一、应用免疫磁珠法富集慢性髓性白血病骨髓CD_(34)~+细胞（论文文献综述）
张琛[1]（2020）在《骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究》文中指出第一部分急性髓性白血病骨髓微环境中神经破坏与Th免疫失衡的研究研究背景急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一组异质性恶性疾病,其特征是白血病干细胞和/或祖细胞的过度增殖造成大量白血病细胞累积并抑制正常造血。即使采用目前临床应用强化的化疗方案和干细胞移植,AML的总体生存率仍然很差。恶性白血病细胞的微环境会被重塑成有利于白血病生存的环境,这样的骨髓微环境可以保护AML细胞免受化疗药诱导的细胞死亡。探究骨髓微环境中可以促进白血病发生发展、保护白血病细胞免受化疗药杀伤的因素,以期能够发现针对AML治疗的有效靶点。骨髓局部区域里的交感神经系统与造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSC）通过直接接触或者通过分泌细胞因子的形式,调节骨髓龛内造血干细胞的存活和休眠状态的转化来调控骨髓的正常造血功能。当破坏小鼠交感神经后,使骨髓局部缺乏交感失神经分布,会使得骨髓中造血干细胞数量的急剧下降,使正常的造血功能受到一定程度的抑制。骨髓局部的交感神经组织对骨髓中的造血和免疫平衡的维持具有极为重要地调控作用。然而,骨髓交感神经损伤与血液系统疾病的发生发展也有着密不可分的关系。有研究发现骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative Neoplasms,MPN）患者及模型小鼠的骨髓中,交感神经纤维有明显受损,这些损伤可以使得正常HSC的凋亡。CD4+T细胞是免疫系统中一个不可忽略的组成成分,其分化的Th（T helper）亚群在许多实体瘤的发生发展中也扮演着关键的角色。课题组前期发现AML患者骨髓中交感神经特异性分子酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、Nestin等的表达水平与Th细胞分泌的特异性细胞因子IL-17A表达呈正相关,而与Foxp3/IL-17A比值呈负相关。因此,我们推测在AML的发生发展中,骨髓交感神经发生病理性改变,引起骨髓区域微环境Th细胞免疫网络的异常,造成骨髓微环境中免疫平衡受到抑制,进而使得白血病病程进展。然而,AML中骨髓交感神经损伤是通过何种机制改变骨髓Th细胞免疫网络,以及Th细胞免疫异常如何促进白血病细胞的发生发展,这些问题亟待进一步研究。研究目的1.明确AML患者骨髓局部存在神经破坏并分析其与患者临床特征之间的相关性。2.检测骨髓局部微环境中Th亚群的改变,明确在AML患者中存在骨髓Th亚群的免疫失衡,并通过系统生物学的分析推测其中作用的关键点。3.探究在白血病动物模型中破坏交感神经后,其Th的变化情况。4.应用髓腔注射的方法,破坏白血病动物模型骨髓局部的交感神经,旨在明确骨髓局部神经受到破坏后对白血病发生发展的作用。研究方法1.标本收集:本研究采集就诊于山东大学齐鲁医院的63例初诊急性髓性白血病病患及16例对照组的骨髓液;分离骨髓中的单个核细胞并用MACS方法分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.AML患者骨髓局部存在神经破坏:应用RT-PCR方法检测患者和对照组骨髓细胞中神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的相对表达水平。3.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:应用RT-PCR方法检测骨髓局部β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR在患者和对照组中的表达差异,并分析其与临床特征之间的相关性。4.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:流式细胞术检测AML患者与对照组骨髓局部Th亚群比例,包括Th1、Th2、Th17、Th9、Th22和Treg;应用RT-PCR技术检测Th亚群特异性转录因子T-bet、RORc、GATA3、AHR和Foxp3的mRNA水平;采用ELISA方法检测骨髓上清中细胞因子IFN-γ、IL-17A、TGF-β、IL-22、IL-10 和 IL-4 的浓度。5.系统生物学方法分析:我们利用系统生物学方法中的贝叶斯网络对白血病患者和对照组骨髓微环境中检测的Th亚群以及Th亚群的关键性转录因子进行分析。6.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的影响:应用MLL-AF9细胞尾静脉注射到C57BL/6J背景的野生型雌鼠体内建造AML小鼠模型;分别进行 6-羟基多巴胺氢溴酸盐（6-Hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA）和 4-甲基儿茶酚（4-Methylcatechol,4-MY）的腹腔注射对小鼠进行神经破坏和神经保护的干预;应用流式细胞术的方法对动物模型骨髓局部Th亚群的比例进行测定。7.骨髓局部交感神经破坏对白血病的影响:应用髓腔注射6-OHDA的方法对小鼠骨髓局部的神经进行破坏。研究结果1.AML患者骨髓局部存在神经破坏:通过比较患者和对照组骨髓局部的基因相对表达量发现,神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的mRNA水平在白血病患者中均低于对照组,提示AML患者骨髓局部微环境中存在交感神经的破坏。2.