一、金标银染基因检测方法中杂交信号的提高(英文)（论文文献综述）
张玲玲[1]（2021）在《新型便携式生物芯片技术的研究及其在疾病早期诊断中的应用》文中提出随着国家的日益富强与人们生活质量的逐渐提高,健康已成为所有人都非常关心的话题。但是在偏远地区,医疗基础设施保障相对薄弱,患者在就医时的长途跋涉和检测结果的漫长等待过程中,往往延误了疾病的最佳诊断和治疗时间。为解决医疗过程中这一空间性和时间性的限制难题,一场关于新一代分析和诊断设备的科技革命应运而生,这些新研发的设备具有体积小,操作简易,分析全面且迅速,综合成本低等优势。即时检测（point-of-care testing,POCT）技术的快速发展正是这一科技革命的体现。POCT是一类极具潜力的检测技术,它快速简便,效率高,成本低,有检验周期短、标本用量少等优点。与此同时,在过去20年中,许多科学家和工程师致力于利用移动端消费类电子产品（如扫描仪,光盘播放器和智能手机等）固有成本效益及用户友好特性的POCT分析仪的研究。本论文首先开展了利用蓝光光盘膜的生物芯片实现免刻蚀法表面活化和通道制备的探索性研究;在前期的光驱生物分子检测平台的基础上实现基于mini DVD的数字化技术的新生儿感染性疾病敏感指标联合快速检测;最后实现基于基因芯片的埃博拉病毒诊断。具体内容如下:1.新型生物芯片基底—蓝光光盘膜的研究及其生物阵列的制备。蓝光光盘（Blu-ray Discs,BDs）与CD（Compact Disc）和DVD（Digital Video Disc）相比,具有更大的存储容量和更高要求的制作光盘介质。最新研究发现,蓝光光盘的“Hard CoatTM”薄膜实际上是一种独特的聚合物,可以通过水解的方法活化产生官能团,且对BD表面形貌没有任何物理损坏。值得一提的是,BD膜具有很好的光透明性和无荧光背景的特性,可用于多种生物芯片的制备。BD膜可通过使用无需刻蚀技术的滤纸通道或聚二甲基硅氧烷（Polydimethysiloxane,PDMS）微流控通道制备生物阵列,使用经典的生物素-链霉亲和素结合方式或原理和DNA杂交反应体系,验证了BD膜作为一种新型生物芯片基质在各种检测中的应用潜力。2.基于标准光盘/光驱数字化检测技术的新生儿感染性疾病敏感指标联合快速检测。新生儿感染是指新生儿在出生后的前四周的感染。据估计,每年有多达60万新生儿死于严重的感染,其中90%以上的死亡发生在贫困的地区。到目前为止,还没有理想的诊断方法,生物标志物对新生儿感染的诊断和合理治疗具有重要的指导意义,其中灵敏度高,并对早期诊断具有指导作用的生物标志物主要包括C反应蛋白（CRP）,血清淀粉样蛋白（SAA）和血清降钙素原（PCT）。在这项研究中,我们利用成本低,便携式的基于mini DVD的检测平台,实现了新生儿感染性疾病敏感指标联合快速检测。3.DNA微阵列芯片在埃博拉病毒诊断中的应用。埃博拉病毒（EVD）是由一种丝状单链RNA病毒引起的一种高致命性传染病。2014-2016年西非EVD疫情已造成11325人（39.5%）死亡,是EVD史上规模最大的一次爆发。因此发展一种可用于现场的快速病毒检测方法具有很大的意义,此方法不仅仅用于埃博拉病毒的检测,更对于将来可能发生的其他疾病的检测起到预防蔓延的作用。在本研究中,利用聚碳酸酯（Polycarbonate,PC）基质表面的DNA杂交反应,通过手持式扫描仪实现对埃博拉病毒的快速、简便、低成本检测。
向华,文翼平,杨国淋,顾佳,曹三杰,文心田[2]（2019）在《基因芯片检测技术在禽类病原检测方面的研究进展》文中提出基因芯片是继PCR后发展起来的一项快速、特异性好、敏感性强及高通量等优点的自动化基因检测技术,被广泛地应用于药物筛选、基因研究和疾病诊断检测等方面。随着病原不断发生基因重组,变异等现象,禽类病毒不断逃避免疫保护导致了强毒株的出现。传统的芯片检测方法虽然能够实现病毒的检测,然而昂贵的仪器设备和较长的检测时间严重阻碍了芯片技术在实际生产中的应用。一种低成本、时间短、快速有效的新的基因芯片技术的开发和应用是解决当前禽业产业发展的必要手段。基因芯片检测技术方法的改良及应用已成为目前疾病诊断的研究热点。本研究主要综述了基因芯片检测技术在禽类疾病检测方面的发展现状,并对今后该技术的发展方向和重点作了展望。
向华[3]（2018）在《可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究》文中进行了进一步梳理禽白血病病毒（Avian leucosis virus,ALV）、马立克病病毒（Marerk’s disease virus,MDV）、传染性法氏囊病病毒（Infectious butsal disease virus,IBDV）是引发家禽免疫抑制病的主要病毒性病原。新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）是引发家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。由于传统的诊断检测方法难以进行多病原或多病原型的联合检测,使生产上发生的同类型疫病短时间内难以鉴别。考虑到家禽疫病防控急需,基于上述六种病原的高通量同步检测和部分病原同步分型检测方法尚未见报道。本研究结合金标银染显色技术,构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检可视化基因芯片,对芯片的制备及检测过程进行条件优化,并对临床初步应用进行评价。研究主要结果如下:一、ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建、检测条件优化和质量评价1.ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建与检测条件优化。以ALV、MDV、IBDV的全基因组为模板,克隆得到ALV-ENV、MDV-MEQ及IBDV-VP2基因序列,设计寡核苷酸探针,成功制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV共检基因芯片（简称共检芯片Ⅰ）。对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol/L,40℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的使用浓度为4μg/mL,染色时间为5min,对阳性标本最终银染显色可见明显检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。芯片检测特异性试验显示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应,特异性好,且以IBV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅰ杂交;敏感性试验显示,芯片的最低检测浓度是1pg/μl。稳定性试验发现,基因芯片能在常温条件下进行有效保存不少于60 d,4℃条件下保存不少于75 d。二、禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六种亚型联合共检可视化基因芯片的构建、检测条件优化和质量评价1.H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片构建与检测条件优化。以H5N6、H7N9和H9N2禽流感病毒毒株的全基因组,以及合成制备的H5N1毒株的NA保守序列片段,克隆得到H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA和N2-NA共6个靶基因,并成功制备出H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片（简称共检芯片Ⅱ）;对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现使用浓度为50μmol/L的寡核苷酸探针与含有生物素标记的靶基因PCR产物45℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的最佳使用浓度为4μg/mL,银染7min,阳性标本银染显色可见明显的检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。基因芯片的特异性试验显示芯片特异性高,无交叉反应,且以ALV、MDV、IBDV、NDV、IBV、ILTV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅱ杂交;敏感性试验显示芯片的敏感性好,H5和N1亚型芯片的最低检测浓度是1×10-10ngul,H7亚型芯片的最低检测浓度是1×10-8ngul,N9亚型检测芯片的最低检测浓度是1×10-7ngul,H9和N2亚型芯片的最低检测浓度是1×10-8ngul,均不同程度的高于RT-PCR检测技术;稳定性试验显示,本研究建立的可视化芯片4℃条件下可保存不少于90d。