一、CD57与病毒性肝炎关系的研究（论文文献综述）
张梦洁[1]（2021）在《外周血衰老CD8+T细胞频率与2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的相关性分析》文中提出目的研究外周血衰老CD8+T细胞的频率变化与2型糖尿病（T2DM）合并非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者的相关性。方法选取单纯T2DM患者（T2DM）52例,T2DM合并NAFLD者（T2DM+NAFLD）50例及正常对照（NC）者40例,测定外周血衰老CD8+T细胞水平,收集临床资料实验室检查指标,计算改良稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA2-IR）。结果T2DM+NAFLD组外周血衰老CD8+T细胞水平均高于T2DM组和NC组,各组间差异均有统计学意义[分别为（25.73±12.12 vs 17.85±8.61%）、（25.73±12.12vs 17.24±6.32%）,均P<0.05]。Pearson相关分析显示衰老CD8+T细胞与体质量指数（BMI）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、CD3+T细胞、CD4+衰老T细胞呈正相关（r=0.253、0.204、0.879、0.206,均P<0.05）。Logistic回归分析显示,LDL-C、BMI和衰老CD8+T细胞是T2DM合并NFALD的独立危险因素（OR=0.042、0.030、0.027、0.005,均P<0.05）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）是其独立保护因素（OR=0.042,P<0.05）。多元逐步回归分析显示BMI是外周血衰老CD8+T细胞的独立影响因素（β=0.865,P<0.05）。结论外周血衰老CD8+T细胞增加是T2DM合并NFALD的危险因素,且与肥胖、脂代谢紊乱密切相关,可能在糖尿病和NAFLD疾病的发生发展中起一定作用。
马美晨[2]（2020）在《HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究》文中提出目的:NK细胞是固有免疫系统中一类大颗粒淋巴细胞,其主要表达CD56分子和/或CD16分子,不表达CD3分子,在抗肿瘤及抗病毒反应中均起到了重要的作用,是免疫系统的第一道防线。根据其表面的不同标志物可将NK细胞划分为不同的亚群,不同的亚群发挥着不同的功能,包括细胞因子分泌、杀伤靶细胞以及免疫调节作用。单细胞测序作为一项新兴的技术,主要被应用于细胞类型鉴定、细胞异质性、信号通路差异响应及分子调控网络等方面的研究。HIV的感染会导致NK细胞亚群分布及功能的改变,但利用单细胞测序技术研究健康对照及HIV感染者总NK细胞亚群变化还尚未见报道;针对人类CD56+NK细胞,出现了以CD11b、CD27分子划分的新的分群方式,而在对HIV感染的研究中,有关新的分群方式来定义CD56+NK细胞亚群及功能的研究仍未见报道;HIV感染导致NK细胞中CD56-CD16+亚群数量的增加,该亚群的杀伤功能及细胞因子分泌功能减弱,但CD56-CD16+亚群是否发挥着免疫调节功能未知。本研究探究了HIV感染者总NK细胞（CD56+NK细胞及CD56-NK细胞）通过单细胞测序技术来揭示NK细胞亚群特征及分布的改变（论文一）;探讨了HIV感染者CD56+NK细胞应用CD11bCD27定义后各个亚群的功能及其调节作用的研究（论文二）;并对HIV感染者CD56-NK细胞的变化及调节作用进行了较为深入的研究（论文三）,为HIV感染的机制研究和相关免疫治疗提供新的思路及方向。研究方法:1.研究对象本研究所使用的对象均来源于中国医科大学艾滋病研究所红丝带门诊的HIV感染者及男同队列的HIV阴性健康对照者。健康对照者为HIV抗体、乙肝、丙肝均为阴性的健康男性。研究中纳入了59名HIV未治疗感染者、ART治疗者28名及39名健康对照者为研究对象。所有入选者均为男性且年龄相匹配。入选对象签署了知情同意书,并获得了中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。2.CD4+T细胞绝对计数EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周血,将TriTESA-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP染料与全血于流式管中混合,进行室温避光染色,再加入溶血素溶解红细胞,使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行上机检测,应用MultiSET软件进行计算CD4+T细胞绝对数。3.外周血单个核细胞的提取应用PBS稀释混匀负压真空采血管中采集的全血,使用移液管缓慢匀速加入至Ficoll液面上,密度梯度离心后使用加样枪吸取细胞层后使用PBS洗涤细胞两次。4.多色流式细胞术检测细胞表面采用UltraComp eBeadsTM Compensation Beads进行补偿校准。CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD16-BV510、CD11b-APC、CD27-PE、NKG2A-PE、NKG2D-PE、NKG2C-PE、CD11c-PE、CD57-PE、Tigit-PE、CCR7-Percp、CD8-APC-Cy7,CD279（PD-1）-BV421及各染料的isotype作为阴性对照。4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。5.NK表面代谢物质的检测CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD27-BV510、CD11b-APC、Glut-1-PE、CD98-FITC、CD36-APC-Cy7进行4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。6.分选NK细胞及NK亚群提取PBMC后使用NK负选试剂盒（EasySep?Human NK Cell Enrichment Kit）富集PBMC中的NK细胞。NK亚群的分选:提前一天使用1-2ml R10放入流式管中,使R10充分湿润管壁后放入4℃冰箱中过夜。次日提取PBMC后,使用含有EDTA的PBS洗细胞两次,300g,10min,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7、CD16-APC、CD8-APC-Cy7、CD11b-APC、CD27-PE 4℃,30min,避光,染色结束后使用含有2%FBS的PBS洗细胞,350g,5min,重复两次。弃掉上清后使用含有EDTA的PBS重悬细胞至2-3ml,使用Aria II分选仪进行分选。7.多色流式细胞术检测胞内因子计数细胞后使用R10重悬后加入至U底96孔板中,保证每孔中含有0.2-0.5million个PBMC,在PBMC周围孔中补200ul PBS以保证目的孔湿度,在PBMC中加入10 ng/mL人重组IL-12、50 ng/m L rIL-15、100 ng/mL rIL-18刺激PBMC 24小时同时加入CD107a-APC-Cy7及isotype,在收细胞前的6小时,在每孔中加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打孔中细胞后收入标记好的流式管中,并用200ul PBS冲洗孔两次,保证PBMC全收入至流式管中。在流式管中加入2ml的PBS,350g,5min,洗细胞,重复两次。在最后一次洗细胞后,使用PBS将细胞重悬至200ul,使用振荡器混匀后进行表面染:CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-BV510荧光抗体染色,避光染色30min,4℃,用2%FBS洗涤细胞,350g,5min,重复此步骤两次,洗去未结合染料。破膜及胞内染色:每管中加入250ul破膜剂,避光,室温进行破膜20min,20min后离心,500g,5min,使用1ml破膜洗液洗涤细胞以去除破膜剂,使用IL-10-APC、TGF-β-PE及IFN-γ-FITC染胞内,4℃,避光,30min染色,结束后使用1×破膜洗液1ml/管洗涤细胞,500g,5min,弃上清后重悬至200ul,使用LSR II流式细胞仪上样检测。