一、家蚕丝胶基因的表达及调控（论文文献综述）
周阳[1]（2021）在《脂联素对冠脉搭桥术后静脉桥血管再狭窄的抑制作用及利用脂联素转基因家蚕蚕丝制备血管外支架的研究》文中指出第一部分脂联素抑制冠脉搭桥术后静脉桥血管再狭窄的研究目的冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）是如今患病人类死亡的重要原因,CABG是CAD的有效外科治疗手段。大隐静脉因取材方便、易于处理等优点而作为常用的桥血管之一,但其容易发生术后再狭窄或闭塞而难以维持通畅性。血栓形成、内膜增生、动脉粥样硬化等诸多机制导致大隐静脉再狭窄,如何预防再狭窄并维持其通畅性有着极其重要的临床意义。脂联素（ADP）是具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗凋亡、促血管生成作用的生物因子,由脂肪组织特异性分泌。最新研究表明,脂联素受体可在内皮细胞和成纤维细胞表面表达,并参与静脉移植术后再狭窄过程。本章拟通过建立大鼠自体静脉移植模型进而模拟CABG手术过程,使用不同剂量的ADP蛋白涂抹于移植静脉的血管表面,旨在探讨ADP对移植术后静脉桥血管再狭窄发生过程的影响。方法利用吻合袖带技术将SD大鼠自体颈静脉移植于颈动脉间,建立大鼠自体静脉移植模型。两组不同剂量的ADP（2.5μg和7.5μg）以30%Pluronic F-127凝胶作为载药材料,均匀涂抹于大鼠移植静脉血管表面,以不治疗组（仅自体移植）和涂抹30%Pluronic F-127凝胶组作为对照。观察并比较术后不同处理组间移植静脉管壁厚度,PCNA、VCAM-1和ICAM-1免疫组织化学表达及Western Blot检测等方法评价ADP对移植静脉的影响。结果各组手术均成功,术后28天采集标本对照组移植静脉增厚、管壁僵硬、周围组织粘连较明显,高剂量ADP组静脉无明显扩张,周围组织分离容易。术后从第3天起,ADP处理组移植血管内膜和外膜PCNA指数均明显低于对照组和胶水组（P<0.01）,移植后28天免疫组化检测表明ADP处理组移植静脉VCAM-1和ICAM-1表达明显下调（P<0.01）,Western Blot检测结果呈现相同趋势。术后28天,两组ADP处理组移植静脉的内膜、中膜和外膜厚度均低于对照组和胶水组（P<0.01）,且高剂量ADP相较于低剂量ADP抑制管壁增厚效果更明显（P<0.05）。结论本研究通过建立大鼠自体静脉模型,利用移植静脉表面局部涂抹不同剂量ADP的方式探究ADP对静脉再狭窄的抑制作用。结果显示,脂联素处理可达到抑制内膜和外膜细胞增殖的效果,并下调VCAM-1和ICAM-1的表达。该结果暗示ADP可减轻移植静脉内膜、中膜和外膜增生,并联合下调与再狭窄过程相关的VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达,最终达到抑制移植静脉再狭窄的作用。本研究结果为深入研究ADP作用于血管再狭窄的过程奠定基础,为实验阶段研究血管再狭窄提供可行的操作方法。第二部分脂联素转基因家蚕品系的建立及蚕丝材料血管外支架制备目的为解决CABG术后移植静脉再狭窄问题,大量研究致力于明确再狭窄的机制及预防改善的措施。医学跨生物材料等学科交叉领域的兴起,为解决临床医学难题提供了新的视角。ADP在抑制静脉再狭窄方面的作用本研究前半部分已证明,此外,血管外支架也在抑制桥血管再狭窄维持通畅性方面具有重要意义。血管外支架可创造保护性环境促进静脉富含微血管的新外膜形成,还可限制移植静脉植入后的迅速扩张,并向血管施加对称性压力以减轻血管壁张力,形成层流并减少异常血流动力。联动ADP和血管外支架的作用共同抑制桥静脉再狭窄是本研究的主要问题。蚕丝优异的力学性能、良好的生物相容性和可调节的生物降解性等特点,符合防治移植静脉再狭窄的血管外支架材料应具备的条件。生物学领域,利用转基因技术以家蚕作为生物学反应器重组表达外源蛋白的技术日趋成熟。本章研究通过家蚕中部丝腺表达系统重组表达外源蛋白策略,构建可遗传的ADP转基因家蚕品系,高效、快速获得大量具有生物学活性的ADP;在此基础上,应用ADP转基因蚕丝制备非限制性ADP蚕丝血管外支架,并通过材料学研究方法分析其性能,为开发使用转基因蚕丝的血管外支架新型材料防治移植静脉再狭窄奠定研究基础。方法利用家蚕丝胶表达系统构建rh ADP转基因表达载体,通过显微注射技术注入Dazao家蚕蚕卵中,荧光筛选rh ADP转基因蚕茧。通过SDS-PAGE和Western Blot检测及定量rh ADP蛋白,获得稳定的rh ADP转基因家蚕品系。提取基因组以明确ADP基因的插入位点,通过免疫荧光实验检测rh ADP蛋白在蚕丝中的分布。调查rh ADP转基因家蚕品系的经济性状,比较rh ADP转基因蚕茧与WT蚕茧微观结构、二级结构及力学性能。提取并浓缩rh ADP蛋白,通过毒性实验、促细胞增殖及抗炎活性检测rh ADP的生物学活性。使用rh ADP转基因蚕茧作为材料制备血管外支架,并通过扫描电镜、FTIR、力学性能检测和吸水性检测对血管外支架进行表征。结果成功建立rh ADP转基因家蚕品系并在转基因蚕丝中检测到rh ADP蛋白的表达;通过Western Blot定量估算得到每克蚕丝中约含有7mg rh ADP蛋白,同时发现家蚕对rh ADP的表达存在修饰,蛋白存在聚体结构。鉴定rh ADP基因插入位点时发现ADP基因以单拷贝形式插入家蚕第10号染色体。从rh ADP转基因蚕茧中提取并浓缩蛋白,细胞水平实验结果显示家蚕表达的rh ADP蛋白无明显细胞毒性,可促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,并可抑制LPS诱导巨噬细胞raw264.7的炎症反应。rh ADP转基因蚕丝与WT蚕丝相比,微观结构、二级结构及力学性能无明显差异,且不影响蚕茧产量。成功制备rh ADP转基因蚕茧制备的血管外支架,扫描电镜显示外支架纵切面成蜂窝状结构,二级结构分析外支架β-折叠含量明显升高,力学性能检测显示血管外支架断裂强度达到0.14MPa,吸水性检测显示外支架吸水随着时间延长逐渐饱和,未发生明显形变,最终重量达到初始重量的100倍左右。结论本研究以家蚕作为生物反应器利用ser-1表达系统在家蚕丝胶层表达rh ADP蛋白,建立rh ADP转基因家蚕品系。同时提取浓缩获得大量具有生物学活性的rh ADP蛋白。此外,鉴于蚕丝具备作为血管外支架的条件,创新性的利用rh ADP转基因蚕丝材料研制出非限制性血管外支架,通过医学与生物材料交叉研究初探其可行性与应用性。
王芹[2]（2020）在《BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究》文中指出提高家蚕的产丝量是蚕丝业几千年来一直追求的目标。家蚕的丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的器官,是整个蚕丝业的生物学基础。因此,探明家蚕丝腺形成和发育的分子调控机制具有重要的理论意义和实践意义。Slit是一类在进化上高度保守的分泌型糖蛋白,它与受体Roundabout（Robo）在神经轴突导向、神经元的迁移、血管生成、癌细胞转移、白细胞趋化等多种生理病理过程中具有调节作用。家蚕丝腺被认为是果蝇唾液腺的进化同源器官。现有研究发现,Slit及其受体Robo在果蝇唾液腺发育中发挥着重要作用,但是在家蚕丝腺中的功能研究还未有相关报道。Tbx20是一种进化上高度保守的转录因子,是T-box转录因子家族成员之一,在调控心脏发生、控制细胞迁移、促进细胞增殖等过程中扮演着重要角色。在果蝇胚胎发育过程中,Tbx20的同源基因midline能够调控唾液腺的导向迁移,也可以同时调控神经系统中slit和robo基因的表达,但对于Tbx20在家蚕中的功能目前还不清楚。本研究基于前期在家蚕中已鉴定并克隆的Bmslit和Bmrobo（Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3）以及Bmtbx20基因,通过qPCR和免疫荧光染色确定Bmslit、Bmrobo及Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式,探讨它们在丝腺发育中的功能,并在胚胎期采用RNAi技术,分析BmTbx20对Bmslit和Bmrobo基因的表达调控作用及对丝腺发育的影响,以期为揭示家蚕丝腺发生和发育的基因调控网络提供新的资料。主要研究结果如下:1.利用qPCR技术,系统检测了家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的表达变化。结果表明,Bmslit和3个Bmrobo基因在家蚕前、中、后部丝腺中均有表达,而且在不同发育时期存在很大差异,但Bmslit和Bmrobo的表达特征具有较高的相似性和关联性。2.通过免疫荧光染色对BmSlit和BmRobo蛋白进行双染,发现BmRobo1a、BmRobo1b、BmRobo2/3与BmSlit在家蚕胚胎以及幼虫不同发育时期、不同功能区的丝腺细胞质中均有合成,而且在幼虫丝腺细胞膜处都存在共定位。说明BmSlit可能通过与BmRobo结合而在家蚕丝腺中发挥作用。3.分别将Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的siRNA注射到丝腺发生前的蚕卵中进行RNA干涉。qPCR检测发现,注射48 h后的蚕卵中以上4种基因的表达均被不同程度抑制,相对表达量都比对照组极显着下调。4.取家蚕不同发育时期的丝腺组织,通过qPCR和免疫荧光染色分别从转录水平和蛋白水平上分析了Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式。结果表明,Bmtbx20在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期均有表达,转录因子BmTbx20与BmSlit在家蚕胚胎期和幼虫期丝腺中均有合成。5.对家蚕17-18期胚胎中的Bmtbx20基因进行RNAi,qPCR测定显示,蚕卵注射后48 h,不仅Bmtbx20的相对表达量与对照组NC相比极显着下降,而且Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的相对表达量也都存在不同程度的下调。这些结果表明,转录因子BmTbx20可能通过调控Bmslit和Bmrobo基因的表达从而调控丝腺的发育过程。6.在家蚕胚胎期对Bmslit、Bmrobo以及Bmtbx20基因进行RNAi,与对照组NC相比,Bmslit和Bmrobo基因RNAi后,丝腺的发生位置及丝腺发育情况均未见明显差异。但Bmtbx20基因RNAi后会导致胚胎发育加快,丝腺发育也相应提前,故在同一催青时间,丝腺较对照组延伸的较长。关于这些基因在丝腺发育中的详细作用机理还有待利用基因敲除等手段做进一步研究。