三、共检芯片Ⅰ和共检芯片Ⅱ的初步临床应用将本研究构建的两套基因芯片对四川安岳、彭州、泸州、广元、自贡、乐山、广汉、温江、重庆、山东等地区疑似患禽白血病、马立克病、传染性法氏囊病、禽流感、新城疫和传染性喉气管炎的155份临床送检样品进行检测,其中,六类禽病毒病基因芯片的检测结果为ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV的阳性检出率分别为7%、1.2%、0.6%、5.8%、14.8%、0%,其中混合感染ALV和AIV为4.5%,NDV和AIV为2.5%,ALV、MDV和IBDV为0.6%,ALV、AIV和NDV为1.2%,该检测方法的敏感性略高于PCR/RT-PCR检测方法,二者方法的符合率高于98%;H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检芯片的检测结果为H5、H7、H9、N1、N9、N2的阳性检出率分别为4.3%、0%、43.4%、0%、34.7%、4.3%,其中H9N9亚型检出率为21.7%,H9N2亚型检出率为4.3%,H5和H9亚型共同感染检出率为4.3%,该检测方法与RT-PCR方法相比,敏感性为100%,特异性高于92.8%,符合率高于95.6%,对二者结果进行差方检验的Kappa值均>0.80,表明两种检测方法具有很好的一致性。综上,本研究成功构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型同步共检基因芯片,两种基因芯片具备较好的特异性、灵敏性和稳定性,能有效应用于上述禽类疫病的临床样本检测,为此类禽疫病的快速鉴别诊检提供了新的先进手段。
刘志鹏[4]（2018）在《同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用》文中进行了进一步梳理猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒A型（Group A rota virus,GAR）以及猪delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原,这四种仔猪腹泻病在临床表现非常相似,难以鉴别诊断。本研究针对PEDV、TGEV、GAR以及PDCoV四种腹泻病毒,将酶促反应显色技术、不对称PCR单链扩增技术和基因芯片技术相结合,构建一套PEDV-TGEV-G AR-PDCoV可视化酶促寡核苷酸共检基因芯片技术,进行了初步临床应用评价研究。研究结果结果显示,各目的基因的不对称PCR上下游引物最佳浓度比分别为:PEDV-S:1:20;PEDV-M:1:10;TGEV-S:1:20;TGEV-N:1:20;GAR-VP7:1:10;GAR-NSP4:1:10;PDCoV-M:1:10;PDCoV-N:1:20,此时目的片段的单链产物量最多。确定了芯片检测的操作程序为:在50℃环境中杂交90 min后,进行洗涤。与2000倍稀释的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶酶联后用DAB显色液显色后进行结果判读。本研究根据阳性对照生成棕褐色斑点,空白对照无斑点生成,确定了芯片检测质量与结果判定标准。该可视化共检芯片特异性好,PEDV、TGEV、GAR以及P DCoV的单独检测及混合检测杂交结果均呈阳性,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV及FMDV杂交结果呈阴性,探针之间没有相互干扰;各探针基因的灵敏性均可达10p g/μl（2.83×106copies/μl）;芯片在保存180天后仍可进行有效检测。研究应用所构建的芯片对四川、重庆地区的200份临床送检样本进行了检测。本研究成功构建了一套能高通量检测四种仔猪腹泻疾病的酶促可视化基因芯片,该方法特异性强,灵敏度高,为临床鉴别仔猪腹泻类疾病提供了一种新的方法。
马锐,黄小波,杨国淋,滑翔,赵玉佳,文心田,曹三杰,文翼平,伍锐[5]（2016）在《猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用》文中进行了进一步梳理基因芯片标准化是其特异灵敏检测病原的基本保障,本研究针对金标银染可视化基因芯片制备中点样缓冲液的使用、点样次数、杂交温度、杂交时间、胶体金浓度以及银染时间分别进行优化实验,分析其对金标银染可视化共检基因芯片杂交信号的影响。分别选取猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV）的N和S基因,A型猪轮状病毒（Group A porcine rotavirus,GAR）的VP7和NSP4基因设计引物。根据目的基因片段设计5’端修饰有15个T碱基的60-mer寡核苷酸探针,分别以1∶1混合点样缓冲液和直接进行喷样两种方式,利用芯片点样仪喷样分别喷样1次、2次、3次于醛基玻片上制成基因芯片。应用不对称PCR对实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,分别在40、45、50和55℃与基因芯片杂交30、60、90和120 min。利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,分别将稀释10、20、30、40、50及60倍的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过不同银离子染色时间后后,直接眼观实验结果。应用优化后的标准化可视化芯片和RT-PCR同时对173份临床送检病料进行检测,以评价芯片临床应用。结果表明,应用探针和点样缓冲液1∶1混合的方法进行1次喷样制作的基因芯片,在50℃环境中杂交90 min后,与4μg/m L链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合,再进行1214 min银染,经过10次重复性实验,可确定为金标银染可视化基因芯片的最佳优化条件。临床病料可视化芯片检测结果与RT-PCR检测结果一致。本研究确定了病毒性腹泻可视化共检芯片的最佳反应条件,为该技术的临床应用标准化研究奠定了基础。
马锐[6]（2016）在《三种猪病毒性腹泻可视化共检基因芯片的构建及初步应用》文中认为猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）以及猪轮状病毒 A 型（Group A rotavirus,GAR）是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原。这三种仔猪腹泻病的临床鉴别较困难,因此新的鉴别诊断方法一直是生产中亟待解决的难题。本研究以PEDV、TGEV以及GAR为研究对象,结合金标银染技术和不对称PCR单链扩增技术构建了一套PEDV-TGEV-GAR联合共检可视化基因芯片,并优化其制备及检测方法,进行初步临床应用评价研究。主要研究内容如下:1.共检可视化基因芯片的构建与优化（1）目的基因引物及探针的设计本研究在前期的基础上,根据Genbank中收录的基因序列,针对PEDV的M及S保守基因;TGEV的S及N保守基因;GAR的VP7及NSP4保守基因分别设计特异性引物。根据各目的基因片段正义链序列分别设计两条长度约为45 bp的探针。（2）共检可视化基因芯片的构建与检测技术优化本研究针对可视化基因芯片的制备方法及其检测程序进行了探索和优化,确定了可视化基因芯片的标准化制备方法、目的基因单链的扩增标记方法、可视化基因芯片的标准化检测方法以及结果判定标准。根据每段目的片段正义链序列分别设计两条长度约为45bp的寡核苷酸探针,在其5端添加15个T碱基,并进行氨基化修饰。进行点样缓冲液稀释后进行喷样。以提取重组质粒的DNA为模板,利用预先设计好的特异性引物对,经不对称PCR扩增对靶基因进行生物素标记。在不对称PCR的扩增标记体系中,对每个靶基因下游引物进行5’端生物素标记,控制上游引物与下游引物的浓度比例,制备大量带有生物素标记的单链靶基因。经过杂交程序和金标银染程序后,观察检测结果。2.共检可视化基因芯片的构建及检测技术优化结果结果显示,利用Baio（?）点样缓冲液对探针溶液进行1:1比例稀释后,按照预先设计的芯片探针矩阵对醛基基片进行一次性喷样。喷样完成后37℃水化过夜（10h）,使用含0.5%BH4Na,25%Ethanol,0.75 ×PBS的封闭液进行封闭,经过洗涤程序后,600 r/min离心干燥,4 ℃保存。PEDV-M基因的上游引物与下游引物的浓度为1:10时,其目的片段单链产量最大;PEDV-S、TGEV-S、TGEV-N、GAR-VP7及GAR-NSP4基因目的片段单链的最佳上游引物与下游引物的浓度为1:20。确定了芯片检测的操作程序为:在45 ℃环境中杂交90 min后,进入洗涤程序。与4 μg ·mL-1链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合,用ddH20温柔冲洗后再进行12min-14min银染。本研究根据阳性对照生成灰黑色斑点,空白对照无斑点生成,确定了芯片检测质量与结果判定标准。3.共检可视化基因芯片检测技术的评价本研究对可视化基因芯片的特异性、灵敏性和保存期进行了试验,并将其应用于临床样本检测,比较其与RT-PCR检测结果的吻合度。（1）特异性、灵敏性和保存期评价分别将PEDV、TGEV、GAR、CSFV、PRRSV、PCV2及JEV的标记产物与芯片进行杂交,以检测其特异性;将重组质粒DNA,经不对称PCR扩增标记后,分别作l0x系列倍比稀释后与芯片进行杂交,以检测其灵敏性;将同一批标准化制备完成的芯片,分别保存30天、60天、90天、120天及180天后,分别取出进行杂交检测,以检测其保存期。结果表明,可视化共检芯片特异性好,PEDV、TGEV、GAR的单独检测及混合检测杂交结果均呈阳性,CSFV、PRRSV、PCV2及JEV杂交结果呈阴性,探针之间没有相互干扰;可视化共检芯片灵敏度可达22.8 pg · μL-1;芯片在保存180天后仍可进行有效检测。（2）共检可视化基因芯片的临床应用评价本研究应用所构建的芯片对四川省21个地区的225份临床送检样本进行了检测。提取病死猪的小肠组织及小肠内容物基因组RNA,反转录成cDNA后用不对称PCR扩增标记后进行可视化芯片杂交检测,比较其与RT-PCR检测结果的吻合度。结果表明;PEDV、TGEV、GAR的阳性感染率为64.89%,其中PEDV的单纯感染率为60.45%,PEDV+TGEV的混合感染率为4.44%,以PEDV的单纯感染情况较为普遍,没有GAR感染。可视化基因芯片与RT-PCR的检测总符合率均为100%,表明所构建的可视化基因芯片可用于临床样本的检测。