8.NK细胞亚群胞内Granzyme B及Perforin的检测实验中使用K562细胞系刺激NK细胞,K562细胞系使用PBS洗涤后,按照2 ul/5million比例加入Cell-Trace-Violet用于标记K562细胞系,37℃,5%CO2,20min,避光染色。染色结束后使用含有FBS的R10终止染色5-10min,R10洗涤细胞,300g,10min,重复两次。计数细胞,调整细胞比例,效靶比（PBMC:K562=5:1）,使细胞数在0.2-0.5 million/200ul,种入96孔板中培养6h。培养结束后使用加样枪将培养板中的细胞移入标记好的流式管中,200ul PBS重复洗涤孔板。2ml 2%FBS洗涤细胞,300g,10min,重复两次,弃掉上清废液,加入7AAD,Vortex混匀细胞,15min内上机检测。9.CD4+T细胞增殖的抑制试验使用流式分选分选出CD4+T细胞及CD11b-CD27-NK亚群及CD11b-CD27+NK亚群,使用Cell-Trace-Violet用于标记CD4+T细胞,20min,37℃染色后按照NK:CD4+T细胞比例为1:1种入96孔板中,按照1million cells/25ul anti-CD3/28 beads刺激细胞,同时加入10 ng/m L r IL-12、r IL-15 50 ng/mL,100ng/mL r IL-18培养72h后将细胞收至流式管中,使用PBS洗涤细胞两次,弃上清后混匀细胞,按照1million cells/1ul live/dead染料。室温染色10min后,PBS洗涤两次,重悬细胞至200ul,上样检测。10.CD8+T细胞分泌IFN-γ的抑制试验将分选后的NK细胞及标记后的CD8+T细胞使用R10重悬,按照1:1的比例放入96孔板中,向其中加入10 ng/m L rIL-12、rIL-15 50 ng/m L,100 ng/m L r IL-18,5μg/mL phytohemagglutinin,及200 U/m L的rIL-2,培养24小时,在培养结束的前6小时,加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打细胞后移入标记好的流式管中,再使用200ul的PBS洗涤培养孔,重复两次。向流式管中加入PBS2ml,300g,10 min,洗涤两次。弃掉废液后使用振荡器混匀细胞,加入250ul的破膜剂,室温,20min,避光破膜。破膜结束后500g,5min离心,再使用1×的破膜洗液洗涤两次,500g,5min。弃掉上清后,使用振荡器混匀细胞,加入IFN-γ-FITC,4℃避光染色30min。染色结束后使用1×破膜洗液去除多余的染料,重悬细胞至200ul,使用流式细胞仪检测CD8+T细胞分泌IFN-γ情况。11.NK细胞IL-10、TGF-β及PD-L1的封闭试验提取新鲜PBMC后,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-APC,CD8-APC-Cy7,4℃避光染色30min,使用含有2%FBS的PBS 2-3ml洗涤细胞,300g,10min,重复两次,去除未结合的染料。染色结束后使用含有EDTA的PBS 2-3ml重悬细胞,使用Aira II流式分选仪分选NK细胞。分选细胞后,使用PBS洗涤细胞两次,使用R10重悬细胞,将其放入96孔板中,在其中加入25ng/ml anti-IL-10 mAb,5ug/ml anti-TGF-βmAb,anti-PD-L1 mAb 0.25ug/106 cells及匹配的同型对照,孵育1-2h,孵育完成后加入IL-12/IL-15/IL-18及PHA、IL-2,刺激24h,在刺激完成的前6h加入Golgistop。12.统计学分析用GraphPad Prism 6软件及SPSS 20.0对实验结果进行统计学分析。两组间比较用Mann–Whitney U检验,配对比较用Wilcoxon signed-rank检验。p<0.05（双侧）被认为是具有统计学差异。结果:一、单细胞测序揭示HIV感染者总NK细胞亚群特征1.健康对照者NK细胞基因水平的亚群分布特征排除了T细胞及B细胞等非NK细胞干扰后,发现NK细胞在单细胞基因层面可被划分为更细致的10个亚群。C0亚群高表达的基因分别是COL6A2,CD3G,CD3D,PTGDS,CD3E,IL32,KLRC2,PRDX2,GZMH;C1亚群高表达的前10个基因为FCER1G,CMC1,KLRC1,CD7,KLRB1,AKR1C3,CD160,SPON2,CLIC3,C1orf162;C2亚群为CD3E,LAG3,TNFRSF18,CLIC3,IL32 CD52,GZMH,KLRC2,GTF3C1,TRG-AS1;C3亚群为S100B,SELL,CD2,CLECL1,CD3D,PRSS57,CD3G,CLEC2D,CD3E,CD52;C4亚群为IGFBP7,ALOX5AP,KIR2DL1,GZMH,MIAT,KLRC2,FGFBP2,LAG3,PFKP,ADGRG1;C5亚群为ZFP36,FOS,CD69,PPP1R15A,NFKB1A,DUSP1,CCL3,JUN,JUNB,ZNF331;C6亚群为JUN,NFKB1A,CD69,IER3,TNF,PPP1R15A,CCL4,NFKBIZ,BTG2,ZC3H12A;C7亚群FOS,DUSP1,ZFP36,GZMK,CMC1,XCL1,JUN,PPP1R15A,CD69,LTB;C8亚群C1orf56,HNRNPH1,MDM4,TMEM120B,CDC42SE1,C16orf54,B4GALT1,APOBEC3C,PHKG1,B3GNT7;C9亚群STMN1,PCNA,MCM7,TYMS,DUT,TUBA1B,PCLAF,MCM5,MCM3,GINS2,每个亚群基因富集到的功能各不相同。2.健康对照者及HIV感染者NK细胞相关性分析健康对照者与HIV感染者NK细胞数量及亚群分布均有显着差异,两例样本合并后的典型相关性分析可将NK细胞共划分为0-11,共12个亚群（CC0-CC11）。在对两个样本在每个亚群占比分析中,CC0、CC3及CC5这三个亚群中HIV感染者的细胞要明显多于健康对照者,而CC1-2、CC4、CC8-9群中,健康对照者的细胞显着高于HIV感染者。3.HIV感染导致NK细胞功能改变在HIV感染样本细胞数量占比较多的亚群进行分析中发现,CC0中HIV感染者下调的基因多集中于I型干扰素信号通路、对病毒的反应及调节免疫反应中。而在CC3中,下调基因集中于I型干扰素信号通路、T细胞共刺激、调节免疫反应等等,CC5亚群中下调基因也富集于I型干扰素信号通路、对病毒反应及调节免疫反应。而在那些HIV感染者细胞比例减少的亚群中发现CC1富集到的基因还参与IFN-γ介导的信号通路,CC2、CC4的基因还涉及到了病毒的转录,CC8-CC9下调基因参与了病毒防御反应。二、HIV感染者CD11b CD27定义的CD56+NK细胞各个亚群功能及其调节作用的研究1.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞各个亚群的变化未治疗HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞各个亚群与健康对照者相比出现明显的差异,未治疗HIV感染者的CD11b+CD27-亚群百分比显着降低,而CD11b-CD27-亚群百分比显着升高。2.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞活化性受体增高HIV感染者活化性受体NKp44及NKp46在CD11bCD27定义的NK细胞各个亚群中的表达均高于健康对照者,且四个亚群中CD11b-CD27-亚群的活化性受体表达最低。说明HIV感染后NK细胞表现出高活化的状态。3.CD11b-CD27-亚群呈现幼稚的表型特征在对各个亚群成熟度的研究当中,无论是HIV感染者或是健康对照者CD11b-CD27-亚群低表达成熟marker——CD11c,同时HIV感染者的CD11c在四个亚群中的表达均高于健康对照者;HIV感染者CD11b-CD27-亚群低表达衰老marker——CD57,CD11b-CD27-亚群幼稚marker——CCR7高于CD11b+CD27-亚群。4.CD11bCD27定义的NK细胞亚群checkpoint点的表达水平在HIV感染者中显着升高HIV感染者各个亚群Tigit的表达均显着高于健康对照者,四个亚群中Tigit表达最高的是CD11b+CD27-亚群;而PD-1的配体PD-L1在HIV感染者中CD11b-CD27-亚群的表达最低。