赵之林[3]（2020）在《家蚕丝胶蛋白的分层绿色制备、理化特性与体外生物活性及其应用于生物墨水的探索》文中认为蚕丝是家蚕（Bombyx mori）分泌的一种天然高分子蛋白,主要由丝素纤维和丝胶蛋白两部分组成。丝胶蛋白是包裹在丝素纤维外部的一种层状胶体蛋白,约占蚕丝总重的25%～30%,可以将丝素纤维粘合在一起形成牢固的茧壳结构。一般认为丝胶蛋白含有两层或两层以上的结构,外层的丝胶蛋白由家蚕中部丝腺的前部细胞合成,内层的丝胶蛋白由家蚕中部丝腺的后部细胞合成。在丝绸产业中,丝胶蛋白会影响丝织物的光泽和手感,并影响后期印染等工艺。将蚕丝中丝胶蛋白去除的过程被称为脱胶,丝胶蛋白常随着大量的脱胶废水被排放,造成严重的环境污染和生物资源浪费。近年来,随着生物医学工程的飞速发展,丝胶蛋白因其优异的生物学性能逐渐得到了研究者的关注。丝绸文化已有千年历史,在纺织缫丝工艺中,常利用沸水、碱性溶液、酸性溶液、蛋白酶或表面活性剂等混合脱胶剂对蚕茧进行脱胶。虽然可以通过透析或膜超滤等现代工艺对脱胶溶液进行丝胶的纯化和回收,但成本过高,严重限制了其实用性。至今仍未有标准化的、实用的、绿色的蚕丝脱胶方法面世。因此,需要人们开发低成本、高效率、绿色的丝胶提取方法。在已有关于新型脱胶方法的报道中,人们大多关注脱胶方法对丝素纤维的影响,而忽视其对丝胶蛋白的回收和性能的影响。因此,本文将通过三种绿色的脱胶方法分层制备丝胶蛋白,并对三种丝胶蛋白的理化性质和体外生物学活性进行系统化的分析比较。一般剧烈的脱胶条件可以提高脱胶效率,但会造成丝胶蛋白严重降解。温和条件的脱胶效率较低,内层的丝胶蛋白难以完全去除。作者在不引入脱胶剂的条件下对丝胶采用分层制备的方法。首先,洁净茧壳通过纯水加热煮沸1 h,可获得脱胶率约12%的外层丝胶蛋白。其次,这些未完全脱胶的茧壳通过120℃高温高压水进行第二次脱胶2 h,便可获得剩余部分的内层丝胶蛋白。在本文中,通过第一次沸水脱胶得到的丝胶蛋白被称为外层丝胶蛋白（Outer layered sericin,OLS）,将通过高温高压水第二次脱胶的丝胶蛋白称为内层丝胶蛋白（Innerlayered sericin,ILS）。此外,氢氧化钙[Ca（OH）2]水溶液作为一种新型的绿色脱胶剂,其获得的碱性脱胶溶液可以通过与硫酸/磷酸中和反应,使脱胶液中的钙离子生成钙盐而沉淀,此法不仅可以快速分离纯化丝胶蛋白,还可以回收钙盐循环利用,本文将此法制备的丝胶蛋白称为全丝胶（whole sericin,WS）。这三种丝胶蛋白的理化特性和体外生物学活性在本文的第一部分中做了系统地分析和研究比较。蚕丝脱胶方法会影响丝胶蛋白的分子量范围和氨基酸组成,从而影响其理化性质和生物学活性。本文中OLS、ILS和WS三种丝胶的脱胶率分别为11.4%,16.65%和28.61%。碱法制备的WS分子量最低,SDS-PAGE电泳条带主要集中在10 kDa～30 kDa,这使其在室温下具有最好的水溶解性能。OLS和ILS的分子量较大,溶解度在温度升至70℃后才会快速升高。氨基酸分析显示OLS中谷氨酸、丝氨酸和赖氨酸等极性氨基酸含量明显高于ILS。富含亲水基团的OLS表现出较强的吸湿、保湿能力,在12 h内的吸湿率超过了 12.5%,8h内的保湿率约为85%。OLS、ILS和WS的热分解温度分别约为308℃、322℃和311℃,ILS的β-折叠结构含量高于OLS,其热分解温度也比OLS高约14℃,表明ILS具有较高的稳定性,可以在自然环境中对丝素纤维起到保护作用。三种丝胶蛋白的X-射线衍射曲线均在20.8°处出现结晶峰,说明三种脱胶方法对丝胶蛋白的结晶度没有显着影响。此外,三种丝胶蛋白都具有明显的抗紫外活性,其中小分子的WS更易被人体吸收利用,具有作为化妆品原料的潜力。ABTS法和FRAP法实验结果显示三种丝胶蛋白的抗氧化能力顺序为:OLS>WS>ILS,另外20 mg/mL的OLS对大肠杆菌的抑制率可达到50%。OLS和WS的酪氨酸酶抑制曲线的 IC50 值分别为 8.67 mg/mL 和 3.49 mg/mL,10 mg/mL 的 OLS 和 WS 对 α-葡萄糖苷酶的抑制率分别达到了 65.62%和51.3%。这些结果表明,这三种丝胶在理化性能上存在一些差异,但都具有明显的抗氧化、抗紫外、抗菌、吸湿保湿、美白和体外降血糖等功能。甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）是生物3D打印领域中一种常用的生物墨水材料,本文通过将OLS、ILS、WS分别与GelMA混合制备三种丝胶/明胶复合型水凝胶（SS/GelMA）,探索丝胶蛋白应用于生物墨水的可能性。实验结果显示这三种丝胶蛋白的添加不会影响GelMA水凝胶的可塑性,且SS/GelMA复合水凝胶的平均孔径约为150μm,其具有的三维网络结构可以满足细胞生长的需求。力学测试结果显示含有较多β-折叠结构的ILS可以将纯GelMA水凝胶的压缩强度从0.21 MPa提升至0.28 MPa,将其抗压性能提高了 25%。由于丝胶蛋白未改变GelMA的分子结构,所以其对GelMA水凝胶的溶胀性能几乎没有影响。经中性蛋白酶处理10天后,除WS/GelMA外,其余两种SS/GelMA复合水凝胶的质量保留率均在80%以上。在药物缓释实验中,OLS/GelMA、ILS/GelMA和WS/GelMA复合水凝胶在第5天的药物释放率分别达到了 78%、62%和70%左右,显示出应用于再生医学领域的潜能。体外细胞培养的结果表明OLS浓度为1%时,过量的OLS会导致OLS/GelMA复合水凝胶产生细胞毒性。将丝胶浓度降低到0.5%、0.25%、0.1%后,所有SS/GelMA复合水凝胶均表现出更高的细胞活性。与培养在纯GelMA水凝胶支架上细胞相比,SS/GelMA复合水凝胶上的细胞伪足较长,呈纺锤状生长。表明SS/GelMA复合水凝胶可以加快L929细胞的粘附,使细胞提前进入快速生长期,表现出优异的细胞相容性。利用绿色的脱胶方法,分层制备OLS、ILS和WS三种丝胶蛋白。一系列实验结果证实,这三种丝胶蛋白均具有优异的理化性能和体外生物学活性。其中具有较好生物学活性的OLS和热稳定性较高的ILS可以作为医用生物材料或工业表面改性材料,而小分子WS具有应用于生物制药、功能性健康食品和化妆品等领域的巨大潜能。同时,这三种丝胶蛋白都可以提高GelMA的机械性能、细胞粘附性和生物相容性,具有应用于生物墨水领域的潜在价值,这为蚕丝产业的可持续发展和高附加值产品开发提供了重要的参考价值。
王伟[4]（2019）在《let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制》文中指出家蚕是由野桑蚕驯化而来的重要的经济昆虫,通过对丝蛋白基因表达调控、丝蛋白组装机制、丝腺生长发育机理的研究,有望在提高蚕丝产量、获得特殊性能蚕丝纤维、拓展丝腺生物反应器应用等方面取得突破。let-7是一个极其保守的microRNA（miRNA）,在不同物种中都以let-7簇（let-7 cluster,let-7C）的形式存在,在时序性发育、肿瘤的发生与发展、细胞多能性维持等方面发挥重要的转录后调控功能,但let-7在家蚕丝腺中的功能目前尚不清楚。本研究利用基因编辑手段,在丝腺的不同部位实现let-7和let-7C敲除,验证了它们对中部丝腺和后部丝腺生长的影响;利用转录组测序探索了let-7调控丝腺生长的分子机理;筛选得到let-7调控丝腺生长的靶基因,并对靶基因功能进行了研究。研究结果如下:1.家蚕丝腺miRNA研究方法探索为研究丝腺中miRNA的功能,我们试用不同方法来改变miRNA在丝腺中的表达量,以找到最适合丝腺miRNA功能研究的方法。首先以丝腺特异性表达的miR-274为研究对象,合成miR-274 mimic和miR-274 antagomir,注射到家蚕五龄幼虫体内,但它们并不能进入丝腺细胞发挥作用;设计、合成miR-274 sponge序列,构建转基因载体,获得miR-274 sponge转基因家蚕个体,发现miR-274 sponge能特异性的下调丝腺中miR-274,效率约20%;扩增miR-274前体序列,构建转基因过表达载体,分别在中部丝腺和后部丝腺过表达miR-274;设计、合成用于miR-274敲除的一对gRNA,构建双gRNA载体,获得双gRNA转基因表达品系,与后部丝腺Cas9表达品系杂交,得到miR-274后部丝腺敲除品系。检测结果表明miR-274所在基因组序列表现出不同形式的碱基缺失,miR-274在后部丝腺表达量下调了54%左右。这些结果表明,miRNA转基因过表达是家蚕丝腺miRNA获得性功能研究首先方法;组织特异性的miRNA敲除比miRNA sponge是更有效的缺失性功能研究方法。2.let-7C miRNAs时空表达及基本功能分析通过qRT-PCR检测let-7C miRNAs（let-7-5p、let-7-3p、miR-100和miR-2795）在家蚕不同发育阶段和五龄第3天不同组织中的表达情况,发现let-7C miRNAs在丝腺中低量表达。在五龄幼虫丝腺生长过程中,let-7C miRNAs在五龄前期低量表达,随着丝腺的生长,表达量逐渐升高;家蚕完成吐丝后,丝腺细胞进入程序性死亡过程,let-7C miRNAs表达量开始下降,这种表达模式暗示let-7C miRNAs可能与丝腺细胞核内复制有关。化学合成let-7C miRNAs模拟物（mimic）和拮抗剂（antagomir）,在家蚕BmE和BmNs细胞系中上调或下调let-7C miRNAs的表达,初步探索了它们在家蚕细胞中的功能。在BmE细胞中,上调let-7-5p对细胞增殖有明显的抑制作用,上调let-7-3p、miR-100和miR-2795不影响细胞增殖;在BmNs细胞中,上调let-7-5p、let-7-3p、miR-100和miR-2795都能抑制细胞增殖,下调则促进细胞增殖。细胞增殖结果表明,let-7C miRNAs在家蚕细胞增殖过程中可能发挥协同调控作用。3.敲除let-7和let-7C促进中部丝腺生长为了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除丝腺中的let-7和let-7C,我们成构建了家蚕个体双gRNA转基因表达品系:let-7-2gRNA和let-7C-2gRNA,将它们分别与中部丝腺Cas9表达品系（MSG-Cas9）进行杂交,通过荧光筛选、敲除位点测序鉴定和表达量检测获得let-7中部丝腺敲除个体△let-7-MSG和let-7C中部丝腺敲除个体△let-7C-MSG。与对照相比,△let-7-MSG中部丝腺后区增粗、变长,表面平滑;△let-7C-MSG中部丝腺中区和后区与对照相比均有增粗,表面呈串珠状。上述结果表明中部丝腺敲除let-7和let-7C均能显着促进五龄期幼虫中部丝腺的生长,但两者之间存在明显的表型差异。△let-7-MSG和△let-7C-MSG在五龄3天开始出现异常表型,五龄前3天是丝腺细胞核内复制增加、细胞体积变大的关键时期。△let-7-MSG和△let-7C-MSG中部丝腺后区DNA总量分别增加170%和120%,为DNA大量合成提供能量的ATP含量也升高了8-10倍,这表明敲除品系丝腺细胞核内复制显着增强。家蚕幼虫完成吐丝之后,预蛹期家蚕丝腺腔中的丝蛋白全部被组装成丝纤维,而△let-7-MSG和△let-7C-MSG中部丝腺后部则残留大量丝蛋白,导致两种突变体家蚕茧重和茧沉率都显着下降,因此△let-7-MSG和△let-7C-MSG突变体家蚕可以作为研究蚕丝纤维组装的新品种使用。4.let-7作为关键负调控因子参与调控后部丝腺生长为了检测let-7和let-7C敲除是否能促进后部丝腺生长并提高家蚕产丝量,将let-7-2gRNA和let-7C-2gRNA品系与后部丝腺Cas9表达品系（PSG-Cas9）杂交;基于胚胎眼色筛选,获得let-7后部丝腺敲除个体△let-7-PSG和let-7C后部丝腺敲除个体△let-7C-PSG。解剖五龄幼虫,观察表型,△let-7-PSG后部丝腺明显增粗、变长,表面平滑;上簇期的后部丝腺自然悬垂长度增加80%,重量增加150%,茧壳重增加12%。△let-7C-PSG后部丝腺明显增粗、变长,表面呈串珠状,无规则卷曲增加;上簇期△let-7C-PSG后部丝腺长度增加60%,重量增加150%,茧壳重增加12%。let-7和let-7C敲除都能促进后部丝腺生长并提高家蚕产丝量,但两者表型有差异,与中部丝腺表型差异类似。对后部丝腺细胞进行phalloidin及DAPI染色,发现△let-7-PSG和△let-7C-PSG后部丝腺细胞变大、核内复制增加,而△let-7C-PSG部分后部丝腺细胞萎缩发育是造成let-7和let-7C敲除表型差异的主要原因。