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:通过检测β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR,我们发现除β1亚型在白血病患者骨髓局部的相对表达量较低,β2和β3亚型在白血病患者的骨髓局部均有着较高的相对表达水平。并且,β2-ADR亚型的表达量远高于β1-ADR和β3-ADR亚型。通过分析其与临床特征的关系,AML-M4和AML-M5亚型高表达β3-ADR,而其中高表达β1-ADR的病患出现髓外浸润的几率更大。3.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:（1）.与对照组相比,AML患者骨髓局部Th1和Th17的比例出现显着地降低,Treg和Th22的比例显着增高:（2）.AML患者骨髓中Th亚群的下游转录因子T-bet、RORc和GATA3的mRNA表达量较对照组明显降低,而Treg的下游转录因子Foxp3和Th22的转录因子AHR有所增高;（3）.AML患者Th亚群分泌的细胞因子中,IFN-γ、IL-17A、TGF-β和IL-22均低于对照组,而IL-10和IL-4的分泌量高于对照组;（4）.将上述结果通过贝叶斯网络进行分析发现,对照组中贝叶斯网络的终点指向IFN-γ和IL-4,而在AML患者中网络的终点变为IL-17A和IL-10。4.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的作用:（1）.AML模型鼠的生存期均短于正常对照组小鼠,且神经破坏剂组AML小鼠生存期短于其他组小鼠生存期;（2）.神经破坏剂组小鼠的白血病负荷明显高于其他组,而神经保护剂组小鼠的白血病负荷明显低于其他组;（3）.骨髓局部微环境中,Th1和Th17在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低,Treg和Th2在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均升高。Th17/Treg比值在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低。5.骨髓局部交感神经破坏对白血病及Th亚群的影响:在利用髓腔注射的方法对白血病模型小鼠单只股骨的局部交感神经进行破坏后,观察其白血病负荷情况发现,被破坏交感神经一侧的髓腔内的白血病负荷明显高于未进行神经破坏一侧的负荷量。研究结论1.AML病患骨髓局部存在交感神经破坏,且β-肾上腺素受体在AML病患骨髓局部存在高表达。2.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡,Th1及Th17的比例明显降低,Treg等免疫抑制亚群的比例明显增高。3.AML小鼠模型组,神经破坏剂组生存期明显变短且白血病负荷增加,而神经保护剂组生存期更长且白血病负荷更少;AML及神经破坏组的骨髓中存在免疫失衡。4.局部破坏AML小鼠单侧的骨髓交感神经发现,被破坏一侧髓腔中白血病负荷明显高于神经完整的一侧髓腔,证明神经破坏会促进急性髓性白血病进展。第二部分 交感神经递质对Th亚群及急性髓性白血病细胞作用的研究研究背景急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种生物学和临床表现上的存在高度异质性疾病。尽管支持治疗和预后风险分层的进展已优化了既定疗法,但总体长期生存率仍然很低,所以明确能够影响疾病发生发展的因素是十分必要的。众所周知急性应激反应是人体会对外界刺激作出的积极地反应,而慢性应激通常是有害的,并可能导致严重的健康并发症。应激会触发中枢神经系统特定部位控制下的神经内分泌链反应,其中主要包括肾上腺和交感神经系统分泌儿茶酚胺和糖皮质激素。儿茶酚胺（catecholamines）是最早对压力作出反应的信号分子,也是主要发挥作用的分子。尽管儿茶酚胺（主要是表肾上腺素和去甲肾上腺素）的主要功能是作用于心脏功能,但新近的研究表明这些应激激素也显示出在癌症中的重要作用。肿瘤坏死因子α（TNFα）是巨噬细胞/单核细胞在急性炎症过程中产生的炎症细胞因子,负责细胞内各种信号事件。TNFα结合TNFR触发各种MAPK等细胞内信号途径,参与到调节炎症和肿瘤中。T辅助（Th）亚群是CD4+T细胞在激活后会分化出不同的亚群,是各种免疫应答中重要的组成部分。不管是早期发现的Thl和Th2亚群还是新近的研究热门Th17及Treg亚群都被认为参与到了诸如卵巢癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中的发病机制中。Th亚群的免疫失衡在疾病中被认为是导致疾病发生的关键因素。而且,有证据表明,诸如淋巴细胞等的膜表面上会存在多种神经递质的受体,而交感神经递质不仅会抑制免疫系统,还会导致Th1/Th2的细胞平衡向以Th2为主的反应发生转变并诱导了哮喘和过敏性疾病的发生。然而,交感神经递质以何种方式参与AML发生发展还尚不明确。依据前期检测到AML骨髓局部中存在着一定程度的神经损害以及Th亚群的免疫失衡,我们推测,在AML骨髓区域微环境中,交感神经递质会造成Th17、Treg、Th1、Th2等多个Th细胞免疫的失衡,最终促进AML白血病的发生发展。研究目的1.探究骨髓局部的交感神经递质对Th亚群免疫平衡的影响,明确其具体的作用机制。2.探究交感神经递质在不同浓度下对原代及白血病细胞系的影响,明确其如何通过改变Th亚群免疫平衡进而促进白血病发生发展。3、明确交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体抑制CD4+T向免疫保护亚群Th1及Th17亚群分化,进而造成了骨髓局部的免疫抑制。4、进一步探究神经递质抑制了Th1及Th17亚群杀伤白血病细胞的作用,进而促进白血病的进展。研究方法1.