一、硒对淋巴细胞杀伤大肠癌细胞的影响（论文文献综述）
李美蓉[1]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中指出急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
王亮[2]（2020）在《uPAR促进卵巢癌发生转移及靶向uPAR-CAR-T细胞治疗卵巢癌的研究》文中研究说明研究背景:卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤中发病率最低,病死率最高的肿瘤类型,具有起病隐匿、进展迅速、早期转移、预后较差等特点。晚期卵巢癌发生盆腹腔广泛种植转移非常常见,往往伴有大量腹水,给临床治疗带来巨大挑战。尽管近年来除传统肿瘤细胞减灭术和化学治疗等方法外,出现了很多新型治疗方法,但临床应用的效果并未显着改善疾病生存率,寻找新的治疗方法尤其关键。免疫治疗,基于细胞免疫和体液免疫的基本原理发展起来,包括细胞因子、单抗隆抗体、肿瘤疫苗、免疫细胞输注、免疫检查点阻断等多项手段。其中,在免疫细胞治疗领域中,嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）逐渐受到关注,其基本原理是特异性识别肿瘤细胞表面的靶抗原并通过胞内信号的激活形成对肿瘤细胞的特异性杀伤。CAR-T细胞在血液肿瘤中的疗效非常显着,抗CD19-CAR-T细胞已有多项产品获得FDA批准,部分患者可达痊愈。但是CAR-T细胞在以卵巢癌为代表的实体瘤上的治疗尚无突破性进展,主要难题和实体瘤的特征有着密切关系,例如,实体瘤微环境复杂,免疫细胞的功能经常受到抑制;实体瘤的肿瘤实质具有高度异质性,免疫靶点的选择存在局限;实体瘤是致密的团块组织,常规免疫细胞难以突破实体瘤的物理屏障。简言之,探究新的卵巢癌免疫治疗方法是非常必要的。同时根本上,免疫治疗的研究也应立足于卵巢癌的疾病特征。尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定膜蛋白,属于纤溶系统的成员之一,在多种恶性肿瘤中,uPAR呈现显着性高表达,通过与尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）特异性结合启动纤溶酶原活化并参与细胞外基质降解,影响肿瘤的增殖、转移、侵袭、耐药及复发等病理过程,是逐渐得到重视的肿瘤标志物之一。现有的研究显示uPAR在卵巢癌组织中特异性高表达,不仅表达在卵巢癌实质细胞上而且表达在肿瘤基质细胞上。那么,不同于传统的肿瘤治疗靶点,靶向uPAR的治疗方法有望同时攻克卵巢癌的基质成分和抑制卵巢癌的实质成分。本研究以uPAR为卵巢癌治疗的靶点,首先验证uPAR对于卵巢癌细胞转移能力的影响,并结合动物模型验证uPAR促进卵巢癌的腹腔种植转移和腹水形成的能力;结合uPAR在卵巢癌中促进卵巢癌进展的功能特点和存在特异性分布的表达特点,设计靶向uPAR的CAR-T细胞用于卵巢癌细胞的杀伤,验证该细胞的杀伤效率和细胞因子的分泌。实验目的:分别构建uPAR基因过表达和基因敲除的稳定转染卵巢癌细胞系;研究uPAR对于卵巢癌细胞转移能力的影响;研究uPAR影响卵巢癌转移过程中上皮间质转化过程各指标的变化情况;建立裸鼠卵巢癌腹腔种植瘤模型,探究uPAR对于卵巢癌腹腔种植和腹水形成的影响;构建靶向uPAR的CAR-T细胞。验证靶向uPAR的CAR-T细胞对于卵巢癌细胞的杀伤能力,为临床上卵巢癌的细胞治疗方法提供新的思路和策略。实验方法:第1部分:uPAR增强卵巢癌的转移能力的体外实验1、通过流式细胞术检测体外培养的卵巢癌细胞系上uPAR蛋白表达情况;2、设计构建uPAR基因过表达质粒载体,转染uPAR阴性细胞系A2780;设计构建靶向uPAR基因的shRNA慢病毒载体,转导uPAR强阳性细胞系ES-2;分别构建并鉴定uPAR基因过表达和敲除的稳定转染细胞系;3、通过细胞划痕实验和Transwell小室实验探究uPAR对于卵巢癌细胞的转移能力的影响;4、利用蛋白质免疫印迹实验检测uPAR变化对uPA、PAI-1的影响和促进卵巢癌转移能力的机制中上皮间质转化过程各指标的变化情况。第2部分:uPAR促进卵巢癌腹腔种植转移和腹水形成的体内实验1、利用ES-2对照细胞系及其uPAR基因敲除的细胞系构建裸鼠腹腔种植瘤模型,验证uPAR对于卵巢癌腹腔种植转移的影响;2、通过测量裸鼠体重及腹围研究uPAR对于裸鼠腹水形成的影响;3、通过HE染色和免疫组化染色的方法探究uPAR基因敲除对于卵巢癌裸鼠的肿瘤病灶及肝、脾等器官的影响。第3部分:靶向uPAR-CAR-T细胞的构建与制备1、利用第三代CAR-T细胞的基本框架设计靶向uPAR的CAR-T细胞,创新性选择靶向uPAR的自然结合片段作为胞外识别区;2、利用三质粒慢病毒包装系统构建CAR慢病毒;3、利用密度梯度离心法提取外周血T淋巴细胞,慢病毒转导法构建CAR-T细胞,并用流式细胞术检测T细胞CD3、CD4、CD8的表达情况。第4部分:靶向uPAR-CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤1、利用靶向uPAR-CAR-T细胞对uPAR阳性卵巢癌细胞系、uPAR阴性卵巢癌细胞系进行效应细胞、靶细胞共孵育实验;2、利用LDH kit方法检测效靶实验的肿瘤裂解率,寻找最佳效靶比;3、在最佳效靶比下,利用CBA kit结合流式细胞仪对于效靶实验的Th细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-5、IL-10进行检测;4、利用ELISA方法检测效靶实验下颗粒酶B的分泌,确定CAR-T发挥细胞毒性的基本规律。实验结果:第1部分:1、流式细胞术显示在不同病理类型的5种卵巢癌细胞系中,有4种细胞高表达uPAR;ES-2细胞是uPAR强阳性细胞系,表达率为95.2%;A2780是uPAR阴性细胞系;2、稳定转染过表达uPAR的A2780细胞及其对照细胞构建完成,过表达uPAR上调uPA、PAI-1的表达;靶向uPAR基因敲除的ES-2细胞及其对照细胞构建完成。稳转细胞系的uPAR蛋白、mRNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异。3、划痕实验和Transwell小室实验表明,uPAR的过表达促进卵巢癌细胞的迁移;相反,敲除uPAR则抑制卵巢癌细胞的转移能力。4、uPAR增强卵巢癌细胞的转移能力,上调间质细胞表型蛋白N-cadherin和vimentin并下调上皮细胞表型蛋白E-cadherin,促进上皮间质转化过程。第2部分:1、在裸鼠腹腔种植瘤模型中,基因敲除uPAR后,卵巢癌细胞系sh-ES-2形成腹腔种植瘤和产生腹水的能力均降低;2、基因敲除uPAR的ES-2细胞形成裸鼠卵巢癌模型后,其uPAR阴性表达的特征成功保留。HE染色显示uPAR阴性细胞形成的肿瘤病灶中细胞排列紧密、胞核深染、细胞形态呈卵圆形;uPAR阳性细胞形成的肿瘤病灶中细胞排列紊乱、细胞形态呈梭形。第3部分:1、靶向uPAR-CAR-T细胞的胞外识别区采用了uPAR的自然结合片段ATF,命名为ATF-CAR-T细胞。并采用了CD28-CD137-CD3ζ作为胞内区;2、利用外源性添加CD3、CD28抗体、IL-2因子的方法体外扩增、活化人外周血来源的淋巴细胞,CD3阳性比例为99.0%,且CD8阳性的比例明显升高;3、CAR慢病毒的对于T淋巴细胞转导效率为61.0%。第4部分:1、CAR-T细胞对uPAR阳性卵巢癌细胞具有显着杀伤作用,对于uPAR阴性卵巢癌细胞则不明显,说明CAR-T细胞发挥作用具有靶抗原特异性;采用不同梯度的效靶比1:1、5:1、10:1、20:1时发现,CAR-T的杀伤作用具有效应细胞剂量依赖性,随着效靶比的升高杀伤作用逐渐增强。在效靶比为10:1时,ATF-CAR-T细胞对ES-2的裂解率为65.2%±2.7%;在效靶比为20:1时,ATF-CAR-T细胞对ES-2的裂解率可达到70.6%±1.7%。考虑到成本和效果的平衡,10:1为最适宜的效靶比例。2、CAR-T细胞对uPAR阳性细胞产生特异性杀伤时,IL-2、IFN-γ、TNF细胞因子的分泌及颗粒酶B的释放显着升高。实验结论:1、分别成功构建了uPAR稳定过表达、敲除的卵巢癌细胞系;确定了过表达uPAR促进了uPA的上调;过表达uPAR基因增强卵巢癌细胞的转移能力,反之,敲除uPAR基因导致卵巢癌的转移能力降低;2、uPAR通过影响上皮间质转化过程促进了卵巢癌细胞发生转移。uPAR过表达促进间质细胞表型的产生,抑制上皮细胞表型的产生;反之,敲除uPAR基因具有相反作用;3、在裸鼠腹腔卵巢癌模型中,卵巢癌uPAR基因敲除导致腹腔病灶减少、腹水形成减少;4、效靶杀伤实验显示,CAR-T细胞对于卵巢癌细胞具有杀伤作用,且该作用具有uPAR靶抗原特异性和CAR-T细胞剂量依赖性,为临床试验的开展奠定了基础;5、CAR-T细胞发挥杀伤作用时,造成IFN-γ、TNF、IL-2和颗粒酶B释放显着升高。证实了靶向uPAR-CAR-T细胞治疗uPAR阳性卵巢癌的有效性。
顾凯娟[3]（2019）在《薏苡附子败酱对肠道腺瘤的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:大肠腺瘤是肠道良性的上皮肿瘤,也是大肠癌重要的癌前病变,超过90%的肠癌是由肠道腺瘤发展而来。中医药在防治大肠癌癌前病变方面具有良好的临床疗效。因此,本课题以肠道腺瘤为研究对象,采用《金匮要略》中治疗肠痈为主的薏苡附子败酱散进行干预,观察其对大肠腺瘤的发生、生长的影响,以及对APC基因突变自发形成肠道腺瘤小鼠的免疫调节作用;探讨其在T淋巴细胞调节大肠腺瘤的发生发展中的作用机制,为临床运用薏苡附子败酱散防治结大肠癌提供实验依据。方法:（1）将C57BL/6J雌性小鼠与APCMin/+雄性小鼠合笼繁殖,通过PCR核酸电泳实验进行基因型鉴定,从子代小鼠中挑选出APCMin/+小鼠用于后续实验。（2）将实验小鼠随机分组,连续灌胃20周,每周称量小鼠体重。20周后取小鼠外周血、脾、肠道和肠系膜组织,计数肠道腺瘤的数目,进行统计分析。（3）通过HE染色鉴定肠道腺瘤的癌变程度;通过免疫组化法检测肠道肿瘤组织中Ki67、PCNA的表达,用Brd U标记肠腺瘤增殖细胞。（4）通过荧光定量PCR技术分析APCMin/+小鼠肠道腺瘤中T淋巴细胞相关基因转录水平。（5）采用ELISA方法对APCMin/+小鼠外周血中免疫相关的细胞因子进行检测;采用流式细胞仪对小鼠脾、肠系膜、小肠固有层淋巴细胞中辅助性T淋巴细胞进行分选与分析。（6）采用CCK-8法检测薏苡附子败酱散对HCT116、MC-38细胞增殖的影响,以及使用台盼蓝试验检测薏苡附子败酱散对小鼠脾、外周血中淋巴细胞的影响。（7）通过台盼蓝实验、克隆形成实验和Western-blot实验检测薏苡附子败酱散和APCMin/+小鼠脾Treg细胞上清对MC-38细胞生长及相关蛋白表达的影响。结果:（1）与模型组小鼠比较,薏苡附子败酱散灌胃给药20周后,小肠腺瘤数、大肠腺瘤数均显着减少（P<0.01）。病理结果显示,模型组小鼠的大肠部位出现原位癌,小肠部位出现典型的腺癌伴局部黏膜下侵犯;薏苡附子败酱散组小鼠大肠未见原位癌,小肠则为高级别腺瘤多见,提示薏苡附子败酱散有效降低肠道腺瘤的恶变程度。IHC结果显示,与模型组比较,Ki67和PCNA蛋白阳性表达率明显降低（P<0.01）。（2）APCMin/+小鼠肠道腺瘤组织的荧光定量PCR结果显示,与模型组比较,治疗组的T-bet、ROR-γ的m RNA表达量升高,而Gata3、Foxp3的m RNA表达量下降（P<0.01）。APCMin/+小鼠脾、肠系膜淋巴细胞和小肠固有层淋巴细胞流式分析结果显示:与模型组比较,治疗组的Treg细胞明显减少;小鼠血清中的IL-10、IL-6的含量显着降低,IL-17A和TNF-α的含量明显升高（P<0.01）,且随着薏苡附子败酱散浓度的增加而呈现剂量依赖效应。提示薏苡附子败酱散可增强了Th1、Th17的细胞功能,而抑制了Th2、Treg的细胞功能。（3）体外CCK-8实验结果显示,薏苡附子败酱散对HCT116细胞和MC-38细胞生长无明显的抑制作用,差异无统计学意义（P>0.05）;台盼蓝实验检测薏苡附子败酱散对小鼠外周血和脾淋巴细胞的增殖无抑制作用。（4）台盼蓝活细胞计数实验和克隆形成实验显示,薏苡附子败酱散干预Treg细胞后的上清能够抑制MC-38细胞的增殖;Western-blot实验结果显示,与对照组相比,药物干预组的Ki67、PCNA蛋白表达下降,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）薏苡附子败酱散可改善了APCMin/+小鼠的生存质量,减少肠道腺瘤的数目。（2）薏苡附子败酱散能够降低APCMin/+小鼠肠道组织的Ki67和PCNA蛋白阳性表达率,并降低肠道腺瘤细胞的分化级别。（3）薏苡附子败酱散能够改变APCMin/+小鼠脾、肠系膜、肠道淋巴细胞相关因子的表达,增强Th1、Th17的细胞功能,抑制Th2、Treg的细胞功能。降低治疗组小鼠脾、肠系膜、小肠固有层淋巴细胞中辅助性T淋巴细胞的比例。下调IL-6、IL-10等促瘤细胞因子的表达,升高TNF-α、IL-17A等抑瘤细胞因子的表达。（4）薏苡附子败酱散可通过调节Treg细胞抑制MC-38细胞的生长及相关蛋白Ki67、PCNA的表达。
