一、免疫荧光法检测脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB的活化（论文文献综述）
郑璐[1]（2021）在《扶芳藤提取物及主要活性成分甜醇对LPS诱导小鼠急性肺损伤的作用及机制研究》文中指出研究背景:本课题组前期对扶芳藤进行粗提并对其抗炎能力进行初步筛选,结果显示,在体外LPS诱导的RAW264.7细胞实验中,粗提的扶芳藤能够抑制各种炎性因子,具有明显的抗炎活性;在体内二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀实验中,粗提的扶芳藤对小鼠耳肿胀也有一定的抑制作用,表明扶芳藤粗提物体内体外有一定的抗炎作用。本文在前期实验结论的基础上进一步研究扶芳藤粗提物对抗LPS诱导的急性肺损伤活性,并对扶芳藤进行不同极性萃取,深入探寻其抗急性肺损伤的活性成分和作用机制。目的:本课题旨在从体内和体外评价扶芳藤提取物的主要抗炎活性成分对巨噬细胞和A549细胞的影响,并初步探讨扶芳藤主要有效活性单体调控巨噬细胞和A549细胞的潜在作用机制。方法:第一部分中药扶芳藤提取物、主要活性成分以及各萃取物对炎症反应的影响1.建立小鼠急性肺损伤模型测定扶芳藤乙醇提取物高、中、低剂量组对LPS所致小鼠急性肺损伤的影响。2.MTT法检测扶芳藤乙醇提取物以及乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和石油醚提取物对RAW264.7细胞活力的影响。3.Griess法检测扶芳藤乙醇提取物以及乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和石油醚提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO产量的影响。4.ELISA法测定扶芳藤乙醇提取物以及正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌IL-6和TNF-α的影响。5.高效液相色谱法检测正丁醇提取物所含的主要活性成分,以及所含主要活性成分的含量。第二部分中药扶芳藤主要活性成分甜醇对LPS诱导的RAW264.7细胞的影响及机制探究1.MTT法检测甜醇对RAW264.7细胞活力的影响。2.Griess法检测甜醇对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响。3.ELISA法测定甜醇对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌IL-6和TNF-α的影响4.RT-PCR检测甜醇对LPS诱导的RAW264.7细胞Myd88、TLR4、TRIF、NF-κB p65、iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA表达的影响。5.Western-blot检测甜醇对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TLR4、Myd88、TRIF和NF-κB p65蛋白表达的影响。6.免疫荧光法检测甜醇对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB p65核转位的影响。第三部分中药扶芳藤主要活性成分甜醇对LPS诱导的A549细胞的影响及机制探究1.MTT法检测甜醇对LPS诱导的A549细胞活力的影响。2.Griess法检测甜醇对LPS诱导的A549细胞分泌NO产量的影响。3.RT-PCR检测甜醇对LPS诱导的A549细胞Myd88、TLR4、TRIF、NF-κB p65、iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA表达的影响。4.Western-blot检测甜醇对LPS诱导的A549细胞分泌TLR4、Myd88、TRIF和NF-κB p65蛋白表达的影响。5.免疫荧光法检测甜醇对LPS诱导的A549细胞NF-κB p65核转位的影响。第四部分中药扶芳藤主要活性成分甜醇对LPS诱导小鼠急性肺损伤中的抗炎作用及其作用机制研究1.ELISA法检测甜醇对LPS诱导小鼠急性肺损伤分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的影响。2.肺湿质量/干质量（W/D）比值检测甜醇对LPS诱导的小鼠急性肺损伤肺组织干湿比的影响。3.BCA及细胞计数法检测甜醇对LPS诱导小鼠急性肺损伤BALF中总蛋白浓度和细胞渗出数的影响。4.HE染色检测甜醇对LPS诱导急性肺损伤小鼠的肺部组织炎症反应影响。5.Western-blot法检测甜醇对LPS诱导急性肺损伤小鼠肺组织细胞中TLR4、Myd88、TRIF和NF-κB p65蛋白表达的影响。6.免疫荧光法检测甜醇对LPS诱导的急性肺损伤小鼠NF-κB p65核转位的影响。结果:1.中药扶芳藤提取物可显着降低LPS诱导小鼠急性肺损伤肺组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平;可显着降低LPS诱导RAW264.7细胞NO及IL-6的分泌。2.中药扶芳藤中单体甜醇、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和石油醚提取物在0～50μmol·L-1浓度下对RAW264.7细胞无明显毒性（P﹤0.05）;甜醇在1～25μmol·L-1时,对A549细胞无明显毒性（P﹤0.05）。因此,RAW264.7细胞选用的浓度为10μmol·L-1、25μmol·L-1和50μmol·L-1;A549细胞选用的浓度为1μmol·L-1、10μmol·L-1和25μmol·L-1。3.扶芳藤乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和石油醚提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的NO、IL-6和TNF-α有显着的抑制作用。4.HPLC表明扶芳藤中甜醇的含量为2.915%,甜醇在乙酸乙酯提取物含量为2.6%,在正丁醇提取物含量为4.6%。在正丁醇提取物中含量最高,与正丁醇提取物抗LPS诱导的急性肺损伤效果最显着相呼应,推测甜醇是主要活性的成分之一。5.甜醇抑制LPS诱导的RAW264.7和A549细胞分泌NO。6.甜醇抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、Myd88、TRIF和NF-κB p65蛋白的表达。7.甜醇抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β、TRIF、TLR4、Myd88和NF-κB p65的mRNA的表达。8.甜醇抑制LPS诱导的A549细胞iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β、TRIF、TLR4、Myd88和NF-κB p65 mRNA的表达;同时,甜醇抑制细胞对TLR4、Myd88、TRIF和NF-κB p65蛋白的表达。9.扶芳藤中主要活性成分甜醇从病理学角度上明显改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠的肺组织的炎性浸润,显着减轻了小鼠肺组织病理状态,改善组织充血的现象,还可以减轻小鼠肺组织渗出物的分泌,肺泡中出血状态减轻,红色变异区域也随之减少,表明小鼠的急性肺损伤状况得到改善,炎症区域普遍缩小,抑制炎症的发生发展,甜醇起到了明显改善小鼠急性肺损伤的作用。结论:1.扶芳藤粗提物高中低剂量在体外实验中,对炎症反应有显着的抑制作用;扶芳藤乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和石油醚提取物均对炎症反应有显着的抑制作用,且正丁醇提取物活性最高。2.扶芳藤不同提取物均含有甜醇,且正丁醇提取物中甜醇含量最高,证明甜醇是扶芳藤中主要抗炎活性成分之一。3.甜醇对LPS诱导的RAW264.7和A549细胞的炎症反应有显着的抑制作用。4.甜醇抑制RAW264.7和A549细胞的TLR4-NF-κB p65信号通路。5.扶芳藤中主要活性成分甜醇通过抑制TLR4-NF-κB p65通路发挥抗炎作用,从而对LPS诱导的急性肺损伤小鼠具有保护作用。
高晓慧[2]（2021）在《苯并恶唑酮类抗炎化合物W3D对MD2和TLR4蛋白调控作用的研究》文中研究指明目的:课题组前期以苯并恶唑酮为母环设计合成了系列4位取代衍生物,并发现4-5’-二甲氨基萘-1’-磺酰氧基-苯并恶唑酮（W3D）具有较好的抗炎活性,且对TLR4/My D88/NF-κB信号通路具有调控作用,但其作用靶点尚不明确。本论文旨在以MD2和TLR4为候选靶蛋白,利用体外、体内及化学生物学等多种方法,研究W3D对上述蛋白的调控机制,为合理设计苯并恶唑酮类抗炎小分子化合物提供靶点依据。方法:第一部分化合物W3D对MD2、TLR4蛋白表达调控的作用研究1.Western Blot法检测化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、MD2、p-IRAK4蛋白表达的影响。2.ELISA法检测化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中TLR4、MD2蛋白表达的影响。3.细胞免疫荧光法检测化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB p65核转移的影响。第二部分MD2抑制剂MD2-IN-1对化合物W3D抗炎活性的影响MD2抑制剂MD2-IN-1阻断MD2蛋白后,LPS与化合物W3D共同处理细胞:1.Griess法测定LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中NO释放量。2.ELISA法测定LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中IL-6、TNF-α释放量。3.Western Blot法测定化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞MD2、TLR4蛋白表达的影响。4.细胞免疫荧光法检测化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB p65核转移的影响。第三部分化合物W3D与MD2、TLR4蛋白相互作用研究1.流式细胞术检测化合物W3D对FITC-LPS结合细胞膜表面受体的竞争性抑制作用。2.DARTS和CETSA技术检测化合物W3D对MD2、TLR4蛋白稳定性的影响。3.荧光光谱技术检测化合物W3D与bis-ANS竞争性结合MD2蛋白的作用。4.BLI生物层干涉技术检测化合物W3D与MD2、TLR4蛋白的平衡解离常数KD。5.分子对接法模拟化合物W3D与MD2蛋白的结合。第四部分化合物W3D对LPS诱导的急性肺损伤的药效学研究气道滴注1 g·L-1LPS造成小鼠肺损伤,采用灌胃方式给予药物,并在12 h后处死小鼠:1.HE染色法观察小鼠肺组织损伤程度并计算肺组织湿干比。2.ELISA法检测小鼠肺组织中MPO活性和血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的释放量。3.Western Blot法检测小鼠肺组织TLR4信号通路相关蛋白的表达水平。结果:1.化合物W3D可显着抑制LPS诱导的RAW264.7细胞MD2、TLR4蛋白的表达,抑制IRAK4磷酸化和NF-κB p65的入核,减少细胞上清液中MD2、TLR4蛋白的表达,且呈现一定的剂量依赖性。2.流式细胞术荧光值表明化合物W3D可抑制LPS与RAW264.7细胞膜受体的结合。3.MD2抑制剂MD2-IN-1的加入,在一定程度上减弱了化合物W3D对NO、IL-6、TNF-α释放的抑制活性,降低了其对MD2、TLR4蛋白表达以及NF-κB p65入核的抑制作用。4.DARTS实验和CETSA实验表明化合物W3D可显着增强MD2、TLR4蛋白的酶稳定性和热稳定性。5.荧光光谱实验分析发现化合物W3D可以竞争性抑制bis-ANS与MD2蛋白结合,而使荧光强度减弱。6.BLI实验表明化合物W3D可与MD2蛋白发生直接作用,平衡解离常数KD值为5.875×10-6mol·L-1,而与TLR4蛋白无直接作用。7.计算机Docking结果显示化合物W3D与MD2蛋白疏水囊中的SER-120、SER118残基形成氢键。8.体内药效学研究显示化合物W3D可减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤,降低肺湿干重比、MPO酶活性以及血清中iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平,同时可显着减轻肺组织中MD2、TLR4、NF-κB p65蛋白的表达,抑制IRAK4磷的酸化,呈现一定的剂量依赖性。结论:1.化合物W3D可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞MD2、TLR4蛋白的表达。2.化合物W3D可通过氢键作用直接与MD2蛋白结合,竞争性抑制LPS与膜表面受体的结合,与bis-ANS竞争性结合MD2蛋白,与MD2蛋白的平衡解离常数为5.875×10-6mol·L-1,该结合作用使得MD2、TLR4蛋白酶稳定和热稳定性有所增强,为新型的MD2抑制剂。3.化合物W3D可通过调控TLR4/MD2/p IRAK4/NF-κB p65信号通路发挥治疗小鼠急性肺损伤的作用。
于春微[3]（2021）在《酿酒酵母β-葡聚糖对RAW264.7细胞氧化应激、炎症和凋亡的缓解作用及机制》文中研究说明巨噬细胞是先天免疫系统的高度可塑性细胞,参与多种病理进程,对许多毒性刺激诱导的氧化应激、炎症和凋亡具有高度的抗性。酿酒酵母β-葡聚糖已被证明是一种有效的免疫增强剂,课题组前期研究证实其可降低肉羊机体氧化应激。本研究首先利用LPS诱导RAW264.7细胞建立氧化应激和炎症反应模型,初步证实酿酒酵母β-葡聚糖的抗氧化作用。然后,在氧化应激模型基础上,探究酿酒酵母β-葡聚糖对RAW264.7细胞抗氧化、抗炎及抗凋亡的分子作用机制,为预防和治疗氧化应激相关性疾病提供新的思路。本研究主要从细胞信号通路转导方面对酿酒酵母β-葡聚糖抗氧化、抗炎和抗凋亡作用机制进行研究,结果如下:（1）试验一以LPS为诱导物,氧化应激和促炎细胞因子作为建立氧化应激和炎症模型指标,探究LPS对RAW264.7细胞氧化损伤效果。结果表明:0.1～5μg/m L LPS处理RAW264.7细胞12 h后,细胞内氧化应激指标MDA和ROS产生显着增多,抗氧化指标SOD、CAT和GSH-Px酶活性显着降低;细胞培养上清液中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α释放显着增多,细胞内COX-2和i NOS含量显着升高。综合多项指标,以1μg/m L LPS作为建立细胞氧化应激和炎症模型的最佳浓度。（2）试验二在试验一基础上,初步探讨酿酒酵母β-葡聚糖对LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激和炎症损伤的缓解作用。结果表明:酿酒酵母β-葡聚糖增强抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO活性,抑制LPS诱导的MDA和ROS产生而发挥抗氧化作用,降低IL-1β、IL-6和TNF-α的释放以及COX-2和i NOS水平而起到抗炎效果,推测可能是酿酒酵母β-葡聚糖激活抗氧化转录因子从而发挥预保护作用。这些结果充分说明β-葡聚糖具有抗氧化和抗炎的双重调节作用,从而抑制细胞内ROS产生,进而对RAW264.7细胞起到保护作用。但其调控抗氧化和抗炎信号转导机制仍需在氧化应激模型中进一步验证。（3）试验三以试验二为基础进行深入性研究,本试验旨在探讨β-葡聚糖抑制LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激分子机制。为阐明β-葡聚糖抗氧化的分子机制,我们设计了β-葡聚糖添加试验,结果表明:β-葡聚糖能够激活其受体Dectin-1介导的Nrf2/HO-1信号转导通路。氧化应激模型中,在LPS抑制Nrf2和HO-1表达的条件下,β-葡聚糖能显着上调LPS诱导的Dectin-1、Nrf2和HO-1的表达,抑制ROS产生,但β-葡聚糖这些作用可被Dectin-1抑制剂Laminarin、Nrf2抑制剂ML385和HO-1抑制剂Sn PP逆转。该结果表明β-葡聚糖可以通过Dectin-1/Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激。（4）试验四在试验三基础上,旨在探讨β-葡聚糖抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的分子机制。结果表明:炎症模型中,LPS显着激活炎症反应转录因子NF-κBp65表达,促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和i NOS基因和蛋白表达显着增强;β-葡聚糖能显着抑制LPS诱导的NF-κBp65及下游促炎细胞因子的表达,而这种抗炎效应能够被Sn PP逆转。该结果表明β-葡聚糖可以通过Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应。（5）试验五基于试验四结果,旨在探讨β-葡聚糖抑制LPS诱导RAW264.7细胞NLRP3形成的分子机制。结果表明:LPS显着激活NLRP3炎性小体,增强ASC、IL-18和Caspase-1表达;添加β-葡聚糖作用后,能显着抑制NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-18表达,但这种抑制状态能够被Sn PP逆转。该结果表明β-葡聚糖可以通过Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3形成。（6）试验六基于以上试验结果及氧化应激造成细胞凋亡的理论基础,旨在探讨β-葡聚糖抑制LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡的分子机制。结果表明:LPS显着增强细胞凋亡率,β-葡聚糖则显着降低细胞凋亡率;LPS显着增强Bax表达,抑制Bcl-2表达,添加β-葡聚糖作用后,Bax表达显着下降,Bcl-2表达显着上升,而这种效应能够被Sn PP逆转。该结果表明β-葡聚糖可以通过Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡。综上所述,本研究阐明β-葡聚糖可激活Dectin-1介导的Nrf2/HO-1信号通路抑制RAW264.7细胞内ROS产生、NF-κBp65和NLRP3表达和凋亡,从而对细胞发挥保护作用。因此,以激活Nrf2/HO-1信号通路为靶标有望成为防治氧化应激相关疾病的一个新途径。