薛斐[7]（2014）在《CHIKV、SINV和JEV可视化基因芯片的建立及初步应用》文中研究表明基孔肯雅病毒（Chikungunya Virus, CHIKV）和辛德毕斯病毒（Sindbis Virus, SINV）是甲病毒属单链RNA病毒，经蚊虫传播，在世界范围内广泛分布，有致病快，传播迅速等特点，其流行对世界公共安全造成威胁。目前缺乏对两种病毒引起疾病的有效治疗药物，因此，对两种病毒快速有效地进行诊断是预防控制和减缓病毒传播的重要措施。乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）是RNA病毒，能引发病毒性的脑炎，经库蚊等在动物与人之间传播。在亚洲的东部和南部及太平洋等地区广泛流行。目前已应用乙型脑炎疫苗防治，但尚缺乏特异性抗病毒药物，因此，对乙型脑炎的早期诊断显得极为重要。基因芯片技术（Gene Chip Technology）有较高的特异性和灵敏度及高通量等特点，在对环境和临床检测上有良好的应用。目前有多种基因芯片技术，以荧光、同位素、酶标标记在核酸检测中比较普遍。但有灵敏度较低，操作复杂，对条件和设备有着较高的要求等问题，限制了这类技术在检测病例中的应用。纳米金标记比荧光标记检测在敏感性上高100倍，简便快速，不需特殊的仪器，结果肉眼可看见。本文将纳米金标记技术应用在可视化基因芯片制备中，旨在建立对CHIKV、SINV和JEV进行快速、准确、价廉、操作简单的诊断研究的可视化基因芯片方法，分别探讨了CHIKV和SINV荧光检测基因芯片和可视化检测基因芯片的制备及两者的比较与JEV可视化分型基因芯片的制备。主要内容包括:一、CHIKV和SINV可视化检测基因芯片和荧光检测基因芯片的研制及两者之间的比较本实验室已初步建立了CHIKV和SINV荧光检测基因芯片，在此基础上，建立了两种病毒可视化检测基因芯片和荧光检测基因芯片。我们以已有CHIKV和SINV E基因序列为模板，重新设计检测探针和引物并对探针进行氨基修饰，对引物进行荧光素/生物素修饰。使用芯片点样仪对探针进行点样，在37℃的湿润环境下将检测探针固定到醛基玻片上，同时，以分别含CHIKV和SINV E基因的质粒为模板扩增待检测片段，变性后杂交到探针芯片，洗脱后荧光标记基因芯片通过特殊扫描仪扫描分析结果，而可视化基因芯片利用生物素与链霉亲和素高度亲和的特性在检测芯片上标记纳米金，银增强实现可视化。以酶切鉴定正确的CHIKV和SINV E基因序列为模板反向转录为RNA模拟真实的CHIKV和SINV RNA，将CHIKV和SINV RNA分别与提取的PRRSV，JEV-III，AIV RNA混合逆转录获得cDNA，PCR电泳鉴定各病毒cDNA的存在，使用CHIKV和SINV特异引物对各种病毒PCR扩增靶序列并与探针芯片杂交进行可视化基因芯片特异性实验，同时也进行灵敏度、重复性试验，结果显示，可视化基因芯片比荧光检测芯片方法对CHIKV和SINV的灵敏度检测结果分别为2.4×10-6ng/mL，2.0×10-8ng/mL和2.4×10-4ng/mL，2.0×10-5ng/mL，两者与PCR方法比较差异显着，可视化基因芯片比荧光检测芯片灵敏度可高出100倍，并且可视化基因芯片检测方法对两种病毒都具有良好的特异性和重复性。二、JEV可视化分型基因芯片的研制本实验室已初步建立了JEV荧光分型基因芯片，以此为基础建立了JEV可视化分型基因芯片。将已设计的氨基修饰检测探针点样并固定到醛基玻片上，同时，对已有引物序列5’末端进行生物素修饰，以已有的分别含乙型脑炎病毒I型（JEV-I）和乙型脑炎病毒III型（JEV-III）的PrM和E基因序列的质粒为模板扩增待检测目的片段，变性后杂交到检测探针芯片，利用生物素与链霉亲和素高度亲和的特性在检测芯片上标记纳米金，银增强实现可视化。进行灵敏度、特异性和重复性试验，结果显示，JEV分型可视化基因芯片检测到JEV-I和JEV-III的灵敏度分别为8.1×105拷贝数/mL和7.9×105拷贝数/mL，且具有良好的特异性和重复性。
王凯[8]（2013）在《常见呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法的研究》文中研究说明目的：呼吸道病毒所引起的呼吸道感染是疾病死亡的主要原因之一。近年来,由呼吸道病毒引起的疫情暴发流行也在逐渐增多,如甲型H1N1流感病毒、腺病毒及近来暴发的H7N9流感病毒等疫情,给人类健康带来了很大的危害。这些呼吸道病毒大都具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点,所引发的疾病及疫情的病原学复杂,快速精确的检测鉴定病原体不仅可以为疾病诊断治疗提供充足的依据,也可以为疫情防控提供坚实的基础。因此,寻找一种快速有效检测呼吸道病毒的方法是非常必要的。传统检验方法如病毒分离培养、免疫学检测等方法检测周期长,操作繁琐不适应推广使用,而现代分子生物学检测技术如荧光定量PCR、毛细管电泳检测等方法虽然一定程度上提高了检测的效率,缩短了操作的周期,但也由于各自技术的弊端不能同时检测多种靶病毒。而基因芯片技术由于可以快速、高通量、平行化的检测多个靶基因片段在病毒检测领域有独特的优势。本课题的研究目的是以基因芯片技术为基础,针对八种常见呼吸道病毒,建立一种快速、灵敏、特异、高通量检测方法。为呼吸道病毒的鉴定提供实验依据,并为感染病例临床诊断、卫生监督、疫情防控等提供快速、有效的诊断手段。方法：本课题选取八种常见呼吸道病毒作为待测靶病毒,设计筛选引物探针、探讨核酸提取方法、策划多重RT-PCR扩增组合、优化杂交体系,建立了以基因芯片技术为基础的呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法,并利用正交实验及对比法对检测方法中的多重RT-PCR扩增、杂交等步骤的参数进行了优化,确定芯片的最佳检测条件并建立芯片的判读标准。对所建立的检测方法从特异性、灵敏度及重复性三个方面进行了评价：根据所建立的检测方法是否可以对八种常见的呼吸道病毒进行准确检测,评价检测方法的特异性；根据可检测到核酸拷贝数的下限,评价检测方法的灵敏度；根据片间片内杂交信号值的变异系数来判定检测方法是否稳定可靠,评价检测方法的重复性。最后,本实验利用所建立的检测方法对262份临床样本进行了检测,考察的检测方法实际应用能力。结果：（1）本课题建立了常见呼吸道病毒检测的方法,可以对人类偏肺病毒,呼吸道合胞体病毒,甲型流感病毒,乙型流感病毒,副流感病毒I型,副流感病毒II型,副流感病毒III型,腺病毒八种呼吸道病毒病毒进行筛查。设计筛选包括副流感病毒通用引物在内的六对特异性引物,及八条特异性探针。同时设立了内标对照探针,对检测过程进行监测。（2）探讨了呼吸道病毒核酸的提取方法,选择了适合本检测方法使用的自动化提取系统磁珠提取法。（3）确定了RT-PCR反应的最佳条件,反转录酶和热启动聚合酶的用量分别为0.35μL及1.25μL,未标记引物与生物素标记引物的比例间为1：5,引物浓度为0.2μM:1μM,两管中各病毒引物的浓度比分别为2：2：1：1：1及2：2：1；RT-PCR反应的最终退火温度为52℃。（4）优化了杂交液的成分及杂交温度。杂交液最佳组分组合为5×SSC、0.8%SDS、2.5%甲酰胺。最佳的杂交温度为45℃。并最终确定了各呼吸道病毒探针的Cutoff值及判读标准。（5）检测方法特异性评价的结果显示,阳性毒株杂交信号值远大于各自对应探针的Cutoff值,阴性毒株及空白对照的杂交信号值均小于各探针Cutoff值,说明所建立的检测方法的特异性很好,可以对八种常见的呼吸道病毒进行准确检测。（6）灵敏度评价的结果显示,该检测方法可以检测出不低于102CFU/mL的体外转录RNA,检测灵敏度较荧光显色检测法提高100倍。（7）重复性评价的结果显示,片间和片内变异系数均小于15%,说明本课题建立的基因芯片检测呼吸道病毒方法稳定、可靠。（8）对262份临床样本进行了检测结果显示,所建立的检测法检测的准确率为96.9%（254/262）。表明该方法能有效的鉴定临床样本中感染的病原体,并可以对呼吸道病毒混合感染病例进行诊断。结论：本实验建立了一种以基因芯片技术为基础、量子点标记银染显色为创新的检测八种常见呼吸道病毒的方法,具有高通量、快速、特异性好、灵敏度高等特点。可以同时对多种病原体进行检测鉴定,且检测结果可以通过可视化信号判别,操作简便快速,可用于临床呼吸道病毒单病毒感染或混合感染病例的诊断,并有利于卫生监督、控制相关病毒传播途径从而预防疫情爆发。