分别构建后部丝腺let-7和miR-1002795的转基因过表达品系:let-7-OE-PSG和miR-1002795-OE-PSG。于G1代五龄期解剖观察,发现let-7过表达强烈抑制后部丝腺的生长,后部丝腺细胞萎缩、排列无序;let-7-OE-PSG后部丝腺DNA总量降低75%,茧壳重量降低50%,表明let-7过表达抑制后部丝腺细胞核内复制并抑制丝素蛋白的合成。而miR-100和miR-2795同时过表达并不影响后部丝腺生长。由此可见,在let-7C中只有let-7才是调控丝腺生长的关键miRNA。由于后部丝腺生长受阻,造成let-7-OE-PSG茧壳变薄、易碎,类似于Nd-s突变体的丝胶茧。经过统计发现let-7-OE-PSG蚕丝中丝素含量与对照相比降低55%,miR-1002795-OE-PSG也降低10%,表明miR-100和miR-2795也参与调控丝素蛋白的合成与分泌,但let-7是丝腺生长的关键负调控因子。5.转录组测序分析let-7调控丝腺生长的分子机制为了揭示let-7调控丝腺生长和功能的分子机制,我们对五龄3天△let-7-MSG中部丝腺和△let-7-PSG后部丝腺共12个样品进行转录组测序分析,在中部丝腺筛选到184个上调表达差异基因和99个下调表达差异基因,在后部丝腺筛选到271个上调表达差异基因和277个下调表达差异基因;在中、后部丝腺同时发生表达变化的基因共有36个。差异基因GO分类分析显示,中部丝腺差异基因主要在氧化还原反应和脂肪酸生物合成途径中富集,后部丝腺差异表达基因在新陈代谢和糖类转运过程中富集。KEGG pathway富集分析表明,中部丝腺差异表达基因在新陈代谢、过氧化物酶脂肪酸代谢和三羧酸循环等多个通路被富集,而后部丝腺差异表达基因只在叶酸“一碳”代谢途径显着富集。中部丝腺和后部丝腺差异表达基因被富集到完全不同的通路中,表明let-7调控中部丝腺和后部丝腺生长的分子机制不同。6.let-7调控丝腺生长的靶基因鉴定提取家蚕转录本的3’UTR,利用RNAhybrid、miRanda和TargetScan对let-7的靶基因进行预测,共有504个潜在靶基因同时被三种软件预测。与△let-7-MSG和△let-7-PSG转录组测序筛选到的455个上调差异表达基因求交集,筛选出22个靶基因,其中10个基因在△let-7-MSG中部丝腺上调表达,12个基因在△let-7-PSG后部丝腺上调表达。利用qRT-PCR检测let-7表型相关靶基因在丝腺生长中的表达模式,筛选出9个与let-7表达呈相反趋势的基因。用3’RACE扩增了其中6个基因的3’UTR,并将它们克隆到psiCHECKTM-2双荧光素酶报告基因载体上,将融合靶基因3’UTR的重组载体与let-7 mimic共转染至HEK-293FT细胞中,检测结果显示,丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase,PC）、蜕皮激素22激酶（ecdysteroid22-kinase,EcK）和卵母细胞锌指蛋白（oocyte zinc finger protein XLCOF6,XLCOF6）三个基因的荧光素酶活性显着降低,表明PC、EcK和XLCOF6基因的3’UTR上具有let-7的靶位点,它们是let-7的直接靶基因。PC和EcK在中部丝腺上调表达,XLCOF6在后部丝腺上调表达。经靶位点突变实验证实,let-7在PC 3’UTR上存在两个靶位点。通过双荧光素酶体外验证实验证明果蝇的PC基因也let-7靶基因。7.PC在丝腺生长中的功能研究PC是糖代谢通路中的重要基因,丙酮酸羧化酶是糖异生途径的限速酶。为了证实PC是let-7调控丝腺生长的靶基因,我们构建了中部丝腺和后部丝腺PC转基因过表达载体,获得了中部丝腺的PC过表达品系PC-OE-MSG。解剖PC-OE-MSG品系的上簇期幼虫丝腺,发现中部丝腺中区长度增加了25%,DNA总量增加了77%。PC过表达促进了中部丝腺生长和中部丝腺细胞核内复制,与let-7敲除后的表型一致,证明PC是let-7调控中部丝腺生长的靶基因。将PC的gRNA转基因品系与中部丝腺和后部丝腺Cas9表达品系分别杂交,筛选得到PC中部丝腺敲除品系△PC-MSG和PC后部丝腺敲除品系△PC-PSG。测序结果表明,在PC mRNA第二个外显子上存在不同形式的碱基缺失,范围从4 bp到64 bp,PC成功被敲除,但PC的敲除并不影响中部丝腺和后部丝腺的生长,这可能与细胞内的补救途径有关。综上所述,本论文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术、miRNA转基因过表达和转录组测序等手段,系统的研究了let-7和let-7C在中部丝腺和后部丝腺中的功能。证明let-7是let-7C中调控丝腺生长的主要miRNA,敲除let-7能促进丝腺的生长并提高家蚕产丝量。PC、EcK和XLCOF6是let-7的直接靶基因,PC是let-7调控中部丝腺生长的靶基因。不同的gRNA转基因表达品系、let-7和let-7C敲除品系、let-7过表达品系等,为研究丝腺生长发育、丝蛋白基因表达和丝纤维组装提供了丰富的家蚕素材。
周晓林[5]（2019）在《BmZFP67调控家蚕丝腺有丝分裂-核内有丝分裂转换机制研究》文中研究说明核内有丝分裂是不同于有丝分裂的一种细胞周期形式,进行核内有丝分裂的细胞会持续进行DNA复制,而不发生胞质分离,导致进行核内有丝分裂的组织中的遗传物质含量不断增加,而细胞的数量保持不变,最终形成含有多倍体细胞的组织。核内有丝分裂可以高效提高基因组拷贝数,使得基因转录翻译进程加快,进而极大提高蛋白合成能力,使细胞在生物体生命进程中行使特定功能。核内有丝分裂细胞通常是由有丝分裂细胞分化形成。但目前核内有丝分裂的发生机制尚不完全清楚,有丝分裂-核内有丝分裂转换机制的研究具有重要意义。家蚕作为泌丝经济昆虫,其丝腺组织细胞会经历有丝分裂和核内有丝分裂两个过程,在胚胎早期进行有丝分裂,在胚胎后期转为核内有丝分裂,是研究有丝分裂-核内有丝分裂转换机制的理想材料。此外,丝腺作为家蚕丝蛋白合成的器官,其强大的蛋白合成能力不仅使其在蚕丝生产上具有重大的经济价值,更使其具备成为新兴生物反应器的条件,对丝腺有丝分裂-核内有丝分裂转换机制的研究可为改造家蚕丝腺、推进其作为生物反应器的进程、提高家蚕经济价值奠定理论基础。对核内有丝分裂发生机制的解析具有十分重要的理论和应用价值。本研究通过胚胎解剖、组织免疫荧光和荧光定量实时PCR（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）等实验技术分析了家蚕丝腺发育中有丝分裂-核内有丝分裂转换时期。通过转录组测序分析家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换差异表达基因,结合核内有丝分裂相关基因BmGeminin2酵母双杂交数据,进行组织表达谱、丝腺发育时期表达谱分析,最终筛选获得了一个参与家蚕丝腺细胞有丝分裂-核内有丝分裂转换过程的关键基因BmZFP67。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记、流式细胞术、丝腺组织体外培养、转基因以及染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）等技术分析了BmZFP67在细胞周期中的功能,研究了BmZFP67在家蚕细胞有丝分裂及丝腺组织细胞核内有丝分裂中的重要作用,构建了BmZFP67调控家蚕丝腺组织细胞有丝分裂-核内有丝分裂转换的调控网络。这将进一步丰富和完善细胞周期调控理论,解析有丝分裂-核内有丝分裂转换机制,同时也可为家蚕丝腺核内有丝分裂效率及蚕丝产量的提高提供理论依据及科学思路。本论文的主要研究结果和结论如下:1.家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换时期分析为了筛选参与有丝分裂-核内有丝分裂转换过程的关键基因,本研究首先通过胚胎解剖技术成功获取了胚胎24期、25期和26期的完整丝腺组织。然后通过qRT-PCR技术检测细胞周期类型标记基因——Cyclin B和Cyclin E及细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase,CDK）基因CDK1和CDK2在24期、25期和26期胚胎丝腺组织中的转录情况:在有丝分裂进程中需要,在核内有丝分裂进程中不需要的G2/M期细胞周期相关基因Cyclin B和CDK1在24期、25期以及26期胚胎丝腺中呈现转录水平持续性下调的趋势;有丝分裂及核内有丝分裂进程均需要的G1/S期细胞周期相关基因Cyclin E和CDK1持续表达,且在25期胚胎丝腺中的转录水平显着高于24期胚胎丝腺和26期胚胎丝腺。组织免疫荧光标记Cyclin B蛋白验证其在24期、25期和26期胚胎丝腺组织中的表达情况发现:胚胎24期时的整个丝腺中均有Cyclin B荧光信号存在,胚胎25期时仅在部分丝腺中存在荧光信号,胚胎26期丝腺组织中没有Cyclin B荧光信号的存在,与qRT-PCR结果一致。综合以上结果,结合前人研究报道,确定胚胎25期为家蚕丝腺组织细胞有丝分裂-核内有丝分裂的转换时期。2.家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换调控相关基因筛选将胚胎24期（有丝分裂期）、25期丝腺材料（转换期）和26期丝腺材料（核内有丝分裂期）丝腺材料进行转录组测序,通过比对三组样品共筛选到6786个差异基因,Gene ontology（GO）分类发现这些差异基因主要属于分子功能类和生物学进程类,属于细胞组分类的基因相对较少。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）聚类分析差异基因富集到了131条信号通路中,其中包括:DNA复制通路、错配修复通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、Notch信号通路和激素信号通路等在先前研究中已被证实与有丝分裂-核内有丝分裂转换或核内有丝分裂效率密切相关的信号通路。通过将转录组数据与先前本实验室所研究的与核内有丝分裂密切相关的Geminin2蛋白的酵母双杂交数据联合分析,发现有14个共有基因。随后对这14个基因进行功能分析发现BmZFP67是唯一的转录调控因子基因。分析BmZFP67基因在家蚕各组织以及丝腺发育时期的表达模式发现:BmZFP67在丝腺组织中的表达量显着低于其它不进行核内有丝分裂的任何组织,且在丝腺有丝分裂-核内有丝分裂的转换过程中转录水平呈现下调趋势,暗示了BmZFP67可能在家蚕丝腺有丝分裂-核内有丝分裂转换过程中发挥功能。因此决定以转录调控因子基因BmZFP67作为后期的主要研究对象。3.BmZFP67在家蚕细胞及丝腺组织中的功能研究利用生物信息学、分子克隆技术及qRT-PCR技术对筛选到的家蚕BmZFP67基因进行克隆及生物信息学分析,并对其在细胞周期各时相的表达特征进行了分析。研究结果表明:BmZFP67基因编码518个氨基酸,其编码的蛋白大小约为59kDa;其同源蛋白主要存在于鳞翅目昆虫中;BmZFP67基因在细胞周期时相的S期、G2/M期转录水平较高。通过基因编辑、BrdU标记、流式细胞术、MTS细胞增殖活力检测、qRT-PCR、细胞染色及形态观察等技术实现BmZFP67基因的过表达和敲除,研究BmZFP67在细胞水平的功能。研究结果表明:BmZFP67过表达会抑制细胞增殖,导致S期细胞比例降低,G2/M期细胞比例升高,G2/M期细胞周期蛋白基因Cyclin B和CDK1的转录水平显着性上调。敲除BmZFP67会导致Cyclin B和CDK1的转录水平显着性下调,S期细胞比例升高,G2/M期细胞比例降低,造成细胞分裂异常,导致异倍体细胞数目增多,细胞体积变大,引发类似于有丝分裂向核内有丝分裂转换现象的发生。