5.CD11bCD27定义的NK细胞亚群代谢特征HIV感染者CD11b-CD27-亚群低表达葡萄糖转运体Glut-1,两组人群的比较无显着性差异;CD11b-CD27-亚群低表达脂质受体CD36,而氨基酸受体CD98的表达仅高于CD11b+CD27-亚群。6.CD11b-CD27-亚群分泌IFN-γ及CD107a的脱颗粒功能不良细胞因子刺激NK细胞后检测各个亚群分泌IFN-γ及CD107a脱颗粒的情况,四个亚群中CD11b+CD27+亚群高表达IFN-γ及CD107a,其次是CD11b-CD27+亚群,CD11b+CD27-亚群低于前两个亚群,CD11b-CD27-亚群最低。7.CD11b-CD27-NK亚群颗粒霉及穿孔素储存能力良好,释放能力受损未经刺激时HIV感染者四个亚群中CD11b-CD27-NK亚群的Granzyme B及Perforin最高,而经过刺激后CD11b-CD27-NK亚群储存的Perforin则显着下降。8.CD11b-CD27-NK亚群分泌负向调节因子分选各个亚群经过细胞因子刺激后收集培养上清进行ELISA检测IL-10及TGF-β发现CD11b-CD27-亚群能分泌大量的IL-10及TGF-β。9.CD11b-CD27-亚群抑制CD4+T细胞增殖分选HIV感染者CD11b-CD27-亚群及CD11b+CD27-亚群,分别将其与CD4+T细胞进行共培养,经过TCR刺激后发现CD11b-CD27-亚群具有能够抑制CD4+T细胞的增殖的趋势。三、HIV感染者CD56-NK细胞的变化及调节作用的研究1.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞百分比显着升高HIV感染者CD56-CD16+NK细胞的百分比较健康对照者相比显着升高,经过ART治疗后百分比虽有所下降,但未降至正常水平;HIV感染者CD56dimCD16+NK细胞百分比明显低于健康对照者,ART组的CD56dimCD16+NK细胞百分比有所回升但仍未达到健康对照者的水平。2.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞分泌高水平的IL-10及TGF-β对比HIV感染者CD56-CD16+NK细胞及CD56dimCD16+NK细胞表达的IL-10及TGF-β发现CD56-CD16+NK细胞高表达IL-10及TGF-β,且未治疗HIV感染者与ART患者CD56-CD16+NK细胞表达的IL-10及TGF-β无差异。3.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞亚群抑制CD8+T细胞功能分别将CD56-CD16+NK细胞及CD56dimCD16+NK细胞与自体的CD8+T细胞进行共培养后发现CD56-CD16+NK细胞能够抑制CD8+T细胞的IFN-γ分泌,且抑制率与CD56-CD16+NK细胞的比例呈正相关。4.阻断CD56-CD16+NK细胞分泌的IL-10及TGF-β可部分恢复CD8+T细胞的功能培养体系中加入IL-10及TGF-β相应的抗体后,CD8+T细胞分泌的IFN-γ得到了部分的恢复,抑制率明显下降。5.CD56-CD16+NK细胞通过直接接触的方式抑制CD8+T细胞功能分离培养实验证实CD56-CD16+NK细胞除了间接接触的方式抑制自体的CD8+T细胞功能外还能够通过直接接触的方式抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ。6.HIV感染者CD8+T细胞高表达PD-1,CD56-CD16+NK细胞高表达其配体PD-L1HIV感染者CD8+T细胞较健康对照者的CD8+T细胞相比,高表达抑制性分子PD-1,同时HIV感染者的CD56-CD16+NK细胞上的PD-L1较CD56dimCD16+NK细胞相比表达增高,说明CD56-CD16+NK细胞可能通过高表达的PD-1/PD-L1来发挥抑制作用。7.封闭PD-L1后可部分恢复CD8+T细胞的功能对CD56-CD16+NK细胞高表达的PD-L1进行了抗体封闭试验后,该亚群对自体CD8+T细胞的抑制作用明显减弱。结论:1.总NK细胞根据单细胞测序可分为10个亚群,HIV感染者NK细胞I型干扰素信号通路基因下调,影响NK细胞抗病毒作用。2.CD56+CD11b-CD27-NK亚群在HIV感染中显着升高,该亚群展现低活化,幼稚的表型,葡萄糖转运能力低,脂质及氨基酸受体高于CD56+CD11b+CD27-NK亚群,同时该亚群细胞功能不良,能够分泌负向细胞因子,抑制CD4+T细胞增殖。3.CD56-CD16+NK亚群增高,抑制自体CD8+T细胞功能,CD56-CD16+NK细胞的分泌大量IL-10及TGF-β,高表达抑制性受体的配体PD-L1,并通过直接接触（PD-1/PD-L1）及间接接触（IL-10及TGF-β的分泌）的方式抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ,阻断PD-L1的表达或封闭IL-10及TGF-β能够恢复CD8+T细胞功能。
蒋福明,李秀芬,程书权,刘平香,黄成军,冼永超[3]（2018）在《83例轻度慢性乙型肝炎合并肺结核患者肝组织病理学与血清生化学及T细胞亚群相关性分析》文中指出目的:分析ALT轻度升高的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）合并肺结核（pulmonary tuberculosis,PTB）患者的肝脏病理学改变及与相关血清学指标的关系。方法:83例CHB合并PTB感染患者按照肝脏炎症程度（G）和纤维化情况（S）进行分组,运用Sperman相关分析及有序多分类logistic回归模型（ordinal duo logistic regression model,OLM）分析病理分级与肝功能相关指标谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（straw transaminase,AST）、总胆红素（total bilirubin,TBil）、血清白蛋白（serum albumin,ALB）、胆碱酯酶（cholinesterase,CHE）水平,及HBV-DNA载量各项临床指标的关系。结果:83例患者肝细胞呈现轻度炎症（<G2）者21例,占25.3%,轻度纤维化（<S2）者36例,占43.4%;中、重度炎症以上（≥G2）者62例,占74.7%,中、重度纤维化（≥S2）者44例,占56.6%,其中有7例患者的肝穿结果提示肝硬化存在（S4）。Sperman相关分析显示,本组患者的G与血清AST、TBil呈正相关（rs分别为0.232、0.239,P分别为0.034、0.029）;与CHE呈负相关（rs=-0.273,P=0.012）;而与ALT、ALB水平、HBV-DNA载量无明显相关关系（rs分别为0.068、-0.073、0.048,P分别为0.538、0.508、0.660）。S与AST、TBil呈正相关（rs分别为0.287、0.273,P分别为0.008、0.012）;与胆CHE呈负相关（rs=-0.316,P=0.003）;而与ALT、ALB水平、HBV-DNA载量无明显相关关系（rs分别为0.050、-0.094、-0.036,P分别为0.650、0.395、0.745）。G与肝组织内的CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD20+B淋巴细胞,CD57+NK细胞表达呈正相关（rs分别为0.622、0.638、0.290、0.316,P分别为0.000、0.000、0.007、0.003）。S与肝组织内的CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD20+B淋巴细胞,CD57+NK细胞表达呈正相关（rs分别为0.543、0.559、0.295、0.270,P分别为0.000、0.000、0.007、0.013）。OLM分析结果显示,CD8与G分级存在关联,随着G分级升高,CD8计数将升高,回归系数=0.045,回归系数95%置信区间为（0.007,0.084）,P=0.021。AST和CD20均与S分级均存在关联,S分级升高,均会引起这两项指标数值上升,均会引起S分级升高,AST:回归系数=0.039,回归系数95%置信区间为（0.002,0.057）,P=0.037;CD20:回归系数=0.026,回归系数95%CI=0.0010.051,P=0.040。结论:在40 U/L<ALT<80 U/L的CHB合并PTB患者中,多数存在中度以上炎症及肝纤维化改变;肝脏炎症程度（G）和纤维化程度（S）与AST、TBil呈正相关,与CHE呈负相关;肝脏炎症程度（G）和纤维化程度（S）与肝组织内的CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD20+B淋巴细胞,CD57+NK细胞表达均呈正相关;此类患者若在进行抗痨治疗前,进行肝穿刺病理检查,有利于进一步明晰肝脏炎症及纤维化程度。