朱晓光[9]（2012）在《麻疹病毒属6种重要病毒目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用》文中指出麻疹病毒属在病毒学分类上位于单负链RNA病毒目，副粘病毒科，副粘病毒亚科。根据国际病毒学委员会第8次分类会议的病毒分类目录，犬瘟热病毒、麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒和海豚瘟热病毒等六种病毒属于麻疹病毒属，这六种病毒分别在各自的宿主中引起重要的疾病，造成严重的公共卫生危害、社会影响和经济损失。上述病毒宿主范围广泛，致病性强，病死率高，已经引起了研究人员的重视，RT-PCR，实时定量PCR以及免疫学和血清学检测等多种方法被应用于上述病毒检测，但是这些方法多数是检测一种病毒或区分两种病毒，目前没有一种方法能同时检测麻疹病毒属上述六种重要病毒。本文研究目的是建立麻疹病毒属6种重要病毒的快速、准确、灵敏、高通量的基因芯片检测技术平台，同时完成麻疹病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒等麻疹病毒属病毒的种特异性检测，为疫病临床诊断、人畜传染病防控及反恐怖活动等提供有效的诊断手段。在NCBI网站下载上述病毒基因组序列信息，利用生物学软件对6种病毒下载的序列进行比对，获得每种病毒长度在200bp以上的种保守性特异核苷酸序列，以此作为设计oligo探针的备选序列，利用分子生物学软件PrimerPremier5.0设计特异性好、长度均一、Tm值相近的寡核苷酸探针。待检样品经荧光引物扩增后与基因芯片在优化的条件下杂交，激光扫描荧光信号分布和强度，Genepix软件分析结果；麻疹病毒属种特异性检测基因芯片制备后，用参比样品检验本基因芯片的敏感性、特异性、重复性和稳定性。麻疹病毒属种特异性基因芯片检测方法建立后，对来自吉林、辽宁和黑龙江的38例疑似犬瘟热病毒感染的临床病料进行了检测。在建立麻疹病毒属核酸检测基因芯片基础上，利用生物素-链霉亲和素的结合，引入胶体金显色及银染放大系统，建立麻疹病毒属的目视化基因芯片检测系统，使用目视化基因芯片对东北三省的48例临床病料进行了检测，共检测到38例犬瘟热病毒阳性样品，基因芯片方法和PCR方法的检测符合率为94.7%。本实验主要完成了以下四部分工作一、麻疹病毒属病毒种特异性寡核苷酸探针的设计从NCBI网站的Genome数据库下载麻疹病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒的基因组序列，从该网站的Oligonucleotide数据库下载上述病毒的核酸序列信息。每种病毒的下载序列分别比对后得到种特异性病毒保守区，在各自保守区内以Primer Premier5.0软件设计种特异性寡核苷酸探针及对应的PCR引物。遵循探针的设计原则，探针长度为25士5mer，TM值为48士5℃，使所有探针具有相近的杂交动力学参数。利用生物信息学技术在线比对，通过与公开发表的所有已知病毒序列进行比较，进行了病毒保守区和寡核苷酸探针的特异性验证，包括病毒属内序列同源性、种间序列的特异性、种内毒株的保守性。经过筛选与验证，从一千余条备选探针中确定了6条麻疹病毒属种特异性鉴定短寡核苷酸探针。二、麻疹病毒属病毒多重PCR扩增方法的建立上述实验确定了各病毒探针，在探针的两端分别设计麻疹病毒属各病毒特异性PCR扩增上下游引物，在上游引物的5′端标记HEX荧光染料，该染料可以被基因芯片扫描仪检测呈现绿色荧光。经优化各病毒引物比例，建立了麻疹病毒属多重PCR扩增方法。以细胞毒、合成模拟毒、质粒和病料为模板，验证了该多重PCR方法的特异性。实验结果显示，所建立的多重反应体系对麻疹病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒等均能扩增出与预期设计大小一致的特异条带，而对犬副流感病毒、VERO细胞和健康犬组织等无特异扩增，该结果与特异PCR方法检测结果一致。三、麻疹病毒属病毒种特异性基因芯片检测方法的建立及初步应用探针用MG2-610型点样仪通过机械手臂分别以夹缝针接触式点样方式印迹于醛基玻片上，探针浓度为40pmol/μl，点样温度为25℃，点样湿度为70%，点样后经NaBH4封闭。经优化杂交条件，初步建立了麻疹病毒属种水平鉴定基因芯片。基因芯片检测犬瘟热病毒、麻疹病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒、小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒的细胞毒和质粒结果均为阳性，而检测犬副流感病毒、VERO细胞和健康犬组织的结果为阴性，证明本基因芯片具有良好的麻疹病毒属种检测特异性。将TCID50为10-4的以犬瘟热病毒细胞毒10倍比稀释，分别用基因芯片和PCR方法梯度检测，基因芯片能检测到10-2TCID50的犬瘟热病毒，检测灵敏度是PCR方法100倍。分别使用同一批次和不同批次的多张芯片检测犬瘟热病毒，结果均为阳性，证明本芯片具有良好的重复性。制备的基因芯片放置1年以上仍然具有良好的检测活性。犬瘟热病毒能够感染犬科、鼬科、浣熊科、大熊猫科、猫科等多种动物，且传染性强、致死率高，对我国家养犬类、宠物、经济动物、野生动物、动物园以及实验动物等危害极大。在基因芯片制备完成后，使用基因芯片对吉林、辽宁和黑龙江等省送检的犬、狐狸和貉子病料进行检测，38例标本中，普通PCR方法和基因芯片方法检测犬瘟热病毒均是阳性结果的为24例，而单独基因芯片方法检测为犬瘟热病毒阳性结果的有2例，两种方法的检测符合率为92.7%。四、麻疹病毒属目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用根据上述实验得到的各病毒种特异性探针，在5’端连接短臂后按照规律的阵列点样在玻璃片上，水合之后形成可以长期保存的芯片。在PCR引物的5’端引入生物素，于胶体金上引入链霉亲和素，利用生物素-链霉亲和素反应使胶体金在点样探针上特异性的结合与聚集，最后利用银染放大信号，形成肉眼可见的结果。该检测平台特异性好，通量高，灵敏度与基因PCR方法相仿，能应用于临床样品，与麻疹病毒属核酸检测基因芯片相互补充，更加适用于基础实验室及临床检测。本实验建立了四步法探针设计方法，建立了麻疹病毒属6种重要病毒探针数据库，制备了能同时检测12份样品、每份样品能同时检测6种病毒的基因芯片。在探针两端设计PCR扩增引物，建立了麻疹病毒属6种重要病毒多重PCR扩增方法，在此基础上，建立了麻疹病毒属种特异性鉴定扫描芯片和目视化芯片技术，并初步应用于犬瘟热病毒临床病料检测，该技术具有良好的灵敏度和特异性，在出现传染病疫情时，结合临床症状及流行病学特征等，可在种水平上快速鉴定上述六种病毒。
陈清标[10]（2011）在《纳米金标芯片检测用于前列腺癌多基因诊断的实验研究》文中研究指明研究背景近年来,随着生活水平的提高和老龄化速度的加快,我国前列腺癌发病率及死亡率明显上升,而检测前列腺癌的实验室指标PSA灵敏度及特异性不高,因此需要寻求新的肿瘤标记物。基因芯片技术具有高通量、高特异性等特点,在疾病诊断等领域应用前景广泛,但是目前主要基因芯片技术均存在着检测仪器昂贵或灵敏度较低等问题,从而限制该技术的进一步发展。本研究利用纳米金可以与银结合后形成体积为原来106倍的黑色颗粒,并且可以凭肉眼观察,普通扫描仪读取图像的特点,将纳米金应用于基因芯片检测技术。目的1、研制纳米金标记芯片技术。2、建立一种可靠的前列腺癌纳米金标记基因芯片诊断系统。3、用纳米金标记芯片对临床前列腺癌标本进行验证。方法首先建立定性检测的纳米金标记芯片技术,并对11个前列腺癌特异性基因靶标（IGF1、P27、AR、PSMA、KLK3、PCNA、Ki-67、KLK1、KLK2、TMPRSS2、SREBF2）及前列腺癌临床标本进行检测,对各基因表达进行研究。结果结果表明,纳米金标记基因芯片检测单链核酸的灵敏度达到80 fmol/L,使用50%DMSO作为点样液效果最好,预杂交会导致杂交信号降低70%,银染时间控制在15 min时显色清晰且背景较低。在优化条件下,目标上调基因呈阳性表达,且颜色深浅不同,下调及阴性对照无显色,可肉眼分辨,达到定性及半定量结果。结论1、在优化条件下,纳米金标基因芯片的最佳点样液是50%DMSO,预杂交会导致杂交信号降低70%,银染时间控制在15 min时显色清晰且背景较低,检测单链核酸的灵敏度达到80 fmol/L。可作为一种相对可靠的基因芯片检测平台,具有灵敏度高、特异性好的特点,费用便宜,可用于临床检测。2、对11个前列腺癌特异性基因靶标（IGF1、P27、AR、PSMA、KLK3、PCNA、Ki-67、KLK1、KLK2、TMPRSS2、SREBF2）及前列腺癌临床标本进行检测,阴性对照及下调基因P27无显色,上调基因（IGF1、AR、PSMA、KLK3、PCNA、Ki-67、KLK1、KLK2、TMPRSS2、SREBF2 ）探针呈现出明显显色点,且颜色深浅不同,可达到定性及半定量结果,且灵敏度高、特异性好。因此可以作为一种前列腺肿瘤早期诊断的重要参考组合指标,应用于临床前列腺癌检测。