标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院初诊AML患者骨髓液;分出骨髓中的单个核细胞并用MACS分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:选取AML细胞系MV4-11和THP-1以及初诊急性髓性白血病患者的原代细胞;应用CCK8检测不同浓度的肾上腺素和去甲肾上腺素在24小时和48小时时间点对其促增殖情况。3.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:应用RT-PCR技术检测不同细胞上β1/β2/β3-肾上腺素受体受体mRNA的表达情况。4.不同浓度的交感神经递质对Th亚群的影响:设置浓度梯度0、10-8M,10-7M、10-6M、10-5M和10-4M的肾上腺素及去甲肾上腺素作用于CD4+T细胞;应用MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-17A细胞因子的浓度。5.交感神经递质通过β-肾上腺素受体影响Th亚群的免疫平衡:MACS免疫磁珠法分选小鼠CD4+T细胞;琼脂糖凝胶DNA电泳明确β-肾上腺素受体敲除鼠的基因型;流式细胞术检测小鼠Th亚群的变化;ELISA检测培养后的细胞上清中IFN-γ和IL-17A的浓度。6.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;CCK8方法用于检测细胞增殖情况。研究结果1.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:分别应用不同浓度梯度等肾上腺素以及去甲肾上腺素,分别作用于初诊AML患者的原代细胞和MV4-11及THP-1两种AML细胞系,在24小时和48小时两个时间点应用CCK8方法检测其增殖情况,随着浓度的增加交感神经递质促进白血病细胞增殖的效果越明显。肾上腺素及去甲肾上腺素均在10-4M浓度时促增殖效果最明显,且肾上腺素促白血病细胞增殖效果优于去甲肾上腺素。2.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:（1）应用RT-PCR技术检测了 HL60、THP-1、U937、Kasumi四种不同的AML细胞系以及CD4+T细胞和Hela细胞系表面β-肾上腺素受体的表达情况。其中β2-肾上腺素受体表达量远高于其他两种亚型,而β3-肾上腺素受体的相对表达量低于其他两种亚型,且AML细胞系及CD4+T细胞均有较高的β-肾上腺素受体。（2）同时检测了小鼠脾脏、骨髓、外周血、分选的CD4+T细胞以及骨骼肌细胞的β-肾上腺素受体受体表达情况。β2-肾上腺素受体表达量在各个组织里仍远高于其他两种亚型,β3-肾上腺素受体表达量也是最低的一种。其中CD4+T细胞上β2-肾上腺素受体的表达量最高,接近骨骼肌中表达量的水平。3.低浓度的交感神经递质对Th亚群的免疫平衡无明显影响:（1）分别加入10-8M-10-5M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素于CD4+T细胞的培养体系中,3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的比例及其比值关系。研究发现在10-8M-10-5M浓度区间,Th亚群及Th1/Th2、Th17/Treg相比于空白对照组均无统计学差异。（2）取培养后的上清,应用酶联免疫标记法（ELISA）测定分泌IFN-γ和IL-17A细胞因子的量,不同浓度梯度组与对照组之间的差别亦无统计学意义。4.高浓度的交感神经递质可改变Th亚群的免疫平衡:（1）CD4+T细胞的培养中分别添加10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的百分比及其比值关系。研究发现,肾上腺素及去甲肾上腺素均能明显降低Th1及Th17的比例,并且能升高Treg的比例。（2）应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测培养后的细胞上清,肾上腺素及去甲肾上腺素培养后上清中IFN-γ及IL-17A细胞因子的浓度明显减低。5.交感神经递质亦改变小鼠Th亚群的免疫平衡:分选小鼠CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测发现Thl和Th17在对照组中的比例明显降低,Treg的比例明显增高。RT-PCR技术检测IFN-γ和IL-17A的mRNA水平明显低于对照组。6.交感神经递质通过β-肾上腺素受体改变Th亚群的免疫平衡:（1）检测β1/β2-肾上腺素受体敲除鼠的基因型,明确β1及β2-肾上腺素受体敲除成功。（2）分选肾上腺素受体敲除小鼠的CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测Th1、Th17和Treg的比例,结果发现Th1及Th17亚群未被交感神经递质所抑制。证明交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体发挥改变Th的作用。7.TNF-α能通过TNFR2促进Treg的比例:TNFR2是TNF-α主要的发挥作用的受体,于是我们应用流式细胞学的方法对初诊的急性髓性白血病患者和对照组中CD4+T细胞及Treg细胞表面的TNFR2表达量进行测定。初诊白血病患者的CD4+T细胞和Treg细胞表面均高表达TNFR2受体。随后,我们在CD4+T细胞的培养体系中加入TNF-α进行培养,在添加了 TNF-α后,Treg的比例明显增加,然而在预先添加TNFR2拮抗剂后再添加TNF-α进行培养则可以降低Treg的比例。8.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:CD4+T细胞的培养体系中分别加入10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后将CD4+T细胞与白血病细胞进行共培养,于24小时和48小时用CCK8方法检测AML细胞增殖情况。