郑炜东[4]（2021）在《麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究使用卵清蛋白（OVA）复制过敏性哮喘模型大鼠,验证麻杏石甘汤的抗过敏作用,进而探究麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠辅助T淋巴细胞Th2、Th9、Th17的调控作用和主要调控细胞;并使用体外培养外周血淋巴细胞的方式探究麻杏石甘汤干预过敏性哮喘的作用靶点;探讨麻杏石甘汤干预过敏性哮喘细胞免疫的主要机制,为阐明麻杏石甘汤抗过敏性哮喘和作用机理提供实验依据。材料与方法:1.麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠的抗过敏作用观察。观察麻杏石甘汤对过敏性模型大鼠血清Ig E,肺组织病理（HE染色）,腹腔肥大细胞脱颗粒的调控作用。采用OVA致敏、激发的方法复制过敏哮喘模型大鼠,然后给予麻杏石甘汤经口灌胃干预,采用ELISA法检测大鼠血清中Ig E,HE染色法观察肺组织病理,腹腔肥大细胞脱颗粒实验观察麻杏石甘汤对肥大细胞膜的稳定作用。2.麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠Th2、Th9、Th17的调控作用观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠血清IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17含量的影响。观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9表达的影响。观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠外周血淋巴细胞Th2、Th9、Th17比例的影响。采用OVA致敏、激发的方法复制过敏性哮喘模型大鼠,然后给予麻杏石甘汤经口灌胃干预,采用ELISA法检测大鼠血清IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17的含量。采用Western-Blot及免疫组化法检测大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9的表达。采用流式细胞法检测大鼠外周血淋巴细胞Th2、Th9、Th17的比例。3.麻杏石甘汤调控CD4+T细胞Th2、Th9、Th17亚型的作用采用体外培养大鼠外周血淋巴细胞,使用细胞因子和含药血清体外干预CD4+T细胞发育,采用免疫荧光法和ELISA法观察麻杏石甘汤对PBMC中Th2、Th9、Th17阳性率和细胞因子含量,阐述麻杏石甘汤调控Th2、Th9、Th17的抗过敏机制。结果:1.动物体内实验部分1.1采用腹腔注射OVA后再行雾化吸入OVA可成功诱导大鼠过敏性哮喘模型。1.2麻杏石甘汤可明显改改善造模大鼠的一般状态,麻杏石甘组大鼠肺组织HE染色气管黏膜完整,未断裂,支气管黏膜慢性炎症较轻,黏膜增生突起、杯状细胞增生较轻,肺气肿及肺间质性炎性改变较轻,周围存在少数肥大细胞、嗜酸性粒细胞等炎细胞浸润。说明麻杏石甘汤可整体改善大鼠过敏性哮喘肺组织病变程度。1.3在肥大细胞脱颗粒检测中,西药对照组、麻杏石甘组大鼠肥大细胞计数、脱颗粒的肥大细胞计数、脱颗粒率均明显降低（p<0.05）;与西药对照组比较,麻杏石甘组大鼠肥大细胞计数、脱颗粒的肥大细胞计数、脱颗粒率差异无统计学意义（p>0.05）。提示麻杏石甘组可降低肥大细胞在肺组织中的募集、减少肥大细胞脱颗粒,缓解气道炎症。且与西药效果相当。1.4 OVA造模大鼠血清中Ig E含量明显增高,空白组大鼠血清Ig E未见明显变化与文献报道结果一致。其余两组经药物干预后与模型对照组比较,麻杏石甘组和西药对照组中大鼠血清Ig E水平均明显下调（p<0.05）。虽然组间差异无统计学意义（p>0.05）,但对比数据,麻杏石甘组对Ig E的调控效果略优于西药对照组。推测示中药复方颗粒剂可能是通过抑制Ig E,增强抗过敏作用,从而减轻气道炎症反应。1.5采用流式细胞术和ELISA分别测定辅助T淋巴细胞比例和细胞因子含量。结果显示与空白对照组相比,模型对照组的大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达明显上调（p<0.05）,Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞比例均增大。说明Th2、Th9、Th17及其主要细胞因子在支气管哮喘发病过程中起重要作用,与文献报道一致。实验还发现Th2细胞因子（IL-4,IL-5）上调趋势明显同时流式检测Th2细胞阳性率最高,证实了Th2细胞在哮喘的发展过程中占主导地位。经过药物治疗后,与模型对照组比较,麻杏石甘组和西药对照组大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达均有不同程度的下调（p<0.05）,麻杏石甘组指标皆优于西药对照组且麻杏石甘组中IL-4、TGF-β、IL-9表达下调较为明显（p<0.05）,尤其在流式检测中,麻杏石甘组Th9细胞阳性率大体与空白对照组相当（p>0.05）且明显低于西药对照组（p<0.05）,证明麻杏石甘汤在调控Th2、Th9、Th17方面都有很好的效果,但麻杏石甘汤最可能是通过调控Th9细胞来干预过敏性哮喘。1.6进一步对肺组织中与Th9分化发育有关的IL-4、TGF-β和Th9分泌的特异性细胞因子IL-9进行研究。IHC结果提示在上皮细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、平滑肌细胞、杯状细胞、肥大细胞中可检测到IL-4、TGF-β、IL-9,western blot结果表明麻杏石甘汤可下调IL-4、TGF-β、IL-9表达（p<0.05）。横向观察IHC、western blot及ELISA法所测得的各组数值,显示出麻杏石甘汤可显着下调IL-9的表达（p<0.05）,同时抑制IL-4和TGF-β表达（p<0.05）,说明麻杏石甘汤可能同时抑制CD4+T细胞向Th9细胞分化和Th2细胞向Th9细胞的转化。推测麻杏石甘汤可能是通过调控细胞因子来干预Th9细胞的发育与分化以达到治疗过敏性哮喘的目的。2.动物体外实验部分2.1使用Ficoll-paque（菲科帕克）成功提取PBMC。2.2通过免疫荧光法证明Th9细胞的分化与IL-4和TGF-β协同作用密不可分,含有麻杏石甘汤成分的血清能够有效调控CD4+T细胞增殖能力。2.3麻杏石甘汤有效调控PBMC中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达在检测IL-4时,细胞因子对照组和含药血清组中IL-4含量均比空白对照组明显增加（p<0.05）,其中IL-4组增加最明显（p<0.05）,含药血清组增加最少（p<0.05）。说明在IL-4高表达的情况下,原始CD4+T细胞可能向Th2细胞分化,当同时存在TGF-β表达时CD4+T细胞可能向非Th2细胞分化,麻杏石甘汤可能具有抑制Th2细胞分化的作用。在检测TGF-β时,IL-4组中TGF-β含量是细胞因子组中最低的（p<0.05）。含药血清组TGF-β含量较细胞因子组降低（p<0.05）,证明麻杏石甘汤可能具有调控TGF-β表达的作用。在检测IL-5含量时,IL-4组和IL-4+TGF-β组无统计学差异且TGF-β组含量很少（p<0.05）,证明IL-5主要由Th2细胞分泌,而含药血清组IL-5含量与TGF-β组基本相当（p>0.05）,证明麻杏石甘汤可能具有抑制IL-5表达的作用。在检测IL-10时,IL-4+TGF-β组中IL-10含量较余下细胞因子组明显增高（p<0.05）,IL-4组和TGF-β组IL-10含量无统计学差异（p>0.05）,上述结果与文献一致。含药血清组IL-10含量明显降低,证明麻杏石甘汤可能具有干预Th9细胞表达IL-10的作用。为了进一步验证麻杏石甘汤对Th9细胞的干预能力,我们检验Th9最主要细胞因子IL-9在各组中的含量,结果显示IL-4+TGF-β组的IL-9含量为细胞因子组中最高（p<0.05）,含药血清组IL-9含量明显下降（p<0.05）,进一步证明麻杏石甘汤可通过干预细胞因子IL-9调控Th9细胞。最后在检测IL-17时,TGF-β组和IL-4+TGF-β组中IL-17高表达（p<0.05）,证明TGF-β是Th17细胞分化的必要细胞因子,含药血清组IL-17表达降低（p<0.05）,说明麻杏石甘汤可能具有抑制IL-17表达的作用。结论:1.通过动物体内实验,揭示麻杏石甘汤可降低哮喘大鼠肥大细胞脱颗粒率,使大鼠血清中Ig E的含量降低,发挥治疗气道炎症的作用;麻杏石甘汤还可通过干预IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17等表达来调控Th2、Th9、Th17细胞以达到控制哮喘的目的。同时麻杏石甘汤可以显着下调IL-9、IL-4和TGF-β的表达,推测麻杏石甘汤可能主要通过干预Th9细胞的分化与IL-9的分泌来达到抗哮喘的作用。2.通过动物体外实验,进一步验证了IL-4和TGF-β对于Th9细胞分化起决定性作用;麻杏石甘汤能够有效抑制CD4+T细胞中Th2、Th9、Th17增殖能力,其中抑制Th9细胞增殖能力最强;进一步证明麻杏石甘汤能够有效干预Th9细胞的分化和相应细胞因子的表达来发挥抗哮喘作用。
徐秋实[5]（2021）在《冷诱导RNA结含蛋白在重症急性胰腺炎相关性肺损伤发病机制中的作用及大黄素干预的实验研究》文中研究表明背景:随着世界范围内生活方式的广泛改变,致使肥胖和胆结石发生率日益增加,导致急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）的发病率呈逐年上升趋势。AP是临床上常见的腹部急症,其特点是起病急,进展快。临床上常将急性胰腺炎分为轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis,MAP）和重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）,其中重症急性胰腺炎占20%左右。最新资料显示,SAP患者的病死率在13%～35%之间。而急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）则是SAP最常见的早期并发症之一,ALI可进一步发展为危重的急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS）。入院1周内死亡的SAP患者中有60%死于呼吸功能衰竭,ARDS被认为是造成SAP患者死亡的主要原因之一。目前,国内、外学者将这种由急性胰腺炎所导致的肺损害称为急性胰腺炎相关性肺损伤（Acute Pancreatitis-Associated Acute Lung Injury,APALI）,虽然在APALI的发病机制和药物干预方面的相关研究越来越多,但近年来APALI的治疗效果仍无明显改善,死亡率仍然居高不下。因此,亟待深入探索APALI的发病机制及有效的治疗策略。细胞外冷诱导RNA结合蛋白（Extracellular cold inducible RNA-binding protein,e CIRP）是一种损伤相关分子模式（Damage-associated molecular pattern,DAMP）。在失血性休克或败血症患者中可检测到高水平的血清CIRP,其升高程度与死亡率呈正相关。在功能上,eCIRP可以激活NLRP3炎性小体,加剧炎症性疾病并导致组织损伤。NLRP3炎性小体是一个蛋白复合物,它可以直接与凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）相互作用激活caspase-1,激活的caspase-1裂解活化gasdermin D（GSDMD）,pro-IL-1β和pro-IL-18,导致细胞焦亡和IL-1β以及IL-18的分泌。细胞焦亡是近年来发现的一种新的细胞死亡形式,与炎症有关,可导致疾病进程恶化。肺常驻巨噬细胞,如肺泡巨噬细胞活化产生剧烈炎症反应释放多种炎症介质是ALI/ARDS发病的关键因素。肺泡巨噬细胞焦亡可以通过产生炎性细胞因子IL-1β、IL-18等,加剧肺组织损伤。然而,对于eCIRP是否引能起肺泡巨噬细胞焦亡以及其是否参与APALI的发生发展过程,目前尚无报道,值得进一步探索。历经20余年的探索,本研究组在APALI的发病机制以及中西医结合治疗方案的基础与临床方面的研究证实,应用中西医结合方案治疗APALI,可明显缩短SAP病程,并降低病死率。因此,在SAP、APALI的诊疗方面,将现代医学与祖国传统医学相结合,优势互补,具有广阔的应用前景。经过多年的临床实践和实验研究,“肺与大肠相表里”理论得到充分阐释,并且经后世医家发展,成为中医学理论的重要组成部分之一。研究显示APALI的发生、发展可能与SAP时肠屏障功能发生障碍,肠内细菌和毒素易位后被吸收入血,循环至肺部有关。上述研究结果与中医脏腑相关理论中的“肺与大肠相表里”相关理论不谋而合,即“腑气不通,上逆于肺”,所以从治疗角度上要注重“从肠治肺”,故病变早期治法上以攻里通下为主,引肺气下行以止喘息。中医常用大黄以泻下攻积,清热泻火,故目前临床在中西医结合治疗急性胰腺炎方剂中都配伍中药大黄,而大黄素是大黄的主要活性成分之一。为探究大黄素在治疗APALI中可能的作用机理,本研究通过5%牛磺胆酸钠（Sodium Taurocholate,STC）逆行胰胆管注射法,应用SD大鼠建立APALI动物模型,利用现代生物学方法与技术,探究eCIRP在APALI发病机制中的病理潜在作用及大黄素的干预作用,以期进一步揭示APALI的发病机制并为中西医结合疗法防治APALI提供实验依据和新的治疗策略。目的:通过检测APALI大鼠模型CIRP的表达变化及拮抗CIRP对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤的影响,以及应用重组大鼠CIRP刺激大鼠肺泡巨噬细胞并检测CIRP对该细胞的影响,以探索CIRP在APALI发病机制中的作用,同时应用大黄素进行干预性治疗的研究,探究大黄素治疗APALI的靶点,从而为治疗APALI寻找潜在靶点和应用大黄素治疗APALI提供理论依据。方法:第一部分:动物模型体内实验研究。将40只雄性SD（Sprague Dawley）大鼠,随机分为4组:假手术组（CON）,重症胰腺炎组（SAP）,C23（CIRP拮抗剂）干预组（C23）,大黄素干预组（EMO）。采用5%牛磺胆酸钠溶液（Sodium Taurocholate,STC）经胆胰管逆行注射（1ml/kg,0.1ml/min）诱导SAP大鼠模型,CON组大鼠经胆胰管逆行注入等体积无菌生理盐水。C23干预组于造模后2小时经尾静脉注入C23（8mg/kg）。大黄素干预组于术后2小时及术后12小时分别灌胃给予大黄素（40mg/kg）。造模24小时后,将各组大鼠麻醉后,开腹经腹主动脉采血,并收集胰腺及肺组织。