通过转基因技术构建丝腺组织特异表达系统,实现BmZFP67基因在丝腺组织中的特异过表达和敲除。通过丝腺组织体外培养结合BrdU标记、丝腺组织免疫荧光、qRT-PCR等技术研究在丝腺组织中特异过表达或敲除BmZFP67基因对家蚕丝腺发育、丝蛋白产量等的影响。研究表明:丝腺组织中过表达BmZFP67会造成丝腺组织细胞有丝分裂-核内有丝分裂转换期的推迟,且会显着性降低丝腺组织细胞核内有丝分裂效率,降低其丝蛋白合成能力。4.BmZFP67基因调控网络研究通过qRT-PCR技术、染色质免疫共沉淀技术、双荧光素酶报告系统鉴定BmZFP67蛋白的转录调控靶基因,结果显示BmZFP67蛋白对M期细胞周期蛋白基因Cyclin B具有正向转录调控作用,其转录调控位点为sna位点。通过蛋白质免疫共沉淀、qRT-PCR鉴定BmZFP67相互作用蛋白并研究互作蛋白与BmZFP67的相互作用对其转录调控功能的影响,结果显示:互作蛋白14-3-3ζ或Aurora-B kinase与BmZFP67蛋白结合都会促进BmZFP67转录调控功能发挥,促进BmZFP67蛋白转录调控下游基因Cyclin B的表达。综合上述研究结果推测BmZFP67的功能及调控网络:BmZFP67在有丝分裂细胞周期G2/M期高量表达,促进其转录调控下游基因Cyclin B,即细胞周期G2/M期的关键调控基因表达上调,实现细胞周期G2/M的推进,在这一过程中BmZFP67蛋白的功能发挥还受到相互作用蛋白14-3-3ζ或Aurora-B kinase的促进。BmZFP67基因在丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换过程中表达量下降,进而导致其下游基因Cyclin B表达下调,使丝腺组织细胞不能通过G2/M期检验点,阻碍M期进程,促使丝腺组织细胞只有DNA的复制,没有细胞质的分裂,实现有丝分裂-核内有丝分裂的转换。
张天洋[6]（2019）在《利用转基因家蚕丝腺表达重组hVEGF165的研究》文中认为鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）是重要的产丝昆虫,至今已被人类饲养利用逾5000年。家蚕丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的专一场所（一头家蚕可生产约0.5克丝蛋白）,是蚕丝业最为核心的生物学基础。近些年来,随着生物技术的蓬勃发展,特别是近年在家蚕基因组计划的推动下,人们对丝腺高效合成与分泌丝蛋白的分子机制有了深入了解,同时也注意到家蚕不仅能用于产丝织绸,其丝腺还是一个理想的生物反应器。2003年,日本学者首次报道了利用转基因家蚕丝腺表达重组人Ⅲ型胶原蛋白,其后,国内外学者利用转基因家蚕丝腺已成功表达了数十种外源蛋白,少数重组蛋白素材已进入中试或产业化生产阶段,表明利用家蚕丝腺作为生物反应器生产重组蛋白,有着巨大的开发应用潜力。人血管内皮生长因子（human vascular endothelial growth factor,hVEGF）是一种对内皮细胞具有高度特异性的有丝分裂原,在血管再生和血管发生中起着重要作用。hVEGF165是hVEGF-A亚型中组织表达频率最高、最具生理相关性的一种异构体,在外周缺血性疾病或慢性伤口的治疗性血管再生研究中效果显着。目前,重组hVEGF165蛋白主要采用大肠杆菌、酵母等原核或低等真核表达系统进行体外表达和研究,其是否适合在家蚕中部丝腺表达尚不清楚。本论文以hVEGF165为靶标,探索利用转基因家蚕中部丝腺表达hVEGF165的可行性,以期为进一步开发重组hVEGF165蛋白提供理论参考和转基因素材基础。取得的主要研究结果如下:1.hVEGF165转基因家蚕的制作首先,从NCBI下载hVEGF165基因序列（NP001020539.2）,根据家蚕密码子偏好进行密码子优化后直接合成在C末端融合有6×His标签的hVEGF165序列。其次,采用酶切连接方式,将合成序列组装到以家蚕丝胶1基因（Sericin-1,Ser1）启动子为调控元件的亚克隆载体pSL1180[hSer1sp-DsRed-Ser1PA]上,进而再装到piggyBac骨架载体,构建成转基因表达载体pB[hSer1sp-hVEGF165-Ser1PA,3×P3EGFP]（简写为S1-V165）。最后,采用显微注射方法,将S1-V165超纯质粒DNA注射至家蚕早期胚胎,经荧光筛选获得了5个阳性蛾圈;基因组PCR及测序结果表明,转基因蚕制作成功,命名为S1-V165。2.hVEGF165的表达特征解剖获取S1-V165五龄幼虫的中部丝腺进行qRT-PCR检测,结果表明:在五龄第16天的中部丝腺中,hVEGF165的表达量逐渐增加,五龄第6天出现表达峰值,其mRNA含量是内源Ser1 mRNA总量的56%。随后对S1-V165五龄幼虫中部丝腺及茧壳溶解产物进行Western Blot检测,结果显示,在中部丝腺以及茧壳溶解产物中均能检测到目的蛋白,表明重组hVEGF165蛋白已成功在S1-V165家蚕中部丝腺细胞中合成并且分泌进入茧壳中。3.重组hVEGF165蛋白的促细胞增殖活性重组hVEGF165蛋白是否二聚体化是其有无生物学活性的关键。本研究分别利用PBS、8M尿素和弱碱溶液（5 g/L Na2CO3,4 g/L NaHCO3）溶解S1-V165茧壳后进行Western Blot分析,结果表明:在存在或缺乏β-巯基乙醇（还原或非还原条件下）的条件下,重组hVEGF165蛋白分别以单体或二聚体形式存在。紧接着,将灭菌处理的S1-V165茧壳蛋白浓缩液与饥饿处理后的HUVE细胞共培养24 h后,分别进行CCK-8检测及EdU染色分析。结果表明:含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液的促细胞增殖效果显着高于对照组,表明其具有促细胞增殖活性。随后,利用弱碱溶液分别处理细胞0、5、15、30 min后,进行Western Blot分析,结果表明,与对照组相比含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液处理细胞后对pMAPK44/42的瞬时磷酸化相对较高,具备激活ERK通路从而促进内皮细胞增殖的作用。4.重组hVEGF165蛋白的释放特性取S1-V165茧粉90 mg于3 mL的弱碱液中溶解72 h,采用Western Blot测定弱碱液上清液中重组hVEGF165蛋白的释放行为。结果表明,重组hVEGF165蛋白在024 h内释放速度极快,达到总释放量的80%,2472 h期间仍有少量释放。5.S1-V165茧片的促细胞增殖活性将干燥灭菌的S1-V165茧片浸泡在血清浓度为10%的培养基中,与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h后进行观察发现,细胞形态及生长状态良好,与对照组相比无明显死亡;随后利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行饥饿处理12 h,将茧片放入96孔板中与细胞共同培养72 h,利用CCK-8及EdU染色进行促细胞增殖分析,结果表明,S1-V165茧片处理过的细胞在450 nm处的吸光度显着高于对照组。综上,本研究制作获得了在家蚕中部丝腺特异表达重组hVEGF165蛋白的转基因系统,并在细胞水平证实其具有生物学活性,为进一步探索重组hVEGF165蛋白的开发应用打下了理论及素材基础。
申雅文[7]（2019）在《长链非编码RNA对家蚕丝蛋白合成相关基因的表达调控研究》文中研究指明家蚕是世界上重要的经济动物,也是鳞翅目最重要的模式昆虫,在工业及科研领域都具有重要价值。丝蛋白具有较好的延展性和力学性,可作为人造皮肤、血管、骨骼的材料,也能够替代高分子材料。因此,研究家蚕丝蛋白合成相关基因之间的分子调控机制将为蚕丝性能的改良提供重要的理论依据。课题组前期通过家蚕转录组测序获得大量新的长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）,经过生物信息学分析,发现部分lncRNA和一些miRNA存在序列互补,这些miRNA的靶基因是丝蛋白合成相关的基因。因此,我们推测lncRNA可能作为miRNA的海绵发挥功能,竞争结合miRNA,从而调控丝蛋白的合成。为验证此假设,我们首先选取lnc7107作为研究对象,由其互补链产生的2个miRNA分别是miR-2739和miR-34-5p。利用实时荧光定量PCR检测了lncRNA和miRNA在家蚕丝腺不同部位及不同发育时期的表达谱。结果发现lnc7107在5龄末期后部丝腺中的表达量较高,由其互补链产生的miR-2739、miR-34-5p在后部丝腺中的表达量较低。miR-2739和miR-34-5p的靶基因为家蚕丝素合成关键基因Fib-H和p25,二者在后部丝腺中的表达量均较高,表达谱结果显示lnc7107可能作为miRNA的内源性竞争RNA（Competitive endogenous RNA,ceRNA）,通过miRNA参与丝素基因合成调控。随后我们在HEK293细胞系中,用双荧光素酶活性检测的方法鉴定了两个miRNA与两个靶基因之间的体外互作。结果发现miR-2739能够与Fib-H的3’-UTR发生直接互作,共转染miRNA模拟物后细胞荧光素酶活性下降了51.4%,达到显着水平,表明Fib-H为miR-2739的靶标。为了进一步研究lnc7107调控丝素蛋白的机制,我们在家蚕个体中利用dsRNA干涉lnc7107的表达,检测丝素合成相关基因Fib-H的表达量和miR-2739的表达量,结果发现lncR7107表达下调后,Fib-H的表达量降低,而miR-2739的表达量升高,观察发现家蚕中有两头出现蚕茧变轻、透亮的现象。表明lnc7107可能作为miR-2739的海绵,竞争结合miR-2739,从而调控丝素蛋白的合成。同时,我们还检测了lnc18326和lnc1433以及与其有互补序列的miRNA,miR-2841和miR-11-3p的互作关系。miR-2841和miR-11-3p预测的靶基因分别为丝胶合成关键基因Ser2,这两个基因在中部丝腺中高表达。家蚕5龄3天至5龄末期前、中、后部丝腺中的表达谱结果显示,lnc18326和lnc1433在中部丝腺中的表达量较高,而miR-2841在5龄3天中部丝腺的表达量较低,miR-11-3p在5龄3天至5龄5天中部丝腺的表达量均低于丝腺其它部位。随后在HEK293细胞系中用双荧光素酶活性检测的方法鉴定了两个miRNA与Ser2之间的体外互作,结果发现共转染miRNA模拟物后细胞荧光素酶活性没有显着下降,Ser2可能不是两个miRNA的靶标。用dsRNA干涉两个lncRNA的表达,检测两个miRNA和Ser2的表达量,发现没有明显变化趋势,观察家蚕表型没有异常。表明lnc18326和lnc1433可能通过其它机制与其互补链上产生的miRNA共同参与调控家蚕丝胶蛋白的合成,该结果为进一步探索lncRNA调控家蚕丝胶蛋白合成奠定了良好的基础。综上所述,我们以家蚕丝腺为实验材料,对lncRNA,miRNA及其靶基因三者之间的调控关系进行了初步探究,从而为深入探索lncRNA调控家蚕丝蛋白的合成奠定了良好基础,从lncRNA角度为培育高产优质的蚕丝新品种提供了一定的理论依据。