黄静[4]（2016）在《多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性及免疫应答研究》文中研究指明研究背景及目的免疫治疗成为继手术、放疗、化疗后第四种治疗肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗方法,免疫治疗按照机制的不同可以分为主动性与被动性（或称为过继性）免疫治疗两大类,主动免疫治疗如治疗前列腺癌的DC疫苗等;过继性免疫治疗,即将各种免疫效应细胞、细胞因子或单克隆抗体输入机体,直接介导抗肿瘤免疫反应。过继性细胞免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy,ACI）是免疫治疗发展历程中的重要里程碑,迄今为止主要应用的细胞类型有肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte,TIL）,树突状细胞-杀伤性T淋巴细胞（Dendritic cell,Cytotoxic T lymphocyte,DC-CTL）以及近年新出现的嵌合抗原受体的T淋巴细胞（Chimeric antigen receptors of T cells,CAR-T）等,尤其是 CAR-T 目前在白血病治疗中疗效肯定,对部分实体瘤患者的临床试验也取得令人鼓舞的效果。原发性肝癌是指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤,其中发生于肝细胞的恶性肿瘤就是原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）约占原发性肝癌的90%。确诊时,大多数HCC患者已达BCLC中晚期（80%）,只有15.3%的是BCLC早期。根据目前的HCC治疗指南,早期的患者可以选择手术、肝移植、射频消融等根治性方法,而对于那么多的中晚期HCC患者来说,仅有化疗和索拉菲尼这两种姑息性治疗方法可选择,因此需要探索新的治疗方法造福于中晚期肝癌患者。近年来对原发性肝细胞癌患者也进行了一系列免疫治疗的试验,目的是评估免疫治疗技术治疗HCC的效果。本研究采用14种肿瘤抗原多肽负载DC（muture dendritic cells,mDCs）的技术,给HCC患者皮下注射DC,并培养诱导CTL（cytotoxic T lymphocytes）静脉回输HCC患者体内,旨在探索联合了主动免疫与被动免疫的多靶点抗原肽自体免疫细胞技术（Multiple Antigen Stimulating Cellular Therapy,MASCTTM）治疗HCC的安全性及诱发患者体内免疫应答的机理研究,为其临床推广应用提供依据。并初步探讨MASCTTM是否能给HCC患者带来临床获益。研究方法1、MASCTTM治疗原发性肝细胞癌患者的临床安全性研究回顾性分析2012年1月至2014年12月期间南方医院肝病中心收治的接受MASCTTM且治疗前的末次治疗（手术、化疗、放疗）结束至少一个月或以上,并且未接受其他免疫治疗的45例原发性肝细胞癌患者的临床资料。第0天分离患者外周血单个核细胞,其中贴壁细胞诱导培养为成熟DC,负载14种抗原肽,小部分mDCs第8天经患者腹股沟淋巴结周围区皮下注射;未贴壁细胞第7天与大部分mDCs共培养诱导为CTL,第26天经静脉回输患者体内,对回输的DC及CTL进行细胞表型及细胞因子分泌检测。分析输注细胞后的不良反应的临床表现、血常规、肝肾功能变化。2、MASCTTM诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究分为回顾性和前瞻性免疫应答机理研究,回顾性机理研究对象为未曾接受MASCTTM治疗与接受多次MASCTTM治疗的原发性肝细胞癌患者,采集原发性肝细胞癌患者外周血分离并获取单个核细胞,对比分析治疗前后T细胞亚群（流式细胞术）、特异性T细胞增殖（EdU检测）以及多靶点肿瘤抗原特异性免疫应答（ELISPOT检测）变化情况;前瞻性机理研究对象是随机纳入临床试验的不接受MASCTTM治疗的对照组和接受MASCTTM治疗的试验组的根治术后的HCC患者,同样对比两组之间T细胞亚群（流式细胞术）、特异性T细胞增殖（EdU检测）以及肿瘤抗原特异性免疫应答变化。分析体内免疫应答的情况,分别进行以下检测:1)T细胞亚群检测（流式细胞术）:将分离得到的PBMC预处理后收集细胞悬液并离心,按照流式细胞染色实验步骤进行染色,染色方案为NKT（CD3+CD56+）;CD8+NKG2D+Granzyme B+CD107a+;Treg（CD4+CD25+FoxP3+）;CD45RO-FITC CD27-Percp-Cy5.5 CD57-APC CCR7-PE CD3-APC-Cy7,最后用FACS CantoⅡ流式细胞仪上机检测。2)抗原特异性T细胞增殖（EdU染色方法）及IFN-y水平测定（流式细胞术）:将分离得到的PBMC给予无关肽、肝癌多靶点抗原肽库及细胞因子预刺激处理3天后收集细胞悬液并离心,按照流式细胞染色实验步骤进行染色,增殖实验染色方案为CD3-PE EdU-FITC;IFN-γ分泌检测染色方案为:CD8-APC-Cy7 CD4-PE CD27-PerCP-Cy5.5 CD28-FITC IFN-y-APC。最后用 FACS CantoⅡ流式细胞仪上机检测各类细胞比例。计算肽库组检测值/无关肽检测值的倍数。3)各肿瘤抗原肽特异性免疫应答检测（ELISPOT方法）:将分离得到的PBMC分别给予无关肽、肝癌多靶点抗原肽库、各类抗原单条肽预刺激处理3天后,按照酶联免疫斑点检测方法（ELISPOT方法）进行检测,晾干板,用 ELISpotreader（AID EliSpot Reader classic）检测并统计斑点数。计算目标肽斑点数/无关肽斑点数的倍数。3、MASCTTM治疗原发性肝细胞癌临床效应的初步探究选取2012年1月之后确诊为原发性肝细胞癌BCLC分期B期并在南方医院肝病中心规律接受治疗（包括传统治疗和/或MASCTTM治疗）,且定期返回南方医院进行复查随访的患者为研究对象,根据RECIST评估标准,回顾性比较接受传统治疗联合多次MASCTTM治疗（≥3次）和只接受传统治疗的BCLC分期B期的原发性肝细胞癌患者1年内疾病进展情况（disease control rate,DCR）,初步探索MASCTTM免疫治疗能否控制HCC疾病发展。4、统计学分析应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,多次重复测量均数比较采用单因素重复测量资料方差分析。计数资料组间两两比较用卡方检验或Fisher’s精确检验。作图用GraphPad Prism软件。P<0.05有显着统计学差异。研究结果1、MASCTTM成功诱导培养mDC和CTL,MASCTTM治疗后患者不良反应少纳入的45例原发性肝细胞癌患者中男性43例,女性2例,年龄30-65岁,平均年龄53.78岁。大约91.1%患者合并慢性乙型肝炎病毒（88.9%）或慢性丙型肝炎病毒（2.2%）感染。按照Child-Pugh评分标准,45例原发性肝细胞癌患者肝功能均为A级（57.8%）或B级（42.2%）,按照巴塞罗那临床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC）分期标准,其中A期7例,B期13例,C期19例,D期6例。45例患者中,14例接受过手术切除治疗（31.1%）,33例曾行肝动脉栓塞术（73.2%）,10例进行过射频消融术（22.2%）,45例患者接受MASCTTM治疗次数为1至10次不等（平均治疗3.78次/人）。MASCTTM培养的mDCs中CD80+细胞比例为（98.5±5）%、CD83+细胞为（88±10）%、CD86+细胞为（98.4±3）%,HLA-DR+细胞为（98.8±2）%,mDCs 分泌高水平 IL-12（985±312 pg/ml）,低水平IL-10（53±10 pg/ml）。CTL 中 CD3+CD8+细胞为（83±10）%,CD3+CD56+细胞为（24±5）%。