进行HE染色观察胰腺及肺组织病理改变,并进行胰腺和肺组织病理评分来评价C23和大黄素对SAPALI的保护作用;酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清中CIRP、淀粉酶、IL-1β;应用全自动血气分析仪进行动脉血气分析测定;免疫组化染色观察胰腺和肺组织内CIRP表达情况及肺组织中Ly6G+细胞;采用qRT-PCR测定胰腺和肺组织中的CIRP mRNA水平及肺组织中的NLRP3、IL-1β和CXCL1的mRNA表达水平;以蛋白印迹（Western blot）法检测CIRP、p-P65、t-P65、p-IKBα、t-IKBα、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、CXCL1蛋白在各组大鼠中的表达;采用多重荧光染色观察胰岛中CIRP及肺内常驻巨噬细胞（F4/80+细胞）NLRP3和CXCL1的表达。第二部分:体外细胞学实验研究。以大鼠肺泡巨噬细胞珠NR8383细胞为研究对象,观察重组大鼠CIRP对肺泡巨噬细胞焦亡及炎症小体相关分子基因和蛋白表达的影响及大黄素的干预作用。实验一,NR8383细胞随机分为5组:对照组（Control）,重组CIRP处理组（CIRP）,TAK-242（一种TLR4受体特异性抑制剂）处理组（CIRP+TAK242）,C23处理组（CIRP+C23）,大黄素处理组（CIRP+EMO）。其中,对照组不予特殊处理,其余各组在采用重组大鼠CIRP（1.5μg/ml）处理NR8383细胞6h的同时,分别予应用TAK-242（500μM）预处理24h、应用C23（300ng/ml）预处理1h以及同时给予大黄素（20μM）干预。应用流式细胞术检测各组细胞的焦亡（Caspase-1以及PI双染）率。采用qRT-PCR测定各组细胞NLRP3、IL-1β和CXCL1的mRNA表达水平。采用Western blot法检测p-P65、t-P65、p-IKBα、t-IKBα、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、CXCL1蛋白在各组细胞中的表达。实验二,细胞分为Control组,CIRP组,CIRP+Si-IL-1β组和CIRP+NC（Negative control）组,应用NC siRNA或IL-1β特异性siRNA,在Lipofectamine 2000的介导下转染NR8383细胞48h后,用1.5μg/ml的CIRP处理CIRP组、NC组及Si-IL-1β组6h。此外,分别用不同浓度（0、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml）的重组大鼠IL-1β和应用10 ng/ml的IL-1β,以不同的时间点（0、6、12、24h）处理NR8383细胞,然后收集细胞,提取蛋白和RNA,采用q RT-PCR法和Western blot法研究IL-1β在CIRP诱导CXCl1表达中的作用。结果:第一部分,动物模型实验结果:（1）与CON组相比,SAP组大鼠胰腺及肺组织显示出明显的病理损伤,病理评分显着性增高（p<0.001）。此外,与CON组相比,SAP组大鼠血清CIRP、淀粉酶、IL-1β均明显升高（p<0.001）,且SAP组动脉血PaO2水平明显下降（p<0.001）,与此同时该组动脉血PaCO2水平明显上升（p<0.001）。与SAP组相比,C23组及EMO组胰腺及肺组织损伤明显缓解（p<0.001）,血清CIRP、淀粉酶、IL-1β均明显下降（p<0.001）,以及动脉血PaO2水平明显上升（p<0.001）而PaCO2水平明显下降（p<0.001）。（2）通过免疫组化、免疫荧光、qRT-PCR以及Western blot检测发现,与CON组相比,SAP组大鼠胰腺（主要位于胰岛）及肺组织CIRP表达明显增加（p<0.001）。与CON组相比,SAP组大鼠肺内p-P65、p-IKBα、NLRP3、ASC（Monomer,Dimer,Polymer）、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β（pro-IL-1β以及p17）、CXCL1表达明显增高（p<0.001）,且SAP组大鼠肺组织内中性粒细胞（Ly6G+细胞）的浸润明显增加。（3）与SAP组相比,C23组及EMO组胰岛及肺组织CIRP表达明显被抑制,且伴随着肺内p-P65、p-IKBα、NLRP3、ASC（Monomer,Dimer,Polymer）、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β（pro-IL-1β以及p17）、CXCL1表达的下降（p<0.05）及肺内Ly6G+细胞的浸润的明显减少。第二部分,体外细胞学实验结果。（1）用CIRP（1.5μg/ml）诱导了NR8383细胞内p-IKBα和p-P65及NLRP3、ASC（Monomer,Dimer,Polymer）、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β（pro-IL-1β以及p17）蛋白的表达增高（p<0.001）,并进一步促进了NR8383细胞的焦亡（p<0.001）,同时还促进了其表达CXCL1（p<0.001）。TLR4受体抑制剂TAK-242几乎完全地抑制了CIRP所致的上述细胞效应（p<0.001）。结果表明,CIRP通过TLR4受体介导的NF-κB信号及NLRP3炎症小体的激活诱导NR8383细胞焦亡。CIRP拮抗剂C23和大黄素均显示出能够显着性抑制CIRP所致的NR8383细胞内NF-κB的活化、NLRP3炎症小体及组装与激活、细胞焦亡及CXCL1的表达,差异有统计学意义（p<0.05）。（2）CIRP对NR8383细胞表达CXCL1的影响。结果显示,与Control组相比,CIRP组的CXCL1表达明显增高（p<0.001）。而与CIRP组相比,CIRP+Si-IL-1β组的CXCL1表达水平显着性下降（p<0.001）,CIRP+NC（Negative control）组的CXCL1表达水平则无明显改变（p>0.05）。结果表明,IL-1β是CIRP促进NR8383细胞表达CXCL1的关键介质。分别用不同浓度（0、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）的重组大鼠IL-1β和以相同浓度的IL-1β（10ng/ml）以不同的时间点（0、6、12、24h）刺激NR8383细胞,结果显示,IL-1β以剂量依赖性的方式和时间依赖性的方式促进NR8383细胞表达CXCL1。结论:（1）采用5%牛磺胆酸钠溶液经胆胰管逆行注射制备SAP肺损伤模型24h后,模型组大鼠血清淀粉酶含量的显着升高,胰腺和肺组织出现了明显的病理损伤,同时动脉血气分析结果也显示大鼠出现明显的呼吸功能障碍,表明SAP诱发肺损伤模型制备成功。（2）CIRP在APALI大鼠模型的胰岛及肺组织中表达增高,并伴有血清CIRP水平的升高。应用CIRP拮抗剂C23后,CIRP在胰岛、肺组织中表达下调且血清中CIRP水平下降,并明显缓解了ALI,提示CIRP与APALI发生发展密切相关。CIRP拮抗剂C23能抑制APALI大鼠肺组织中NF-κB的激活、NLRP3炎症小体的组装与活化、肺组织中CXCL1的表达及中性粒细胞的浸润,并缓解了SAP时的肺损伤。（3）CIRP可能通过TLR4受体介导激活大鼠肺泡巨噬细胞的NF-κB信号及NLRP3/IL-1β/CXCL1信号通路,在APALI中发挥重要作用。（4）大黄素能能显着降低APALI大鼠的血清淀粉酶、CIRP和IL-1β水平,能明显减轻SAP大鼠胰腺和肺组织的病理损伤,并能够改善肺功能,显示出对APALI具有较好的治疗作用。（5）大黄素可能通过抑制CIRP-TLR4介导的NF-κB和NLRP3/IL-1β/CXCL1信号通路减少中性粒细胞向肺内浸润从而发挥其治疗APALI的药理作用。
詹倩[6]（2021）在《Lyn激酶对急性肺损伤（ALI）小鼠模型的影响及机制研究》文中研究表明目的:探讨Lyn激酶对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型的影响及其机制。方法:按照随机原则,将10只Lyn高表达的转基因C57BL/6J小鼠分为2组:LPS组（LPS+Lyn-TG组）和PBS组（PBS+Lyn-TG组）,10只野生型C57BL/6J小鼠按同样方法分为LPS组（LPS+WT组）和PBS组（PBS+WT组）,每组各5只。各组小鼠气管内注射前均以戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉。LPS+WT组和LPS+Lyn-TG组分别气管内注射5μg/g浓度的LPS（LPS溶于50μL PBS中）,其余两组给予等体积的PBS（磷酸缓冲盐溶液）。在给予LPS/PBS 4h后将所有小鼠处死,收集肺组织和血标本。取部分右肺组织,称重计算其湿/干比（W/D）,收集中叶组织冻存以后期做成组织匀浆,右肺下叶组织取出后,用甲醛固定保存,用于行HE染色观察病理变化;左肺组织行肺泡灌洗并收集灌洗液（BALF）,测定其细胞总数,并用HE染色法染色计数中性粒细胞;测定肺泡灌洗液和血清中的蛋白质浓度以计算肺通透指数（LPI）;针对各实验组血清,采用ELISA法,对其内IL-6、IL-8、TNF-α进行检测;免疫荧光法观察ZO-1、闭合蛋白（Occludin）和β-连环蛋白（β-catenin）的表达情况;Westen blot法测定CHOP、BIP、Caspase-3和Bcl-2的表达水平。结果:经PBS处理的PBS+WT组小鼠和PBS+Lyn组小鼠显示出完整的肺组织结构,肺泡壁基本未见破坏,间隔无增宽,无炎性细胞浸润。LPS+WT组与PBS+WT组比较,肺组织出现明显病理损伤,肺泡壁结构不连续,可见明显破坏,并出现间质水肿、肺泡内出血及间隔增厚,而LPS+Lyn-TG组小鼠上述改变明显减轻。与PBS+WT组比较,LPS+WT组和LPS+Lyn-TG组BALF中炎症细胞数明显增多（P<0.001）,且LPS+WT组较LPS+Lyn-TG组变化更明显（P<0.001）,而LPS+WT组与PBS+WT组数量接近（P>0.05）。经LPS处理后,LPS+WT小鼠的W/D和LPI均高于LPS+Lyn-TG小鼠（P<0.001）。比较ELISA结果可见,PBS+WT组与PBS+Lyn-TG组IL-6、IL-8和TNF-α的含量较接近（P>0.05）,而与PBS+WT组比较,LPS+WT组和LPS+Lyn-TG组三者的含量出现了明显升高（P<0.05）,且LPS+Lyn-TG组升高无LPS+WT组明显（P<0.05）。与PBS+WT组比较,LPS+WT组和LPS+Lyn-TG组中ZO-1、Occludin、β-catenin的荧光强度均减弱,且LPS+WT组较LPS+Lyn-TG组减弱更明显,而PBS+Lyn-TG组与PBS+WT组荧光强度无明显差别。与PBS+WT组及PBS+Lyn-TG组比较,LPS+WT组和LPS+Lyn-TG组的CHOP、BIP和Caspase-3表达水平均升高,反之Bcl-2表达水平降低,且LPS+WT组较LPS+Lyn-TG组变化更显着,内质网应激水平及相关凋亡更明显（P<0.05）。结论:1、Lyn激酶可减轻LPS诱导的小鼠肺组织结构破坏、炎性渗出及紧密连接蛋白降解,对急性肺损伤发挥保护效应。2、LPS诱导的小鼠ALI/ARDS中内质网应激水平明显升高。3、Lyn激酶可降低LPS诱导的小鼠ALI/ARDS中内质网应激水平。4、Lyn激酶可通过其介导的抗炎作用对LPS诱导的ALI/ARDS产生保护作用,其机制可能是通过与内质网应激相关的新机制来调节的。
汪岩[7]（2020）在《大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:本研究旨在从亚细胞结构层面探讨城市大气颗粒物对血管内皮造成的损伤及毒作用机制。以多重经典细胞器（内质网、线粒体和溶酶体）为切入点,结合细胞程序性死亡方式（细胞凋亡与细胞自噬）讨论大气颗粒物诱导血管内皮细胞毒性的潜在机制,以及体内血管组织损伤的相关作用模式。研究方法:（1）以美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology,NIST）出品的城市大气颗粒物标准物质（编号1648a,PM SRM1648a）为研究对象,初步对颗粒物的成分、水合粒径和表面电位进行分析,并进行颗粒物内毒素含量的检测。选用人脐静脉血管内皮细胞系EA.hy926和HUVECs为体外实验模型,运用共聚焦显微镜观察法以及流式细胞仪侧向光检测值衡量血管内皮细胞对城市大气颗粒物PM SRM1648a的摄取情况。在细胞毒性层面,运用MTT和CCK8法检测细胞存活率并作为体外实验剂量筛选的依据;结合GSH/GSSG、MDA、NADP+/NADPH 和 C11-BODIPY581/591 等指标评估血管内皮细胞在大气颗粒物PM SRM1648a刺激下的氧化应激状态。在亚细胞结构层面,运用免疫荧光法检测γ-H2AX荧光灶点数以衡量DNA损伤;利用透射电子显微镜（透射电镜,Transmission Electron Microscope,TEM）观察血管内皮细胞对颗粒物的摄取以及细胞内超微结构的变化;（2）以内质网（Endoplasmic reticulum,ER）为核心,讨论大气颗粒物PM SRM1648a 触发血管内皮细胞内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）在自噬小体累积和细胞凋亡中的作用:TEM观察结果提示内质网结构出现撕裂扩张样改变,进一步运用ER-Tracker Blue-White DPX探针标记内质网,观察内质网荧光着色变化;运用DCFH-DA探针检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）;FITC-Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率;通过透射电镜法结合免疫荧光法观察自噬小体数量和LC3B的表达情况;运用western blot蛋白免疫印迹实验讨论颗粒物引起的内质网应激相关标志性蛋白GRP78/BIP、CHOP和caspase12,自噬标志性蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62,以及凋亡相关蛋白caspase9、caspase3、BCL-2和BAX的表达变化。进一步运用氧化应激抑制剂谷胱甘肽乙酯（Glutathione monoethy1 ester,GSH-MEE）和内质网应激广谱抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）探讨 ROS/ER stress 信号轴在颗粒物诱导血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用;此外,运用自噬不同阶段调节剂3-Methyladenine（3-MA）、Rapamycin 和 Bafilomycin A1,探讨颗粒物暴露下,细胞自噬和内质网应激的相互关系,以及细胞自噬在细胞凋亡中发挥的作用;（3）以溶酶体损伤为核心,探讨颗粒物引起血管内皮细胞自噬小体累积与细胞毒性的具体原因:聚焦自噬动态过程,运用mRFP-GFP-LC3腺病毒载体检测颗粒物暴露下,EA.hy926和HUVECs血管内皮细胞中自噬流的通畅性;并在饱和浓度Bafilomycin A1的剂量下讨论颗粒物引起血管内皮细胞自噬小体累积的具体原因;LysoSensorTM Green DND-189探针法标记溶酶体并运用荧光半定量法检测溶酶体相对酸碱度pH;免疫荧光双标法（LAMP-2与LC3B）衡量溶酶体与自噬小体的共定位（即自噬溶酶体）;结合酶活性实验和蛋白表达量实验确定酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）以及溶酶体水解酶（Cathepsin B,CTSB）的活性和表达改变;（4）以线粒体动力学为核心,讨论颗粒物暴露扰乱血管内皮细胞线粒体分裂-融合平衡,进而引起炎症反应:检测线粒体功能学指标ATP、mtROS、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）等;运用 MitoTracker（?）Red CMXRos线粒体红色荧光探针观察线粒体形态学改变;qRT-PCR和western blot法分别检测线粒体动力学相关分子的表达情况;ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子的含量,如TNF-α、IL-1β等;Hoechst33258/PI双染法结合细胞上清液乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的含量检测,初步判断细胞膜的损伤情况;运用流式细胞仪通过FLICA Caspase-1 Reagent FAM-YVAD-FMK/PI双染法检测细胞焦亡率和caspase1活性;运用caspase1特异性抑制剂Z-YVAD-FMK评估caspase1在颗粒物诱导血管内皮细胞炎症级联反应中的作用;以及运用si RNA慢病毒转染敲降技术敲低EA.hy926细胞中线粒体分裂调控基因DNM1L（DRP1）,在蛋白水平验证DRP1的表达量,重复上述相关实验指标评判线粒体分裂、caspase1酶活性、细胞炎症反应等,反向讨论颗粒物暴露经DRP1/caspase1/IL-1β信号通路扰乱血管内皮细胞线粒体分裂-融合平衡,进而触发炎症反应;（5）运用BALB/c小鼠模型,结合WHO建议的发展中国家第一阶段PM2.5过渡值（年均PM2.5浓度35μg/m3）、现实人群暴露情况、小鼠生理解剖结构以及外推系数等,设置低中高暴露剂量组,分别为1.28、5.5和11 mg/kg·bw/w。