二、金标银染基因检测方法中杂交信号的提高(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、金标银染基因检测方法中杂交信号的提高(英文)（论文提纲范文）
（1）新型便携式生物芯片技术的研究及其在疾病早期诊断中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疾病早期诊断的背景及意义 |
| 1.2 现有的疾病诊断方法 |
| 1.3 现场快速检测方法概括 |
| 1.4 生物芯片技术概括 |
| 1.4.1 寡核苷酸芯片 |
| 1.4.2 蛋白质芯片 |
| 1.4.3 微流控芯片 |
| 1.4.4 传统生物芯片信号检测技术 |
| 1.5 新型生物芯片检测方法概括 |
| 1.5.1 CD/DVD/BD生物传感器 |
| 1.5.2 基于便携式CMOS和CCD图像的检测技术 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 新型生物芯片基底—蓝光光盘膜的研究及其生物阵列的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 试剂与仪器 |
| 2.2.1.2 缓冲液的配置 |
| 2.2.2 BD光盘膜表面性能研究 |
| 2.2.3 基于微流控技术的DNA阵列的制备 |
| 2.2.4 BD膜表面纸基通道的设计和生物阵列的制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 BD膜表面活化效果和材料表征 |
| 2.3.2 BD膜表面DNA阵列检测 |
| 2.3.3 BD膜表面基于纸基通道的链霉亲和素检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于标准光盘/光驱数字化检测技术的新生儿感染性疾病敏感指标联合快速检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 Mini DVD表面墨点的制备与读取 |
| 3.2.3 Mini DVD表面三明治免疫反应结构制备 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Mini DVD数字化检测体系研究 |
| 3.3.2 CRP、SAA和PCT三明治免疫法检测的条件优化 |
| 3.3.3 CRP、SAA和PCT的定量检测 |
| 3.3.4 CRP、SAA和PCT的同时检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 DNA微阵列在埃博拉病毒诊断中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.1.2 缓冲液的配制 |
| 4.2.2 埃博拉病毒检测材料和探针的设计 |
| 4.2.3 质粒DNA提取和RT-PCR |
| 4.2.4 DNA杂交芯片的制备 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA杂交检测原理 |
| 4.3.2 芯片表面活化和DNA杂交阵列制备 |
| 4.3.3 DNA杂交反应条件优化 |
| 4.3.4 互补配对DNA链的杂交定量检测 |
| 4.3.5 特异性研究 |
| 4.3.6 埃博拉病毒检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 完成的主要工作 |
| 5.2 工作计划和展望 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）基因芯片检测技术在禽类病原检测方面的研究进展（论文提纲范文）
| 1 传统的基因芯片技术在禽类病原检测方面的应用 |
| 2 可视化基因芯片技术的起源及分类 |
| 3 可视化基因芯片技术在目前疾病诊断中的应用及展望 |
| 3.1 可视化基因芯片在目前疾病诊断中的应用 |
| 3.1.1 酶与底物可视化显色技术 |
| 3.1.2 磁珠可视化显色技术 |
| 3.1.3 金标银染显色技术 |
| 3.2 可视化基因芯片在禽类病毒检测中存在的问题及应用展望 |
| 4 小结 |
（3）可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 六种禽类疫病及其病原学特征 |
| 1.1.1 禽白血病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.2 禽白血病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.3 马立克病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.4 马立克病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.5 传染性法氏囊病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.6 鸡传染性法氏囊病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.7 新城疫概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.8 新城疫的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.9 禽流感概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.10 禽流感的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.11 传染性喉气管炎概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.12 传染性喉气管炎的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.2 禽类病毒病诊断方法 |
| 1.3 基因芯片检测技术在禽类病原检测方面的研究进展 |
| 1.3.1 基因芯片检测技术的概述 |
| 1.3.2 基因芯片技术在禽类病原检测方面的应用 |
| 1.3.3 可视化基因芯片技术的起源及分类 |
| 1.3.4 可视化基因芯片技术在目前疾病诊断中的应用及展望 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建、检测条件优化和质量评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 ALV-ENV、MDV-MEQ、IBDV-VP2靶基因的扩增及鉴定 |
| 2.2.3 靶基因的复苏及鉴定 |
| 2.2.4 寡核苷酸探针设计 |
| 2.2.5 可视化基因芯片的制备 |
| 2.2.6 可视化基因芯片的检测步骤 |
| 2.2.7 可视化基因芯片的条件优化 |
| 2.2.8 可视化基因芯片的质量评价 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 靶基因的扩增、克隆及重组质粒菌复苏鉴定结果 |
| 2.3.2 基因芯片制备的初检 |
| 2.3.3 可视化基因芯片的条件优化结果 |
| 2.3.4 可视化基因芯片的质量评价结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六种亚型联合共检可视化基因芯片的构建、检测条件优化和质量评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA、N2-NA基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型靶基因特异性的检测 |
| 3.2.3 寡核苷酸探针设计与芯片制备 |
| 3.2.4 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型可视化基因芯片的检测 |
| 3.2.5 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型可视化基因芯片的质量评价 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 靶基因的扩增、克隆及重组质粒菌复苏鉴定结果 |
| 3.3.2 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型靶基因特异性的检测结果 |
| 3.3.3 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型基因芯片制备的初检 |
| 3.3.4 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型基因芯片的质量评价结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 六种禽病毒病及禽流感分型的可视化共检基因芯片检测技术的临床应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 临床样本核酸的提取及PCR扩增标记 |