肾上腺素及去甲肾上腺素均能通过改变Th亚群平衡进而促进AML的增殖,其中肾上腺素作用更为明显。研究结论1、交感神经递质肾上腺素和去甲肾上腺素均能在24小时和48小时促进原代白血病细胞及白血病细胞系的增殖,且随浓度的增加其促进白血病细胞增殖的效果更加显着。2、交感神经递质可以抑制人和小鼠CD4+T细胞向Th1和Th17方向分化。3、敲除β-肾上腺素受体后,交感神经递质不能改变小鼠Th1及Th17的比例。4、TNF-α能通过TNFR2受体促进Treg的比例。5、交感神经递质通过抑制Th1和Th17的比例进而抑制其对白血病细胞杀伤作用。第三部分NLRP3炎性小体相关基因单核苷酸多态性在急性淋巴细胞白血病中的研究研究背景急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）是一种血液恶性肿瘤,由于骨髓和其他组织中的淋巴样干祖细胞的恶性增殖和积累所致。尽管最常见的ALL是儿童急性淋巴细胞白血病（占ALL 80%的病例）,但成人急性淋巴细胞白血病的治愈率仅有20%-40%。在过去的十年中,尽管在改善预后以及开发针对特定亚型的新疗法方面取得了一定进展,但了解疾病的发病机制仍是改变ALL治愈率的关键点。炎性小体是固有免疫中公认的重要角色。其中研究最透彻的是NLRP3炎性小体,NLRP3炎性小体复合物属于核苷酸结合和寡聚化域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs）的家族,也被称为“含pyrin域的蛋白3”。NLRP3炎性小体与许多疾病密切相关,包括多发性硬化症、炎症性肠病以及其他自身免疫性和自身炎性疾病。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）是一种 DNA 序列的多态性,是由于单个核苷酸在基因组水平上的变异而引起的。SNP在至少1%的人群中有差异,占正常人类遗传变异的大部分。虽然大多数SNP没有明显的表型作用,然而仍有很多的SNP被认为可能促进疾病发生发展以及影响药物治疗的功效。NLRP3相关分子的SNP在许多肿瘤和慢性病的发病及疾病进展过程中都有很大的作用。例如,已有文献表明CARD8（rs2043211）与心血管疾病的发生有关,NF-κB-94ins/del ATTG多态性则与胃癌、肝细胞癌和肺癌等癌症的发生密切相关,NLRP3效应分子之一IL-18的单核苷酸多态性rs1946518已显示与牙周炎和肝细胞癌的发病有关,而IL-1β rs16944被认为可能导致宫颈癌和胃炎。因此,NLRP3炎性体相关基因的多态性与恶性肿瘤的发生关系密切。NLRP3己广泛涉及各种血液疾病的发生和发展。然而,NLRP3炎性小体如何促进ALL的发生发展仍然未知。因此,我们探究了 ALL患者的骨髓中NLRP3炎性小体的单核苷酸多态性及其相关基因的表达情况,以期明确其在ALL发生发展中的作用。研究目的探索NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与ALL易感性的关系;分析不同模式下NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与临床特征之间的关系;为明确NLRP3单核苷酸多态性具体作用机制,探索其对NLRP3各组分表达水平及下游因子表达和细胞因子分泌的影响。研究方法1、PCR 检测 ALL 病人及健康对照组中的 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG 基因的单核苷酸多态性。2、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组和正常对照组 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与ALL易感性之间的关联。3、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组中CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与预后有关的临床特征的关联。4、RT-PCR测定ALL患者IL-1β、IL-18 mRNA的相对表达,并分析其与患者NLRP3炎性小体相关基因SNPs之间的关系。5、ELISA测定ALL患者血清中IL-1β、IL-18的含量,并分析其与NLRP3炎性小体相关基因SNPs的关系。研究结果1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关:检测ALL患者组和对照组NLRP3相关成分的单核苷酸多态性,我们发现CARD8（rs2043211）在显性模式下的AT/TT基因型和共显性模型下的TT基因型与ALL易感性明显相关。此外,NF-κB-94ins/del ATTG中D等位基因的频率和显性模式下的DD基因型均与ALL易感性显着相关。我们采用单因素逻辑回归分析法分析NF-κB和CARD8,研究发现NF-κB单核苷酸的多态性表现为保护作用,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型却极大的增加了 ALL的易感性。2、表达NF-KB-94ins/del ATTG DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关:根据《NCCN急性淋巴细胞白血病指南》,一些临床检查指标可以给临床提供预后信息。我们的研究分析了这些预后指标与NLRP3炎性小体相关基因的四个SNP之间的关联,旨在弄清NLRP3遗传多态性与ALL预后之间的相关性。