钱平,蒋涛,何平,陈晨,唐旭东,唐顺明,沈兴家[8]（2017）在《家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究》文中指出对家蚕中部丝腺小RNA高通量测序获得若干新miRNA,生物信息学分析发现Bmo-miR-0047可能对家蚕丝胶蛋白基因Bm Ser-1有调控作用。设计特异性茎环引物,利用半定量RT-PCR检测分析家蚕5龄3 d幼虫丝腺（包括前、中、后部丝腺）、头部、脂肪体、表皮、中肠、马氏管、精巢/卵巢、血淋巴细胞和气管等12个器官组织中Bmo-miR-0047的表达情况。结果显示,中部丝腺中Bmo-miR-0047的相对表达量明显高于其他组织,说明在家蚕5龄幼虫期Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因的表达调控存在时空特异性。为了进一步分析Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因表达的调控作用,构建重组表达载体pc DNA3.0（ie1-egfp-pri-miR-0047-SV40）和p GL3（A3-luc-Bm Ser-1 3’UTR-SV40）,并以海肾荧光素酶报告质粒pRL-CMV为内参,利用家蚕卵巢培养细胞Bm N进行共转染。转染后检测发现实验组Bm N细胞中的荧光素酶活性与对照组相比显着减弱,表明Bmo-miR-0047在体外培养细胞中对Bm Ser-1基因的表达具有负调控作用。
刘娜[9]（2018）在《家蚕茧丝性状相关性分析及部分基因的功能研究》文中研究说明家蚕是具有经济价值的鳞翅目模式昆虫。茧丝作为饲养家蚕主要的效益产品,其茧丝性状是蚕桑行业产量和质量效益的主要决定因素,因此充分了解和研究家蚕茧丝性状,对选育茧丝性状良好的蚕品种、提高蚕茧生产效益有着重要的意义。家蚕五龄幼虫的丝腺能够大量合成丝蛋白,但是在不同的家蚕品系中,其丝腺合成丝蛋白的能力不同,从而产丝量存在着明显的差异。探究家蚕产丝机制以及不同品系家蚕产丝量的差异,挖掘与丝蛋白合成相关的功能基因,对阐释家蚕产丝的分子机制以及构建家蚕生物反应器有着促进作用。近年来,随着高通量测序技术的发展,推动了基因组学以及功能基因组学的研究。本研究以多丝量品系菁松（JS）和少丝量品系兰10（L10）为研究样本,对两个品系的家蚕的丝腺以及产丝量展开研究。根据这两个品系家蚕丝腺的转录组测序数据结合家蚕茧丝性状QTL定位的信息,挖掘影响茧丝产量性状的功能基因,为研究家蚕茧丝性状的决定机制打下基础。1、以多丝量品系JS和少丝量品系L10为研究样本,构建杂交F2代群体,并对该群体的部分茧质性状进行调查统计,结果发现在调查的1179个F2代个体的茧层量和全茧量性状分离明显,并且雌雄茧质性状的分布均呈现正态曲线,符合数量性状连续变异的基本特征,茧层量和全茧量的极大值和极小值接近于亲本值。同时我们对该F2代群体的全茧量、茧层量、蛹重和茧层率这四个茧质性状进行相关性分析,发现除了茧层率与蛹重之间的相关性较低外,其余的几个茧质性状之间的相关系数均很高。该F2代群体的调查和统计,为家蚕茧质性状相关基因的定位分析提供了基础样本。2、本研究小组前期通过高通量测序技术得到JS和L10家蚕品系五龄第三天丝腺的转录本数据,获得了1411个差异表达基因,其中包括一些与蛋白生物合成相关的转录因子,它们在两品系之间的转录水平上存在较大差异。结合NCBI数据库中家蚕转录因子的筛选以及生物信息学分析,以转录因子E2F为研究对象,分析该转录因子在家蚕JS和L10五龄丝腺中的表达模式。另外根据已知背景,在果蝇的细胞周期信号通路中E2F与Dp结合激活Ras85D的表达。我们分析了家蚕同源基因Ras1在五龄丝腺中的表达谱,同时根据qRT-PCR得到的结果分析了家蚕转录因子E2F与家蚕Ras1基因的表达相关性。比较了E2F与Ras1基因同丝蛋白基因Fib-H,Fib-L,P25五龄后部丝腺的表达谱,结果发现这几个基因的表达相关性较高,证实了转录因子E2F和Ras1基因同三个丝蛋白基因的表达模式非常相似,并且这两个基因对茧丝产量有影响,同时推测这两个基因在丝蛋白的合成过程中也有一定的影响。3、酪氨酸激酶基因Abl普遍存在于细胞核和细胞质中,参与多种信号转导,主要是在细胞增殖以及细胞周期中起着重要的调控作用。在家蚕JS和L10丝腺转录数据中,Abl基因在JS中的表达量高于L10两倍左右。我们通过CRISPR-Cas9系统构建了表达Abl guide RNA的质粒pBac[IE1-DsRed2-U6-Abl-sgRNA 1+U6-Abl-sgRNA 2]。将构建好的质粒注射到家蚕的卵中,得到G0代自交产卵获得G1代,筛选得到单阳性个体,并与Cas9品系杂交,获得G2代双阳性个体的转基因家蚕品系。我们比较了转基因的双荧光个体与野生型家蚕的全茧量与茧层量,发现均有明显的差异,其中Abl基因敲除型的突变体全茧量比野生型的降低了11.54%,茧层量比野生型的低25%。因此我们推测家蚕Abl基因对茧丝量生产有一定的影响。本文基于前期转录组测序结果,将获得的差异表达基因结合生物信息学分析以及相关文献知识,比对筛选到转录因子E2F、家蚕基因Ras1以及家蚕酪氨酸激酶基因Abl,对这三个基因在五龄丝腺中的表达量进行定量分析测定,分析三者之间在细胞周期信号通路中的上下游关系,推测Abl基因处于另外两个基因的上游。利用CRISPR/Cas9技术对Abl基因进行敲除,根据表型分析以及基因型分析,可以确定家蚕Abl基因对丝蛋白的分泌有一定的影响作用。这一研究为解析家蚕产丝的分子机制提供了部分依据,同时对选育家蚕多丝量品种有着指导作用。
赵晓明[10]（2017）在《蜕皮激素和保幼激素对家蚕丝蛋白基因表达的影响》文中研究表明蜕皮激素（Ecdysone,20-hydroxyecdysone,20E）和保幼激素（Juvenile Hormone,JH）可以调控昆虫的生长发育,家蚕丝腺的生长发育及丝蛋白的合成也受到20E和JH的调节。为了研究20E和JH对家蚕丝蛋白基因表达的调控作用,本文检测分析了三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”丝蛋白基因表达水平的差异;离体培养家蚕丝腺,分析其在激素诱导下丝蛋白基因的表达水平;并分析了丝素基因5’侧翼区中与激素诱导相关的重要区域。结果如下:1三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”丝蛋白基因的表达水平分析1.1三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”ser-1基因的表达趋势均表现为龄初快速上升然后下降。其中三眠蚕“三光”4龄期ser-1基因的表达量最高上调了3.0倍,四眠蚕“皓月”4龄期ser-1基因的表达量最高上调了1.5倍,5龄期最高上调了2.8倍,其中三眠蚕4龄期ser-1基因的表达水平上调倍数最高。1.2三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”丝素基因的表达均表现出从起蚕开始直线上升的趋势。三眠蚕“三光”4龄期fib-H、fib-L和p25基因的表达量最高分别上调了2.8倍,2.9倍,5.2倍。四眠蚕“皓月”4龄期fib-H、fib-L和p25基因的表达量最高分别上调了1.4倍、1.4倍、2.2倍;5龄期最高分别上调了4.5倍、6.2倍、24.3倍。其中四眠蚕“皓月”5龄期丝素基因上调倍数最高,其次是三眠蚕“三光”4龄期。1.3无论是三眠蚕“三光”4龄期还是四眠蚕“皓月”4龄期、5龄期丝素基因的表达量高低依次为:p25、fib-H、fib-L;表达量上调倍数高低依次为:p25、fib-L、fib-H。2激素处理体外培养丝腺丝蛋白基因的早期（0-24h）表达分析2.1 20E处理对丝蛋白基因表达的早期影响20E单独处理时,中浓度20E处理组对ser-1基因的表达水平有促进作用并在12h最为显着;不同浓度20E处理均抑制了fib-H基因的表达水平;对于fib-L基因的表达,高浓度20E处理具有促进作用;不同浓度20E处理均能促进p25基因的表达,且中、高浓度效果更为显着。2.2 JHⅢ处理对丝蛋白基因表达的早期影响JHⅢ单独处理对丝蛋白基因的表达以抑制作用为主。其中只有低浓度JHⅢ处理对ser-1基因的表达在早期有促进作用,其余浓度对ser-1基因的表达起抑制作用;不同浓度JHⅢ处理对fib-H、fib-L和p25基因的表达均有抑制作用。2.3 20E和JHⅢ共同处理对丝蛋白基因表达的早期影响一般情况下,20E和JHⅢ共同处理比单种激素处理更有利于丝蛋白基因的表达,但特定的浓度比例促进作用更为明显。低浓度20E+中浓度JHⅢ处理组对3种丝素基因的表达均有促进作用;中浓度20E+中浓度JHⅢ处理组对ser-1基因和p25基因的表达起促进作用;中浓度20E+低浓度JHⅢ处理组促进ser-1基因和fib-H基因的表达。在某些特殊情况下,例如,JHⅢ浓度太低时,共同处理不但对丝蛋白基因的表达无促进作用,反而严重抑制了fib-L和p25基因的表达。3.激素诱导后家蚕丝素基因启动子活性分析实验结果表明,在本实验所用Bmfib-H、Bmfib-L基因5’侧翼区全长（Bmfib-H全长+36-1164 bp;Bmfib-L全长+15-1061 bp）及不同短截片段中,20E、JHⅢ单独处理以及20E和JHⅢ共同处理均不同程度抑制了Bmfib-H、Bmfib-L基因各启动子片段的活性,且与对照相比均未发现活性上调的片段。20E、JHⅢ单独处理以及20E和JHⅢ共同处理显着抑制Bmp25基因启动子-1342-1032 bp片段的活性,却显着上调-743-662 bp片段的活性,表明Bmp25基因启动子-1342-1032 bp之间可能存在与20E或JHⅢ诱导相关的抑制区域;而-743-662bp之间可能存在促进激素诱导作用的区域或转录因子,进一步的基因启动子突变结果表明,GA-BF和HNF-1A转录结合位点是激素促进Bmp25启动子-743+38 bp区域活性所必需的。总之,在本研究中,通过比较分析三眠蚕“三光”和四眠蚕“皓月”丝蛋白基因的表达水平,发现丝蛋白基因的表达水平在四龄或五龄前期20E和JH均处于极低水平的情况下即快速上升,在龄中后期随着20E和JH滴度上调,ser-1基因的表达下降,而丝素基因的表达水平继续上升达到最高,表明在个体体内,20E和JH对丝蛋白基因表达的影响较为复杂,有待于今后深入地研究;通过分析激素诱导体外培养丝腺中丝蛋白基因的表达水平,发现20E和JHⅢ共同处理比激素单独处理更有利于丝蛋白基因的表达,但共同处理组JHⅢ浓度过低会抑制fib-L和p25基因的表达;此外,通过分析激素诱导后Bmp25基因启动子的活性,发现GA-BF和HNF-1a转录结合位点是激素促进Bmp25启动子-743+38 bp区域活性所必需的。这些结果为今后研究家蚕丝蛋白基因的激素调控提供理论参考。
二、家蚕丝胶基因的表达及调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、家蚕丝胶基因的表达及调控（论文提纲范文）
（1）脂联素对冠脉搭桥术后静脉桥血管再狭窄的抑制作用及利用脂联素转基因家蚕蚕丝制备血管外支架的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 脂联素抑制冠脉搭桥术后静脉桥血管再狭窄的研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 再狭窄机制研究 |
| 1.3 脂联素 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组大鼠手术及存活状况 |
| 3.2 脂联素抑制移植静脉内膜、中膜和外膜增生 |
| 3.3 脂联素抑制静脉移植PCNA表达 |
| 3.4 脂联素下调静脉移植后VCAM-1和ICAM-1的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 脂联素转基因家蚕品系的建立及蚕丝材料血管外支架制备 |
| 1 前言 |
| 1.1 脂联素 |
| 1.2 血管外支架 |