| 4.2.2 阳性质粒的提取 |
| 4.2.3 可视化基因芯片的制备 |
| 4.2.4 PCR/RT-PCR和可视化基因芯片检测临床样本的比较 |
| 4.2.5 RT-PCR和可视化基因芯片检测禽流感病毒亚型的比较 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PCR/RT-PCR检测六种禽病毒病结果 |
| 4.3.2 可视化基因芯片检测六种禽病毒病结果 |
| 4.3.3 两种检测六种禽病毒病方法的符合率 |
| 4.3.4 RT-PCR检测禽流感H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型结果 |
| 4.3.5 可视化芯片检测禽流感H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型结果 |
| 4.3.6 两种检测禽流感六种亚型方法的符合率 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 附录 |
（4）同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1.猪病毒性腹泻病毒的研究进展 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒概述 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒概述 |
| 1.3 猪轮状病毒A型概述 |
| 1.4 猪delta冠状病毒概述 |
| 1.5 猪病毒性腹泻传统诊断方法 |
| 2.基因芯片技术及其在病原诊断上的应用 |
| 本研究的目的与意义 |
| 1.材料 |
| 1.1 阳性病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 临床样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 目的基因重组质粒的构建 |
| 2.2 寡核苷酸探针设计和合成 |
| 2.3 芯片的制备 |
| 2.4 不对称PCR引物浓度的优化 |
| 2.5 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片检测步骤 |
| 2.6 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的条件优化 |
| 2.7 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的评价及应用 |
| 3.结果 |
| 3.1 靶基因阳性质粒提取结果 |
| 3.2 不对称PCR扩增体系的条件优化结果 |
| 3.3 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片探针浓度的选择 |
| 3.4 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片杂交时间选择 |
| 3.5 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片杂交温度选择 |
| 3.6 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片酶浓度的选择 |
| 3.7 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片显色时间的选择 |
| 3.8 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的特异性检测结果 |
| 3.9 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的敏感性检测结果 |
| 3.10 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的保存期检测结果 |
| 3.11 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的临床样品检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 靶基因的选择 |
| 4.2 寡核苷酸探针的设计 |
| 4.3 不对称PCR扩增技术的讨论 |
| 4.4 可视化芯片条件优化的讨论 |
| 4.5 关于可视化芯片质量评估结果的讨论 |
| 4.6 关于可视化芯片临床应用评价的讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 ：探针基因序列 |
| 附录二 ：试验试剂的配置 |
| 附录三 ：部分临床样品可视化基因检测结果 |
| 作者简历 |
（5）猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 仪器及试剂 |
| 1.3 引物及探针设计 |
| 1.4 点样缓冲液与点样次数优化 |
| 1.5 不对称PCR制备靶基因 |
| 1.6 可视化DNA芯片杂交温度和杂交时间优化 |
| 1.7 金标银染程序优化 |
| 1.8 可视化基因芯片结果判定与信号扫描 |
| 1.9 可视化基因芯片的临床应用评价 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 可视化基因芯片点样缓冲液的优化 |
| 2.2 可视化基因芯片点样次数优化 |
| 2.3 可视化基因芯片杂交温度优化 |
| 2.4 可视化基因芯片杂交时间优化 |
| 2.5 可视化基因芯片纳米金溶液浓度优化 |
| 2.6 可视化基因芯片银染时间优化 |
| 2.7 可视化基因芯片重复性试验 |
| 2.8 可视化基因芯片临床检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（6）三种猪病毒性腹泻可视化共检基因芯片的构建及初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻概述及其诊断方法 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 猪流行性腹泻诊断方法 |
| 1.2.1 传统病原学诊断方法 |
| 1.2.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.2.2.1 核酸探针技术(ISH) |
| 1.2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.2.2.3 环节导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.2.2.4 基因芯片检测技术(Microarray) |
| 1.2.3 血清学诊断方法 |
| 1.2.3.1 荧光免疫技术(IF) |
| 1.2.3.2 血清中和试验(SN) |
| 1.2.3.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2 猪传染性胃肠炎概述及其诊断方法 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 猪传染性胃肠炎诊断方法 |
| 2.2.1 传统病原诊断方法 |
| 2.2.2 分子生物学诊断方法 |
| 2.2.2.1 核酸探针技术(ISH) |
| 2.2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.2.3 环节导等温扩增技术(LAMP) |
| 2.2.2.4 基因芯片检测技术(Microarray) |
| 2.2.3 血清学诊断方法 |
| 2.2.3.1 荧光免疫技术(IF) |
| 2.2.3.2 血清中和试验(SN) |
| 2.2.3.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3 猪轮状病毒A型概述及其诊断方法 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 猪轮状病毒A型诊断方法 |
| 3.2.1 传统诊断方法 |
| 3.2.2 分子生物学诊断技术研究进展 |
| 3.2.2.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 3.2.2.2 环节导等温扩增技术(LAMP) |
| 3.2.2.3 基因芯片检测技术(Microarray) |
| 3.2.3 血清学诊断方法 |
| 3.2.3.1 胶体金免疫技术(GICA) |
| 3.2.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 4 可视化基因芯片技术及其在病原检测中的应用 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 可视化基因芯片技术在病原检测中的应用 |