依据指南,WBC计数超过30×109/L被认为是不良的预后指标,而我们研究发现表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有更低的WBC计数。ALL的免疫表型主要分为T细胞免疫表型和B细胞免疫表型,T细胞免疫表型也是一个预后不良因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关性更强。因此,我们认为NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型显示为保护因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与预后不良相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG,IL-18（rs1946518）和 IL-1β（rs16944）与 ALL 患者的临床特征相关性分析:对于NF-κB-94ins/del ATTG在隐性模式下的WW/WD基因型相比,DD基因型与较低的血红蛋白含量相关。共显性模型中的DD基因型及D等位基因发生脾肿大概率更高。IL-18（rs1946518）在隐性模式下TT基因型与脾肿大和血清中的高AST浓度具有统计学相关性。另外,在共显性模型中的TT基因型和T等位基因与较高水平空腹血糖有关。而IL-1β（rs16944）中的多态性与肌酐浓度有关。在隐性模式中,TT基因型比GG/GT基因型和高肌酐浓度更为相关。关于等位基因的频率方面,G等位基因也与高肌酐浓度显着相关。4、NLRP3炎性小体单核苷酸多态性与其相关基因表达的关系:关于CARD8（rs2043211）的AT基因型会表达较高NLRP3和ASC。TT基因型比AA和AT基因型会有更高的caspase-1 mRNA表达量。关于IL-1β（rs16944）多态性,相较于GG和TT基因型,GT基因型与IL-18表达量密切相关。并且相较于TT基因型,GT基因型会有更高的ASC表达量并分泌更多的IL-1β。与GG基因型相比,IL-18（rs1946518）多态性的TT基因型也与IL-1β和IL-18浓度相关。然而,IL-18多态性的GT基因型与NLRP3和ASC的较高水平有关。研究结论1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关。2、表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG与较低的血红蛋白含量以及脾肿大相关;表达IL-18（rs 1946518）基因型的ALL患者更易出现脾肿大及高的AST浓度和高的空腹血糖;而IL-1β（rs16944）基因型的ALL患者更易出现高肌酐浓度。4、CARD8（rs2043211）的 AT 和 TT 基因型、IL-1β（rs16944）的 GT 和 TT 基因型和IL-18（rs1946518）的TT基因型与NLRP3相关基因的mRNA高表达和分泌的细胞因子有关。
冯悦[2]（2019）在《UM171类似物体外扩增脐血造血干/祖细胞的效果评价及机制研究》文中研究指明目的:造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）是有自我更新潜力,并能够在人的一生中持续多向分化以形成多谱系血液细胞的一种成体干细胞。临床上主要是用造血干细胞移植（Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）治疗多种血液系统疾病如造血系统恶性肿瘤,遗传缺陷和自身免疫性疾病和某些实体瘤。然而,人白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）配型困难是限制骨髓或动员外周血HSCT临床应用的最大障碍。脐血来源的HSCs免疫原性低,可降低移植物抗宿主病（Graft versus host disease,GVHD）的发生率,且细胞增殖潜力强,收集方便,具有更广阔的临床应用前景。但是,由于单份脐血细胞量过少,限制了其临床应用,因此可体外扩增脐血HSCs的药物成为研究热点。造血干细胞激动剂UM171是现阶段扩增脐血HSCs最优的小分子化合物。方法:首先,我们使用免疫磁珠法富集脐血中的CD34+细胞,构建含细胞因子组合的体外培养体系,以及以流式细胞术为主要检测手段的药物筛选体系。在此基础上,对合成的37种UM171小分子化合物进行了初筛、复筛,根据它们对脐血CD34+CD38-细胞的扩增效果和生物活性（EC50值）,挑选出最优化合物,并确定佳扩增浓度。之后,使用流式细胞术对扩增效果进行了验证,使用Metho Cult?H4434半固体培养基对培养后的细胞造血功能进行评价。接着,为探索化合物11扩增效果的机制,我们检测了培养后各亚型细胞的凋亡（Annexin-V凋亡检测）,周期（Ki67/7-AAD胞内染色周期检测）和细胞增殖分裂（CFSE）情况,并使用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RTq PCR）检测了HSCs自我更新相关基因的表达情况。结论:根据初筛结果,我们选出了6个潜力化合物,择其二进行了复筛,根据它们对脐血CD34+CD38-细胞的扩增效果和生物活性（EC50值）,得到化合物11为最优化合物,并确定了其佳扩增浓度为165n M,最佳浓度时的扩增效果显着优于多种HSCs扩增药物（遗憾的是,化合物11的效果未能企及UM171）,扩增后的细胞保持完整的造血集落形成能力。机制研究发现,化合物11对细胞凋亡无显着影响,对长期HSCs（Long termHematopoietic stem cells,LT-HSCs）和造血干祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cell,HSPCs）细胞周期进程也无显着改变。细胞分裂实验发现化合物11会减缓HSPCs的分裂,且化合物11可以保持更高的BMI1基因表达,这对HSCs的自我更新式分裂具有重要意义。总的来说,化合物11生物活性高,扩增效果佳,培养后的细胞保持着完整的多谱系分化潜力。机制研究发现,化合物11可能是通过减缓HSPCs分裂速度,避免耗竭,并促进干细胞自我更新式分裂,从而实现扩增效果。意义:本研究合成了37种新小分子化合物,并对其扩增脐血HSCs的效果进行了检验、筛选,发现了一种具有很好扩增效果的新型小分子化合物11。有望从这一新小分子化合物结构中探寻UM171结构活性关系,为寻找更高效的HSCs扩增剂奠定基础。