CTL 分泌高水平 IFN-y（1222±650 pg/ml）,低水平IL-10（6.8±5.0 pg/ml）。MASCTTM治疗后,绝大多数患者的精神、食欲、睡眠、体力较前好转,有2名（4.44%）患者在输注CTL细胞1h后出现轻中度发热,未观察到其他严重明显不良反应。患者的血常规、肾功能均无明显异常变化,肝功能有轻度升高趋势。未发现与MASCTTM相关的死亡事件。2、多次MASCTTM治疗后改善原发性肝细胞癌患者体内免疫抑制状况,诱导特异性免疫应答多次MASCTTM治疗组的患者外周血NKT（CD3+CD56+）比例上调、Treg（CD4+CD25+FoxP3+）下调、共表达杀伤相关分子（NKG2D,Granzyme B,CD 107a）的CD8+T细胞比例上调,效应T细胞（effect T cell,Te）、中央记忆性T细胞（center memory T cell,Tcm）比例也明显上调。在体外将PBMC分别用HCC抗原肽库和无关肽刺激培养后检测T细胞的增殖能力（EdU检测方法）和分泌IFN-r的能力（流式细胞术）以及对各个肿瘤抗原的特异性应答（ELISPOT检测方法）,多次MASCTTM治疗的HCC患者外周血中T细胞增殖能力、分泌IFN-γ的能力均显着提高且T细胞对HCC抗原肽库产生了应答,不同患者对肝癌多靶点抗原肽库中不同单肽产生不同程度应答。3、MASCTTM治疗+传统治疗的BCLC B期原发性肝细胞癌患者1年内疾病控制率为80%纳入研究的32名BCLC分期B期HCC患者,其中有15名接受多次MASCTTM治疗（≥3次）,有17名接受了传统治疗,观察分析并比较接受传统治疗联合多次MASCTTM治疗组患者1年内疾病进展情况（disease control rate,DCR）与只接受传统治疗的原发性肝细胞癌患者,接受了多次MASCTTM治疗的HCC患者1年内的疾病控制率为80%,传统标准治疗组为17.65%。研究结论1、本研究表明MASCTTM治疗原发性肝细胞癌患者不良反应较少,临床应用安全性良好,可为其临床推广应用提供依据。2、MASCTTM治疗技术可改善HCC患者体内免疫抑制状态,诱导针对肿瘤抗原肽的特异性免疫应答,可对肽库中不同的抗原肽产生特异性免疫应答,且会随着治疗次数的增加而增强应答。3、MASCTTM治疗HCC的临床疗效还有待临床试验的研究结果。
冼永超,李秀芬,易丹,程书权,倪辉,黄成军[5]（2016）在《不同基因型HBV感染患者临床表现及肝组织内免疫活性细胞表达的研究》文中认为目的探讨桂林地区不同基因分型慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者临床表现及肝内免疫活性细胞（CD4+、CD8+、CD20+、CD57+）与肝脏病理的关系。方法对70例2008年1月至2013年12月在桂林市第三人民医院肝病科住院CHB患者进行肝组织活检术,其中B基因型44例,C基因型26例,并运用免疫组织化学法分析肝组织内CD4+、CD8+、CD20+、CD57+淋巴细胞的表达,比较不同乙型肝炎病毒（HBV）基因分型患者CD4+、CD8+、CD20+、CD57+淋巴细胞与临床相关性。结果桂林地区CHB患者以B基因型为主,B、C两组基因型在年龄、白蛋白（albumin,ALB）、球蛋白（globulin,GLB）差异无统计学意义,而C基因型丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）水平高于B基因型（P<0.05）,B基因型HBeAg阳性率高于C基因型（P<0.05）,C基因型肝脏组织病理损害程度比B基因型严重（P<0.05）;B基因型CHB患者炎症程度到达G4组及C基因型到达G3组肝组织中CD4+、CD8+、CD20+的表达均比G1组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;C基因型组炎症程度到达G4肝组织中CD57+T细胞表达比G1明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）,B基因型ALT与CD4+、CD8+、CD20+T细胞水平呈直线相关（r值分别为0.554、0.678、0.740,P均<0.01）,与CD57+无相关性,而C基因型ALT与CD8+、CD20+、CD57+T淋巴细胞水平呈直线相关关系（r值分别为0.517、0.626、0.737,P均<0.05）,与CD4+无相关性。结论CHB患者以B基因型为主,B基因型患者HBeAg阳性率明显高于C基因型患者,C基因型肝脏组织病理损害程度比B基因型严重,B、C基因型患者肝组织内CD4+、CD8+、CD20+表达与肝组织内炎症分级均有明显相关性,不同基因型疾病严重程度与机体的免疫状况有关。
易丹[6]（2015）在《慢性乙型肝炎患者HBV不同基因型肝组织内T淋巴细胞表达的研究》文中提出目的:探讨桂林地区不同乙肝基因分型慢性乙型肝炎（CHB）患者临床表现及肝内免疫活性细胞（CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD20+T淋巴细胞、CD57+T淋巴细胞）等与肝脏病理损害情况的关系。方法:观察70例慢性乙型病毒性肝炎患者,做HBV基因分型,其中B基因型44例,C基因型26例。70例均常规检查血清生化学、病毒学、免疫学、影像学等指标,知情同意后进行1秒钟快速肝脏穿刺活体组织检查术,所得标本除做常规病理染色镜检、参照Knodell组织学活动指数（Histologicalactivity index,HAI）评分系统和Ishak肝炎活动指数对肝脏炎症及纤维化情况进行评分,并运用免疫组织化学法分析肝组织内CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD20+T淋巴细胞、CD57+T淋巴细胞淋巴细胞的表达,比较不同乙肝病毒基因分型患者CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD20+T淋巴细胞、CD57+T淋巴细胞与临床相关性。结果:桂林地区CHB患者以B基因型为主,B、C两组基因型在年龄、ALB、GLB无差异,B基因型患者HBe Ag阳性率明显高于C基因型患者,而C基因型患者ALT水平明显高于B基因型患者,C基因型肝脏组织病理损害程度比B基因型严重;B基因型CHB患者炎症程度到达G4组及C基因型到达G3组肝组织中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD20+T淋巴细胞的表达均比G1组明显增加,有统计学差异,p<0.05;C基因型组炎症程度到达G4肝组织中CD57+T细胞表达比G1明显增加,有统计学差异,p<0.05。结论:CHB患者以B基因型为主,B基因型患者HBe Ag阳性率明显高于C基因型患者,C基因型肝脏组织病理损害程度比B基因型严重,B、C基因型患者肝组织内CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD20+T淋巴细胞表达与肝组织内炎症分级均有明显相关性,不同基因型疾病严重程度与机体的免疫状况的关系有关。
赵昌林[7]（2015）在《CD4+CXCR5+CD57+T细胞在肝癌发病中的作用及解毒抗癌方干预的研究》文中研究说明背景:毒邪是癌症发病的中心环节,解毒抗癌法是中医治疗癌症的有效方法,解毒抗癌方对癌症的作用机制仍不清楚。滤泡性辅助性T细胞（Tfh）在B细胞的活化中起主要作用,在前期实验中我们发现HBs Ag和CD57有密切的关系,我们认为在人体中存在CD4+CXCR5+CD57+T细胞亚群,而解毒抗癌方可以调节这一细胞亚群,在肝癌的治疗和预后中起着重要的作用。目的:解毒抗癌法是治疗癌症的有效方法,解毒抗癌方对癌症的作用机制有待阐明,本研究拟通过分析CD4+CXCR5+CD57+T细胞在肝癌中的作用及对预后的影响,探讨解毒抗癌方的抗肿瘤作用和调节CD4+CXCR5+CD57+T细胞的作用机制。方法:临床实验:按照方案筛选实验对象肝癌65例,32例健康志愿者作为对照组。肝癌手术标本行HE染色和免疫组化检测标本中CD57、HBs Ag、CXCR5等蛋白的表达;分离外周血中的淋巴细胞后加入荧光标记的CD57、CXCR5和CD4抗体,孵育后进行流式细胞检测,分析CD4+CXCR5+CD57+T细胞的表达量;血清分离后,使用ELISA方法检测IL-21、IL-6、IFN-γ、CXCL13和CXCR5的浓度;使用生化检测仪分析血清中Ig G、ALT、AST、胆红素的含量;PCR-荧光探针法检测肝癌组织中HBV-DNA表达量;采用荧光定量QPCR分析肝癌组织标本中IL-10、TGFB1、RORC、IL-17A、IL-21、IL-6、CXCR5和CD57等基因的表达量。