| 1.3 蚕丝生物材料及家蚕生物反应器 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 rhADP转基因品系构建 |
| 3.2 转基因蚕茧rhADP表达检测 |
| 3.3 rhADP基因插入位点的鉴定 |
| 3.4 rhADP蛋白的分离浓缩 |
| 3.5 rhADP毒性实验及促增殖作用 |
| 3.6 rhADP抑制LPS诱导巨噬细胞raw264.7的炎症反应 |
| 3.7 rhADP转基因家蚕品系经济性状调查 |
| 3.8 rhADP转基因家蚕品系特性分析 |
| 3.9 rhADP转基因蚕丝血管外支架的制备及特性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 冠心病危险因素和治疗方法的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 家蚕丝腺研究进展 |
| 1.1.1 家蚕丝腺的结构及功能 |
| 1.1.2 家蚕丝腺的发生和发育 |
| 1.1.3 家蚕丝腺发育的调控机理 |
| 1.2 Slit-Robo信号通路的研究进展 |
| 1.2.1 Slit-Robo家族简介 |
| 1.2.2 Slit-Robo信号通路基本结构 |
| 1.2.2.1 Slit基本结构 |
| 1.2.2.2 Robo基本结构 |
| 1.2.3 Slit-Robo信号通路的主要功能 |
| 1.2.3.1 对神经轴突的导向作用 |
| 1.2.3.2 调节细胞迁移 |
| 1.2.3.3 参与器官形成 |
| 1.3 Tbx20的研究进展 |
| 1.3.1 T-box家族简介 |
| 1.3.2 tbx20基因的鉴定 |
| 1.3.3 转录因子Tbx20的功能研究 |
| 1.3.3.1 调控心脏的发育 |
| 1.3.3.2 控制细胞的迁移 |
| 1.3.3.3 促进心肌细胞的增殖 |
| 1.3.4 tbx20的表达调控机制 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试剂及配制 |
| 2.1.2.1 试剂及试剂盒 |
| 2.1.2.2 相关试剂的配制 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 生物信息学分析工具及数据处理软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因在家蚕丝腺中的表达测定 |
| 2.2.1.1 取材 |
| 2.2.1.2 家蚕丝腺总RNA的提取 |
| 2.2.1.3 RNA反转录合成c DNA |
| 2.2.1.4 qPCR引物设计 |
| 2.2.1.5 qPCR反应体系及程序 |
| 2.2.1.6 数据处理与分析 |
| 2.2.2 BmSlit、BmRobo和 BmTbx20 蛋白在家蚕丝腺中的表达定位 |
| 2.2.2.1 抗体稀释 |
| 2.2.2.2 家蚕丝腺解剖与染色前处理 |
| 2.2.2.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.3 Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎期丝腺发育的影响分析 |
| 2.2.3.1 siRNA的设计与注射液的配制 |
| 2.2.3.2 显微注射前准备工作 |
| 2.2.3.3 注射卵的制备 |
| 2.2.3.4 蚕卵的显微注射 |
| 2.2.3.5 RNAi对家蚕胚胎期Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因表达水平影响测定 |
| 2.2.3.6 RNAi对家蚕胚胎发育和丝腺发生的影响观察 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期的表达模式 |
| 3.1.1 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫前部丝腺中的表达变化 |
| 3.1.2 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫中部丝腺中的表达变化 |
| 3.1.3 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫后部丝腺中的表达变化 |
| 3.2 BmSlit和 BmRobo在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期的组织定位 |
| 3.2.1 BmSlit和 BmRobo在家蚕胚胎期丝腺中定位 |
| 3.2.2 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期前部丝腺中共定位 |
| 3.2.3 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期中部丝腺中共定位 |
| 3.2.4 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期后部丝腺中共定位 |
| 3.3 Bmslit和 Bmrobo基因RNAi对家蚕胚胎期相关基因表达的影响 |
| 3.3.1 RNAi对家蚕胚胎期Bmslit基因表达水平的影响 |
| 3.3.2 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo1a基因表达水平的影响 |
| 3.3.3 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo1b基因表达水平的影响 |
| 3.3.4 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo2/3 基因表达水平的影响 |
| 3.4 转录因子BmTbx20 在家蚕丝腺中的表达定位及其对Bmslit和 Bmrobo的表达调控 |
| 3.4.1 Bmtbx20在家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期的表达模式 |
| 3.4.2 BmTbx20和BmSlit在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期的组织定位 |
| 3.4.3 BmTbx20 调控Bmslit和 Bmrobo的表达 |
| 3.5 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎发育和丝腺发生的影响 |
| 3.5.1 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎发育的影响 |
| 3.5.2 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕丝腺发生的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（3）家蚕丝胶蛋白的分层绿色制备、理化特性与体外生物活性及其应用于生物墨水的探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 家蚕丝胶蛋白概述 |
| 2. 蚕茧或蚕丝脱胶方法 |
| 2.1. 碱性溶液脱胶 |
| 2.2. 酸性溶液脱胶 |
| 2.3. 高温高压水脱胶 |
| 2.4. 表面活性剂脱胶 |
| 2.5. 高浓度盐/有机物水溶液脱胶 |
| 2.6. 新能源脱胶 |
| 2.7. 生物法脱胶 |
| 3. 丝胶的生物学活性及其应用 |
| 3.1. 抗氧化 |
| 3.2. 抗紫外及抑菌活性 |
| 3.3. 抑制酪氨酸酶活性 |
| 3.4. 降血糖、血脂 |
| 3.5. 改善肠胃功能 |
| 3.6. 抗肿瘤 |
| 3.7. 细胞增殖、伤口愈合 |
| 3.8. 护肤、表面活性剂 |
| 3.9. 表面改性材料 |
| 3.10. 医用组织工程材料 |
| 3.11. 丝胶在生物打印材料中应用 |
| 4. 本课题的研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 丝胶蛋白的分层制备与其特性及生物活性 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 2.1. 实验材料 |
| 2.2. 实验方法 |
| 3. 实验结果与分析 |
| 3.1. 蚕茧脱胶率 |
| 3.2. 丝胶粉末外观 |
| 3.3. 钙离子浓度 |
| 3.4. 溶解度 |
| 3.5. 吸湿保湿性能 |
| 3.6. 粒度分布 |
| 3.7. 分子量范围 |
| 3.8. 热性能 |
| 3.9. 氨基酸组成 |
| 3.10. 红外光谱 |
| 3.11. X-射线衍射图谱 |
| 3.12. 抗紫外能力 |
| 3.13. 抗氧化活性 |
| 3.14. 抑菌活性 |
| 3.15. 抑制酪氨酸酶活性 |
| 3.16. 抑制α-葡萄糖苷酶活性 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 丝胶蛋白应用于生物墨水的探索 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 2.1. 实验材料 |
| 2.2. 实验方法 |
| 3. 实验结果与分析 |
| 3.1. 生物打印的水凝胶外观 |
| 3.2. 表面形貌表征 |
| 3.3. 平均孔径、孔隙率 |
| 3.4. 力学性能 |
| 3.5. 溶胀率 |
| 3.6. 降解率 |
| 3.7. 药物释放率 |
| 3.8. 细胞相容性 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章结论 |
| 参考文献 |
| 缩写索引 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（4）let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 丝腺发育与丝蛋白表达调控 |
| 1.2.1 丝腺发育 |
| 1.2.2 丝蛋白合成与分泌 |
| 1.3 非编码RNA研究进展 |
| 1.3.1 非编码RNA分类及主要功能 |
| 1.3.2 miRNA的产生与作用机制 |
| 1.3.3 miRNA Cluster |
| 1.3.4 家蚕非编码RNA研究进展 |
| 1.4 let-7 研究进展 |
| 1.4.1 let-7 在发育中的调控作用 |
| 1.4.2 let-7 在癌症中的调控作用 |
| 1.4.3 let-7 在细胞周期调控中的作用 |
| 1.5 miRNA功能研究方法 |
| 1.5.1 基于大数据的miRNA研究方法 |
| 1.5.2 基于化学合成和转基因技术的miRNA研究方法 |
| 1.5.3 基于基因编辑技术的miRNA研究方法 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 科学问题及主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 家蚕丝腺miRNA研究方法探索 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 实验方法与步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 功能试剂注射及效果检测 |