祝启成[4]（2019）在《硒对金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳腺上皮细胞增殖作用的机制研究》文中研究指明奶牛乳腺炎是奶牛产后常见疾病之一,可造成巨大的经济损失。病原菌入侵乳腺组织并在宿主细胞中生存,这一过程常伴随组织损伤。金黄色葡萄球菌（S.qaureus）是奶牛乳腺炎重要的致病菌之一。乳腺被感染损伤后,在各种信号通路和因子的作用下进行自我修复,以恢复乳腺的正常结构和功能。硒通常以硒蛋白的形式存在于动物机体内。已有多项研究证实,硒能够调控细胞的增殖,但运用硒对于奶牛乳腺上皮细胞（Bovine mammary epithelial cells,BMECs）的促增殖作用尚未见报道。本试验通过体外培养BMECs,研究Wnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR信号通路、细胞周期以及修复相关因子,探讨硒对BMECs增殖的作用机制,为奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。（1）为了研究硒对S.aureus感染BMECs增殖的影响采用流式细胞术检测细胞周期,分组同上。结果显示:硒添加后,与空白组相比,4μM硒添加,S期细胞极显着增多（p<0.01）;8μM硒使G0/G1期的细胞极显着减少（p<0.01）,G2/M期细胞极显着增多（p<0.01）,PI极显着升高（P<0.01）。当S.aureus感染细胞后,与空白组相比,S.aureus组S期细胞极显着下降（p<0.01）,G2/M期细胞显着增多（p<0.05）。与S.aureus组相比,2、4、8 μM硒与S.aureus共处理时,G0/G1期细胞显着或极显着下降（p<0.05或p<0.01）,S期细胞显着或极显着增多（p<0.05或p<0.01）,PI显着上升（p<0.05）。说明硒可以调控BMECs的细胞周期。当S.aureus感染BMECs时会阻滞BMECs细胞周期,而适当浓度的硒促进BMECs向S期和或G2/M期的转化,PI显着升高。（2）为研究硒对BMECs相关修复基因表达的影响,检测CTGF、EGFR、VEGF、TGF-β、ERα和ERβ基因的mRNA表达。结果显示:硒添加后,与空白组相比,2 μM硒促进BMECs中CTGF和VEGF基因表达水平升高,差异显着（p<0.05）;4 μM硒促进BMECs中CTGF、EGFR、TGF-β3、VEGF、ERα和ERβ基因表达水平上升,差异显着或极显着（p<0.05或p<0.01）;8μM 硒促进 BMECs 中 CTGF、EGFR、TGF-β3、VEGF、ERα 和 ERβ 基因表达水平极显着上升（p<0.01）。S.aureus感染细胞后,与空白组相比,S.aureus组CTGF、EGFR、VEGF、ERα、ERβ和TGF-β3基因表达上升,差异显着或极显着（p<0.05或p<0.01）。与S aureus组相比,2 μM 硒与 S.aureus 共处理组 EGFR、TGF-β3、VEGF 和ERβ基因表达上升,差异极显着（p<0.01）;4 μM硒与S.aureus共处理组VEGF、CTGF、EGFR和ERα基因表达水平升高,差异显着或极显着（p<0.05或p<0.01）;8μM硒与S.aureus共处理组EGFR、CTGF、VEGF和ERα基因表达水平升高,差异显着或极显着p<0.05或p<0.01)。说明硒可以调节BMECs中修复相关因子和受体的基因表达。当S.aureus感染BMECs,适当浓度的硒通过促进上述修复因子和受体基因的表达,影响组织和细胞的增殖和修复。（3）研究硒调控 Wnt/β-catenin 和 P13K/Akt/mTOR 信号通路在 S.aureus 感染BMECs过程中的作用机制。本试验以BMECs为研究对象,设置空白组、S.aureus组（MOI=1:1）、亚硒酸钠组（2、4、8 μM）,以及亚硒酸钠与S.aureus共处理组。运用Western Blot对Wnt/β-catenin 信号通路中的关键蛋白 β-catenin、Cyclin D1、c-Myc 以及 PI3K/Akt/mTOR 信号通路中PI3K和AKT的磷酸化水平进行检测,通过免疫荧光检测β-catenin蛋白的分布情况,探究硒对 BMECs和S.aureus感染 BMECs 情况下 Wnt/β-catenin 和 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的影响。结果显示:硒添加后,与空白组相比,4μM硒促进BMECs中Cyclin D1蛋白表达升高,差异极显着（p<0.01）;8μM硒促进BMECs中β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达升高,差异显着或极显着（p<0.05或p<0.01）,β-catenin入核增加。2μM硒促进BMECs中mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显着（P<0.05）;4和8μM硒促进BMECs中PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显着或极显着（p<0.05或p<0.01）。当S.aureus感染BMECs时,与空白组相比,β-catenin蛋白表达升高,差异极显着（p<0.01）,β-catenin入核增加;PI3K蛋白和Akt蛋白磷酸化水平升高,差异极显着（p<0.01）。与S.aureus 组相比,2、4 和 8 μM 硒添加,促进了S.aureus感染的 BMECs 中 β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达升高,其差异显着或极显着p<0.05或p<0.01),β-catenin入核增加;2μM硒与S.aureus共处理组mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显着（p<0.05）;4μM硒与S.aureus共处理组PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显着或极显着（p<0.05 或 p<0.01）。说明硒可以促进 BMECs 中 Wnt/β-catenin 和 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活。当S.aureus感染BMECs,适当浓度的硒可以促进BMECs中Wnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。综上所述,硒通过激活Wnt/β-catenint通路和PI3K/Akt/mTOR通路,调控相关修复因子和受体的表达,改善BMECs的细胞周期,促进了 BMECs的增殖和修复。研究结果为探究奶牛乳腺损伤的自我修复和乳腺炎的防治提供理论基础。
臧浩哲[5]（2019）在《硒对金黄色葡萄球菌感染的巨噬细胞自噬和氧化损伤的影响研究》文中指出巨噬细胞在免疫系统中扮演重要角色,保护机体抵抗病原体感染,调控组织炎症发展。自噬包括细胞将其内部错误折叠的蛋白质、功能异常或结构受损的细胞器及感染细胞的病原微生物等送至溶酶体进行降解等过程,是细胞抵御病原体感染的重要机制之一。本实验室前期研究发现奶牛乳腺炎的主要病原体一金黄色葡萄球菌（S.aureus）可诱导巨噬细胞发生自噬。硒是机体所必需的一种重要微量元素,那么硒对S.aureus感染的巨噬细胞自噬又有何种影响,目前为止尚不明确。课题前期研究表明,硒可有效缓解S.aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激,那么硒是否同样能缓解S.aureus感染的巨噬细胞氧化应激,有待于进一步研究。鉴于此,本试验以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,研究硒对S.aureus感染的巨噬细胞自噬及其相关信号通路（NF-κB和MAPK）的影响,同时探讨硒对S.aureus感染的巨噬细胞氧化应激及其相关信号通路（PI3K/Akt/mTOR）的影响。为研究硒对S.aureus感染的巨噬细胞自噬及其相关信号通路（NF-κB和MAPK）的影响,试验分为空白对照组、S.aurus感染组、补硒组和硒与.aurs共处理组。采用2μM的硒预孵育细胞12 h后,按MOI=1:1的比例接种S.aureus,45 min后终止处理进行相关研究。采用Western Blot检测细胞自噬相关蛋白Beclinl、p62、LC3和Atg5以及MAPK与NF-κB信号通路关键蛋白的表达水平;采用激光共聚焦法观察细胞内LC3蛋白聚点荧光强度;采用透射电镜观察细胞超微结构的变化,同时采用平板计数法研究S.aureus在巨噬细胞内的细菌载量变化。结果显示:与空白对照组相比,S.aureus感染巨噬细胞后,极显着提高自噬相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3ⅡI和p62的表达量（p<0.01）,激光共聚焦显微镜可见细胞内明显的LC3蛋白荧光聚点,透射电镜可见包裹S.aureus的囊泡及自噬体,极显着提高NF-κB和MAPK信号通路的关键蛋白磷酸化水平（p<0.01）;与S.aureus感染组相比,补硒后极显着升高LC3Ⅱ表达量（p<0.01）,极显着降低p62表达量（p<0.01）,激光共聚焦显微镜观察细胞内LC3蛋白荧光聚点增多,透射电镜可见包裹S.aureus的囊泡和自噬体,极显着降低NF-κB和MAPK信号通路的关键蛋白磷酸化水平（p<0.01）;同时,与S aureus感染组相比,补硒后,在1 h、2 h和3 h时细胞内细菌载量显着或极显着降低（p<0.05或p<0.01）。结果表明,硒能促进S.aureus感染的RAW264.7 巨噬细胞自噬,且能缓解自噬流阻滞,有利于巨噬细胞对S.aureus的清除,抑制胞内菌的增殖,并能显着抑制NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白表达水平。为研究S.aureus感染巨噬细胞后,硒对巨噬细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路及其氧化损伤的影响,细胞处理同上进行后续实验。Western Blot检测细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,流式细胞仪检测细胞ROS水平和线粒体膜电位的变化,比色法检测细胞T-SOD、CAT和GSH-Px的活性及MDA与T-AOC的水平。结果显示:与空白对照组相比,S.aureus感染后极显着提高细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平（p<0.01）;细胞内的ROS水平极显着升高（p<0.01）,细胞的线粒体膜电位极显着降低（p<0.01）;CAT、T-SOD、GSH-Px的活性均极显着下降（p<0.01）,MDA含量升高,T-AOC降低,差异均极显着（p<0.01）;与S.aureus感染组相比,补硒后极显着降低细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平（p<0.01）,细胞内的ROS水平极显着降低（p<0.01）,细胞的线粒体膜电位显着上升（p<0.05）,CAT、T-SOD和GSH-Px的活性均极显着上升（p<0.01）,MDA含量降低,T-AOC升高,差异均极显着（p<0.01）。结果表明,硒能显着提高S.aureus感染的RAW264.7细胞的抗氧化酶活性,降低ROS水平和MDA的生成,同时提高线粒体膜电位水平,并可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的蛋白表达,提高细胞的抗氧化能力。综上所述,硒可通过促进RAW264.7自噬,缓解自噬流的阻滞,抑制MAPK和NF-κB信号通路关键蛋白,降低炎症反应,同时抑制PI3K/Akt/mTOR,提高细胞的抗氧化能力,稳定线粒体膜电位,减少ROS产生,缓解S.aurus导致的细胞损伤。该研究为临床奶牛乳腺炎的防治提供了新的思路和方法。