细胞实验:取健康脐带血或外周血进行淋巴细胞分离,IL-2（300U/ml）、IL-1α（100U/ml）、IL-21（40ng/ml）进行诱导,通过磁珠筛选进行分离,之后加入CD57、CXCR5和CD4荧光标记抗体,检测CD4+CXCR5+CD57+T细胞表达量;取培养液0.5ml加入Hp G2的细胞培养液中,比例为20%,在24-48小时后进行Hp G2的凋亡检测。使用MTT法分析疏肝健脾方、解毒抗癌方、DDP对Hp G2肿瘤细胞生长的抑制作用;分离细胞培养液,使用ELISA检测L-21、IL-6、IFN-γ和CXCR5的含量。动物实验:昆明小鼠和C57BL/6购买自广东省医学实验动物中心,C57BL/6-HBV购买自上海南方模式生物研究中心,C57BL/6-Foxp3GFP购自The Jackson Laboratory。H22肝癌细胞（广东省医学实验动物中心）左前臂腋窝处注射0.1ml,48小时后给与药物干预,干预时间为10d。各组小鼠处死后,取肝、肺和接种的瘤体进行常规HE染色和免疫组化染色分析CD57、CXCL13蛋白表达;无菌分离脾脏研磨分离淋巴细胞后进行CD4+CXCR5+CD57+T细胞的流式细胞检测;ELISA检测外周血IL-21、IL-6、IFN-γ、CXCR5和CXCL13的含量;PCR荧光探针法检测HBV-DNA表达量;荧光定量RT-PCR分析IL-10、TGFB1、RORC、IL-17A、IL-21、IL-6、CXCR5、CD57等基因的表达量。统计方法:使用SPSS（statistics package for social science）19.0软件进行数据分析,定量资料如果符合正态分布,统计描述指标可用均数及标准差,如果不符合正态分布,则指标选用中位数和级差（即:最大值和最小值之差）。对于分组呈正态分布的定量资料,如为两组比较,使用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:临床实验:病理学结果检查表明,HBs Ag阳性与CD57阳性的结果符合率为83%,表明二者之间有密切的相关性;CD4+CXCR5+T细胞的数量在正常人中为5.95%,在I-IIIA期肝癌患者中为5.39%,在IIIB-IV期肝癌患者中为3.21%,正常人群和IIIB-IV期肝癌之间存在着统计学差异（P<0.05）;CD57+CXCR5+T细胞在正常人中为20.9%,在I-IIIA期肝癌患者中为13.8%,IIIB-IV期肝癌患者中为8.44%,其表达量在三者之间具有统计学意义;CD4+CD57+T细胞在正常人群为3.5%,在I-IIIA期肝癌患者中为3.18%,在IIIB-IV期肝癌患者中为2.02%,之间具有统计学差异。CD4+CXCR5+CD57+T细胞的阳性表达在正常人群为22.9%,I-IIIA期肝癌患者为8.18%,IIIB-IV期肝癌患者为2.79%,具有统计学意义。ELISA分析发现IL-21的数量则有明显的不同,INF-γ无明显的不同;RT-PCR分结果表明,Hbs Ag阳性标本中的IL-6、LI-21、IL-17A、CD57和CXCR5的基因表达明显下降,具有统计学意义。回归分析发现,CD4+CXCR5+CD57+T细胞与ALT的水平密切相关,当ALT的水平升高时,CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量也随之升高,具有统计学意义,与Ig G的相互关系中发现两者密切相关,而与HBV-DNA的水平没有明显的关系;CD4+CXCR5+CD57+T细胞与生存时间的关系表明,其表达水平越多,肝癌病人的生存时间越长。细胞实验:外周血中的干细胞经IL-2、IL-21和INF-γ诱导可以分化为CD4+CXCR5+CD57+T细胞,并且随着培养时间的增加分化的细胞数量升高,占CD4+细胞数量的22%;诱导的CD4+CXCR5+CD57+T细胞可以分泌IL-6、IL-21、INF-γ,具有时间相关性,而不分泌CXCL13。流式分析发现CD4+CXCR5+CD57+T细胞在24h小时可诱导71.3%的Hp G2细胞凋亡,在48小时诱导89.2%的细胞凋亡,具有统计学意义,分析发现其机制与FAS的表达相关;诱导12d,CD4+的T细胞数量占总数的21.4%,CD4+CXCR5+T细胞的数量为5.9%,而CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量为9.7%,CD57+T细胞的数量为28.2%,随着培养时间的延长,CD4+、CD57+、CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量显着增多,具有统计学意义。疏肝健脾方的抑制率为11.1%,解毒抗癌方为72.8%,DDP为74.7%,疏肝健脾方和解毒抗癌方两组之间具有统计学差异;解毒抗癌方可以抑制IL-6的分泌;同时解毒抗癌方抑制IGF-IR的分泌,其作用与DDP相当。动物实验:解毒抗癌方能抑制肿瘤组织的生长,但是抑制作用小于DDP;C57BL/6-HBV的小鼠肝、肺可见淋巴细胞、浆细胞浸润;C57BL/6-HBV小鼠的H22,Ki67的免疫组化阳性率为80%,中药干预后期阳性率为30%,DDP为10%,IL-21阳性率为10%以下,具有统计学学意义（P<0.05）。ELISA结果显示中药可以提高IL-6、IL-21、INF-γ、CXCL13的水平,具有统计学意义。HBV可以显着的抑制CD4CXCR5的阳性表达,促使IL-6显着升高,IL-21下降,给以中药干预,CD4CXCR5的细胞数量显着的上升,DDP干预后CD4CXCR5的细胞数量减少,进行IL-21的腹腔内注射,可以使CD4CXCR5的数量显着升高。C57BL/6小鼠的CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量为6.2%,而C57BL/6-HBV的数量为2.16%,两组之间有明显的差别。给以C57BL/6-HBV接种H22细胞,在d5,d10和d14进行流式细胞学的检测,结果表明,CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量没有明显的变化,给以解毒抗癌方干预,CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量显着的上升,DDP干预后CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量未见变化,IL-21干预后CD4+CXCR5+CD57+T细胞的显着上升。实时定量RT-PCR分析H22瘤体中Tfh,Th17和Treg相关基因的表达发现,在C57BL/6-HBV接种的H22瘤体IL-6、LI-21、IL-17A、CD57和CXCR5的基因表达明显下降,经解毒抗癌方干预后IL-6、IL-21、CXCR5和CD57的基因表达显着提升（P<0.01）,DDP干预后IL-6,IL-21,CXCR5,CD57的基因表达下降;基因表达分析发现,HBV显着的抑制了Tfh,Treg,Th17的相关基因表达,而在DDP和解毒抗癌方的干预方面,则有非常显着的差异,解毒抗癌方则显着的增加CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量。结论:1.CD4+CXCR5+CD57+T细胞是CD4+CXCR5+T细胞的一个亚群,具有抑制肝癌的作用,通过CD95诱导Hp G2细胞凋亡。HBV可以抑制CD4+CXCR5+T细胞和CD4+CXCR5+CD57+T细胞的功能,在肝癌的形成过程中可能是一个重要的因素。2.毒邪是肝癌病因病机中的中心环节,其病变基础是毒邪可以抑制机体的免疫功能,CD4+CXCR5+CD57+T细胞和CD4+CXCR5+T细胞的功能下降使机体表现为正气亏虚。3.解毒抗癌方可以杀死Hp G2细胞,减少IL-6和IGF-IR的分泌。解毒抗癌方可显着的提高CD4+CXCR5+T细胞和CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量和功能,可能是其抗癌的作用机理。