经过急性（7天）和亚急性（28天）暴露后,取肺泡灌洗液、血液标本以及肺、主动脉和心脏组织进行后续实验;Hematoxylin and eosin stain（H&E）、von kossa和Masson染色观察各组织样本的病理改变、钙离子沉积以及胶原蛋白沉积等;运用ELISA法检测肺泡灌洗液和血液样本中炎性因子以及氧化应激相关指标;BCA法检测肺泡灌洗液中总蛋白含量;流式抗体染色结合流式细胞仪侧向散射光数值检测肺泡灌洗液中总细胞数、单核细胞数、淋巴细胞数以及中性粒细胞数,进一步运用F4-80/CD11b/CD86/CD206流式抗体检测M1和M2型巨噬细胞比例;qRT-PCR法检测主动脉组织中炎性因子和氧化应激相关标志物基因层面的表达量;qRT-PCR法检测主动脉组织中亚细胞结构功能相关指标的表达改变,如内质网应激相关分子hspa5和ddit3,线粒体动力学相关分子dnm1l、fis1、mff、mfn1、mfn2和oopa1,以及溶酶体膜蛋白相关分子lamp1和lamp2;免疫组化、免疫荧光和western blot法检测主动脉组织中亚细胞结构功能相关指标蛋白水平的表达情况,如BIP、CHOP、DRP1、LAMP1和LAMP2;TUNEL法检测主动脉组织细胞凋亡率。综上方法,试图从体内水平初步揭示大气颗粒物引起细胞器功能紊乱参与血管组织损伤。研究结果:（1）体外细胞实验结果显示,大气颗粒物PM SRM1648a暴露下,血管内皮细胞比肺泡上皮细胞更为敏感。暴露于颗粒物24小时后,PM SRM1648a在相对低剂量下（10和20 μg/cm2;相当于32和64 μg/mL）,分别引起EA.hy926（P<0.05）和HUVECs（P<0.05）血管内皮细胞毒性,而未引起肺泡上皮细胞生存率降低。血管内皮细胞具有颗粒物摄取能力,并且颗粒物摄取先于细胞毒性的出现。同为人血管静脉内皮细胞株,PM SRM1648a对EA.hy926比HUVECs的细胞毒性更为显着,可能是因为EA.hy926细胞比HUVECs具有更强的颗粒物摄取能力。除了细胞毒性层面,PM SRM1648a可诱导DNA损伤,以及多重细胞器结构改变等;（2）PM SRM1648a引起血管内皮细胞胞内ROS过量释放和氧化应激,进一步损伤亚细胞结构功能,如内质网应激和结构损伤,从而影响血管内皮细胞自噬小体累积与凋亡。正常的自噬诱导可以保护PM SRM1648a引起的血管内皮细胞凋亡,抑制自噬或者破坏自噬降解过程会加剧颗粒物引起的内皮细胞损伤。内质网应激和自噬之间的相互对话表明内质网应激与LC3Ⅱ表达上调有关,而自噬过程对PM SRM1648a引起的内质网损伤并无显着影响。一定程度上探讨了内质网应激下,自噬诱导是颗粒物导致血管内皮细胞损伤的保护性因素;ROS/内质网应激通路和自噬降解功能障碍促进PM SRM1648a引起的血管内皮细胞凋亡;（3）20 μg/cm2（64 μg/mL）PM SRM1648a 导致 EA.hy926 血管内皮细胞内自噬小体累积、LC3Ⅱ高表达。在不同时间点LC3Ⅱ上调的具体原因不尽相同。短时间6小时内,自噬活性有所提高导致LC3Ⅱ的快速转化,参与自噬小体膜的合成;而随着暴露时间延长至24小时,LC3Ⅱ的增高归结于溶酶体降解清除能力受阻引起的缺陷型自噬。类似地,20μg/cm2（64μg/mL）剂量下,颗粒物暴露24小时后造成HUVECs内自噬小体累积,其原因归结于溶酶体损伤引起的缺陷型自噬。同时,20 μg/cm2 PM SRM1648a在暴露于EA.hy926细胞24小时后,ACP和CTSB溶酶体水解酶活性出现显着性降低（P<0.05,P<0.05）;在HUVECs中,ACP和CTSB活性检测同样显示类似的结果,于20μg/cm2剂量下暴露24小时后开始显着性降低。颗粒物引起的溶酶体损伤以及水解酶活性降低是引起自噬流阻断和降解清除能力削弱的关键因素。而氧化应激的恢复并不能缓解自噬流障碍和自噬溶酶体的减少,但可以缓解LC3Ⅱ的表达以及溶酶体膜蛋白LAMP-2的表达。PM SRM1648a经非氧化应激依赖型途径引起溶酶体水解酶失活,进而导致血管内皮细胞自噬流紊乱及后续降解异常,促进血管内皮细胞损伤甚至死亡;（4）线粒体是PM SRM1648a攻击人类血管内皮细胞的亚细胞结构靶标。大气颗粒物的摄入会破坏线粒体功能,包括mtROS增高、MMP减少和ATP消耗。同时,PGC-1α的降低表明PM SRM1648a损害线粒体生物发生。此外,20μg/cm2（64μg/mL）剂量暴露24小时后,PM SRM1648a导致线粒体形态呈现分裂样改变,分裂相关分子DRP1等异常上调;PM SRM1648a激活caspase1酶活性和炎症级联反应,caspase1抑制剂Z-YVAD-FMK可以显着降低颗粒物引起的caspase1激活及IL-1β炎性因子的释放;汇集DRP1介导的线粒体分裂通路以及caspase1介导的炎性通路发现,在PM SRM1648a的刺激下,si DNM1L（DRP1）慢病毒转染的EA.hy926细胞相对于空载病毒转染组细胞,线粒体形态有所恢复,caspase1酶活性（P<0.05）以及IL-1β含量（P<0.05）出现显着性降低,提示DRP1/caspase1/IL-1β信号轴参与颗粒物引起的血管内皮细胞线粒体分裂和炎性损伤。同等剂量20 μg/cm2暴露24小时后,EA.hy926细胞中凋亡率为23.43 ±1.76%（P<0.001）,焦亡率为 0.38±0.08%（P>0.05）;HUVECs 中凋亡率为17.30±1.61%（P<0.01）,焦亡率为0.41±0.07%（P>0.05）,同时结合细胞形态学、超微电镜结构以及流式细胞仪衡量细胞大小的前向散射光Forward Scatter,FSC值分析,细胞焦亡不是PM SRM1648a引起血管内皮细胞程序性死亡的主要作用模式;（5）急性（7天）和亚急性（28天）口咽吸入法暴露于不同浓度的PM SRM1648a（1.28、5.5 和 11 mg/kg·bw/w）,正常饲养环境的 BALB/c 雄性和雌性小鼠中出现局部和全身的氧化应激以及炎性反应,未见明显的主动脉脂质累积或斑块样沉积。亚急性组出现主动脉壁增宽以及主动脉根部胶原蛋白出现增多趋势。虽然未见显着性病理学损伤,亚急性暴露后,亚细胞结构层面分子表达出现改变,以内质网和线粒体相关分子改变为主,并且主动脉组织细胞凋亡率增高,以上结果均发生于雄性和雌性BALB/c小鼠中,无性别特异性。结论:亚细胞结构,如内质网、线粒体和溶酶体是PM SRM1648a损伤血管内皮细胞的重要靶点。颗粒物的暴露可以通过损害亚细胞结构功能进而导致血管内皮细胞炎症反应和细胞死亡。在探讨了内质网、溶酶体和线粒体结构功能紊乱后,亚细胞层面靶向毒性评估有助于更全面地了解大气颗粒物引起的血管内皮毒性。在进行环境颗粒物人群健康效应研究时,应综合考虑细胞毒性和亚细胞毒性,关注于早期的检查点,为全面掌握安全性评价信息及更好地实施危险度管理提供合理的基础资料。
关雪娃[8]（2020）在《中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究》文中研究表明慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是以持续气流受限为特征的进行性炎症加重疾病,目前居疾病死亡原因第三位。COPD的急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）是导致COPD患者死亡的主要原因,具体临床症状表现为脓样痰液增加、呼吸困难、咳嗽及喘息等。呼吸道感染能够引起AECOPD的发生,主要包括病毒和细菌感染,其中细菌感染占AECOPD发病原因的50%左右。从AECOPD患者下呼吸道分离出的细菌包括不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable haemophilus infuenza,NTHi）、卡他莫拉菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌等,其中NTHi是COPD患者痰液中最常见的细菌。因此,明确NTHi诱导AECOPD的发生机制有助于深入了解疾病进程并进行有效干预。中性粒细胞是机体抵抗外源性感染的重要防线,在趋化因子的募集作用下能够迅速迁移至感染部位发挥吞噬作用。但过量的中性粒细胞聚集会导致中性粒细胞弹性蛋白酶、金属蛋白酶以及氧化活性物质的过度分泌,进而引起局部组织损伤。中性粒细胞伪足的形成及细胞骨架肌动蛋白的重塑对细胞迁移发挥重要作用,这一过程受磷脂酰肌醇（PtdIns）3-激酶（phosphatidylinositol（PtdIns）3–kinases,PI3K）信号通路的主要调节。化学趋化剂（如N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸,fMLP）刺激后,中性粒细胞表面G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）被激活,Gβγ亚基解离并激活PI3K,磷酸化下游效应因子蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）,促进F-肌动蛋白（F-actin）极化聚集在细胞边缘伪足区域,进而参与中性粒细胞的迁移。中性粒细胞被认为是COPD患者气道中最常见的炎症细胞之一,气道中性粒细胞的增多与NTHi感染密切相关。临床上将外周血中性粒细胞绝对值>7.5×109/L定义为中性粒细胞增多症。NTHi通过感染内皮细胞,产生一系列的炎症因子和趋化因子（如（interleukin,IL）-1β、IL-8等）,募集大量中性粒细胞迁移至气道,而气道中性粒细胞的过度迁移则会导致患者肺功能下降与气道功能障碍。因此,深入探讨中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD发生中的作用,抑制中性粒细胞迁移从而降低气道炎症是预防治疗AECOPD疾病的关键性科学问题。目前,AECOPD的临床治疗包括吸入性支气管扩张剂、皮质类固醇及抗生素等,但受机体不良反应及耐药性的限制,并不能有效控制疾病的发展,因此,迫切需要安全有效的新型AECOPD治疗药物。有研究显示,人参等植物源药物具有抗炎作用,且无明显副作用,其主要活性成分为人参皂苷。目前从人参中已鉴定出100余种单体,其中人参皂苷Rg3单体具有多种药理活性,如抗炎、抗肿瘤和抗疲劳等。近来研究发现人参皂苷Rg3具有治疗呼吸道疾病的作用,如:人参皂苷Rg3可以通过调节癌细胞岩藻糖基化以及p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核转录因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路,抑制上皮-间质转化和肺癌的侵袭;人参皂苷Rg3能够抑制NF-κB的活性并减少相应炎症细胞因子的分泌;人参皂苷Rg3通过调节PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路可减轻脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱发的急性肺损伤。综上,本文的研究目的是基于NTHi诱导的AECOPD模型,探讨中性粒细胞在AECOPD发生中的作用,明确人参皂苷Rg3能否通过抑制中性粒细胞的迁移进而调节气道炎症,从而对AECOPD起到治疗作用,并基于超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）的代谢组学方法初步探讨人参皂苷Rg3对AECOPD小鼠内源性代谢物和相关代谢途径的作用机制。一、NTHi诱导小鼠AECOPD的发生方法:将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分为4组（n=16）,正常对照（Normal Control,NC）组,不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）感染组,香烟烟雾（Cigarette Smoke,CS）组和联合作用（NTHi+CS）组。其中CS和NTHi+CS组应用14周香烟烟雾鼻部暴露法建立小鼠COPD模型,NC和NTHi组暴露于正常空气。于第14周末,NTHi和NTHi+CS组小鼠滴鼻接种NTHi,NC和CS组滴入等量生理盐水。24 h后将各组小鼠麻醉固定。肺功能仪检测小鼠肺功能损伤情况,苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色观察小鼠肺组织结构变化,细胞迪夫染色法和流式细胞术分析小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中性粒细胞细胞及巨噬细胞数量和比例,酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠BALF中炎症因子的含量。结果:与NC组相比,NTHi组小鼠第0.1秒用力呼气量/用力肺活量（forced expiratory volume in 100 ms/forced vital capacity,FEV0.1/FVC）下降,气道发生中性粒细胞浸润。CS组小鼠经14周香烟烟雾暴露后,体重显着下降,肺功能残气量（functional residual capacity,FRC）和气道阻力（airway resistance,RI）增加,FEV0.1/FVC和肺动态顺应性（dynamic compliance,Cydn）下降,肺组织结构损伤,平均肺泡截距增加,小鼠BALF中炎症细胞增多,IL-6和Keratinocyte–derived细胞因子（KC,同人源IL-8）表达增多。当NTHi接种烟雾暴露的小鼠后,上述症状加重,小鼠体重下降,Cydn显着低于CS组,RI和平均肺泡截距显着高于CS组,BALF里中性粒细胞及巨噬细胞数量增多,IL-6和KC分泌升高,且差异具有统计学意义。二、中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD中的作用方法:首先将分离纯化的中性粒细胞与人支气管上皮细胞（BEAS-2B）培养,建立中性粒细胞跨气道上皮细胞迁移模型,分为NC组,NTHi组,CS组和NTHi+CS组,依次用NTHi和香烟烟雾刺激BEAS-2B细胞。ELISA法检测细胞上清液中IL-6和IL-8的含量。迪夫染色法观察中性粒细胞的迁移数量和形态。随后NTHi及香烟烟雾直接刺激中性粒细胞,分为NC组、NTHi组、CS组和NTHi+CS组,ELISA法检测中性粒细胞脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PtdIns（4,5）P2,PIP2）和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PtdIns（3,4,5）P3,PIP3）的含量,Western blot法检测PI3K信号通路相关蛋白的表达水平,免疫荧光法检测中性粒细胞内F-actin的蛋白分布和表达。结果:与NC组相比,NTHi和香烟烟雾刺激气道上皮细胞后,NTHi组和CS组上清液中炎性细胞因子IL-6和IL-8的含量显着升高,中性粒细胞跨上皮细胞迁移数量增多,且NTHi+CS组IL-6和IL-8的表达及中性粒细胞迁移数量显着高于CS组。NTHi和香烟烟雾刺激中性粒细胞后,与NC组相比,模型组中性粒细胞PI3K信号通路被激活,相关信号分子表达显着变化,PIP3及AKT蛋白磷酸化水平显着增加,F-actin蛋白发生极化表达,且NTHi+CS组变化最为显着。三、人参皂苷Rg3对AECOPD以中性粒细胞增多为特征的炎症反应的预防治疗作用1.人参皂苷Rg3对NTHi诱导的AECOPD模型小鼠的影响方法:将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分为9组（n=16）:NC组,CS组,低、中、高浓度Rg3干预CS（CS+10 mg/kg Rg3、CS+20 mg/kg Rg3和CS+40mg/kg Rg3）组,NTHi+CS组,低、中、高浓度Rg3干预NTHi+CS（NTHi+CS+10mg/kg Rg3、NTHi+CS+20 mg/kg Rg3和NTHi+CS+40 mg/kg Rg3）组。应用14周香烟烟雾鼻部暴露法建立小鼠COPD模型,于第12周开始,每天进行人参皂苷Rg3灌胃给药治疗,于第14周末进行NTHi滴鼻接种。应用小动物肺功能仪检测各组小鼠肺功能指标,HE染色观察肺组织结构变化,流式细胞术分析BALF中中性粒细胞比例,ELISA法检测小鼠BALF中炎性因子IL-6和KC的含量。结果:与模型组相比,高浓度Rg3可显着增加模型组小鼠体重,中、高浓度Rg3可改善CS组和NTHi+CS组的各项肺功能指标,减少肺部病理损伤,降低小鼠BALF中炎症细胞的浸润,中性粒细胞比例以及IL-6、IL-8的含量,结果与CS组和NTHi+CS组相比具有统计学差异。