| 3.2.2 miR-274 sponge特异性下调miR-274 |
| 3.2.3 miR-274转基因过表达 |
| 3.2.4 利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除miR-274 |
| 3.3 总结与讨论 |
| 第四章 家蚕let-7C miRNA抑制家蚕细胞增殖 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 实验方法与步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 let-7C miRNAs的在不同发育时期的家蚕个体和组织中的表达谱分析 |
| 4.2.2 let-7C miRNAs在五龄幼虫丝腺中的时序表达 |
| 4.2.3 let-7C miRNAs对家蚕Bm E细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 let-7C miRNAs对家蚕Bm Ns细胞增殖的影响 |
| 4.3 总结与讨论 |
| 第五章 let-7C miRNA敲除对中部丝腺生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要仪器与试剂 |
| 5.1.3 实验方法与步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 敲除let-7和let-7C双gRNA表达品系 |
| 5.2.2 中部丝腺let-7和let-7C敲除个体 |
| 5.2.3 let-7及let-7C敲除促进中部丝腺生长 |
| 5.2.4 中部丝腺敲除let-7和let-7C后的表型差异 |
| 5.2.5 中部丝腺敲除let-7和let-7C对家蚕吐丝的影响 |
| 5.3 总结与讨论 |
| 第六章 let-7C miRNA对后部丝腺生长的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 主要仪器与试剂 |
| 6.1.3 实验方法与步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 let-7和let-7C后部丝腺敲除个体获取 |
| 6.2.2 let-7 敲除对后部丝腺生长的影响 |
| 6.2.3 let-7C敲除对后部丝腺生长的影响 |
| 6.2.4 敲除后部丝腺let-7和let-7C产生的表型差异 |
| 6.2.5 let-7和let-7C敲除促进后部丝腺细胞核内复制 |
| 6.2.6 过表达let-7C miRNA对丝腺生长的影响 |
| 6.3 总结与讨论 |
| 第七章 let-7 调控丝腺生长的分子机理初探 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 主要仪器与试剂 |
| 7.1.3 实验方法与步骤 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 丝腺RNA提取及质量检测 |
| 7.2.2 测序数据质量评估 |
| 7.2.3 基因表达分析 |
| 7.2.4 差异表达基因聚类分析 |
| 7.2.5 差异表达基因GO和 Pathway富集分析 |
| 7.3 总结与讨论 |
| 第八章 let-7 靶基因鉴定及功能研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 主要仪器与试剂 |
| 8.1.3 实验方法与步骤 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 let-7 靶基因预测 |
| 8.2.2 let-7 表型相关靶基因筛选 |
| 8.2.3 表型相关靶基因表达分析、3’UTR及双荧光素酶报告系统 |
| 8.2.4 let-7 靶基因验证 |
| 8.2.5 靶位点有效性验证 |
| 8.2.6 过表达PC对丝腺生长的影响 |
| 8.2.7 敲除PC对丝腺生长的影响 |
| 8.3 总结与讨论 |
| 第九章 综合与结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表文章和参研课题 |
| 致谢 |
（5）BmZFP67调控家蚕丝腺有丝分裂-核内有丝分裂转换机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细胞周期 |
| 1.1.1 细胞周期类型 |
| 1.1.2 细胞周期调控机制 |
| 1.2 核内复制 |
| 1.2.1 核内复制概述 |
| 1.2.2 核内复制调控机制 |
| 1.3 核内有丝分裂 |
| 1.3.1 核内有丝分裂概述 |
| 1.3.2 家蚕丝腺核内有丝分裂研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景与目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换时期鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 家蚕胚胎期丝腺组织获取 |
| 3.2.2 qRT-PCR分析不同发育时期丝腺组织中细胞周期调控基因表达情况 |
| 3.2.3 丝腺组织免疫荧光确定细胞周期类型 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 家蚕丝腺组织有丝分裂-核内有丝分裂转换调控相关基因筛选 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转录组样品质量检测 |
| 4.2.2 转录组组内样品重复性分析 |
| 4.2.3 转录组差异基因鉴定 |
| 4.2.4 KEGG富集分析 |
| 4.2.5 转录组-酵母双杂交数据联合分析 |
| 4.2.6 BmZFP67基因时空表达模式分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 BmZFP67基因在家蚕细胞及丝腺组织中的功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BmZFP67基因的基本特征分析及鉴定 |
| 5.2.2 BmZFP67基因在不同细胞周期时相中的表达情况分析 |
| 5.2.3 过表达BmZFP67影响细胞增殖及细胞周期 |
| 5.2.4 敲除BmZFP67影响细胞周期时相和细胞周期相关蛋白表达 |
| 5.2.5 敲除BmZFP67诱导异倍体细胞形成 |
| 5.2.6 BmZFP67丝腺特异性过表达品系有丝分裂-核内有丝分裂转换时期分析 |
| 5.2.7 BmZFP67丝腺特异性过表达品系丝腺及蚕丝产量变化分析 |
| 5.2.8 BmZFP67丝腺特异性敲除品系丝腺DNA含量、蚕茧量情况分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 BmZFP67基因调控网络研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 BmZFP67蛋白转录调控靶位点预测 |
| 6.2.2 双荧光素酶报告系统鉴定BmZFP67蛋白转录调控靶基因 |
| 6.2.3 双荧光素酶报告系统、染色质免疫共沉淀鉴定BmZFP67蛋白转录调控靶位点 |
| 6.2.4 Co-IP-MS筛选鉴定BmZFP67相互作用蛋白 |
| 6.2.5 相互作用蛋白特征分析 |
| 6.2.6 互作蛋白对BmZFP67蛋白转录调控功能的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 综合与结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参研课题 |
| 致谢 |
（6）利用转基因家蚕丝腺表达重组hVEGF165的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 家蚕丝腺生物反应器 |
| 1.2.1 家蚕生物反应器的优势 |
| 1.2.2 家蚕生物反应器表达系统 |
| 1.2.3 家蚕转基因表达系统的应用 |
| 1.3 人血管内皮生长因子 |
| 1.3.1 人血管内皮生长因子的位置与结构 |
| 1.3.2 人血管内皮生长因子受体 |
| 1.3.3 人血管内皮生长因子的外源表达及应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 转基因家蚕的制作 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 |
| 3.1.3 主要溶液及配制 |
| 3.1.4 家蚕转基因表达载体的构建 |
| 3.1.5 显微注射及荧光筛选 |
| 3.1.6 基因组PCR |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 显微注射和阳性个体筛选 |
| 3.2.2 转基因表达个体的分子确认 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 hVEGF165 的表达特征 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 主要溶液及配制 |
| 4.1.4 hVEGF165 基因转录表达检测 |
| 4.1.5 重组hVEGF165 蛋白的表达检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 hVEGF165 基因的转录表达 |
| 4.2.2 重组hVEGF165 蛋白的表达检测 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 重组hVEGF165 蛋白的生物活性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.1.3 主要溶液及配制 |
| 5.1.4 重组hVEGF165 蛋白的提取与浓缩 |
| 5.1.5 HUVE细胞培养 |
| 5.1.6 重组hVEGF165 蛋白促细胞增殖活性 |
| 5.1.7 重组hVEGF165 蛋白在茧粉中的释放特征分析 |
| 5.1.8 蚕茧薄片促细胞增殖分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组hVEGF165 蛋白二聚体检测 |
| 5.2.2 重组hVEGF165 蛋白的促进细胞增殖活 |
| 5.2.3 重组hVEGF165 蛋白的释放特征 |
| 5.2.4 转基因茧片的促细胞增殖活性分析 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 总结与结论 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）长链非编码RNA对家蚕丝蛋白合成相关基因的表达调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 家蚕丝蛋白 |
| 1.1.1 家蚕丝腺结构 |
| 1.1.2 丝素蛋白与其相关基因 |
| 1.1.3 丝胶蛋白与其相关基因 |
| 1.1.4 丝蛋白功能的研究进展 |
| 1.2 非编码RNA |
| 1.2.1 非编码RNA概述 |