马轶轩,王璐,米瑞华,王献伟,吕晓东,范瑞华,魏旭东[3]（2017）在《慢性髓性白血病患者CD34+细胞BCR-ABL融合基因的检测意义》文中认为慢性髓性白血病（CML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病[1]。其特征性标志是Ph染色体及BCR-ABL融合基因。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）作为CML患者靶向治疗药物,极大程度提高了CML患者的临床疗效,现已成为CML临床一线治疗药物[2]。但是,长期服用TKI仍存在血液学和非血液学不良反应、TKI耐药以及经济负担重等问题。因此,如何安全停药以及安全停药的标准成为目前
程玉萍[4]（2015）在《急性髓系白血病干细胞新靶点3A4抗原的生物学特性研究》文中指出目的研究认为白血病患者体内存在一群极微量的细胞群,这些细胞通常对化疗药物不敏感,能够逃逸化学药物的杀伤作用；同时具有一定的自我更新能力使其可以在体内维持白血病的生成,从而成为白血病复发和耐药的根源。这群白血病细胞被称为白血病干细胞（Leukemia stem cells, LSCs）。只有有效清除LSCs,才能从根本上治愈白血病。发现并研究LSCs上特异性表达的分子抗原,对LSCs的生物学特性研究以及白血病治疗都具有重要意义。前期实验初步表明,本实验室自行研制的3A4单克隆抗体对急性髓系白血病干细胞（CD34+CD38-CD123+）具有较强的识别能力。在此基础上,我们对3A4单抗靶向的3A4抗原的生物学特性进行全面和深入的分析,探讨3A4抗原作为AML LSCs靶点的可能性,为白血病靶向治疗提供新的途径。本课题进行了如下四个部分内容的研究：（1）3A4抗原表达规律的分析；（2）3A4抗原表位的研究；（3）3A4抗原相关干细胞特性的研究；（4）3A4-高三尖杉酯碱抗体偶联物的制备及其靶向杀伤活性检测。方法13A4抗原表达规律的分析1.13A4及相关抗原在白血病干细胞及各亚群细胞上的表达：（1）流式细胞术检测3A4抗原、3A4的相关同型抗原（CD45RA、CD45和CD45RO）以及干／祖细胞相关抗原（CD33、CD44、CD123、CD133、CD19和HLA-DR）在儿童白血病患者骨髓LSCs、正常造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSCs）及各亚群细胞上的表达情况。其中ALL37例（31例B-ALL,6例T-ALL）, AML54例（4例M0-M1,14例M2,5例M3,29例M4-M5,2例M6）,CML6例。11例特发性血小板减少性紫癜（Idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP）患者作为对照。（2）流式细胞术检测3A4抗原及上述抗原在10例AML和10例B-ALL复发白血病患者骨髓白血病细胞上的表达。（3）细胞定义：LSCs和HSCs以CD34+CD38-Lin-细胞群定义,各亚群细胞分别指CD34-、CD34+CD38+、 CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-细胞。1.23A4抗原在多器官正常组织和肿瘤组织的分布情况：通过组织微阵列技术结合免疫组化法检测3A4抗原在99例多器官正常组织和96例多器官肿瘤组织上的表达。23A4抗原表位的研究2.1CD45RC各截短型真核表达载体的构建及表达：根据CD45基因6号外显子基因序列（CD45RC）构建4个不同的截短型真核表达载体,分别命名为pcDNA3.1+/CD45RC-1（包含6号外显子前99bp）、pcDNA3.1+/CD45RC-2（包含6号外显子后99bp）、pcDNA3.1+/CD45RC-3（包含6号外显子前48bp）和pcDNA3.1+/CD45RC-4（包含6号外显子后48bp）；将空载体pcDNA3.1+、未截短型pcDNA3.1+/CD45RC以及构建成功的上述4个截短型真核表达载体分别经转染级抽提试剂盒抽提质粒后,经LipofectamineTM2000试剂盒采用脂质体转染法将上述质粒DNA转染CHO细胞；通过RT-PCR检测转染后CHO细胞目的基因的表达；采用流式细胞术和Western blot检测转染后CHO细胞膜上的CD45RC各截短体蛋白的表达情况。2.2表位肽扫描法测定3A4抗原表位：根据CD45基因6号外显子编码的氨基酸序列采用固相合成法合成一条多肽片段（序列为DVPGERSTAS TFPTDPVSPL TTTLSLAHHS SAALPARTSN TTITANTSD）;采用质谱法（Mass spectrometry, MS）及高效液相色谱法（High performance liquid chromatography, HPLC）检测合成的多肽抗原的正确性及纯度；根据间接酶联免疫吸附分析法（Indirect enzyme linked immunosorbent assay, iELISA）分析该抗原多肽与3A4抗体的结合能力。33A4抗原相关干细胞特性研究3.1体外实验测定3A4抗原相关干细胞特性：间接免疫磁珠法分选3A4阳性和3A4阴性Kasumi细胞和HL60细胞；BrdU渗入法标记3A4阳性和3A4阴性白血病细胞的增殖状态；CCK-8法和Annexin V-PI染色法检测化疗药物作用下3A4阳性和3A4阴性白血病细胞的增殖状态和抗凋亡能力。