冼永超,程书权,倪辉,黄成军[8]（2015）在《不同HBeAg状态下慢性乙型肝炎患者肝组织内CD4+、CD8+、CD20+、CD57+ T淋巴细胞的表达分析》文中研究指明目的探讨HBe Ag阳性和阴性慢性乙型肝炎（CHB）患者肝内免疫活性细胞（CD4+、CD8+、CD20+、CD57+T淋巴细胞）与肝脏病理及临床的关系。方法选取2008年1月-2013年12月在桂林市第三人民医院住院的70例CHB患者进行肝穿刺活组织检查,其中HBe Ag阳性患者38例,HBe Ag阴性患者32例。运用免疫组化染色分析肝组织内CD4+、CD8+、CD20+、CD57+T淋巴细胞的表达,比较不同HBe Ag状态患者CD4+、CD8+、CD20+、CD57+T淋巴细胞与临床相关性。等级资料采用Kruskal-Walls H检验,组间比较采用Nemenyi法,相关性分析采用直线相关分析法。结果 HBe Ag阳性和阴性患者的炎症程度到达G3G4,其肝组织中CD8+、CD20+T淋巴细胞的表达均比G1组明显增加（P值均<0.05）;HBe Ag阳性患者炎症程度到达G4、而HBe Ag阴性患者炎症程度到达G3,其肝组织中CD4+T淋巴细胞的表达比G1组明显增加（P值均<0.05）;在HBe Ag阴性患者中CD4+、CD8+、CD20+、CD57+T淋巴细胞均与ALT水平呈正相关（r值分别为0.353、0.628、0.693、0.540,P值均<0.05）,且CD20+T淋巴细胞还与HBV DNA水平呈正相关（r=0.378,P<0.05）。而在HBe Ag阳性患者中只有CD8+、CD20+T淋巴细胞与ALT水平呈正相关,与HBV DNA水平无相关性。结论不同HBe Ag状态患者肝组织内CD4+、CD8+、CD20+T淋巴细胞表达与肝组织内炎症分级均有明显相关性,但肝内免疫活性细胞与ALT、HBV DNA水平的相关性存在差异。
丁玉平,邹志强,于吉广,于红,郑媛,龙波,许爱玲,郭砚梅,宋戈,贾伟,方雨晴,王贵强[9]（2013）在《肝组织病理与慢性乙型病毒性肝炎病毒复制及抗病毒应答的关系》文中研究指明目的探讨肝组织内核心抗原的表达与慢性乙型病毒性肝炎病毒复制与炎症活动的关系;分析肝脏炎症、纤维化程度及肝内CD8,CD57,CD68等表达与抗病毒应答的关系。材料和方法回顾分析入组81例慢性乙型病毒性肝炎肝穿患者,排除其他疾病,或合并其他疾病患者,排除HBV慢性感染免疫耐受期和免疫控制期患者。入组患者在肝穿前未接受任何治疗,血清学指标检测在肝穿当日或肝穿前后1
丁玉平,邹志强,于吉广,于红,郑媛,龙波,许爱玲,郭砚梅,宋戈,贾伟,方雨晴,王贵强[10]（2013）在《肝穿病理及肝小叶内CD8的表达对抗病毒应答的预测意义》文中研究表明背景基线肝穿状态及肝内HBV特异性CD+T细胞的功能与不同抗病毒治疗应答的关系还不是很明确。方法我们回顾性分析了36例应用干扰素或核苷类似物抗病毒治疗超过24周的慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒基线时肝穿情况。该36例慢性乙型肝炎患者抗病毒前均排除合并其他疾病,6个月内未用其他药物。我们在肝穿组织中应用CD8和CD57的免疫组化双染方法,及Grazyme-B的单染方法。
二、CD57与病毒性肝炎关系的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CD57与病毒性肝炎关系的研究（论文提纲范文）
（1）外周血衰老CD8+T细胞频率与2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的相关性分析（论文提纲范文）
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 局限与展望 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 衰老T细胞的研究进展 |
| 10 参考文献 |
（2）HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :单细胞测序揭示HIV感染者总NK细胞亚群特征 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂与耗材 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 外周血中分选NK细胞 |
| 2.3.2 单细胞样本的制备及检测 |
| 2.3.3 单细胞测序结果的分析 |
| 2.3.4 GO及KEGG分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 样本的质量控制 |
| 3.2 健康人NK细胞基因水平的亚群分布特征 |
| 3.3 健康人及HIV感染者NK细胞相关性分析 |
| 3.4 HIV感染导致NK细胞功能改变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :HIV感染者CD56+NK细胞应用CD11b CD27定义的各个亚群功能及其调节作用的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 NK细胞CD11b CD27亚群分群情况的检测 |
| 2.3.2 NK细胞CD11b CD27亚群表面受体表达情况检测 |
| 2.3.3 NK细胞CD11b CD27亚群分泌IFN-γ、CD107 脱颗粒的检测 |
| 2.3.4 NK细胞CD11b CD27亚群杀伤功能的检测 |
| 2.3.5 NK细胞CD11b CD27亚群分泌IL-10、TGF-β的检测 |
| 2.3.6 NK细胞CD11b CD27亚群Granzyme B及 Perforin存储情况的检测 |
| 2.3.7 NK细胞CD11b CD27亚群抑制CD4+T 细胞增殖的检测 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HIV感染者CD11b~+CD27-亚群百分比降低,CD11b~-CD27~-亚群百分比显着升高 |
| 3.2 HIV感染者CD11b CD27定义的NK亚群活化性受体增高,但CD11b~-CD27~-NK亚群低表达活化性受体 |
| 3.3 CD11b~-CD27~-NK亚群呈现幼稚的表型特征 |
| 3.3.1 CD11b~-CD27~-NK亚群低表达成熟marker——CD11c |
| 3.3.2 CD11b~-CD27~-NK亚群低表达衰老marker——CD |
| 3.3.3 CD11b~-CD27~-NK亚群幼稚marker——CCR7表达高于CD11b~+CD27~-NK亚群 |
| 3.4 CD11b CD27定义的NK细胞亚群checkpoint点的表达水平在HIV感染者中显着升高 |
| 3.5 CD11b~-CD27-NK亚群细胞代谢特征 |
| 3.5.1 CD11b~-CD27~-NK亚群葡萄糖转运体表达较低 |
| 3.5.2 CD11b~-CD27~-NK亚群脂质受体高于CD11b~+CD27~-NK亚群 |
| 3.5.3 CD11b~-CD27~-NK亚群氨基酸受体高于CD11b~+CD27~-NK亚群 |
| 3.6 CD11b~-CD27~-NK亚群分泌IFN-γ及CD107a的脱颗粒功能不良 |
| 3.7 CD11b~-CD27~-NK亚群颗粒霉及穿孔素储存能力良好,释放能力受损 |
| 3.8 CD11b~-CD27~-NK亚群分泌负向调节因子 |
| 3.9 CD11b~-CD27~-NK亚群能够抑制CD4~+T 细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :HIV感染者CD56~-NK细胞的变化及调节作用的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 NK细胞亚群及分泌IL-10及TGF-β检测 |
| 2.3.2 NK细胞、T细胞分选及IFN-γ的检测 |
| 2.3.3 NK细胞表面PD-L1表达情况的检测 |
| 2.3.4 CD8~+T细胞表面PD-1表达情况的检测 |
| 2.3.5 NK细胞IL-10及TGF-β封闭实验 |
| 2.3.6 NK细胞PD-L1封闭实验 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HIV感染者CD56~-CD16~+NK细胞百分比显着增高 |
| 3.2 HIV感染者CD56~-CD16~+NK细胞分泌高水平IL-10及TGF-β |
| 3.3 HIV感染者CD56~-CD16~+NK亚群抑制CD8~+T细胞功能 |
| 3.4 阻断CD56~-CD16~+NK细胞分泌的IL-10及TGF-β可部分恢复CD8~+T 细胞功能 |