| 4.2.1金标银染可视化基因芯片在病原检测中的应用 |
| 4.2.2 酶和底物可视化基因芯片在病原检测中的应用 |
| 4.2.3 磁珠可视化基因芯片在病原检测中的应用 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PEDV-TGEV-GAR可视化共检基因芯片的制备与标记技术研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 引物及探针 |
| 2 方法 |
| 2.1 芯片的制备 |
| 2.1.1 PEDV-TGEV-GAR可视化共检芯片的制备 |
| 2.1.2 PEDV-TGEV-GAR可视化共检芯片的封闭 |
| 2.2 点样缓冲液的优化 |
| 2.3 点样次数的优化 |
| 2.4 阳性质粒的提取 |
| 2.5 靶基因的不对称扩增标记 |
| 3 结果 |
| 3.1 芯片制备初检 |
| 3.1.1 阳性定位基因的检测 |
| 3.1.2 共检芯片全基因的检测 |
| 3.2 阳性质粒提取结果 |
| 3.2.1 阳性质粒浓度测定 |
| 3.2.2 阳性质粒扩增产物鉴定 |
| 3.3 点样缓冲液的优化结果 |
| 3.4 喷样次数的优化结果 |
| 3.5 不对称PCR的优化结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 寡核苷酸探针 |
| 4.2 点样缓冲液及喷样次数 |
| 4.3 不对称PCR的优化 |
| 第三章 PEDV-TGEV-GAR可视化共检基因芯片的杂交及优化研究 |
| 1 材料 |
| 1.1主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 芯片杂交程序的优化 |
| 2.1.1 PEDV-TGEV-GAR可视化共检芯片的杂交温度优化 |
| 2.1.2 PEDV-TGEV-GAR可视化共检芯片的杂交时间优化 |
| 2.2 金标银染程序优化 |
| 2.3 可视化基因芯片结果判定与信号扫描 |
| 3 结果 |
| 3.1 芯片杂交程序优化结果 |
| 3.1.1 PEDV-TGEV-GAR可视化共检芯片的杂交温度的优化结果 |
| 3.1.2 PEDV-TGEV-GAR可视化共检芯片的杂交时间的优化结果 |
| 3.2 纳米金溶液优化结果 |
| 3.3 银染时间优化结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 杂交程序的优化 |
| 4.2 金标银染程序的优化 |
| 第四章 PEDV-TGEV-GAR可视化共检基因芯片的评价及临床应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 临床样本 |
| 1.3 其他试剂和仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 芯片制备 |
| 2.2 核酸样本的提取 |
| 2.3 阳性质粒的提取 |
| 2.4 PCR扩增及标记 |
| 2.4.1 不对称PCR扩增标记靶基因 |
| 2.4.2 普通PCR扩增标记靶基因 |
| 2.5 灵敏性试验 |
| 2.5.1 不对称PCR方法检测灵敏度 |
| 2.5.2 普通PCR方法检测灵敏度 |
| 2.6 特异性试验 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.8 临床样本检测 |
| 2.8.1 RT-PCR检测临床样本 |
| 2.8.2 可视化基因芯片检测临床样本 |
| 2.8.3 检测结果符合率 |
| 3 结果 |
| 3.1 灵敏性试验 |
| 3.2 特异性实验 |
| 3.3 保存期试验 |
| 3.4 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于基因芯片的灵敏性、特异性、保存期 |
| 4.2 临床检测样品的应用 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一: 目的基因的测序结果 |
| 附录二: 绵阳部分临床样品RT-PCR检测结果 |
| 附录三: 绵阳部分临床样品可视化芯片检测结果 |
（7）CHIKV、SINV和JEV可视化基因芯片的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 目录 英文缩略词 摘要 Abstract 前言 第一章 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析和已有质粒克隆及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 应用软件 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂和工具酶 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析 |
| 1.2.2 CHIKV 和 SINV 质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.3 CHIKV 和 SINV 酶切产物的回收纯化及测序 |
| 1.2.4 CHIKV 和 SINV 质粒的克隆 |
| 1.2.5 CHIKV 和 SINV 探针及引物设计 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析结果 |
| 1.3.2 分别含 CHIKV 和 SINV E 基因质粒的酶切鉴定结果 |
| 1.3.3 克隆分别含 CHIKV 和 SINV E 基因质粒的浓度测定 |
| 1.3.4 CHIKV 和 SINV E 基因片段的测序结果 |
| 1.3.5 CHIKV 和 SINV 引物探针设计结果 |
| 1.4 讨论 第二章 CHIKV 和 SINV 荧光基因芯片和可视化基因芯片的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂和工具酶 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液及配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 探针点样、固定、洗脱 |
| 2.2.2 CHIKV 和 SINV 质粒扩增 |
| 2.2.3 CHIKV 和 SINV 质粒扩增产物杂交探针芯片 |
| 2.2.4 荧光检测基因芯片扫描 |
| 2.2.5 可视化检测基因芯片标记纳米金 |
| 2.2.6 银增强实现可视化 |
| 2.2.7 两种检测芯片灵敏度检测 |
| 2.2.8 两种检测芯片特异性检测 |
| 2.2.9 两种检测芯片重复性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 检测探针点样矩阵 |
| 2.3.2 CHIKV 和 SINV 质粒目的片段扩增电泳鉴定结果 |
| 2.3.3 荧光检测基因芯片结果 |
| 2.3.4 可视化检测芯片结果 |
| 2.3.5 两种检测芯片灵敏度检测结果 |
| 2.3.6 两种检测芯片特异性检测结果 |
| 2.3.7 可视化检测芯片重复性检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 芯片探针点样及固定优化 |
| 2.4.2 芯片杂交反应条件优化 |
| 2.4.3 纳米金标记及银增强优化 |
| 2.4.4 芯片检测结果的判定 第三章 JEV 已有质粒阳性克隆及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 溶液和培养基配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 JEV-III 质粒酶切鉴定 |
| 3.2.2 JEV-III 酶切产物回收纯化及测序 |
| 3.2.3 JEV-I 和 JEV-III 已有质粒克隆 |
| 3.2.4 JEV 鉴别用检测探针、阳性坐标探针和扩增引物设计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 克隆质粒浓度测定 |
| 3.3.2 JEV-III 质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 JEV-III 测序结果和 JEV-I 合成序列 |
| 3.3.4 检测探针、阳性坐标探针及扩增引物设计结果 |
| 3.4 讨论 第四章 JEV 可视化分型检测基因芯片制备及初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 检测探针点样、固定、洗脱 |
| 4.2.2 JEV 待检测目的片段扩增 |
| 4.2.3 扩增产物杂交探针芯片 |
| 4.2.4 基因芯片标记纳米金 |
| 4.2.5 银增强实现可视化 |