林丹敏[6]（2019）在《霍乱毒素样抗肿瘤嵌合蛋白佐剂的设计、制备及活性评价》文中研究说明抗癌疫苗因其能够激活自身免疫系统靶向攻击表达有肿瘤特异性抗原的癌细胞而被广泛关注。含有肿瘤抗原表位肽的亚单位疫苗因其独特的优势而成为抗癌疫苗的研发热点。然而,抗原表位肽免疫原性弱,体内易被降解,常常介导机体耐受,难以达到治疗肿瘤的目的。有效发挥疫苗抗肿瘤效应的关键在于打破免疫耐受,激活体内细胞免疫应答。前列腺癌的微环境中存在多种特异性肿瘤相关抗原（TAAs）,是研究抗癌疫苗的理想目标。使用前列腺癌TAAs作为抗原表位来源设计亚单位疫苗,需要佐剂帮助表位肽激活抗原提呈细胞（APC）,并经交叉提呈途径激活细胞免疫。由于目前常用的佐剂-肽混合物不能确保将二者共定位于同一个APC,因而疫苗的抗肿瘤活性不高。因此,基于完整的霍乱毒素（CT）六聚体的结构,将鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF）通过基因工程方法融合表达到CTA2（霍乱毒素的A2亚基）的N端,并在霍乱毒素B亚基（CTB）的C端融合人源前列腺特异性膜抗原（PSMA）表位肽片段PSMA624-632,设计了CT样嵌合蛋白,并对其抗前列腺癌活性及机制进行了研究。研究方法:1.CT样嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2/（CTB-PSMA624-632）5的获得。构建表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统,分别以包涵体形式表达融合蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632,柱层析纯化后在体外用柠檬酸-Tris碱变复性方法组装六聚体嵌合蛋白。2.CT样嵌合蛋白的生物学活性测定。以骨髓增殖实验和GM1-ELISA实验分别验证嵌合蛋白的mGM-CSF和CTB的活性。3.表达人PSMA的小鼠前列腺癌细胞的构建。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因构建表达人PSMA蛋白的质粒载体,将其转染入小鼠前列腺癌细胞RM-1,获得重组细胞株RM-1-PSMA。4.体内实验评估CT样嵌合蛋白的抗肿瘤活性。C57BL/6J小鼠滴鼻免疫CT样嵌合蛋白5次后接种RM-1-PSMA细胞,观察小鼠肿瘤生长情况及小鼠生存状态,测定荷瘤小鼠血清细胞因子IFN-γ的水平。5.CT样嵌合蛋白帮助增强PSMA624-632肽免疫原性的效果测定。小鼠免疫5次后,分离脾淋巴细胞,体外加入PSMA624-632肽进行刺激,观察脾淋巴细胞受刺激后的增殖能力。6.CT样嵌合蛋白诱导DC细胞成熟的效果测定。制备骨髓源DC细胞,体外经CT样嵌合蛋白诱导刺激后,通过形态学和流式细胞术检测成熟DC细胞的数量和表型比例,探索免疫激活的机制。7.嵌合蛋白激活CTL细胞的效果测定。过继回输成熟DC至C57BL/6J小鼠,处死小鼠后纯化脾T细胞并将其诱导为抗原特异性CTL（效应细胞）,通过LDH试剂盒检测效应细胞与靶细胞（RM-1-PSMA细胞）的杀伤活性,测定培养上清液中分泌细胞因子IFN-γ的水平。研究结果:1.成功制备了CT样嵌合蛋白。2.CT样嵌合蛋白与市售mGM-CSF具有同样刺激髓系细胞增殖的能力,且保留有CTB亚基结合GM1的能力。3.成功构建了RM1-PSMA-EGFP细胞株,成为评估嵌合蛋白抗肿瘤效果的模式细胞。4.在动物模型上验证了CT样嵌合蛋白的抗肿瘤活性。5.机理研究证明,CT样嵌合蛋白增强了抗原肽PSMA624-632的免疫原性,使用该嵌合蛋白刺激DC后能有效激活DC细胞的成熟,显着增强其产生诱导CTL杀伤靶细胞和刺激IFN-γ分泌的能力。结论:本研究设计制备的CT样嵌合蛋白,可以显着提高其所含肿瘤抗原表位肽的免疫原性,增强其诱导DC细胞成熟,激活CTL细胞的能力,为肿瘤亚单位疫苗佐剂的开发提供了新的策略,所构建的表达人PSMA蛋白的小鼠前列腺癌细胞可以用于其他抗肿瘤疫苗活性筛选。
王钰[7]（2019）在《甲基硒酸抑制食管鳞癌细胞生长的机制研究》文中进行了进一步梳理硒是人体必不可少的微量元素之一。硒摄入的极度缺乏往往与某些疾病密切相关,如Keshan病、Kashin-Beck病以及地方性克汀病。多个流行病学以及实验室研究资料显示血清硒含量与肿瘤的发生呈负相关,且硒的补充能够降低包括食管癌在内的多种肿瘤的发生风险。在对硒的研究中,研究者们发现高剂量的含硒化合物能够特异性地杀伤肿瘤细胞而不会对正常细胞产生显着毒性。这使得含硒化合物有望成为治疗肿瘤的药物。目前含硒化合物的抗肿瘤研究还处于临床前阶段。甲基硒酸（MSA）是一种稳定的合成的单甲基含硒化合物,经细胞吸收后能够直接被还原为甲基硒醇,从而进一步发挥细胞毒性作用。目前,MSA的肿瘤杀伤效应已经在前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和透明细胞肾癌中得到证实,而在食管癌方面的研究还很少。我们实验室一直从事硒在食管癌方面的研究,已经证实MSA能够抑制食管鳞癌细胞的生长,本文将在食管鳞癌细胞系以及小鼠模型中进一步探究MSA抑制食管鳞癌细胞生长的作用机制。我们发现在食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE510中MSA能够显着下调表皮生长因子受体（EGFR）的蛋白水平,但不影响EGFR的mRNA水平。通过microRNA芯片的检测我们发现MSA能够上调miR-146a,而已有研究显示EGFR正是miR-146a的直接靶基因之一。通过miR-146a的互补序列antagomir-146a抑制miR-146a能够有效回复MSA对EGFR蛋白的下调作用。我们还利用4-硝基喹啉-氧化物（4NQO）诱导的小鼠食管癌模型探究MSA在体内对食管癌的抑制作用。结果显示MSA处理组的小鼠的肿瘤数量和肿瘤负荷以及EGFR的表达均显着低于对照组。此外,我们还发现MSA能够下调食管鳞癌细胞系IL-6的外泌以及4NQO诱导的小鼠血清中IL-6的含量。为进一步探究IL-6与MSA抑瘤作用之间的关系,我们用IL-6基因敲除小鼠进行4NQO诱导食管癌模型的构建,比较MSA的抑瘤作用,结果显示虽然IL-6的缺失不会影响4NQO诱导的食管癌的发生,但IL-6的缺失能够拮抗MSA的抑瘤效果。尽管已有很多硒在营养层面对免疫系统的调节作用的相关研究,但对于作为抗癌药物的含硒化合物对肿瘤微环境的调控研究还很少。在此,我们通过免疫组化对4NQO诱导的小鼠食管癌模型中的肿瘤微环境进行检测,发现MSA能够减弱巨噬细胞和中性粒细胞的浸润同时增加Granzyme B的表达。而在IL-6缺失的小鼠中MSA对肿瘤微环境的上述调节作用明显减弱。综上所述,本研究表明MSA可通过上调miR-146a抑制EGFR的蛋白水平,进而抑制EGFR信号通路并下调IL-6的表达,从而抑制食管鳞癌细胞的生长。在肿瘤微环境中,MSA能够减少巨噬细胞以及中性粒细胞的浸润同时增加Granzyme B的表达,且MSA对微环境的调节作用依赖于IL-6。
邓新娜[8]（2019）在《NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体内外研究》文中研究指明结肠癌（colon cancer）是较为常见的消化道恶性肿瘤之一,具有治疗难度大、发病率高及死亡率高等特点。结肠癌的发病率在消化道肿瘤中位于第2位,并且在全球范围内呈现逐渐攀升趋势。对于早期或局部转移患者,如果能获得根治性手术的机会,预后一般较好;对于晚期患者,常常丧失根治性手术的机会,而是采用放疗、化疗、对症支持治疗等治疗手段,预后一般较差。因此,安全、有效的治疗策略对于结肠癌治疗来说是很有必要的。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy）是肿瘤免疫治疗的重要手段之一。嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T）是一类经过整合嵌合抗原受体（chimeric Antigen Receptor,CAR）基因修饰,能够特异性消灭肿瘤细胞的免疫细胞。CAR可以特异性识别肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen,TAA）或者肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigen,TSA）,随后将信号传递至T细胞,引起T细胞激活和增殖,从而有效杀伤肿瘤细胞。2017年美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）已经先后批准了诺华制药公司的CAR-T药物Kymriah和Kite制药公司的Yescarta上市,用于血液系统疾病的治疗并取得了惊人成绩。近年来的研究发现,CAR-T免疫疗法对实体瘤也有一定的治疗效果。NKG2D（natural killer group 2 member D）是NK细胞凝集素样受体家族Klrk1基因编码的一种重要激活受体。它主要存在于小鼠和人的NK细胞上,在人的CD8+T细胞上组成性表达,但仅在小鼠T细胞活化时表达。人类NKG2D能够识别多种高度多样化的配体,包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP-2、ULBP-3、ULBP-4、ULBP5和ULBP6等。一般情况下,NKG2D配体在正常细胞上是不存在的,但可以被各种刺激所诱导。在肿瘤细胞上,NKG2D配体与NKG2D结合,随后激活NK细胞并参与免疫细胞介导的杀伤作用。由此可见,NKG2D配体可以作为CAR-T细胞治疗的高效靶蛋白。在本研究中,我们将利用非病毒微环DNA载体构建NKG2D CAR,并将其转染T细胞,获得第三代NKG2D CAR-T细胞,并探讨该细胞对人结肠癌细胞的体外、体内杀伤作用。非病毒载体可以避免病毒复制、细菌复制等风险,具有很好的安全性。因此,本研究将为结肠癌乃至其他实体瘤的治疗提供新的作用靶点和思路,具有重要的临床应用价值。第一部分:NKG2D嵌合抗原受体T细胞的制备和功能检测目的:构建嵌合抗原受体NKG2D CAR微环DNA,制备和验证NKG2D CAR-T细胞。方法:根据参考文献和Genebank,确定NKG2D CAR的氨基酸序列。按照CD8α信号肽序列、人NKG2D胞外区序列、人CD8α铰链区序列、人CD28跨膜区序列和胞内区序列、人4-1BB胞内信号序列、人CD3ζ胞内信号序列的顺序确定NKG2D CAR的结构。此外,分别将EcoRI和BamHI两个酶切位点放置在整段NKG2D CAR基因序列的前端和后端,形成NKG2D CAR的全基因序列。合成NKG2D CAR全基因序列,并连接到pUC57大肠杆菌基因克隆质粒中,命名为NKG2D CAR-pUC57质粒。对NKG2D CAR-pUC57进行EcoRI和BamHI双酶切,使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,回收NKG2D CAR片段。