2.人参皂苷Rg3对中性粒细胞迁移的抑制作用及机制研究方法:人参皂苷Rg3作用于人外周血分离纯化的中性粒细胞,将细胞分为6组:NC组,fMLP阳性对照（fMLP）组,Rg3低、中、高浓度药物（fMLP+Rg3（10μM）、fMLP+Rg3（20μM）、fMLP+Rg3（40μM））组和抑制剂（LY294002）组。在中性粒细胞跨上皮细胞（BEAS-2B）迁移模型的基础上,检测各浓度药物对中性粒细胞迁移数量的影响。将fMLP、人参皂苷Rg3以及LY294002分别先后作用于各组中性粒细胞,ELISA法检测细胞脂质PIP2和PIP3的含量,Western blot法检测PI3K信号通路相关蛋白的表达水平,免疫荧光法检测中性粒细胞内F-actin的蛋白分布及表达水平。结果:与未加药物空白对照组相比,各浓度药物组中性粒细胞跨上皮细胞迁移的数量均显着减少。将fMLP、人参皂苷Rg3以及LY294002分别作用于各组中性粒细胞后发现,与NC组相比,fMLP组PI3K通路相关信号分子PIP2的含量显着降低,PIP3的含量显着增高,PI3K及AKT蛋白磷酸化水平显着增加,F-actin蛋白极化表达。与fMLP组相比,各浓度Rg3组均在一定程度上抑制了PI3K相关信号分子表达,其中40μM Rg3组PIP3的含量显着降低,PI3K及AKT蛋白磷酸化水平显着降低,F-actin蛋白极化表达降低,均匀分布于整个细胞质,结果与LY294002组结果相似。3.人参皂苷Rg3对AECOPD模型小鼠的代谢组学影响的研究方法:收集上述NC组,NTHi+CS组和NTHi+CS+40 mg/kg Rg3组小鼠尿液,并命名为NC组,AECOPD组和Rg3组（n=6）。应用UPLC-QTOF-MS对样本进行检测,应用MassLynx V4.1工作站进行数据采集分析。结果:与NC组相比,AECOPD模型组小鼠尿液中许多内源性代谢物含量发生了明显改变,人参皂苷Rg3干预可显着回调L-色氨酸、花生四烯酸、亚油酸、白细胞三烯A4、核黄素和皮质醇等19种内源性代谢物水平,推测人参皂苷Rg3通过干预亚油酸代谢、核黄素代谢、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成和鞘脂代谢等6条代谢途径而发挥对AECOPD的保护作用。结论:1.NTHi感染联合香烟烟雾刺激建立的AECOPD模型,特点为中性粒细胞迁移引起的以中性粒细胞浸润为主的气道炎症。2.AECOPD发生的可能机制为AKT磷酸化引起的PI3K相关分子信号通路激活,引起中性粒细胞迁移。3.人参皂苷Rg3通过抑制中性粒细胞内PI3K信号通路的活化,从而抑制中性粒细胞迁移,减少炎症的发生,对AECOPD发生具有一定程度的预防作用。4.人参皂苷Rg3对AECOPD发生的预防作用,与其调节亚油酸代谢、核黄素代谢、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成和鞘脂代谢等6条代谢途径有关。创新性:1.本文发现了PI3K信号通路的激活是NTHi感染联合烟雾刺激引起AECOPD中性粒细胞迁移浸润增多的主要机制,提示PI3K可能是AECOPD的治疗靶点之一。2.本文发现了人参皂苷Rg3能够通过抑制中性粒细胞PI3K信号通路的激活,从而减轻AECOPD中性粒细胞增多引起的炎症反应,提示人参皂苷Rg3具有开发为防治AECOPD药物的潜力。
周静[9]（2020）在《小檗碱对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及对巨噬细胞极化的影响》文中认为目的:1.观察小檗碱（berberine,BBR）对大鼠佐剂性关节炎（adjuvant-induced arthritis,AA）的治疗作用;2.明确BBR发挥抗关节炎的作用和机制与调控M1/M2型巨噬细胞平衡有关。方法:弗氏完全佐剂（complete Freund adjuvant,CFA）制备AA大鼠模型。实验分组为正常组、AA模型组、BBR（40 mg/kg,80 mg/kg,160 mg/kg）剂量组和甲氨蝶呤（methotrexate,MTX,0.5 mg/kg）剂量组。通过动物关节炎评分表对大鼠全身表现、多发性关节炎指数、关节炎肿胀数进行评分,大鼠足趾容积测量仪检测足爪肿胀度的变化;小动物活体成像中X射线检测骨质破坏情况;称重并计算胸腺和脾脏指数;CCK-8（cell counting kit-8,CCK-8）检测大鼠胸腺T淋巴细胞增殖情况;苏木精-伊红染色观察大鼠脾脏和踝关节病理变化;流式细胞术检测脾脏T细胞亚群;中性红吞噬实验检测巨噬细胞吞噬功能;酶联免疫吸附法检测细胞因子浓度;免疫荧光法检测诱导型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,iNOS）和精氨酸酶1（arginase 1,Arg1）的表达情况;免疫印迹法检测iNOS、Arg1、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）、p-AMPK、p65（RelA）、p-p65、核因子κB抑制蛋白α（NF-κB inhibitor alpha,IκBα）、p-IκBα和环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）的蛋白表达情况。结果:1.BBR对AA大鼠的治疗作用BBR给药后可明显改善AA大鼠全身炎症反应,降低全身表现评分、减轻足爪肿胀度,减少多发性关节炎指数及关节肿胀数;X射线结果表明,BBR可以明显缓解AA大鼠骨质破坏的情况;组织病理结果显示,BBR减少AA大鼠踝关节滑膜细胞增生、血管翳形成、炎性细胞浸润及软骨侵蚀;同时,BBR还可改善AA大鼠脾脏红髓充血,减少白髓及边缘区增生;BBR显着降低胸腺和脾脏指数;BBR明显降低血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、白细胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-6、IL-2、IL-17A、γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）的水平,增加转化生长因子-β1（transforming growth factor-β,TGF-β1）、IL-4、IL-10的水平。2.BBR对AA大鼠巨噬细胞功能和极化的影响BBR降低巨噬细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的水平,增加IL-10、TGF-β1的水平;抑制巨噬细胞的吞噬功能;减少巨噬细胞中iNOS、COX-2表达,增加Arg1的表达,这些结果表明BBR减少M1型巨噬细胞,促进M2型巨噬细胞极化。3.BBR对AA大鼠T淋巴细胞的影响BBR明显抑制T淋巴细胞增殖能力;对CD3+CD4+总T细胞、CD4+CD44+记忆T细胞比例无明显影响,增加CD4+CD62L+初始T细胞比例,BBR（80 mg/kg,160 mg/kg）显着降低CD4+CD25+活化T细胞比例;BBR明显减少Th17细胞比例,BBR（80 mg/kg,160 mg/kg）显着提高Treg细胞比例。4.BBR激活AMPK抑制NF-κB信号通路调控巨噬细胞极化AA大鼠腹腔巨噬细胞p-AMPK表达明显降低,p-p65、p-IκBα表达显着增加;BBR（80 mg/kg）可明显上调巨噬细胞p-AMPK的表达,降低p-p65和p-IκBα的表达。结论:1.BBR减轻AA大鼠的关节炎症和骨质破坏,发挥良好的治疗作用;2.BBR抑制AA大鼠M1型巨噬细胞极化,促进M2型巨噬细胞极化;3.BBR抑制T淋巴细胞的增殖和活化,调节Th17/Treg细胞的平衡;4.BBR调控巨噬细胞极化的作用机制与AMPK/NF-κB信号通路有关。
黄高[10]（2020）在《培土生金通络法抑制特发性肺纤维化NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡作用及其机制研究》文中研究表明目的:特发性肺纤维化（IPF）是一类以损伤、炎症、免疫和纤维沉积为特征的间质性肺炎。中医学将其归为肺痹和肺痿范畴,整理综合较有代表性历代医家相关中医论述,阐明该病的中医发病机制与常用治法方药,并以此为基础突出培土生金通络法在其中起到的重要作用。同时,基于课题组前期中西医理论与实验研究基础,复制IPF小鼠肺脾两虚模型和脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞模型,从NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡视角调控IPF的发展,探究培土生金通络法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方可以通过调控NF-κBp65高表达对其产生的作用,从而为培土生金通络法治疗IPF提供可靠的理论、临床及实验依据。方法:1.理论探讨:查阅中国古代和现代医家记录肺痹、肺痿、IPF、培土生金通络法的相关古籍文献和现代研究报道,分析肺痹、肺痿与IPF共有病机特点与治法方药,阐明培土生金通络法防治IPF的中医机制。2.实验研究:实验先将C57BL/6小鼠建成小鼠IPF肺脾两虚模型进行动物实验,并用LPS诱导巨噬细胞模型进行细胞实验。动物实验部分先建立IPF肺脾两虚模型,通过体重、脾虚证表观情况分级观察进行脾虚证证候评价;通过一般状态观察与肺组织HE染色、Masson染色病理学检测后的病理分级标准判断IPF造模情况和“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对其作用的影响。应用ELISA法检测“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对IPF肺脾两虚模型小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1的影响。应用Western blot检测“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对IPF肺脾两虚模型小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1、NF-κBp65蛋白表达的影响。应用RT-PCR检测“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对IPF肺脾两虚模型小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表达的影响。细胞实验部分先建立脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞模型,通过“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方含药血清干预后,用ELISA法检测该含药血清对LPS诱导巨噬细胞模型培养液中IL-1β和IL-18的影响;用免疫荧光法检测该含药血清对LPS诱导巨噬细胞模型中NLRP3和Caspase-1蛋白表达的影响。结果:1.动物实验结果1.1脾虚证小鼠模型造模观察结果1.1.1脾虚证造模前后各组小鼠体重的比较实验过程中,分别在建立脾虚模型前、造模第4天和造模第7天后进行3次测量体重发现,空白对照组和假手术对照组体重在缓慢增加,但是3次体重之间无统计学差异（P﹥0.05）。建立脾虚模型第1天给药前,脾虚造模组、空白对照组和假手术对照组体重之间无统计学差异（P﹥0.05）。而建立脾虚模型第1天给药前、造模第4天和造模第7天后3次体重之间有显着差异（P﹤0.05）。其表现为体重依次降低,造模第7天相比其他2个时间段最低,造模第4天次之,建立脾虚模型第1天给药前体重最高（P﹤0.05）。1.1.2脾虚证小鼠一般状态的观察脾虚造模前后各组小鼠表观情况分级统计显示:与空白对照组比较,脾虚造模组在身体气味、精神状态、身体感温情况、毛发色泽和大便形态五种分级评分均明显高于空白对照组（P﹤0.05）,而假手术对照组与空白对照组之间并无统计学差异（P﹥0.05）。1.2小鼠IPF肺脾两虚造模观察结果1.2.1一般状态的观察脾虚模型基础上IPF（肺虚）造模后发现,造模各组小鼠表现为气促、气短、咳嗽、挠鼻,精神萎靡,倦怠,蜷缩,反应迟钝,毛色枯槁、易脱落,食欲差,饮水量减少等,而空白与假手术对照组无上述表现。经过28天治疗,激素对照组和中医高、中、低剂量组小鼠精神尚可,反应较敏捷,毛色欠光泽,时有咳嗽、气促、气短,食量欠佳等一般状态均明显优于模型组;激素对照组和中医高、中剂量组小鼠一般状态优于中医低剂量组。1.2.2肺组织病理结果1.2.2.1 HE染色结果空白对照组小鼠肺组织中支气管、肺泡管、肺泡囊,肺泡及肺泡间隔等肺组织结构完整。假手术对照组小鼠肺组织结构完整与空白对照组相似,偶有炎细胞浸润。模型对照组小鼠肺组织可见结构紊乱,肺泡塌陷、融合,肺泡壁明显增厚,炎细胞浸润明显,成纤维细胞开始增生,纤维组织沉积,出现大片实变区域。激素对照组和中药中、高剂量组小鼠肺组织可见结构紊乱,但程度均较模型对照组和中药低剂量组减轻,又较空白对照组和假手术对照组破坏严重。HE染色肺泡炎评分显示:与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织病理评分均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组肺组织肺泡炎评分与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,除中药低剂量组外,其余各组小鼠肺组织病理评分均明显降低（P﹤0.05）,而中药低剂量组与其比较无明显差异（P﹥0.05）。1.2.2.2Masson染色结果空白对照组小鼠肺组织中各级支气管、肺泡等肺组织结构完整,在肺泡间隔上偶尔可见很薄的蓝色胶原纤维。假手术对照组小鼠肺组织结构完整与空白对照组相似,小部分有极轻微的间质纤维化。模型对照组小鼠肺组织可见结构错乱,有明显的纤维化增生改变,在肺泡间隔、各级支气管、血管外模均能见到明显的蓝色胶原纤维。激素对照组和中药中、高剂量组小鼠肺组织均可见结构杂乱,纤维化程度均较模型对照组和中药低剂量组轻,又较空白对照组和假手术对照组重。Masson染色中肺组织胶原程度评分显示:与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织胶原程度评分均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组肺组织胶原评分与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,除中药低剂量组外,其余各组小鼠肺组织胶原程度评分均明显降低（P﹤0.05）,而中药低剂量组较其无明显差异（P﹥0.05）。1.3 ELISA实验结果与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1含量均明显增高（P﹤0.01）,假手术对照组与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1含量均明显降低（P﹤0.05）。激素对照组和中药中、高剂量组小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1含量均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。1.4 Western blot实验结果与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织中CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1和NF-kβp65蛋白表达均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组4种蛋白表达与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1和NF-κBp65蛋白表达均明显降低（P﹤0.05）。中药中、高剂量组小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1和NF-κBp65均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。激素对照组和中药中剂量组小鼠肺组织NLRP3、Caspase-1和NF-κBp65蛋白表达之间比较无明显差异（P﹥0.05）。中药中、高剂量组小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3和Caspase-1蛋白表达之间比较无明显差异（P﹥0.05）。