| 1.2.2 lncRNA的结构功能和研究进展 |
| 1.2.3 miRNA的结构功能和研究进展 |
| 1.2.4 ceRNA的调控机制和研究进展 |
| 1.3 研究的意义和主要内容 |
| 第2章 lnc7107 对丝素合成相关基因表达调控 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 lnc7107与miRNA在基因组上的位置关系及miRNA靶基因预测 |
| 2.2.2 lnc7107 与其互补链miRNA及丝素合成基因的表达谱分析 |
| 2.2.3 体外验证miRNA与其靶基因的互作关系 |
| 2.2.4 个体中lnc7107、miR-2739和Fib-H相互调控的关系 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 lnc18326和lnc1433 对丝胶合成相关基因表达调控 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 lncRNA与 miRNA在基因组上的位置关系及miRNA靶基因预测 |
| 3.2.2 lncRNA与其互补链miRNA的表达谱分析 |
| 3.2.3 体外验证miRNA与其靶基因的互作关系 |
| 3.2.4 个体中lncRNA、miRNA和 Ser2 相互调控的关系 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历及硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和主要试剂 |
| 1.2 调控靶基因Bm Ser-1的候选家蚕miRNAs预测 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 候选家蚕miRNA的克隆及前体二级结构预测 |
| 1.5 候选家蚕miRNA的组织表达模式分析 |
| 1.6 含靶基因和候选miRNA的重组表达载体构建 |
| 1.7 质粒转染细胞及荧光素酶活性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bm Ser-1 3'UTR具有潜在的Bmo-miR-0047结合位点 |
| 2.2 候选家蚕miRNA Bmo-miR-0047的鉴定 |
| 2.3 Bmo-miR-0047和靶基因Bm Ser-1的表达模式 |
| 2.4 Bmo-miR-0047对Bm Ser-1表达的调控作用 |
| 2.4.1 miRNA表达载体的鉴定 |
| 2.4.2 质粒共转染Bm N细胞的荧光素酶活性 |
| 3 讨论 |
（9）家蚕茧丝性状相关性分析及部分基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 茧丝性状的研究现状 |
| 1.2.1 家蚕茧丝性状概述 |
| 1.2.2 茧丝性状在家蚕传统育种方面的研究与应用 |
| 1.2.3 分子标记技术在茧丝性状研究中的应用 |
| 1.3 茧丝性状相关基因的研究 |
| 1.3.1 家蚕茧丝性状在基因组学水平上的研究 |
| 1.3.2 家蚕茧丝性状在基因水平上的研究 |
| 1.3.3 家蚕茧丝性状在蛋白质组学水平上的研究 |
| 1.4 家蚕泌丝系统的研究 |
| 1.4.1 家蚕丝腺的结构及其功能 |
| 1.4.2 蚕丝及丝蛋白的组成和结构 |
| 1.4.3 家蚕吐丝机制概述 |
| 1.4.4 影响家蚕丝蛋白合成相关的转录因子概述 |
| 1.5 基因组编辑技术在基因功能验证的应用 |
| 1.6 本研究目的和意义 |
| 第2章 家蚕茧丝量性状相关性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料的选择以及群体的组配 |
| 2.2.2 茧质相关数据的收集和统计 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 杂交群体茧质性状数据的统计 |
| 2.3.2 杂交群体茧质性状相关性分析 |
| 2.4 结果讨论 |
| 第3章 影响丝蛋白合成的相关转录因子的表达模式分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 转录因子数据及相关基因的筛选 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 主要实验仪器和设备 |
| 3.2.4 常用溶液的配制 |
| 3.2.5 样品准备 |
| 3.2.6 RNA提取 |
| 3.2.7 反转录反应 |
| 3.2.8 cDNA扩增反应及电泳检测 |
| 3.2.9 qRT-PCR验证分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 转录因子的筛选 |
| 3.3.2 E2F基因在丝腺中表达模式的测定 |
| 3.3.3 Ras1基因在丝腺中表达模式的测定 |
| 3.3.4 转录因子E2F与Ras1基因的相关性分析 |
| 3.4 结果讨论 |
| 第4章 酪氨酸激酶基因对茧丝产量影响的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂和试验仪器 |
| 4.2.3 常用溶液的配制 |
| 4.2.4 家蚕丝腺组织RNA的抽提 |
| 4.2.5 反转录反应以及qRT-PCR反应 |
| 4.2.6 sgRNA靶点选择以及质粒构建 |
| 4.2.7 DNA提取 |
| 4.2.8 PCR体系和条件 |
| 4.2.9 切胶回收 |
| 4.2.10 PCR产物的连接、转化及克隆测序 |
| 4.2.11 质粒大量提取与纯化 |
| 4.2.12 家蚕遗传转化 |
| 4.2.13 表型分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 家蚕Abl基因 |
| 4.3.2 Abl基因在丝腺中的表达模式测定 |
| 4.3.3 Abl基因的gRNA转基因家蚕获得 |
| 4.3.4 Abl转基因家蚕品系的表型分析以及基因型分析 |
| 4.4 结果讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
（10）蜕皮激素和保幼激素对家蚕丝蛋白基因表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蜕皮激素和保幼激素 |
| 1.1 蜕皮激素及其应用 |
| 1.2 保幼激素及其应用 |
| 2 家蚕丝腺及丝蛋白的研究进展 |
| 2.1 家蚕丝腺的结构与功能 |
| 2.2 丝蛋白的组成 |
| 3 家蚕丝蛋白基因的结构功能与转录调控 |
| 3.1 丝胶基因的基因结构 |
| 3.2 丝素基因的基因结构及顺式作用元件 |
| 3.3 丝蛋白基因的反式作用调控 |
| 3.4 家蚕丝蛋白基因表达的激素调控 |
| 4 启动子的功能研究 |
| 4.1 启动子的功能分析与研究方法 |
| 4.2 双报告基因分析系统 |
| 第二章 不同眠性家蚕丝蛋白基因的表达水平分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 家蚕品种及饲养 |
| 2.2 化学试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同眠性家蚕中部丝腺中丝胶基因（ser-1）的表达差异 |
| 3.2 不同眠性家蚕后部丝腺中丝素基因（fib-H、fib-L、p25）的表达差异 |
| 4 讨论 |
| 第三章 蜕皮激素与保幼激素对体外培养丝腺中丝蛋白基因表达的早期影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和缓冲液 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 激素处理对家蚕丝胶基因（Bmser-1）表达水平的早期影响 |
| 3.2 激素处理对家蚕丝素基因（Bmfib-H、Bmfib-L、Bmp25）表达水平的早期影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蜕皮激素对丝蛋白基因表达的早期影响 |
| 4.2 保幼激素对丝蛋白基因表达的早期影响 |
| 4.3 蜕皮激素和保幼激素共同作用对丝蛋白基因表达的早期影响 |
| 4.4 蜕皮激素和保幼激素对丝蛋白基因表达的影响 |
| 第四章 家蚕丝素基因 5’侧翼区与激素诱导相关的区域及转录因子分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与主要试剂 |
| 2.2 家蚕丝素基因的启动子的克隆 |
| 2.3 荧光素酶报告质粒的构建 |
| 2.4 沉淀法质粒抽提 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 细胞抽提物制备和双荧光素酶活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 激素诱导后家蚕丝素重链基因（Bmfib-H）启动子活性分析 |
| 3.2 激素诱导后家蚕丝素轻链基因（Bmfib-L）启动子活性分析 |
| 3.3 激素诱导后家蚕p25基因（Bmp25）启动子活性分析 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 1 研究结果 |
| 1.1 三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”丝蛋白基因的表达分析 |
| 1.2 体外培养条件下激素处理丝腺后早期（0-24 h）丝蛋白基因的表达分析 |
| 1.3 激素诱导后家蚕丝素基因启动子活性分析 |
| 2 研究成果与创见 |
| 3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、家蚕丝胶基因的表达及调控（论文参考文献）
- [1]脂联素对冠脉搭桥术后静脉桥血管再狭窄的抑制作用及利用脂联素转基因家蚕蚕丝制备血管外支架的研究[D]. 周阳. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究[D]. 王芹. 山东农业大学, 2020(01)
- [3]家蚕丝胶蛋白的分层绿色制备、理化特性与体外生物活性及其应用于生物墨水的探索[D]. 赵之林. 苏州大学, 2020(02)
- [4]let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制[D]. 王伟. 西南大学, 2019(05)
- [5]BmZFP67调控家蚕丝腺有丝分裂-核内有丝分裂转换机制研究[D]. 周晓林. 西南大学, 2019(05)
- [6]利用转基因家蚕丝腺表达重组hVEGF165的研究[D]. 张天洋. 西南大学, 2019(01)
- [7]长链非编码RNA对家蚕丝蛋白合成相关基因的表达调控研究[D]. 申雅文. 郑州大学, 2019(07)
- [8]家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究[J]. 钱平,蒋涛,何平,陈晨,唐旭东,唐顺明,沈兴家. 蚕业科学, 2017(06)
- [9]家蚕茧丝性状相关性分析及部分基因的功能研究[D]. 刘娜. 江苏科技大学, 2018(03)
- [10]蜕皮激素和保幼激素对家蚕丝蛋白基因表达的影响[D]. 赵晓明. 苏州大学, 2017(05)