将NKG2D CAR片段与亲本微环DNA进行连接反应后,转化到特殊感受态菌ZYCY10P3S2T E.coli中,在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养。挑取2个单克隆菌落,摇菌,提取NKG2D CAR微环DNA质粒。对质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。利用密度梯度离心法从人外周血中分离出T淋巴细胞,采用电穿孔法将NKG2D微环DNA质粒转到T淋巴细胞中,获得NKG2D CAR-T细胞。每隔2天传代或换液一次,换液前进行细胞计数。利用台盼蓝染色计算细胞存活率,利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）表达情况,利用共聚焦显微镜观察细胞的NKG2D和GFP表达情况以及细胞定位,利用流式细胞术观察细胞的NKG2D和GFP表达情况,利用Western blotting检测细胞的CD3ζ表达情况,利用流式细胞仪检测细胞中CD4+和CD8+细胞亚群的比例。结果:1.琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,凝胶中可见一个约1200bp大小的条带,条带大小与实验设计的NKG2D CAR一致,此即为NKG2D CAR片段,提示NKG2D CAR-pUC57质粒构建成功。2.倒置培养过夜后,LB固体培养基中肉眼可见密布的单克隆菌落,提示NKG2D CAR亲本微环DNA质粒顺利转化到感受态细菌中,获得卡那霉素抗性。3.提取2个单克隆菌落质粒,双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,二号单克隆菌落所提质粒呈现一个约1200bp大小的条带,条带大小与实验设计的NKG2D CAR一致,提示二号菌落所提取得NKG2D CAR微环DNA质粒包含NKG2D CAR片段,NKG2D CAR微环DNA质粒构建成功。基因测序结果显示,NKG2D CAR微环DNA中的目的片段未发生基因突变,并包括完整基因序列。4.经过FICOLL分离液处理后,每个人外周血去白细胞过滤器可以获得3×106至5×106个淋巴细胞。倒置显微镜下观察可见,淋巴细胞悬浮生长,呈圆形或椭圆形;另有少量体积较大、形态不规则细胞呈贴壁生长。细胞培养12h之后,淋巴细胞开始聚集成团、形成增殖集落;同时,体积较大、形态不规则细胞的数量明显减少。5.电转后,台盼蓝染色结果显示,正常T细胞的存活率达97%,NKG2D CAR-T细胞的存活率达76%。由此可见电穿孔法对细胞的存活率有一定影响。6.细胞计数结果显示,正常T细胞和NKG2D CAR-T细胞在培养12天后显示出相似的扩增率,扩增比例均达到5-6倍;此外,NKG2D CAR-T细胞在第2-4天的数量显着下降,这可能是电穿孔导致的细胞损伤。7.荧光显微镜观察结果显示,GFP在NKG2D CAR微环DNA载体转染T细胞后电转24h开始出现明显表达,转染后48h达到高峰表达,并至少持续到72h以上。8.共聚焦显微镜检测结果显示,NKG2D和GFP在CAR-T细胞中的表达明显强于正常对照组T细胞,而且NKG2D蛋白主要定位于细胞膜和胞浆,提示NKG2D CAR可以顺利折叠并与T细胞膜特异性结合。9.Western blotting检测结果显示,NKG2D CAR-T细胞和正常对照组T细胞均具有内源性CD3ζ表达,但是NKG2D CAR-T细胞还有外源性CD3ζ表达,而正常对照组T细胞无外源性CD3ζ表达。10.流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组T细胞相比,CD4+的NKG2D CAR-T细胞比例略有升高,CD8+的NKG2D CAR-T细胞比例略有降低。小结:1.通过基因重组技术,成功制备了NKG2D CAR微环DNA质粒。2.通过电穿孔技术,成功地将NKG2D CAR微环DNA质粒转到人外周血淋巴细胞中并在体外培养、扩增,成功获得NKG2D CAR-T细胞。3.人结肠癌细胞LS174T表达高水平的MICA和ULBP-3,HCT-116细胞表达高水平的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3。第二部分:NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体外研究目的:观察CAR-T细胞的功能及对人结肠癌细胞株的体外杀伤作用。方法:复苏人结肠癌细胞株LS174T和HCT-116到细胞培养瓶中,加入含1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞形态,待细胞充分贴壁后,每2天更换一次培养基。细胞贴壁生长至90%融合度时,根据1:3-1:4的扩增倍数,采用胰蛋白酶EDTA消化法进行细胞传代。使用流式细胞仪检测MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2/5/6和ULBP-3等NKG2D配体在人结肠癌细胞株LS174T和HCT-116的表达情况。将正常T细胞或NKG2D CAR-T细胞分别与LS174T或HCT-116细胞按照5:1、10:1和20:1的效应细胞:靶细胞比例（effector:target cell ratios,E:T）共同培养24h,使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（LDH Cytotoxicity Assay Kit）,分别检测NKG2D CAR-T细胞对LS174T和HCT-116的细胞毒性。此外,使用酶联免疫吸附检测试剂盒（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,分别检测NKG2D CAR-T与LS174T或HCT-116结肠癌共培养时IL-2和IFN-γ等细胞因子的释放情况。结果:1.流式细胞仪检测结果显示,人结肠癌细胞LS174T表面的MICA和ULBP-3高表达,MICB、ULBP1和ULBP-2/5/6低表达。2.流式细胞仪检测结果显示,人结肠癌细胞HCT-116表面的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3高表达,ULBP1低表达。3.乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果显示,与正常对照T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞对LS174T细胞在各E:T均表现出更强的杀伤作用。当E:T为20:1时,NKG2D CAR-T细胞对LS174T的杀伤效果最佳,杀伤率达到47%。4.乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果显示,与正常对照T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞对HCT-116细胞在各E:T均表现出更强的杀伤作用。当E:T为20:1时,NKG2D CAR-T细胞对HCT-116的杀伤效果最佳,杀伤率达到52%。5.ELISA检测结果显示,与正常对照组T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞能释放出大量IL-2。其中,NKG2D CAR-T细胞与LS174T细胞共培养24h,培养基中IL-2的浓度达到为3265.83±840.45pg/mL;NKG2D CAR-T细胞与HCT-116细胞共培养24h,培养基中IL-2的浓度达到为4855.71±1166.61pg/mL。6.ELISA检测结果显示,与正常对照组T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞能释放出大量IFN-γ。其中,NKG2D CAR-T细胞与LS174T细胞共培养24h,培养基中IFN-γ的浓度达到为8621.43±1594.91pg/mL;NKG2D CAR-T细胞与HCT-116细胞共培养24h,培养基中IFN-γ的浓度达到为10757.14±2163.74pg/mL。小结:1.体外研究结果显示,NKG2D CAR-T细胞对人结肠癌细胞LS174T和HCT-116均具有良好的杀伤作用,且杀伤效率与效靶比呈正相关。2.NKG2D CAR-T细胞能够分泌大量IL-2和IFN-γ等细胞因子。第三部分:NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体内研究目的:建立HCT-116异种移植NOD/SCID小鼠模型,观察NKG2D CAR-T细胞在体内对人结肠癌细胞杀伤作用。方法:复苏人结肠癌细胞HCT-116-Luc到培养瓶中,加入含1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察结肠癌细胞的形态,待细胞充分贴壁后,每2天更换一次培养基。细胞贴壁生长至90%融合度时,根据1:3-1:4的扩增倍数,采用胰蛋白酶EDTA消化法进行细胞传代。向刚刚传代的人结肠癌细胞株HCT-116-Luc的培养基中加入潮霉素B溶液,经过3-4次传代,筛选具有潮霉素B抗性的HCT-116-Luc细胞。在无特定病原体动物（Specific Pathogen Free,SPF）级动物实验室饲养雄性NOD/SCID小鼠（non-obese diabetic/severe-combined immunodeficient mice,非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠）,于小鼠右肩背皮下注射HCT-116-Luc肿瘤细胞悬液（1×106个/只）,建立小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。当肿瘤负荷达到150-250mm3时,根据肿瘤体积大小和体重,结合实验设计方案,将小鼠随机分为3组:（1）正常对照组（control group）:NOD/SCID小鼠5只,正常饲养,分别于治疗第0天和第7天给予PBS注射、干预;（2）T细胞治疗组（T cells group）:NOD/SCID小鼠5只,分别于治疗第0天和第7天给予正常T细胞治疗、干预;（3）NKG2D CAR-T细胞治疗组（NKG2D CAR-T cells group）:NOD/SCID小鼠5只,分别于治疗第0天和第7天给予NKG2D CAR-T细胞治疗、干预。治疗期间观察小鼠精神状态、毛发情况以及是否存在腹泻、治疗后过敏反应等情况,记录小鼠生存时间。每5天记录一次小鼠体重和肿瘤体积,绘制小鼠体重及肿瘤生长曲线。于治疗后第20天,利用小鼠活体成像仪分析观察肿瘤生长情况。于治疗第25天,处死小鼠,切取、称量肿瘤以及心、肝、肺、脾、肾等重要器官、组织,置于4%多聚甲醛通用型组织固定液,用于免疫组化检测和常规苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin,HE）。结果:1.通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc,成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型,12天全部成瘤。将小鼠分为正常对照组、T细胞治疗组和NKG2D CAR-T细胞治疗组。2.体重测量结果显示,治疗期间,正常对照组小鼠体重略有升高,T细胞治疗组小鼠体重变化不明显,但是NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠体重有所下降。3.活体动物成像结果显示,与正常对照组和T细胞治疗组相比,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤生长受到明显抑制。4.游标卡尺测量结果显示,治疗期间,正常对照组、T细胞治疗组小鼠的肿瘤体积进一步快速增加,但是NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤体积增加速度明显减缓。