| 3.5 CD56~-CD16~+NK细胞通过直接接触抑制CD8~+T细胞功能 |
| 3.6 HIV感染未治疗患者CD56~-CD16~+NK细胞Tigit未升高 |
| 3.7 HIV感染者CD8~+T 细胞高表达PD-1,CD56~-CD16~+NK细胞高表达其配体PD-L1 |
| 3.8 封闭CD56~-CD16~+NK细胞高表达的PD-L1 可部分恢复CD8~+T 细胞分泌IFN-γ功能 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）83例轻度慢性乙型肝炎合并肺结核患者肝组织病理学与血清生化学及T细胞亚群相关性分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 病例选择 |
| 1.2 实验室检查 |
| 1.3 病理检查 |
| 1.4 统计学分析方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CHB合并PTB感染患者的病理结果 |
| 2.2 CHB合并PTB感染患者的肝脏病理程度与五项主要肝功能指标及HBV-DNA的关系 |
| 2.3 合并感染患者肝脏炎症程度 (G) 和纤维化程度 (S) 与血清HBV-DNA及肝组织淋巴细胞亚群的关系 |
| 2.4 OLM分析病理分级与各项临床指标的关联分析 |
| 3 讨论 |
（4）多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性及免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第二章 多靶点抗原肽自体免疫细胞诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三章 多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌临床疗效初步探究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）不同基因型HBV感染患者临床表现及肝组织内免疫活性细胞表达的研究（论文提纲范文）
| 1 对象与方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.2 检查设备与方法 |
| 1.2.1 病理检查 |
| 1.2.2 免疫组织化学染色 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV基因型与临床表现关系 |
| 2.2 B基因型慢性乙型肝炎患者不同肝组织炎症程度与CD4+、CD8+、CD20+、CD57+淋巴细胞的关系 |
| 2.3 C基因型CHB患者不同肝组织炎症程度(G)与CD4+、CD8+、CD20+、CD57+淋巴细胞的关系 |
| 2.4 B基因型CHB患者肝组织CD4+、CD8+、CD20+、CD57+淋巴细胞与ALT、GLB、HBVDNA的相关性分析 |
| 2.5 C基因型CHB患者肝组织CD4+、CD8+、CD20+、CD57+淋巴细胞与ALT、GLB、HBVDNA的相关性分析 |
| 3 讨论 |
（6）慢性乙型肝炎患者HBV不同基因型肝组织内T淋巴细胞表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 检查设备与方法 |
| 1.3 统计学分析方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV 基因型与临床表现关系 |
| 2.2 B基因型慢性乙肝患者不同肝组织炎症程度(G)与 CD4~+T 淋巴细胞、CD8~+T 淋巴细胞、CD20~+T 淋巴细胞和 CD57~+T 淋巴细胞的关系表（2） |
| 2.3 C基因型慢性乙肝患者不同肝组织炎症程度(G)与 CD4~+、CD8~+、CD20~+、CD57~+淋巴细胞的关系(表 3) |
| 2.4 B基因型 CHB 患者肝组织 CD4~+T 淋巴细胞、CD8~+T 淋巴细胞、CD20~+T淋巴细胞、CD57~+T 淋巴细胞与 ALT、GLB、HBV-DNA 载量的相关性分析(表 4) |
| 2.5 C基因型 CHB 患者肝组织 CD4~+、CD8~+、CD20~+、CD57~+淋巴细胞与 ALT、GLB、HBV-DNA 的相关性结果（表 5） |
| 附图 1~8 肝活检结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）CD4+CXCR5+CD57+T细胞在肝癌发病中的作用及解毒抗癌方干预的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 国内外研究进展 |
| 2 临床实验 |
| 2.1 实验内容 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 检测指标 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 3 细胞实验 |
| 3.1 实验内容 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 检测指标 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 4 动物实验 |
| 4.1 实验内容 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 检测指标 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 5 结论和创新 |
| 1、结论 |
| 2、创新点 |
| 3、展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表论文清单 |
| 致谢 |
（8）不同HBeAg状态下慢性乙型肝炎患者肝组织内CD4+、CD8+、CD20+、CD57+ T淋巴细胞的表达分析（论文提纲范文）
| 1资料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
四、CD57与病毒性肝炎关系的研究（论文参考文献）
- [1]外周血衰老CD8+T细胞频率与2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的相关性分析[D]. 张梦洁. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究[D]. 马美晨. 中国医科大学, 2020
- [3]83例轻度慢性乙型肝炎合并肺结核患者肝组织病理学与血清生化学及T细胞亚群相关性分析[J]. 蒋福明,李秀芬,程书权,刘平香,黄成军,冼永超. 重庆医科大学学报, 2018(01)
- [4]多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性及免疫应答研究[D]. 黄静. 南方医科大学, 2016(05)
- [5]不同基因型HBV感染患者临床表现及肝组织内免疫活性细胞表达的研究[J]. 冼永超,李秀芬,易丹,程书权,倪辉,黄成军. 中国病毒病杂志, 2016(01)
- [6]慢性乙型肝炎患者HBV不同基因型肝组织内T淋巴细胞表达的研究[D]. 易丹. 桂林医学院, 2015(03)
- [7]CD4+CXCR5+CD57+T细胞在肝癌发病中的作用及解毒抗癌方干预的研究[D]. 赵昌林. 暨南大学, 2015(06)
- [8]不同HBeAg状态下慢性乙型肝炎患者肝组织内CD4+、CD8+、CD20+、CD57+ T淋巴细胞的表达分析[J]. 冼永超,程书权,倪辉,黄成军. 临床肝胆病杂志, 2015(04)
- [9]肝组织病理与慢性乙型病毒性肝炎病毒复制及抗病毒应答的关系[A]. 丁玉平,邹志强,于吉广,于红,郑媛,龙波,许爱玲,郭砚梅,宋戈,贾伟,方雨晴,王贵强. 中华医学会第十六次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编, 2013
- [10]肝穿病理及肝小叶内CD8的表达对抗病毒应答的预测意义[A]. 丁玉平,邹志强,于吉广,于红,郑媛,龙波,许爱玲,郭砚梅,宋戈,贾伟,方雨晴,王贵强. 中华医学会第十六次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编, 2013