1.5 RT-PCR实验结果与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1、NF-kβp65mRNA表达均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组5种基因表达与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组小鼠肺组织IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1、NF-κBp65mRNA表达均明显降低（P﹤0.05）。激素对照组和中药中、高剂量组5种基因表达均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。中药高剂量组小鼠肺组织IL-18mRNA均明显低于其他药物治疗组（P﹤0.05）。中药中剂量组和中药高剂量组小鼠肺组织IL-1β、NLRP3、Caspase-1、NF-κBp65mRNA表达之间无明显差异（P﹥0.05）。2.细胞实验结果统计24小时细胞培养上清液IL-1β、IL-18含量可知,与空白对照组比较,模型对照组、中药血清低、中、高剂量组和NF-κB抑制剂组上清液IL-1β、IL-18含量均明显增高（P﹤0.01）,而正常血清对照组上清液IL-1β、IL-18含量与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组上清液IL-1β、IL-18含量均明显降低（P﹤0.05）。中药血清中、高剂量组和NF-κB抑制对照组上清液IL-1β、IL-18含量均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。中药血清高剂量组上清液IL-1β和NF-κB抑制对照组之间比较无明显差异（P﹥0.05）。24小时各组细胞NLRP3和Caspase-1平均荧光强度检查,结果统计可知,与空白对照组比较,模型对照组和4种不同药物处理组细胞NLRP3和Caspase-1蛋白平均荧光强度均明显增强（P﹤0.01）,而正常血清对照组细胞NLRP3和Caspase-1平均荧光强度与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组细胞NLRP3和Caspase-1蛋白平均荧光强度均明显减弱（P﹤0.05）。中药血清中、高剂量组和NF-κB抑制对照组两种蛋白平均荧光强度均明显弱于中药低剂量组（P﹤0.05）。中药血清高剂量组和NF-κB抑制对照组两种蛋白平均荧光强度之间比较无明显差异（P﹥0.05）。结论:1由理论探讨可知:IPF病机的本虚主要表现为肺气阴两虚,常伴脾肾不足,标实主要体现在痰浊、血瘀、络阻相互夹杂。培土生金通络法是治疗IPF的有效方法。2采用脾虚证造模法和IPF肺虚造模法相结合能呈现出IPF肺脾两虚证相似证候,与大鼠IPF肺脾两虚复合模型造模效果类似。3培土生金通络法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方能通过调控NLRP3炎症小体相关基因蛋白对IPF有一定改善作用。4培土生金通络法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对NLRP3炎症小体的影响与该方调控NF-κB的表达有关,该法的作用机制可能是通过影响NF-κB通路进而调控NLRP3炎症小体的活化。
二、免疫荧光法检测脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB的活化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、免疫荧光法检测脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB的活化（论文提纲范文）
（1）扶芳藤提取物及主要活性成分甜醇对LPS诱导小鼠急性肺损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 中药扶芳藤提取物、主要活性成分以及各萃取部位对炎症反应的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 扶芳藤提取物对LPS所致小鼠急性肺损伤的影响 |
| 2.2 MTT法测定扶芳藤提取物对RAW264.7细胞活力的影响 |
| 2.3 Griess法检测扶芳藤提取物对LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO的影响 |
| 2.4 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6炎性因子分泌的影响 |
| 2.5 HPLC法测定正丁醇提取物的主要活性成分及含量 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 药扶芳藤主要活性成分甜醇对LPS诱导RAW264.7细胞的影响及机制探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 甜醇对RAW264.7细胞活力的影响 |
| 2.2 醇对LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO的影响 |
| 2.3 甜醇对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6的影响 |
| 2.4 醇对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、Myd88、TRIF、NF-κB p65、COX-2、iNOs、IL-6、IL-1β和TNF-α RNA表达的影响 |
| 2.5 甜醇对LPS诱导RAW264.7细胞TLR4、Myd88、TRIF、NF-κB p65、蛋白表达的影响 |
| 2.6 甜醇对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65核转位的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 中药扶芳藤主要活性成分甜醇对LPS诱导的A549细胞的影响及机制的探究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 甜醇对A549 细胞活力的影响 |
| 2.2 醇对LPS诱导A549细胞分泌NO的影响 |
| 2.3 甜醇对LPS诱导A549细胞TLR4、Myd88、TRIF、NF-κB p65、COX-2、iNOs、IL-6、IL-1β和TNF-α RNA表达的影响 |
| 2.4 甜醇对LPS诱导A549细胞TLR4、Myd88、TRIF、NF-κB p65蛋白表达的影响 |
| 2.5 甜醇对LPS诱导A549 细胞NF-κBp65核转位的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 中药扶芳藤主要活性成分甜醇对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的抗炎作用及其作用机制探究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 甜醇对LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺湿质量/干质量比值的影响 |
| 2.2 甜醇对LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺匀浆中IL-1β、TNF-α和IL-6含量的影响 |
| 2.3 甜醇对LPS诱导急性肺损伤小鼠的肺组织病理学影响的影响 |
| 2.4 甜醇对LPS诱导急性肺损伤小鼠BALF中总蛋白浓度和细胞渗出数的影响 |
| 2.5 甜醇对肺组织细胞中的TLR4、Myd88、TRIF、NF-κB p65蛋白表达的影响 |
| 2.6 甜醇对肺组织细胞NF-κB p65核转位的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 炎症及其机制与急性肺损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）苯并恶唑酮类抗炎化合物W3D对MD2和TLR4蛋白调控作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 化合物W3D对 TLR4、MD2 蛋白表达调控的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 化合物与细胞来源 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养的技术和方法 |
| 1.2.2 Western Blot法检测RAW264.7 细胞中TLR4、MD2、p-IRAK4 蛋白的表达 |
| 1.2.3 ELISA法检测RAW264.7 细胞上清液TLR4、MD2 蛋白的表达 |
| 1.2.4 细胞免疫荧光法检测RAW264.7 细胞中NF-κB p65 的核转移 |
| 1.2.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 化合物W3D对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TLR4、MD2、p-IRAK4 蛋白表达的影响 |
| 2.2 化合物W3D对 LPS诱导的RAW264.7 细胞NF-κB p65 核转移的影响 |
| 2.3 化合物W3D对 LPS诱导的RAW264.7 细胞上清液中TLR4、MD2 蛋白表达的影响 |
| 2.4 4-取代苯并恶唑酮类衍生物对LPS诱导的RAW264.7 细胞MD2 蛋白表达的构效关系分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 MD2抑制剂MD2-IN-1对化合物W3D抗炎活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞与化合物来源 |
| 1.1.2 仪器及试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Griess法检测RAW264.7 细胞上清液中NO的含量 |
| 1.2.2 ELISA法检测细胞上清液中IL-6、TNF-α的释放量 |
| 1.2.3 Western Blot法测定RAW264.7 细胞中TLR4、MD2 蛋白的表达 |
| 1.2.4 免疫荧光法检测RAW264.7 细胞中NF-κB p65 的核转移 |
| 1.2.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 化合物W3D对 MD2-IN-1 阻断后LPS诱导的RAW264.7 细胞上清液NO抑制活性的影响 |
| 2.2 化合物W3D对 MD2-IN-1 阻断后LPS诱导的RAW264.7 细胞上清液IL-6、TNF-α抑制活性的影响 |
| 2.3 化合物W3D对 MD2-IN-1 阻断后对 LPS诱导的RAW264.7 细胞中MD2、TLR4 蛋白表达的影响 |
| 2.4 化合物W3D对 MD2-IN-1 阻断后对 LPS诱导的RAW264.细胞中NF-κB p65核转移的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 化合物W3D与 MD2、TLR4 蛋白的相互作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞与化合物来源 |
| 1.1.2 仪器及试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 流式细胞术检测FITC-LPS结合细胞膜表面受体的强度 |
| 1.2.2 DARTS技术与Western Blot联用检测MD2、TLR4 蛋白的酶解稳定性 |
| 1.2.3 CETSA技术与Western Blot联用检测MD2、TLR4 蛋白的热稳定性.. |
| 1.2.4 荧光光谱实验检测化合物与MD2 蛋白的结合 |
| 1.2.5 BLI生物层干涉技术检测化合物与MD2、TLR4 蛋白平衡解离平衡常数 |
| 1.2.6 分子对接法模拟化合物与MD2、TLR4 蛋白的相互作用 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 化合物可以抑制FITC-LPS与 RAW264.7 细胞膜上LPS受体的结合 |
| 2.2 化合物W3D可增强MD2、TLR4 蛋白酶稳定性 |
| 2.3 化合物W3D可增强MD2、TLR4 蛋白热稳定性 |
| 2.4 化合物W3D可竞争性抑制bis-ANS与 rh MD2 蛋白结合 |
| 2.5 BLI技术检测化合物W3D与 MD2、TLR4 蛋白解离结合常数 |
| 2.6 化合物与MD2 蛋白分子对接结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 化合物W3D对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的药效学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物及来源 |
| 1.1.2 仪器和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 HE染色行肺组织病理学检查 |
| 1.2.2 肺组织湿干重比 |
| 1.2.3 小鼠肺组织中MPO(髓过氧化物酶)活性检测 |
| 1.2.4 ELISA法测定小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的释放量 |
| 1.2.5 Western Blot法检测小鼠肺组织中TLR4、MD-2、p-IRAK4、NF-κB p65蛋白的表达水平 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 化合物W3D对LPS诱导的小鼠肺组织病理学的影响 |
| 2.2 化合物W3D对小鼠肺组织湿干重比的影响 |
| 2.3 化合物W3D对小鼠肺组织MPO活性的影响 |
| 2.4 化合物W3D对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS含量的影响 |
| 2.5 化合物W3D对 TLR4、MD2、p-IRAK4、p65 蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 结果展望 |
| 参考文献 |
| 综述 MD2抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）酿酒酵母β-葡聚糖对RAW264.7细胞氧化应激、炎症和凋亡的缓解作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 酿酒酵母β-葡聚糖 |
| 1.1.1 β-葡聚糖简介 |
| 1.1.2 Dectin-1 |
| 1.2 Nrf2/HO-1 信号通路抗氧化、抗炎和抗凋亡作用 |
| 1.2.1 氧化应激 |
| 1.2.2 Nrf2/HO-1 信号通路 |
| 1.2.3 Nrf2/HO-1 信号通路作用及其分子机制 |
| 1.3 氧化应激激活NLRP3 |
| 1.4 氧化应激激活NF-κB |
| 1.4.1 NF-κB抗氧化靶标 |
| 1.4.2 ROS诱导NF-κB靶标 |
| 1.5 巨噬细胞与氧化应激 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 研究内容 |
| 1.7.1 LPS诱导RAW264.7 细胞氧化应激与炎症模型建立 |
| 1.7.2 β-葡聚糖抑制LPS诱导的RAW264.7 细胞氧化应激及炎症反应 |
| 1.7.3 β-葡聚糖通过Dectin-1/Nrf/HO-1 通路调节LPS诱导的RAW264.7 细胞氧化应激 |
| 1.7.4 β-葡聚糖通过Nrf/HO-1 通路调节LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症应答 |
| 1.7.5 β-葡聚糖通过Nrf2/HO-1 通路调节LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症小体NLRP3 形成 |
| 1.7.6 β-葡聚糖通过Nrf/HO-1 调节LPS诱导RAW264.7 细胞凋亡 |
| 2 试验内容 |