5.生存时间记录结果显示,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠生存时间长于正常对照组和T细胞治疗组。6.免疫组织化学检测结果显示,与正常对照组和T细胞治疗组相比,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤组织周围有大量淋巴细胞浸润。7.HE染色检测结果显示,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织切片均未发现明显的形态学改变,具有很好的安全性。小结:1.通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc,成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。2.NKG2D CAR-T细胞治疗导致小鼠体重下降、生存时间延长,肿瘤生长受到抑制。3.NKG2D CAR-T细胞能够浸润到小鼠的肿瘤组织周围,未导致心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等重要脏器的形态学改变,具有很好的安全性。结论:1.通过基因重组技术,成功制备了NKG2D CAR微环DNA质粒。通过电穿孔技术,成功地将NKG2D CAR微环DNA质粒转到人外周血淋巴细胞中并在体外培养、扩增,成功获得NKG2D CAR-T细胞。2.人结肠癌细胞LS174T表达高水平的MICA和ULBP-3,HCT-116细胞表达高水平的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3。3.体外研究结果显示,NKG2D CAR-T细胞对人结肠癌细胞LS174T和HCT-116均具有良好的杀伤作用,且杀伤效率与效靶比呈正相关;同时NKG2D CAR-T细胞能够分泌大量IL-2和IFN-γ等细胞因子。4.体内研究结果显示,通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc,成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。NKG2D CAR-T细胞治疗导致小鼠体重下降、生存时间延长,肿瘤生长受到抑制。NKG2D CAR-T细胞能够浸润到小鼠的肿瘤组织周围,未导致心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等重要脏器的形态学改变,具有很好的安全性。
韩锦胜[9]（2017）在《PSCA靶向嵌合抗原受体T细胞对前列腺癌抗肿瘤治疗的临床前研究》文中研究说明前列腺癌是男性高发的恶性肿瘤,在西方国家其死亡率位居于癌症死亡率第二位,在我国也呈逐年增加趋势。前列腺特异抗原PSA的发现提高了前列腺癌的确诊率,但是并没有降低死亡风险。早期前列腺癌是可以治愈的,但是复发和晚期转移的前列腺癌是不可治愈的,治疗手段上包括抗雄激素治疗,放射治疗、化学药物治疗等方法收到的治疗效果欠佳。近几年免疫治疗成为肿瘤治疗的新方法。本研究希望采用细胞免疫疗法提高前列腺癌的治疗效果。过继性嵌合抗原受体修饰的T细胞回输成功的治疗了难治性血液恶性肿瘤,这也暗示了这种方法在实体恶性肿瘤治疗应用的可能性。靶标抗原的选择极其重要,如前列腺癌表达很多特异性抗原,并且不在其他组织表达。这些组织限制性抗原可能成为CAR T细胞治疗前列腺癌的潜在靶标。以往的临床前研究中,已使用PSMA和PSCA作为CAR T细胞的靶标,但是治疗效果欠佳。所以本次研究全新设计了靶向PSCA的第三代CAR T细胞,采用了非病毒载体微环DNA作为转染的质粒,通过电转染的方法制造出全新的靶向PSCA的CAR T细胞,并对其生物功能和表达情况进行研究。获得靶向PSCA的CAR-T细胞后,检测其杀伤活性最直接的办法就是对靶细胞进行体外杀伤实验。第二部分实验设计了PSCA-CAR T细胞不同效靶比分别对靶细胞RT4和PC-3M细胞株进行体外杀伤实验,同时检测了细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。体外的实验结果为体内实验提供了良好的基础,但是体外和体内环境因素的差异可能对PSCA-CAR T细胞发挥作用造成不同的影响,为此第三部分实验建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,模拟人类肿瘤患者的体内环境,建造前列腺癌移植瘤小鼠模型后,给予PSCA-CAR T细胞治疗,观察肿瘤的体积情况,检测PSCA-CAR T细胞在体内的存活情况,以及体内IFN-γ和IL-2细胞因子分泌水平,评价体内抗肿瘤的疗效。第一部分第三代嵌合抗原受体PSCA scFv-CD28-CD137-CD3ζ的构建及CAR T细胞转染的实验研究目的:构建第三代嵌合抗原受体PSCA scFv-CD28-CD137-CD3ζ（PSCA-CAR）的结构,连接至微环DNA载体中,并对T细胞进行转染,检测CAR T细胞的生物功能。方法:通过全基因序列合成PSCA-CAR的结构并构建于pUC57载体中,通过基因工程技术将PSCA-CAR结构连接到亲本微环DNA载体中,提取含有目的片段的微环DNA并使用电转染的方法转染T细胞,获得PSCA-CAR T细胞。观察微环DNA转染T细胞的效果及转染效率,电转染对T细胞存活率的影响,微环DNA和电转染方法对T细胞表型的影响,流式细胞术检测PSCA-CAR在T细胞表面的表达情况,Western blot检测PSCA-CAR蛋白在T细胞的表达情况。结果:1成功的将PSCA-CAR结构通过基因工程技术连接到亲本微环DNA载体中,提取含有目的片段的微环DNA质粒,通过基因测序未发现目的片段有基因突变。2通过电转染的方法成功的将微环DNA转染了人T淋巴细胞,获得第三代PSCA-CAR T细胞,转染效率约58%,电转染后T细胞的存活率约60.2%。3电转染的方法对PSCA-CAR T细胞的增殖造成短暂的影响,经过后期细胞因子刺激培养后增殖活性恢复。4电转染的方法以及微环DNA载体对PSCA-CAR T细胞的表面分子表型没有影响。5流式细胞术检测了PSCA-CAR在T细胞表面的表达最高达88.96%。6 Western blot检测到T细胞中PSCA-CAR蛋白的表达。第二部分PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的实验研究目的:研究PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的作用。方法:PSCA-CAR T细胞分别与细胞表面不表达PSCA的PC-3M细胞株及天然高表达PSCA的RT4细胞株体外共培养,CCK8法检测CAR T细胞的体外选择性杀伤活性,ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。结果:1 PSCA-CAR T细胞对PSCA阳性表达的RT4细胞有较高杀伤效率,对不表达PSCA的PC-3M细胞的杀伤效率与普通T细胞相比无明显差别。2 PSCA阳性的RT4细胞可以明显刺激PSCA-CAR T细胞分泌大量IFN-γ和IL-2,而与不表达PSCA的PC-3M细胞共培养后IFN-γ和IL-2的分泌量极低,有明显统计学差异。第三部分PSCA-CAR T细胞体内抗肿瘤的实验研究目的:探讨PSCA-CAR T细胞对前列腺癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法构建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达情况,PCR法检测人源化小鼠骨髓细胞中人特异性ALU基因序列的表达情况。利用人源化的NOD/SCID小鼠制造前列腺癌移植瘤动物模型,成瘤后将动物随机分为三组进行试验,分别给予盐水、普通T细胞、PSCA-CAR T细胞治疗两次,观察肿瘤的生长体积。治疗4周后用流式细胞术检测PSCA-CAR T细胞在小鼠外周血的比例,ELISA法检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的分泌量。肿瘤标本进行病理切片,并免疫组化标记PSCA及人CD3的表达情况。结果:1人源化的NOD/SCID小鼠外周血中检测到人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达,表达比例在正常成人水平。PCR法检测到人特异性ALU基因序列在人源化小鼠骨髓细胞中表达。2 PSCA-CAR T细胞治疗组小鼠肿瘤体积明显缩小,与盐水组及T细胞组相比统计学分析有显着差异。3治疗4周后采用流式细胞术仍能检测到PSCA-CAR T细胞治疗组小鼠外周血中PSCA-CAR的表达,ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-2的分泌量与其他组比较也明显升高,统计学分析有显着差异。4各组前列腺癌肿瘤标本免疫组化结果均高表达PSCA抗原,盐水治疗组的肿瘤组织无CD3表达,T细胞治疗组可见少量散在CD3表达,PSCA-CAR T细胞治疗组可见强烈的CD3表达。结论:1携带PSCA-CAR结构的微环DNA载体通过电转染的方法成功转染了人T淋巴细胞获得第三代PSCA-CAR T细胞,并且PSCA-CAR在T细胞上高水平表达。2 PSCA-CAR T细胞具有抗原依赖性激活的特征,体外在PSCA抗原的刺激下有强烈的抗肿瘤作用,并且分泌大量的IFN-γ及IL-2。3采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并在此基础上制造人前列腺癌移植瘤模型。PSCA-CAR T细胞可以在体内有效聚集到肿瘤组织发挥良好的抗肿瘤作用,使肿瘤体积明显缩小。
关少培[10]（2016）在《趋化因子CCL19对大肠癌增殖的作用》文中研究指明目的:研究CCL19对人大肠癌细胞增殖的影响方法:构建慢病毒LV5-CCL19转染肠癌细胞株,获得过表达CCL19肠癌细胞株SW1116-CCL19和SW480-CCL19。通过细胞增殖实验（CCK-8法）、流式细胞技术、软琼脂克隆形成试验,小鼠体内成瘤实验,分别检测上调CCL19后对SW1116及SW480细胞增殖、细胞周期的影响。免疫印迹检测细胞内以及胞浆内,胞核内β-catenin、cyclinD1表达。免疫组化检测临床标本中CCL19与β-catenin表达关系。结果:实时定量PCR及免疫印迹法验证LV5-EF1a-Puro-CCL19慢病毒载体系统稳定上调大肠癌细胞株SW1116及SW480的CCL19表达。增殖实验,软琼脂克隆形成实验提示CCL19高表达后肿瘤细胞增殖能力相比阴性对照组及空白对照组受到抑制。流式细胞周期及凋亡检测显示上调CCL19后,将大肠癌细胞阻滞于G1期,抑制肿瘤细胞增殖。凋亡检测结果显示,上调CCL19后,肿瘤细胞凋亡相比阴性对照增加。免疫印迹结果表明,CCL19过表达后细胞内总β-catenin表达量下降。细胞胞浆内β-catenin表达量无明显变化,胞核内β-catenin表达量相比阴性对照组明显下降。裸鼠体内成瘤实验结果显示,上调CCL19后,肿瘤生长较阴性对照组受到抑制。临床标本结果显示,CCL19表达与β-catenin成负相关关系,CCL19高表达的病人相比CCL19低表达的病人肿瘤更小,浸润层次更浅。结论:我们的研究证实,CCL19在大肠癌的增殖中起着抑制作用。
二、硒对淋巴细胞杀伤大肠癌细胞的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、硒对淋巴细胞杀伤大肠癌细胞的影响（论文提纲范文）
（1）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）uPAR促进卵巢癌发生转移及靶向uPAR-CAR-T细胞治疗卵巢癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 综述一 uPAR在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.1.1 uPAR的基本结构与主要功能 |