3.2体内实验测定3A4抗原相关干细胞特性：通过3A4抗体封闭白血病细胞株（KGla细胞和Nalm-6细胞）和人骨髓单个核细胞表面的3A4抗原,观察经过3A4抗体封闭和未封闭的两群细胞在NOD/SCID小鼠体内成瘤能力的差异；通过间接免疫磁珠法分选3A4阳性和3A4阴性的AML患者骨髓单个核白血病细胞,比较这两群细胞在NOD/SCID小鼠异体移植成瘤能力的差异。43A4-HHT抗体偶联药物的制备及靶向杀伤活性检测：4.13A4-HHT抗体偶联药物的制备：异型双功能交联剂（SPDP和SMCC）修饰3A4抗体的半胱氨酸（Cysteine, Cys）富含的巯基（-SH）或赖氨酸（Lysine, Lys）残基富含的氨基（-NH2）；硫脲法将高三尖杉酯碱（Homoharringtonine, HHT）的末端羟基（-OH）巯基化；修饰后的3A4抗体与巯基化HHT4℃过夜结合反应：BCA测定3A4-HHT偶联药物蛋白浓度；流式细胞仪测定3A4-HHT偶联药物的活性。4.23A4-HHT抗体偶联药物靶向杀伤活性检测：采用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测不同浓度（0、1、2、4、8、16、32μg/ml）3A4-HHT抗体偶联药物在不同作用时间（24h、48h和72h）下对KG1a细胞和Nalm-6细胞的靶向杀伤活性。结果13A4抗原表达规律的分析1.13A4及相关抗原在白血病干细胞及各亚群细胞上的表达：（1）3A4抗原在AML LSCs上的表达水平明显高于HSCs,中位表达水平分别为94.8%vS.21.8%,P<0.0001；且3A4抗原在54例AML患者的LSCs上均为阳性表达。（2）3A4抗原在AML和B-ALL复发白血病患者的白血病细胞上具有较强的表达,中位表达水平分别为（90.94±4.9）%和（81.74±9.1）%。（3）3A4抗原在各亚型AML LSCs上的表达水平分别为（92.3±3.3）%[M0-1]、（95.1±1.5）%[M2]、（46.4±13.8）%[M3]、（85.2±4.3）%[M4-5]和（61.2士28.9）%[M6],以MO-1和M2型白血病上的抗原表达水平最高。（4）3A4抗原在正常CD34+CD38+细胞上较其他细胞亚群（CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-）相对高表达,而在AML CD34+CD38+、CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-各细胞群上的表达无明显差异。（5）3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表达选择性明显高于CD33、CD123、CD133、CD44和HLA-DR抗原。1.23A4抗原在多器官正常组织和肿瘤组织器官的分布情况：（1）3A4抗原主要在脾脏、扁桃体和胸腺等淋巴组织器官上表达,在甲状旁腺、小肠、结肠、胃等组织上主要限制表达于淋巴组织处,在重要器官组织（如脑、心、肝、肺、肾、生殖器官）上基本不表达。（2）3A4抗原主要在肠、脾、甲状腺、淋巴结等淋巴组织处发生的B细胞性淋巴瘤、B细胞性细胞瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤上高表达,在T细胞性淋巴瘤上基本不表达。23A4抗原表位的研究2.1CD45RC各截短型真核表达载体的构建及表达：（1）真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RC-1、pcDNA3.1+/CD45RC-2、pcDNA3.1+/CD45RC-3和pcDNA3.1+/CD45RC-4经摇菌扩增提取质粒DNA后,酶切及测序结果显示构建的载体分别包含相应的目的基因片段,表明CD45RC的4个截短型真核表达载体构建成功。（2）RT-PCR结果显示转染后的各截短型CD45RC CHO细胞中存在CD45基因表达,表明各转染的CHO细胞在转录水平上成功表达CD45基因,转染后细胞分别命名为CD45RC-1CHO、CD45RC-2CHO、CD45RC-3CHO和CD45RC-4CHOO（3）流式细胞术结果发现,4个截短型CD45RC CHO细胞均可检测到3A4抗原的表达,表达水平分别为（36.7+6.9）%、（35.2+13.3）%、（43±7.9）%和（41.4+14.2）%,各组间均无明显统计学差异（P值均>0.05）。而Western blot法在CD45RC-1CHO、CD45RC-2CHO、CD45RC-3CHO和CD45RC-4CHO细胞上未能检测到3A4抗体识别的抗原。2.2表位肽扫描法测定3A4抗原表位：MS结果显示合成的多肽抗原分子量为4996.5,与理论分子量4996.35相近,从分子量水平上提示多肽合成正确；HPLC检测结果显示,合成的多肽抗原纯度为70%左右,符合下一步实验要求；iELISA结果显示,3A4抗体不能识别CD45基因6号外显子编码的氨基酸线性序列,提示3A4抗原表位可能为构象型表位。33A4抗原相关干细胞特性研究3.1体外实验测定3A4抗原相关干细胞特性：3A4阳性Kasumi细胞和HL60细胞的增殖能力分别低于相应3A4阴性Kasumi细胞和HL60细胞的增殖能力,BrdU的表达水平分别为（4.6±1.9）%vs.I（35.1+1）%,（P<0.05）和（44.9士1.3）%vs.（74.4±2）%,（P<0.05）; IC50和IC70作用浓度下的THP和Ara-C对3A4阳性Kasumi细胞和HL60细胞的抑制率均低于相应3A4阴性细胞（P值均<0.05）,而IC50和IC70浓度下的HHT对这两群细胞的抑制率均无明显差异（P值均>0.05）；在THP和Ara-C作用下,3A4阳性Kasumi细胞和HL60细胞的抗凋亡能力均高于相应的3A4阴性白血病细胞,而在HHT作用下两者的抗凋亡能力无明显差异。