| 2.1 试验一LPS诱导的RAW264.7 细胞氧化应激与炎症模型建立 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 试验材料与方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 试验二β-葡聚糖对LPS诱导的RAW264.7 细胞氧化应激和炎症的保护作用 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 试验三β-葡聚糖通过Dectin-1/Nrf/HO-1 通路调节LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 试验材料与方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 试验四β-葡聚糖通过Nrf2/HO-1 通路抑制LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症反应 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 试验材料与方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 试验五β-葡聚糖通过Nrf/HO-1 抑制LPS诱导RAW264.7 细胞炎症小体NLRP3 形成 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 试验材料与方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 试验六β-葡聚糖通过Nrf2/HO-1 抑制LPS诱导的RAW264.7 细胞凋亡 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 试验材料与方法 |
| 2.6.3 结果 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 3 结论 |
| 4 创新性 |
| 5 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠的抗过敏作用观察 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠Th2、Th9、Th17的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 麻杏石甘汤对体外培养PBMC中Th2、Th9、Th17的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 辅助T细胞亚群对过敏性哮喘的调控作用机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 麻杏石甘汤治疗支气管哮喘研究进展综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（5）冷诱导RNA结含蛋白在重症急性胰腺炎相关性肺损伤发病机制中的作用及大黄素干预的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:CIRP 在 SAP 大鼠模型中的表达及其在 APALI 发病机制中的作用和大黄素干预的研究 |
| (一)引言 |
| (二)材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 药物配制 |
| 2.2 实验动物分组及模型制备 |
| 2.3 采集样本 |
| 2.4 苏木精-伊红(Hematoxylin & Eosin, HE)染色 |
| 2.5 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测血清 CIRP、淀粉酶(amylase)、IL-1β 水平 |
| 2.6 免疫组化检测 CIRP 及 Ly6G 的表达 |
| 2.7 免疫荧光法(Immunofluoresence, IF)实验步骤 |
| 2.8 Western blot法实验步骤 |
| 2.9 Quantitative Real-time PCR (qRT-RCR) 法实验步骤 |
| 2.10 统计学方法 |
| (三)结果 |
| 3.1 各组大鼠一般状态的比较 |
| 3.2 各组大鼠胰腺及肺组织的病理学观察结果 |
| 3.3 各组大鼠肺功能的变化 |
| 3.4 各组大鼠血清中的淀粉酶、IL-1β 及CIRP水平的变化 |
| 3.5 各组大鼠胰腺和肺组织中 CIRP mRNA 的表达 |
| 3.6 各组大鼠胰腺和肺组织中CIRP蛋白的表达 |
| 3.7 免疫组化观察各组大鼠胰腺及肺组织中CIRP的表达 |
| 3.8 免疫荧光观察各组大鼠胰岛中CIRP的表达 |
| 3.9 各组大鼠肺组织内NF-κB p65 和IKBα 磷酸化水平的比较 |
| 3.10 各组大鼠肺组织内 NLRP3 及 IL-1β mRNA 的表达 |
| 3.11 各组大鼠肺组织内 NLRP3 炎性小体的组装与活化水平 |
| 3.12 各组大鼠肺组织中 CXCL1 表达水平的比较 |
| 3.13 各组大鼠肺内中性粒细胞的浸润的比较 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:CIRP 对 NR8383 细胞 NF-κB 及 NLRP3/IL-1β/CXCL1信号通路的影响及大黄素干预的实验研究 |
| (一)引言 |
| (二)材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 试剂准备 |
| 2.2 细胞的复苏 |
| 2.3 细胞培养条件 |
| 2.4 细胞的传代 |
| 2.5 细胞的冻存 |
| 2.6 CCK8 实验检测大黄素的细胞毒性 |
| 2.7 细胞的分组及处理 |
| 2.8 流式细胞术检测细胞焦亡 |
| 2.9 siRNA瞬时转染 |
| 2.10 Western blot分析 |
| 2.11 Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) |
| 2.12 统计学方法 |
| (三)结果 |
| 3.1 大黄素对 NR8383 细胞增殖活性的影响 |
| 3.2 各组NR8383 细胞NF-κB p65 和IKBα 磷酸化水平的的比较 |
| 3.3 各组NR8383 细胞的NLRP3 和IL-1β mRNA的表达水平 |
| 3.4 各组 NR8083 细胞内 NLRP3 炎性小体的组装与活化水平 |
| 3.5 各组NR8383 细胞焦亡率的比较 |
| 3.6 各组NR8383 细胞的CXCL1 的表达水平比较 |
| 3.7 RNA 干扰 IL-1β 对 CIRP 诱导 NR8383 细胞 CXCL1 表达的影响 |
| 3.8 IL-1β 促进NR8383 细胞表达CXCL1 的剂量和时间依赖性关系 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 本研究存在的不足与展望 |
| 综述 冷诱导 RNA 结合蛋白(Cold-inducible RNA binding protein)在炎症性疾病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）Lyn激酶对急性肺损伤（ALI）小鼠模型的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| Lyn激酶在调节肺部炎症固有免疫细胞功能中的作用(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1. 研究背景和进展 |
| 1.1 大气颗粒物相关血管疾病的人群研究 |
| 1.2 大气颗粒物引起血管损伤的体内外实验研究 |
| 2. 研究拟解决的关键科学问题及主要思路 |
| 3. 研究的主要内容 |
| 4. 研究的创新点 |
| 5. 技术路线图 |
| 第二章 城市大气颗粒物PM SRM1648a的细胞毒性和亚细胞毒效应 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 颗粒物水合粒径与电位分析 |
| 2.2.2 内毒素检测 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 细胞生存率(MTT法与CCK8法) |
| 2.2.5 细胞形态学观察 |
| 2.2.6 氧化应激指标GSH/GSSG和NADP~+/NADPH检测 |
| 2.2.7 脂质过氧化丙二醛MDA及C11-BODIPY~(581/591)探针检测 |
| 2.2.8 颗粒物摄取实验 |
| 2.2.9 亚细胞结构超微电镜 |
| 2.2.10 免疫荧光 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 城市大气颗粒物PM SRM1648a的成分分析、水合粒径和内毒素含量检测 |
| 3.1.1 PM SRM1648a的成分分析 |
| 3.1.2 PM SRM1648a的水合粒径分析 |
| 3.1.3 PM SRM1648a的内毒素检测 |
| 3.2 PM SRM1648a的细胞毒性 |
| 3.2.1 PM SRM1648a影响细胞生存率 |
| 3.2.2 PM SRM1648a导致血管内皮细胞形态学改变 |
| 3.2.3 PM SRM1648a诱导血管内皮细胞氧化应激及脂质过氧化 |
| 3.3 颗粒物的摄取先于血管内皮细胞毒性的产生 |
| 3.3.1 血管内皮细胞具有摄取PM SRM1648a颗粒物的能力 |
| 3.3.2 颗粒物的摄取可能导致血管内皮细胞存活率的降低 |
| 3.4 PM SRM1648a引起血管内皮细胞亚细胞结构损伤 |
| 3.4.1 PM SRM1648a诱发血管内皮细胞γ-H2AX灶点的表达量改变 |
| 3.4.2 PM SRM1648a引起血管内皮细胞细胞器结构变化 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第三章 PM SRM1648a触发内质网应激引起血管内皮细胞自噬小体累积和凋亡 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 主要材料与仪器设备 |
| 2.1.2 Western blot及免疫荧光实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 内质网染色 |
| 2.2.2 细胞凋亡率 |
| 2.2.3 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) |
| 2.2.4 亚细胞结构超微电镜 |
| 2.2.5 免疫荧光 |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a触发血管内皮细胞内质网应激 |
| 3.1.1 PM SRM1648a引起血管内皮细胞内质网结构损伤 |
| 3.1.2 PM SRM1648a改变血管内皮细胞内质网应激标志性蛋白表达 |
| 3.2 PM SRM1648a引起血管内皮细胞内自噬小体累积与细胞凋亡 |
| 3.2.1 PM SRM1648a引发血管内皮细胞内自噬小体累积 |
| 3.2.2 PM SRM1648a触发内皮细胞内自噬小体标志蛋白表达改变 |
| 3.2.3 PM SRM1648a引起血管内皮细胞凋亡及刺激凋亡相关标志蛋白表达变化 |
| 3.3 ROS/内质网应激信号轴在PM SRM1648a诱导血管内皮细胞凋亡中的作用 |
| 3.3.1 ROS参与PM SRM1648a诱导的血管内皮细胞内质网应激和细胞凋亡 |
| 3.3.2 内质网应激抑制剂4-PBA有效缓解PM SRM1648a引起的内质网损伤和细胞凋亡 |
| 3.4 PM SRM1648a暴露下,内质网应激和自噬的相互关系 |
| 3.4.1 内质网应激参与PM SRM1648a诱导的血管内皮细胞自噬小体累积 |
| 3.4.2 细胞自噬对PM SRM1648a诱导的血管内皮内质网应激无显着影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第四章 溶酶体损伤参与PM SRM1648a引发的血管内皮细胞缺陷型自噬 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 主要材料与仪器 |
| 2.1.2 Western blot及免疫荧光实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 mRFP/GFP-LC3腺病毒装载观察自噬流 |
| 2.2.2 溶酶体探针染色 |
| 2.2.3 LAMP-2/LC3B免疫荧光 |
| 2.2.4 酸性磷酸酶及组织蛋白酶B检测 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a扰乱EA.hy926血管内皮细胞自噬流 |
| 3.1.1 暴露PM SRM1648a不同时间后,EA.hy926细胞内自噬标志性蛋白表达变化 |
| 3.1.2 不同时间点,颗粒物造成EA.hy926内皮细胞内自噬小体累积的原因不同 |
| 3.1.3 PM SRM1648a导致EA.hy926血管内皮细胞自噬流异常 |
| 3.2 PM SRM1648a破坏EA.hy926细胞溶酶体,诱导缺陷型自噬 |
| 3.2.1 PM SRM1648a导致EA.hy926细胞溶酶体碱性化 |
| 3.2.2 PM SRM1648a显着性降低溶酶体膜蛋白LAMP-2的表达水平 |
| 3.2.3 PM SRM1648a引起溶酶体水解酶失活 |
| 3.3 氧化应激在颗粒物影响EA.hy926细胞自噬过程中的作用 |
| 3.3.1 氧化应激参与PM SRM1648a引起的LC3Ⅱ上调/自噬小体累积 |
| 3.3.2 氧化应激不是PM SRM1648a引起自噬流紊乱的关键因素 |
| 3.3.3 PM SRM1648a破坏EA.hy926细胞溶酶体结构功能,扰乱自噬流 |
| 3.4 PM SRM1648a破坏溶酶体完整性,诱导血管内皮细胞自噬流紊乱 |
| 3.4.1 PM SRM1648a引发HUVECs自噬流异常 |
| 3.4.2 颗粒物损伤溶酶体导致自噬流紊乱,即缺陷型自噬 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第五章 线粒体动力学分裂-融合失衡在PM SRM1648a致血管内皮细胞炎性损伤中的作用 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 主要材料与仪器 |
| 2.1.2 Western blot实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 线粒体活性氧(Mitochondrial reactive oxygen species, mtROS) |
| 2.2.2 线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP) |
| 2.2.3 ATP及ATP相关酶 |
| 2.2.4 线粒体形态学观察 |
| 2.2.5 乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH) |
| 2.2.6 Hoechst 33258/PI |
| 2.2.7 Caspase1~+/PI~+细胞焦亡率检测 |
| 2.2.8 细胞炎性因子ELISA |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.2.10 LV-DNM1L-RNAi慢病毒转染 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a诱导EA.hy926内皮细胞线粒体功能紊乱 |
| 3.1.1 PM SRM1648a削弱线粒体活性并促进线粒体活性氧簇(mtROS)释放 |
| 3.1.2 PM SRM1648a损伤线粒体膜电位(ΔΨm,MMP) |
| 3.1.3 PM SRM1648a抑制EA.hy926细胞ATP及ATP酶合成 |
| 3.2 PM SRM1648a破坏血管内皮细胞线粒体分裂-融合动态平衡 |
| 3.2.1 血管内皮细胞摄取PM SRM1648a诱导线粒体结构改变 |
| 3.2.2 PM SRM1648a引起血管内皮细胞线粒体动力学平衡紊乱 |
| 3.2.3 PM SRM1648a引起线粒体动力学相关基因表达改变 |
| 3.2.4 PM SRM1648a经DRP-1磷酸化影响线粒体分裂-融合动态平衡 |
| 3.3 PM SRM1648a经线粒体分裂异常触发血管内皮细胞炎症反应 |
| 3.3.1 PM SRM1648a破坏EA.hy926细胞膜并激活caspase1酶活性 |
| 3.3.2 PM SRM1648a诱导EA.hy926血管内皮细胞炎症反应 |
| 3.2.3 PM SRM1648a诱导HUVECs血管内皮细胞caspase1激活及炎性反应 |
| 3.3.4 DRP1介导的线粒体异常分裂参与颗粒物诱导的EA.hy926细胞炎性反应 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第六章 急性亚急性暴露PM SRM1648a致BALB/c小鼠主动脉血管组织损伤 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料与试剂 |