| 1.1.2 uPAR在恶性肿瘤中的关键作用 |
| 1.1.3 uPAR靶向治疗的现有方法 |
| 1.1.4 结论 |
| 1.2 综述二 CAR-T细胞治疗恶性实体肿瘤的现状与未来 |
| 1.2.1 CAR-T细胞的基本结构和作用原理 |
| 1.2.2 CAR-T细胞在以卵巢癌为代表的实体瘤中的应用 |
| 1.2.3 CAR-T细胞治疗实体瘤的困境与改进 |
| 1.2.4 结论 |
| 第2章 uPAR增强卵巢癌的转移能力的体外实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器及设备 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 流式细胞术检测卵巢癌细胞uPAR的表达 |
| 2.3.3 过表达uPAR质粒载体的构建及转染 |
| 2.3.4 短发夹RNA慢病毒载体的构建及转导 |
| 2.3.5 定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 2.3.6 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 2.3.7 卵巢癌细胞划痕实验 |
| 2.3.8 卵巢癌细胞迁移实验 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 细胞培养基中支原体检测 |
| 2.4.2 uPAR在五种卵巢癌细胞系中的表达 |
| 2.4.3 稳定uPAR过表达、uPAR敲除细胞系的鉴定 |
| 2.4.4 uPAR过表达或敲除对uPA和 PAI-1 表达的影响 |
| 2.4.5 uPAR过表达或敲除对卵巢癌细胞转移能力的影响 |
| 2.4.6 uPAR过表达或敲除对上皮间质转化的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 uPAR促进卵巢癌腹腔种植转移和腹水形成的体内实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器及设备 |
| 3.1.2 主要试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验流程 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 卵巢癌细胞悬液的准备 |
| 3.3.2 裸鼠腹腔移植瘤模型的建立 |
| 3.3.3 裸鼠体重及腹围的测量 |
| 3.3.4 苏木精和伊红染色技术(Hematoxylin and eosin dyeing techniques,HE) |
| 3.3.5 免疫组织化学染色技术 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 卵巢癌细胞u PAR基因敲除对裸鼠体重的影响 |
| 3.4.2 卵巢癌细胞u PAR基因敲除对裸鼠腹围的影响 |
| 3.4.3 裸鼠腹腔种植瘤模型的建立 |
| 3.4.4 裸鼠组织HE染色结果 |
| 3.4.5 裸鼠组织免疫组化染色结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 靶向uPAR-CAR-T细胞的构建与制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器及设备 |
| 4.1.2 实验试剂及耗材 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 慢病毒ATF-CAR的构建 |
| 4.3.2 外周血来源的T淋巴细胞的获取 |
| 4.3.3 T淋巴细胞的慢病毒转导 |
| 4.3.4 流式细胞术对T细胞的检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 靶向uPAR-CAR慢病毒的基本结构 |
| 4.4.2 T淋巴细胞体外分离、培养及扩增前后表型变化 |
| 4.4.3 T淋巴细胞的慢病毒转导效率 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 靶向uPAR-CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 仪器及设备 |
| 5.1.2 实验试剂及耗材 |
| 5.2 实验流程 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1效靶杀伤实验 |
| 5.3.2 细胞因子检测 |
| 5.3.3 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 ATF-CAR-T细胞对卵巢癌细胞的体外细胞毒性 |
| 5.4.2 杀伤作用相关细胞因子的分泌 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）薏苡附子败酱对肠道腺瘤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂的配制 |
| 1.5 中药复方的提取 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 薏苡附子败酱散药物活性成分分析 |
| 2.2 APC~(Min/+)小鼠繁殖 |
| 2.3 APC~(Min/+)小鼠基因型鉴定 |
| 2.4 APC~(Min/+)小鼠实验分组和给药方案 |
| 2.5 APC~(Min/+)小鼠的一般情况观察和体重测定 |
| 2.6 APC~(Min/+)小鼠解剖和取材 |
| 2.7 APC~(Min/+)小鼠肠道组织病理观察 |
| 2.8 APC~(Min/+)小鼠肠道组织Ki67、PCNA蛋白免疫组化检测 |
| 2.9 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱散成分分析结果 |
| 3.2 APC~(Min/+)小鼠基因型鉴定结果 |
| 3.3 本实验设计 |
| 3.4 APC~(Min/+)小鼠生长情况 |
| 3.5 APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤生物学特征及形成规律 |
| 3.6 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤组织病理的影响 |
| 3.7 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤Ki67、PCNA蛋白表达的影响 |
| 4.分析与讨论 |
| 第二部分 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠T淋巴细胞的影响及相关因子的调节作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 小鼠外周血及组织的获得 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 APC~(Min/+)小鼠脾脏指数 |
| 2.2 APC~(Min/+)小鼠脾淋巴细胞分离 |
| 2.3 APC~(Min/+)小鼠肠系膜取材以及细胞制备 |
| 2.4 APC~(Min/+)小鼠小肠固有层淋巴细胞的分离 |
| 2.5 流式细胞仪检测APC~(Min/+)小鼠淋巴细胞Treg细胞比例 |
| 2.6 ELISA 法检测小鼠血清细胞因子 |
| 2.7 荧光定量PCR检测APC~(Min/+)小鼠T淋巴细胞相关转录因子 |
| 2.8 统计方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠脾脏指数的影响 |
| 3.2 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠Treg细胞表达的影响 |
| 3.3 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠脾、肠系膜、小肠固有层 Treg 细胞表达的影响 |
| 4.分析讨论 |
| 第三部分 薏苡附子败酱散对大肠癌细胞生长的影响和对APC~(Min/+)小鼠脾脏淋巴细胞的调节作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 CCK-8法检测薏苡附子败酱散对大肠癌细胞生长的作用. |
| 2.3 分离APC~(Min/+)小鼠脾淋巴细胞 |
| 2.4 分离APC~(Min/+)小鼠外周血淋巴细胞 |
| 2.5 台盼蓝方法检测薏苡附子败酱对APC~(Min/+)小鼠淋巴细胞增殖的作用 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱散对HCT116细胞增殖的影响 |
| 3.2 薏苡附子败酱散对MC-38细胞增殖的影响 |
| 3.3 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠脾淋巴细胞的影响 |
| 3.4 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠外周血淋巴细胞的影响 |
| 4.分析讨论 |
| 第四部分 薏苡附子败酱散调节肿瘤细胞生长的机制探讨 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CD4~+CD25~+Treg淋巴细胞分选 |
| 2.2 收集薏苡附子败酱散与APC~(Min/+)小鼠Treg细胞的上清 |
| 2.3 台盼蓝实验检测薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞增殖的影响 |
| 2.4 克隆形成实验检测薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38细胞增殖的影响 |
| 2.5 Western blot实验检测薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞Ki67、PCNA蛋白表达的影响 |
| 2.6 统计方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞增殖的影响 |
| 3.2 薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞克隆形成的影响 |
| 3.3 薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞Ki67,PCNA蛋白表达的影响 |
| 4.分析讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 CD4~+T 淋巴细胞与肿瘤发生 |
| 参考文献 |
| 论文发表及获奖情况 |
（4）硒对金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳腺上皮细胞增殖作用的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 硒与奶牛乳腺炎 |
| 1.1 奶牛乳腺炎的病因及危害 |
| 1.2 奶牛乳腺组织的免疫机制 |
| 1.2.1 解剖学屏障 |
| 1.2.2 病原体识别 |
| 1.2.3 炎症的发生 |
| 1.2.4 获得性免疫 |
| 1.3 硒与奶牛乳腺炎 |
| 1.3.1 硒的特性与生物学作用 |
| 1.3.2 硒与细胞免疫反应 |
| 1.3.3 硒与体液免疫反应 |
| 第二章 硒与Wnt/β-catenin信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路 |
| 2.1 Wnt/β-catenin信号通路研究进展 |
| 2.1.1 Wnt/β-catenin信号通路概述 |