| 4.2.6 灵敏度检测 |
| 4.2.7 特异性检测 |
| 4.2.8 重复性检测 |
| 4.2.9 JEV 分型可视化基因芯片初步应用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 JEV 质粒扩增结果 |
| 4.3.2 可视化检测基因芯片对乙型脑炎分型检测结果 |
| 4.3.3 灵敏度检测结果 |
| 4.3.4 特异性检测结果 |
| 4.3.5 重复性检测结果 |
| 4.3.6 初步应用检测结果 |
| 4.4 讨论 结论 参考文献 致谢 文献综述 |
| 一、CHIKV和SINV危害性及流行情况 |
| 二、CHIKV和SINV检测方法进展 |
| 三、JEV危害性及流行情况 |
| 四、JEV的检测方法研究进展 |
| 五、基因芯片技术研究进展及应用 |
| 参考文献 |
| 摘要 个人简历 参与课题 硕士生期间投稿文章 |
（8）常见呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词汇对照 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 常见呼吸道病毒概述 |
| 1.1.1 流感病毒(influenza virus,Flu) |
| 1.1.2 副流感病毒(parainfluenza virus,PIV) |
| 1.1.3 呼吸道合胞体病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV) |
| 1.1.4 腺病毒(adenovirus,Adv) |
| 1.1.5 其余呼吸道病毒 |
| 1.2 呼吸道病毒检测的临床意义 |
| 1.2.1 个体化呼吸道疾病诊断 |
| 1.2.2 卫生监控及疫情防控 |
| 1.2.3 流行病学研究 |
| 1.3 呼吸道病毒核酸检测方法研究进展 |
| 1.3.1 聚合酶链反应(PCR)技术 |
| 1.3.2 DNA探针技术 |
| 1.3.3 基因芯片技术 |
| 1.3.4 其他分子生物学检测技术 |
| 1.4 基因芯片技术研究进展 |
| 1.5 本课题研究的目的、意义及主要内容 |
| 1.5.1 本课题研究的目的和意义 |
| 1.5.2 本课题研究的主要内容 |
| 第2章 常见呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒毒株 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物的设计与筛选 |
| 2.2.2 探针设计与筛选 |
| 2.2.3 引物和探针的合成 |
| 2.2.4 基因芯片的制备 |
| 2.2.5 病毒核酸的提取 |
| 2.2.6 内标的设立 |
| 2.2.7 多重RT-PCR扩增的建立与优化 |
| 2.2.8 芯片的杂交与检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 常见呼吸道病毒引物的筛选 |
| 2.3.2 常见呼吸道病毒探针的筛选 |
| 2.3.3 核酸提取方法优化结果 |
| 2.3.4 内标引物探针的筛选结果 |
| 2.3.5 基因芯片的最终阵列 |
| 2.3.6 多重RT-PCR的优化 |
| 2.3.7 杂交体系优化与Cutoff值的确定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 常见呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法的评价 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒毒株 |
| 3.1.2 细胞株 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 标准品的建立 |
| 3.2.2 基因芯片检测法特异性评价 |
| 3.2.3 基因芯片检测法灵敏度评价 |
| 3.2.4 基因芯片检测法重复性评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 标准品构建结果 |
| 3.3.2 基因芯片检测法的特异性评价结果 |
| 3.3.3 基因芯片检测法的灵敏度评价结果 |
| 3.3.4 基因芯片检测法的重复性评价结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 检测方法的初步临床应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 临床样本 |
| 4.1.2 细胞株 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 临床样本的采集处理 |
| 4.2.2 临床样本病毒核酸的提取 |
| 4.2.3 基因芯片检测法对样本进行八种呼吸道病毒检测 |
| 4.2.4 检测结果的复核 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 临床标本检测芯片及阵列 |
| 4.3.2 临床标本检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（9）麻疹病毒属6种重要病毒目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 短寡核苷酸探针的设计和生物信息学验证 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 麻疹病毒属多重PCR 扩增方法的建立 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 麻疹病毒属种特异性基因检测芯片的建立及其初步应用 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 麻疹病毒属目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用 |
| 一 材料 |
| 二 方法 |
| 三 结果 |
| 四、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 期间撰写的论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）纳米金标芯片检测用于前列腺癌多基因诊断的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1、 前列腺癌（PCa） |
| 1.2、 前列腺癌早期检测和预后标记 |
| 1.3、 基因芯片 |
| 1.4、 纳米金标记技术 |
| 1.5、 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 参考文献 |
| 第七章 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读硕士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、金标银染基因检测方法中杂交信号的提高(英文)（论文参考文献）
- [1]新型便携式生物芯片技术的研究及其在疾病早期诊断中的应用[D]. 张玲玲. 太原理工大学, 2021(01)
- [2]基因芯片检测技术在禽类病原检测方面的研究进展[J]. 向华,文翼平,杨国淋,顾佳,曹三杰,文心田. 中国兽医学报, 2019(01)
- [3]可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究[D]. 向华. 四川农业大学, 2018(02)
- [4]同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用[D]. 刘志鹏. 四川农业大学, 2018(02)
- [5]猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用[J]. 马锐,黄小波,杨国淋,滑翔,赵玉佳,文心田,曹三杰,文翼平,伍锐. 农业生物技术学报, 2016(08)
- [6]三种猪病毒性腹泻可视化共检基因芯片的构建及初步应用[D]. 马锐. 四川农业大学, 2016(01)
- [7]CHIKV、SINV和JEV可视化基因芯片的建立及初步应用[D]. 薛斐. 中国人民解放军军事医学科学院, 2014(01)
- [8]常见呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法的研究[D]. 王凯. 陕西师范大学, 2013(03)
- [9]麻疹病毒属6种重要病毒目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用[D]. 朱晓光. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(10)
- [10]纳米金标芯片检测用于前列腺癌多基因诊断的实验研究[D]. 陈清标. 广州医学院, 2011(05)