| 2.1.1 qRT-PCR引物序列 |
| 2.1.2 Western blot及免疫组化实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BALB/c小鼠分组与暴露 |
| 2.2.2 H&E和Masson染色病理观察 |
| 2.2.3 肺泡灌洗液的提取与检测 |
| 2.2.4 BALF细胞分类计数以及巨噬细胞极化 |
| 2.2.5 血液基础相关指标检测 |
| 2.2.6 炎性因子ELISA检测 |
| 2.2.7 主动脉大体油红实验 |
| 2.2.8 qRT-PCR与Western blot |
| 2.2.9 组织TUNEL法凋亡率 |
| 2.2.10 免疫组化 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a致BALB/c小鼠血液学细胞计数参数改变 |
| 3.2 亚急性暴露导致BALB/c小鼠主动脉病理改变 |
| 3.3 PM SRM1648a诱导BALB/c小鼠局部及全身氧化应激 |
| 3.3.1 急性亚急性颗粒物暴露后引起小鼠肺部氧化应激 |
| 3.3.2 急性亚急性暴露引起小鼠血液学氧化应激相关指标改变 |
| 3.3.3 急性亚急性暴露引起小鼠主动脉氧化应激相关分子表达改变 |
| 3.4 PM SRM1648a颗粒物刺激小鼠肺部、主动脉及循环炎症反应 |
| 3.4.1 颗粒物刺激BALB/c小鼠肺部炎症反应 |
| 3.4.2 急性亚急性暴露导致小鼠血液炎性因子含量升高 |
| 3.4.3 急性亚急性暴露引起小鼠主动脉组织炎性相关因子mRNA表达改变 |
| 3.5 亚急性暴露PM SRM1648a致BALB/c小鼠主动脉亚细胞结构功能紊乱 |
| 3.6 亚急性暴露PM SRM1648a致BALB/c小鼠主动脉细胞凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 大气颗粒物对血管损伤的研究进展一基于体内大小鼠实验 |
| 1 背景及简介 |
| 2 大气颗粒物诱导大小鼠血管损伤 |
| 2.1 血管损伤与血压升高 |
| 2.2 脂质沉积与动脉粥样硬化 |
| 2.3 血栓与脑部血管疾病 |
| 3 大气颗粒物诱导血管损伤与疾病的潜在机理 |
| 3.1 ROS与氧化应激 |
| 3.2 炎症反应 |
| 3.3 NOX/eNOS/NO系统紊乱失衡 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1.1 慢性阻塞性肺疾病(COPD) |
| 1.1.1 COPD的定义及诊断标准 |
| 1.1.2 COPD的流行病学概况 |
| 1.1.3 COPD的诱发因素 |
| 1.2 呼吸道感染与COPD急性加重(AECOPD) |
| 1.2.1 AECOPD的定义及诱因 |
| 1.2.2 病毒感染与AECOPD |
| 1.2.3 细菌感染与AECOPD |
| 1.2.4 AECOPD与中性粒细胞 |
| 1.3 常见COPD的治疗方法 |
| 1.3.1 支气管扩张剂治疗 |
| 1.3.2 皮质类固醇治疗 |
| 1.3.3 抗生素治疗 |
| 1.3.4 中药治疗及人参皂苷Rg3对肺疾病的保护作用 |
| 研究内容 |
| 第一部分 NTHi诱导的小鼠AECOPD的发生 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 NTHi诱导的AECOPD小鼠模型体重变化 |
| 1.3.2 NTHi诱导的AECOPD小鼠模型肺功能改变 |
| 1.3.3 NTHi诱导的AECOPD小鼠肺组织结构变化 |
| 1.3.4 NTHi诱导的AECOPD小鼠BALF中炎症细胞变化 |
| 1.3.5 NTHi诱导的AECOPD小鼠BALF中炎症因子变化 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 NTHi及香烟烟雾刺激BEAS-2B细胞诱导炎症细胞模型 |
| 2.3.2 中性粒细胞在BEAS-2B细胞模型中迁移的变化 |
| 2.3.3 NHTi及香烟烟雾诱导中性粒细胞迁移的分子机制 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 人参皂苷Rg3对AECOPD以中性粒细胞增多为特征的炎症反应的预防治疗作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人参皂苷Rg3对NTHi诱导的AECOPD模型小鼠的影响 |
| 3.3.2 人参皂苷Rg3对中性粒细胞迁移的影响及机制研究 |
| 3.3.3 人参皂苷Rg3 作用于AECOPD模型小鼠的代谢组学研究 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）小檗碱对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及对巨噬细胞极化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料与仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物及试剂耗材 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物模型 |
| 2.2 实验分组及给药 |
| 2.3 全身表现评分 |
| 2.4 多发性关节炎指数评分 |
| 2.5 关节肿胀数评分 |
| 2.6 足爪肿胀度测量 |
| 2.7 X射线观察骨关节破坏程度 |
| 2.8 胸腺指数和脾脏指数测定 |
| 2.9 胸腺T淋巴细胞增殖实验 |
| 2.10 脾脏组织病理学观察及评分 |
| 2.11 踝关节组织病理学观察及评分 |
| 2.12 脾脏T细胞亚群检测 |
| 2.13 细胞因子的检测 |
| 2.14 巨噬细胞吞噬功能检测 |
| 2.15 巨噬细胞极化鉴定 |
| 2.16 Western Blot检测目的蛋白的表达水平 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.BBR对AA大鼠的治疗作用 |
| 2.BBR对AA大鼠巨噬细胞极化和功能的影响 |
| 3.BBR对 AA大鼠T淋巴细胞的影响 |
| 4.BBR通过AMPK/NF-κB信号通路对巨噬细胞极化的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 主要英文缩略词表 |
| 附录 B 常用试剂配制方法 |
| 附录 C 个人简介 |
| 附录 D 综述 |
| 参考文献 |
（10）培土生金通络法抑制特发性肺纤维化NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 中医理论探讨 |
| 1 IPF中医辨治源流探析 |
| 1.1 《内经》论述肺痹、肺痿 |
| 1.2 《伤寒杂病论》论述肺痿 |
| 1.3 两晋、隋唐时期中医药着作论述肺痹、肺痿 |
| 1.4 宋、元、明时期中医药着作论述肺痹、肺痿 |
| 1.5 清代中医药着作论述肺痹、肺痿 |
| 2 IPF的中医临床病证探讨 |
| 2.1 IPF病因病机 |
| 2.2 IPF病位病性 |
| 2.3 IPF分型治疗 |
| 3 培土生金通络法理论探讨 |
| 3.1 培土生金法理论探讨 |
| 3.1.1 母子相生 |
| 3.1.2 经脉相连 |
| 3.1.3 功能联系 |
| 3.1.4 病理影响 |
| 3.1.5 培土生金分类论治 |
| 3.2 通络法理论探讨 |
| 3.2.1 络脉的正常功能 |
| 3.2.2 络脉闭阻的病理特点 |
| 3.3 培土生金通络法在 IPF 中常用药物研究 |
| 4 “参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方理论研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 IPF小鼠肺脾两虚模型的建立、证候评价与肺组织病理检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验器材与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 建立番泻叶灌胃脾虚模型 |
| 2.2 观察造模前后各组小鼠一般状态 |
| 2.3 建立BLM气管滴注诱导小鼠IPF肺虚模型 |
| 2.4 实验动物分组给药 |
| 2.5 各组肺组织病理学观察 |
| 2.5.1 取材 |
| 2.5.2 各组肺组织切片制作过程 |
| 2.5.3 各组肺组织病理学检查 |
| 2.5.4 病理切片下肺泡炎和肺纤维化分级标准 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 脾虚证小鼠模型造模观察指标 |
| 3.1.1 脾虚证造模前后各组小鼠体重的比较 |
| 3.1.2 脾虚证小鼠一般状态的观察 |
| 3.2 脾虚模型基础上IPF造模观察指标 |
| 3.2.1 一般状态的观察 |
| 3.2.2 肺组织病理学观察结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 模型评价 |
| 4.2 脾虚模型和IPF模型的判定 |
| 4.3 肺组织病理学观察探讨 |
| 实验二 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠血浆相关细胞因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物造模、分组、给药、取材 |
| 2.2 ELISA检测血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1 含量 |
| 2.2.1 ELISA检测各组血浆IL-1β、TGF-β1 含量 |
| 2.2.2 ELISA检测各组血浆IL-18 含量 |
| 2.3 计算与统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物造模、分组、给药、取材 |
| 2.2 肺组织前期预处理 |
| 2.3 总蛋白定量:选用微板检测法进行 |
| 2.4 Western blot 凝胶电泳 |
| 2.5 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关基因表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 引物设计 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验动物造模、分组、给药、取材 |
| 3.2 RT-PCR检测小鼠肺组织IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1、NF-κBmRNA表达 |
| 3.2.1 各组小鼠肺组织总mRNA提取 |
| 3.2.2 去RNA中基因组DNA并合成cDNA |
| 3.2.3 Real Time-PCR检测 |
| 3.3 结果与计算 |
| 3.4 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 IPF小鼠肺组织IL-1βmRNA表达 |
| 4.2 IPF小鼠肺组织IL-18mRNA表达 |
| 4.3 IPF小鼠肺组织NLRP3mRNA表达 |
| 4.4 IPF小鼠肺组织Caspase-1mRNA表达 |
| 4.5 IPF小鼠肺组织NF-κBmRNA表达 |
| 5 讨论 |
| 实验五 培土生金通络法对LPS诱导巨噬细胞焦亡相关细胞因子与蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 大鼠含药血清 |
| 1.4 主要试验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RAW264.7 细胞生长曲线筛选 |
| 2.2 RAW264.7 细胞分组加样培养 |
| 2.3 ELISA检测各组细胞培养上清液IL-1β、IL-18 含量 |
| 2.4 免疫荧光检测 |
| 2.5 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 生长曲线 |
| 3.2 细胞活性 |
| 3.3 ELISA检测结果 |
| 3.424 小时平均免疫荧光检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 IPF产生的病因 |
| 2 NLRP-3 炎症小体介导的细胞焦亡促进IPF形成的机制探讨 |
| 2.1 IPF产生机制之一是肺泡上皮损伤,异常修复而形成,可诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化 |
| 2.2 在肺损伤条件下,炎症与免疫反应促进IPF的形成 |
| 2.3 AM、AECs等引导的炎症反应是IPF发病的重要原因,该反应与IL-1β、IL-18 高表达有关 |
| 2.4 NLRP-3 炎症小体介导的细胞焦亡在IPF发病中起到关键作用 |
| 2.5 NF-κB高表达可能调控着NLRP-3 炎症小体的活化,共同影响IPF的发展 |
| 2.6 NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡可通过转化生长因子-β通路促进IPF的形成 |
| 3 西医治疗探讨 |
| 4 IPF肺脾两虚模型实验相关研究 |
| 5 培土生金法在IPF实验中的相关应用 |
| 6 实验研究结果探讨 |
| 6.1 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠探讨 |
| 6.2 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠血浆相关细胞因子的影响探讨 |
| 6.3 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关蛋白表达的影响探讨 |
| 6.4 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关基因表达的影响探讨 |
| 6.5 培土生金通络法对LPS诱导巨噬细胞焦亡相关细胞因子与蛋白表达的影响探讨 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 在校期间公开发表的学术论文及科研成果 |
| 致谢 |
四、免疫荧光法检测脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB的活化（论文参考文献）
- [1]扶芳藤提取物及主要活性成分甜醇对LPS诱导小鼠急性肺损伤的作用及机制研究[D]. 郑璐. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]苯并恶唑酮类抗炎化合物W3D对MD2和TLR4蛋白调控作用的研究[D]. 高晓慧. 山西医科大学, 2021
- [3]酿酒酵母β-葡聚糖对RAW264.7细胞氧化应激、炎症和凋亡的缓解作用及机制[D]. 于春微. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [4]麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究[D]. 郑炜东. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [5]冷诱导RNA结含蛋白在重症急性胰腺炎相关性肺损伤发病机制中的作用及大黄素干预的实验研究[D]. 徐秋实. 大连医科大学, 2021
- [6]Lyn激酶对急性肺损伤（ALI）小鼠模型的影响及机制研究[D]. 詹倩. 西南医科大学, 2021(01)
- [7]大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究[D]. 汪岩. 东南大学, 2020
- [8]中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究[D]. 关雪娃. 吉林大学, 2020(01)
- [9]小檗碱对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及对巨噬细胞极化的影响[D]. 周静. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [10]培土生金通络法抑制特发性肺纤维化NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡作用及其机制研究[D]. 黄高. 湖北中医药大学, 2020(08)