| 2.1.2 Wnt/β-catenin信号通路的转导 |
| 2.1.3 Wnt/β-catenin信号通路对细胞增殖、分化的影响 |
| 2.2 PI3K/Akt/mTOR信号通路研究进展 |
| 2.2.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路概述 |
| 2.2.2 PI3K/Akt/mTOR信号通路的转导 |
| 2.3 硒对Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 试验一 硒对S.aureus感染BMECs增殖和修复相关基因的影响 |
| 1. 材料与仪器 |
| 1.1 BMECs细胞培养 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2. 方法 |
| 2.1 细胞处理和分组 |
| 2.2 流式细胞术检测硒对BMECs和S.aureus感染的BMECs细胞周期的影响 |
| 2.3 荧光定量PCR |
| 2.4 数据分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 硒对BMECs细胞周期影响的检测结果 |
| 3.2 硒对S.aureus感染的BMECs细胞周期影响的检测结果 |
| 3.3 硒对BMECs中修复相关因子和受体基因表达影响的检测结果 |
| 3.4 硒对S.aureus感染的BMECs中相关修复因子和受体基因表达影响的检测结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 试验二 硒对 S.aureus感染奶牛乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)细胞培养 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2. 方法 |
| 2.1 Western Blot检测硒对BMECs及S.aureus感染的BMECsWnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白表达 |
| 2.2 免疫荧光检测硒对BMECs及S.aureus感染的BMECs β-catenin蛋白的表达 |
| 2.3 数据处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 硒对BMECs中Wnt/β-catenin及PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 3.2 硒对S.aureus感染的BMECs中Wnt/β-catenin及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 3.3 免疫荧光检测β-catenin在BMECs中的分布 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
（5）硒对金黄色葡萄球菌感染的巨噬细胞自噬和氧化损伤的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 奶牛乳腺炎与乳腺先天免疫防御机制的研究进展 |
| 1 奶牛乳腺炎的研究进展 |
| 1.1 奶牛乳腺炎的经济危害 |
| 1.2 S.aureus性奶牛乳腺炎 |
| 1.3 S.aureus性奶牛乳腺炎的预防策略 |
| 1.4 氧化应激与奶牛乳腺炎的关系 |
| 2 奶牛乳腺先天性免疫防御机制 |
| 2.1 先天性细胞防御机制 |
| 2.2 先天性蛋白介导防御机制 |
| 第二章 硒与奶牛乳腺炎的关系 |
| 1 硒生物学作用 |
| 2 硒与奶牛乳腺炎的关系 |
| 2.1 硒与体细胞数(SCC)的关系 |
| 2.2 硒与奶牛乳腺炎易感性的关系 |
| 3 硒对奶牛乳腺炎的抑制作用 |
| 3.1 硒对免疫功能细胞的影响 |
| 3.2 硒对NF-κB和MAPK信号转导通路的影响 |
| 第三章 硒在细胞自噬和氧化应激中的作用 |
| 1 硒对细胞自噬过程的影响 |
| 1.1 细胞自噬的基本过程 |
| 1.2 硒对细胞自噬的促进作用 |
| 2 硒对S.aureus感染的细胞氧化应激的抑制作用 |
| 2.1 S.aureus诱导细胞氧化应激的分子机制 |
| 2.2 PI3K/Akt/mTOR信号通路与氧化应激的关系 |
| 2.3 硒对氧化应激的抑制作用 |
| 3 课题研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 硒对S.aureus感染的巨噬细胞自噬和炎症相关通路的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验细胞系 |
| 1.2 实验菌株 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 相关试剂的配制 |
| 1.5.1 RAW264.7细胞培养相关试剂的配制 |
| 1.5.2 Western Blot相关试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 RAW264.7细胞的培养方法 |
| 2.1.1 RAW264.7细胞的复苏 |
| 2.1.1 RAW264.7细胞的冻存 |
| 2.2 S.aureus的复苏与培养 |
| 2.3 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞自噬相关蛋白表达的检测 |
| 2.3.1 细胞处理 |
| 2.3.2 总蛋白样品提取 |
| 2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.4 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞MAPK和NF-κB信号通路关键蛋白影响的检测 |
| 2.4.1 细胞处理 |
| 2.4.2 总蛋白样品提取 |
| 2.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.5 激光共聚焦免疫荧光技术检测细胞LC3蛋白表达 |
| 2.6 透射电镜技术观察细胞超微结构变化 |
| 2.7 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞胞内细菌载量的影响检测 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 3.2 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞MAPK信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 3.3 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞NF-κB信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 3.4 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞LC3蛋白聚点的影响 |
| 3.5 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞超微结构的影响 |
| 3.6 硒对RAW264.7细胞胞内S.aureus载量的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 硒对S.aureus感染的巨噬细胞PI3K/Akt/mTOR通路关键蛋白和细胞氧化损伤的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验细胞系 |
| 1.2 实验菌株 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 相关试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 RAW264.7细胞的培养 |
| 2.2 S.aureus的培养与准备 |
| 2.3 硒对S.aureus感染RAW264.7细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白表达的检测 |
| 2.3.1 细胞的处理 |
| 2.3.2 总蛋白样品的提取 |
| 2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.4 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞ROS影响的检测 |
| 2.5 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞线粒体膜电位影响的检测 |
| 2.6 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞相关抗氧化酶活性的影响 |
| 2.6.1 过氧化氢酶(CAT)活性的测定 |
| 2.6.2 总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的测定 |
| 2.6.3 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定 |
| 2.7 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞MDA与总抗氧化能力的影响 |
| 2.7.1 丙二醛(MDA)含量的测定 |
| 2.7.2 总抗氧化能力(T-AOC)的测定 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的影响 |
| 3.2 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞产生ROS的影响 |
| 3.3 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.4 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞抗氧化酶活性的影响 |
| 3.5 硒对S.aureus感染的RAW264.7细胞MDA和总抗氧化能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
（6）霍乱毒素样抗肿瘤嵌合蛋白佐剂的设计、制备及活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 亚单位疫苗在前列腺癌中的应用 |
| 1.1.1 前列腺癌与免疫治疗 |
| 1.1.2 亚单位疫苗的研究现状 |
| 1.1.3 亚单位疫苗在前列腺癌中的应用 |
| 1.2 免疫佐剂的应用 |
| 1.2.1 免疫佐剂的功能 |
| 1.2.2 许可的人用免疫佐剂 |
| 1.2.3 在研的免疫佐剂 |
| 1.3 霍乱毒素在免疫佐剂中的应用 |
| 1.3.1 霍乱毒素的分子结构与生物学功能 |
| 1.3.2 霍乱毒素与免疫反应 |
| 1.3.3 霍乱毒素作为免疫佐剂的递送途径 |
| 1.4 选题目的及意义 |
| 第二章 CT样嵌合蛋白的表达、纯化与鉴定 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 溶液配制 |
| 2.3.2 重组蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632 的表达 |
| 2.3.3 重组蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632 的纯化 |
| 2.3.4 重组蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632 的鉴定 |
