 肝脏组织Hoechst33258 染色结果 |
| 4.7 免疫印迹法检测组织蛋白的表达结果 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9与转氨酶和组织损伤的关系 |
| 5.2 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和胶原纤维的关系 |
| 5.3 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9 和α-SMA的关系 |
| 5.4 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和细胞凋亡的关系 |
| 5.5 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9 对肝细胞应激分子HSP70 的影响 |
| 5.6 小鼠酒精性肝损伤中ADAM9对肝细胞增殖的作用 |
| 5.7 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和VEGF的关系 |
| 5.8 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和JNK信号途径的关系 |
| 5.9 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和CYP2E1 的关系 |
| 5.10 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和TNF-α的关系 |
| 5.11 问题与展望 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 附录 Ⅰ 图及说明 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
四、大鼠慢性酒精性肝损伤及肝纤维化改变观察（论文参考文献）
- [1]基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制[D]. 张强. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究[D]. 宋远. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用[D]. 吕艳杭. 广西中医药大学, 2021
- [4]基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究[D]. 郑瑞鹏. 吉林大学, 2020(01)
- [5]基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响[D]. 成茂源. 成都中医药大学, 2020(01)
- [6]葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究[D]. 许皖. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]短穗兔耳草基于炎症信号通路对慢性酒精性肝损伤和急性痛风性关节炎治疗作用研究[D]. 单佳铃. 江西中医药大学, 2020(05)
- [8]小鼠骨髓间充质干细胞对酒精性肝损伤的疗效及机制研究[D]. 万岳梦. 昆明医科大学, 2020
- [9]ATP-CD39-CD73通路调控肝星状细胞炎症因子和纤维化因子分泌在酒精性肝病中的作用[D]. 单亮. 安徽医科大学, 2020(01)
- [10]ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究[D]. 宋晓改. 河南科技大学, 2020(06)