| 2.3.5 CT样嵌合蛋白的制备 |
| 2.3.6 CT样嵌合蛋白的鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 质粒pET22b-mGM-CSF-CTA2和p ET28a-CTB-PSMA624-632 的构建 |
| 2.4.2 含目的蛋白表达质粒的工程菌的生长曲线绘制 |
| 2.4.3 目的蛋白表达优化的条件参数确定 |
| 2.4.4 目的蛋白的表达与纯化鉴定 |
| 2.4.5 BCA法定量蛋白浓度 |
| 2.4.6 嵌合蛋白的制备与鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CT样嵌合蛋白的体外生物活性评价 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物 |
| 3.3.2 溶液配制 |
| 3.3.3 细胞培养 |
| 3.3.4 小鼠髓样细胞增殖实验 |
| 3.3.5 GM1-ELISA实验 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 MTT比色法检测CT样嵌合蛋白对小鼠髓样细胞增殖影响 |
| 3.4.2 间接ELISA法检测CT样嵌合蛋白结合GM1 活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 表达人PSMA的小鼠前列腺癌细胞的构建 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 溶液配制 |
| 4.3.2 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的构建 |
| 4.3.3 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的中量提取 |
| 4.3.4 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP浓缩 |
| 4.3.5 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3.6 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP转染RM-1 细胞 |
| 4.3.7 阳性细胞RM-1-PSMA-EGFP的筛选及EGFP-PSMA表达鉴定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的构建与鉴定 |
| 4.4.2 G418 最佳筛选浓度的确定 |
| 4.4.3 转染质粒的鉴定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 CT样嵌合蛋白的抗肿瘤活性 |
| 5.1 实验目的 |
| 5.2 实验试剂与仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 嵌合蛋白体内抗肿瘤活性研究 |
| 5.3.2 ELISA检测血清中细胞因子IFN-γ分泌 |
| 5.3.3 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 小鼠肿瘤测量与称重 |
| 5.4.2 小鼠体重变化 |
| 5.4.3 血清IFN-γ的含量测定 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 抗肿瘤活性机制研究 |
| 6.1 实验目的 |
| 6.2 实验试剂与仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 溶液配制 |
| 6.3.2 小鼠BMDCs的分离和培养 |
| 6.3.3 流式细胞术检测BMDCs表面分子 |
| 6.3.4 DC细胞过继治疗作用研究 |
| 6.3.5 小鼠脾淋巴细胞的制备 |
| 6.3.6 尼龙毛柱纯化小鼠脾脏淋巴细胞 |
| 6.3.7 流式细胞术检测T细胞纯度 |
| 6.3.8 抗原特异性CTLs细胞的制备 |
| 6.3.9 CTLs体外杀伤活性的研究 |
| 6.3.10 ELISA检测细胞上清液中细胞因子IFN-γ的分泌 |
| 6.3.11 脾淋巴细胞增殖性实验 |
| 6.3.12 统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 小鼠BMDCs的形态观察 |
| 6.4.2 小鼠BMDCs纯度和表面标记物的检测 |
| 6.4.3 过继转移DCs和 T细胞纯度检测 |
| 6.4.4 诱导抗原特异性CD8+T细胞反应 |
| 6.4.5 脾T细胞增殖反应 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）甲基硒酸抑制食管鳞癌细胞生长的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. MSA抑制食管癌细胞的生长 |
| 1.1. MSA改变食管癌细胞的形态 |
| 1.2. MSA抑制食管癌细胞的生长 |
| 2. MSA诱导食管癌细胞凋亡 |
| 3. RNA seq分析 |
| 4. MSA下调EGFR的机制 |
| 4.1. MSA下调EGFR蛋白 |
| 4.2. 过表达EGFR部分逆转MSA对食管癌细胞的生长抑制作用 |
| 4.3. MSA不影响EGFR的mRNA |
| 4.4. MSA上调miR-146a |
| 4.5. 抑制miR-146a部分逆转MSA对EGFR的下调 |
| 5. MSA在体内抑制食管癌的发生 |
| 5.1. 4-硝基喹啉-氧化物(4NQO)诱导的小鼠食管癌模型 |
| 5.2. MSA在体内的抑瘤作用 |
| 5.3. MSA在体内下调EGFR蛋白 |
| 6. MSA下调食管癌细胞IL-6的外泌 |
| 6.1. MSA下调食管癌细胞EGFR信号通路 |
| 6.2. MSA在体内、外下调IL-6的外泌 |
| 6.3. MSA下调IL-6的表达部分依赖EGFR |
| 6.4. MSA下调NF-κB的转录活性 |
| 6.5. 4NQO诱导的IL-6敲除小鼠的食管癌模型 |
| 6.6. MSA对4NQO诱导的食管癌的抑制作用依赖于IL-6 |
| 7. MSA对肿瘤微环境的影响 |
| 7.1. MSA降低巨噬细胞和中性粒细胞的浸润 |
| 7.2. MSA增强Granzyme B的表达 |
| 8. 小结 |
| 9. MSA上调CXCL10 |
| 10.MSA影响肿瘤细胞与巨噬细胞间的相互作用 |
| 10.1.MSA对巨噬细胞的作用 |
| 10.1.1. MSA对THP-1的作用 |
| 10.1.2. MSA对Ana-1的作用 |
| 10.2. MSA能够削弱肿瘤细胞与巨噬细胞间的作用 |
| 11. MSA下调HDAC6蛋白 |
| 12. MSA上调TRAIL |
| 12.1. MSA上调TRAIL |
| 12.2. MSA对食管癌细胞的促凋亡作用不依赖于TRAIL |
| 讨论 |
| 总结 |
| 基金资助 |
| 研究生期间发表论文 |
| EGFR与恶性肿瘤(文献综述） |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体内外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 NKG2D嵌合抗原受体T细胞的制备和功能检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体外研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体内研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 CAR-T细胞治疗实体瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）PSCA靶向嵌合抗原受体T细胞对前列腺癌抗肿瘤治疗的临床前研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 第三代嵌合抗原受体PSCA sc Fv-CD28-CD137-CD3ζ的构建及CAR T细胞转染的实验研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的实验研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分PSCA-CAR T细胞体内抗肿瘤的实验研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 前列腺癌的免疫治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）趋化因子CCL19对大肠癌增殖的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 绪论 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 慢病毒感染及稳定转录细胞株筛选 |
| 2.2 总RNA提取步骤 |
| 2.3 RNA浓度检测 |
| 2.4 RNA逆转录步骤 |
| 2.5 实时定量PCR |
| 2.6 免疫印迹 |
| 2.7 CCK8法细胞增殖实验 |
| 2.8 细胞周期检测 |
| 2.9 细胞凋亡检测 |
| 2.10 软琼脂克隆形成 |
| 2.11 裸鼠皮下移植瘤模型 |
| 2.12 免疫组织化学染色 |
| 2.13 免疫组化染色分析 |
| 3.统计学方法 |
| 结果 |
| 一、慢病毒LV5上调大肠癌细胞中CCL19表达 |
| 二、CCL19上调后对大肠癌细胞增殖能力的影响 |
| 三、流式细胞技术检测细胞周期 |
| 四、流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 五、软琼脂克隆形成实验 |
| 六、免疫印迹检测细胞内β-catenin及cyclinD1表达 |
| 七、裸鼠皮下成瘤实验 |
| 八、免疫组织化学染色检验CCL19及β-catenin在大肠癌组织中的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 硕士阶段发表论文 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文目录 |
四、硒对淋巴细胞杀伤大肠癌细胞的影响（论文参考文献）
- [1]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [2]uPAR促进卵巢癌发生转移及靶向uPAR-CAR-T细胞治疗卵巢癌的研究[D]. 王亮. 吉林大学, 2020(08)
- [3]薏苡附子败酱对肠道腺瘤的作用及机制研究[D]. 顾凯娟. 上海中医药大学, 2019
- [4]硒对金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳腺上皮细胞增殖作用的机制研究[D]. 祝启成. 扬州大学, 2019
- [5]硒对金黄色葡萄球菌感染的巨噬细胞自噬和氧化损伤的影响研究[D]. 臧浩哲. 扬州大学, 2019
- [6]霍乱毒素样抗肿瘤嵌合蛋白佐剂的设计、制备及活性评价[D]. 林丹敏. 广东工业大学, 2019(02)
- [7]甲基硒酸抑制食管鳞癌细胞生长的机制研究[D]. 王钰. 北京协和医学院, 2019(02)
- [8]NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体内外研究[D]. 邓新娜. 河北医科大学, 2019(01)
- [9]PSCA靶向嵌合抗原受体T细胞对前列腺癌抗肿瘤治疗的临床前研究[D]. 韩锦胜. 河北医科大学, 2017(01)
- [10]趋化因子CCL19对大肠癌增殖的作用[D]. 关少培. 上海交通大学, 2016