3.2体内实验测定3A4抗原相关干细胞特性：经尾静脉注射5×106个Nalm-6细胞后,3A4抗体孵育组小鼠和鼠IgG抗体孵育组小鼠在植入15天以后,均开始出现行动迟缓,消瘦、后肢瘫痪或弓背等情况,流式和病理结果显示小鼠体内存在白血病细胞浸润,中位发病时间分别为18和22天。经尾静脉注射5×106个KGla细胞后,鼠IgG抗体孵育组小鼠均生成白血病,成瘤率为100%（3/3）,中位发病时间为58天；3A4抗体孵育组小鼠生存状态良好。43A4-HHT抗体偶联药物的制备及靶向杀伤活性检测：BCA测定3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT偶联物的蛋白浓度分别为0.2mg/ml和0.3mg/ml;流式结果显示3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT对KGla细胞的识别能力与裸抗3A4无明显差异,分别为98.89%和94.68%；CCK-8结果显示,在不同观察时间和药物浓度作用下,3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT对Nalm-6细胞的抑制率均明显低于KGla细胞（P值均<0.05）,说明3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT对靶细胞KGla具有良好的选择性杀伤作用。其中,3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT随着作用浓度增加,对细胞的抑制作用亦逐渐增强,但不呈时间依赖性。结论1.3A4抗原选择性地高表达于AML LSCs,以M0-1和M2类型白血病最为明显,而在正常HSCs上弱表达。3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表达选择性明显高于CD33、CD123、CD133和CD44等抗原分子。此外在复发AML患者的骨髓白血病幼稚细胞上同样具有较强的表达水平。2.3A4抗原主要在淋巴相关组织器官及淋巴细胞上表达,在重要器官组织（如脑、心、肝、肺、肾和生殖器官等）上基本不表达。3.3A4抗原表位主要为CD45基因6号外显子编码的蛋白区域,可能是构象型表位。4.3A4抗原阳性的HL60细胞和Kasumi细胞较相应的3A4阴性细胞耐药及抗凋亡能力更强,一定程度上反映了3A4阳性白血病干细胞的特性。5.3A4抗体可以有效抑带KG1a细胞在NOD/SCID小鼠体内成瘤。6.成功制备3A4-SMCC-HHT和3A4-SPDP-HHT抗体偶联物,体外显示良好的靶向杀伤效应。
崔雪艳[5]（2012）在《低氧微环境对造血干细胞特性及白血病细胞多药耐药性的影响》文中提出背景和目的成人骨髓不仅是正常造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）赖以生存的微环境,也是白血病微小残留病变（minimal residual disease, MRD）潜伏的天然庇护所和复发的根源。研究表明,骨髓内微环境是一个低灌注、低氧分压的环境,在这个高度特异的微环境中氧浓度仅为1-6%。成人造血干细胞定居在骨髓中的干细胞龛（stem cell niche）中,龛内的氧浓度非常低,但造血细胞的耗氧量却很高,因此,HSCs处于一个严重缺氧的环境中,低氧可能直接参与了对HSCs自我更新和多向分化潜能的调控。造血干细胞已经被广泛应用于恶性血液病、部分实体恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗,但目前的HSCs培养和扩增大多数是在环境氧浓度（21%O2）状态下进行的,HSCs暴露在高氧浓度中,反应性氧自由基会堆积在线粒体内导致细胞的氧化损伤,对细胞的扩增潜能产生不利影响,从而无法高效地对HSC进行体外扩增,这在一定程度上限制了HSC的临床应用。白血病（leukemia）是来源于造血干祖细胞的恶性克隆性血液系统疾病,目前联合化疗仍是白血病的基本治疗方法。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是成人急性白血病中最常见的类型,在AML患者中联合化疗后的完全缓解（complete remission,CR）率仅有50-80%,而白血病细胞的多药耐药（multidrug resistance, MDR）是导致治疗失败的最主要原因。耐受化疗的白血病细胞往往在治疗后潜伏下来,在骨髓中形成微小残留病变,成为白血病复发和多药耐药的根源。骨髓中低氧的微环境可能为这些恶性细胞提供一个天然的庇护所。本研究旨在探讨低氧培养对造血干祖细胞的自我更新及增殖分化的影响,为体外高效培养和扩增干细胞提供实验室依据；同时探讨了低氧条件对于白血病细胞多药耐药性的的影响,及在低氧状态下这些恶性干细胞性的变化,了解二者之间的联系,从而为白血病多药耐药的研究提供一个新思路。材料和方法采集人外周血单个核细胞,采用免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,将等量细胞分为低氧组和正常氧组,分别在1%氧浓度和正常氧浓度（21%）下培养7天后,检测细胞扩增总数,流式细胞仪检测细胞表型CD34、CD45和CD61及测定各亚群数量；实时荧光定量PCR （Taqman）检测低氧诱导因子1α （HIF-1α） mRNA的表达；并将细胞接种至甲基纤维素半固体培养基,观察BFU-E、 CFU-GM和CFU-GEMM细胞集落的形成情况。采用逐步提高培养液中阿霉素浓度的方法长期诱导建立K562耐药株（K562/DOX）,并检测该耐药株对其他化疗药物的耐药性。将K562/DOX细胞和野生株（K562/WT）分别在1%氧浓度和正常氧浓度（21%）下进行培养后,MTT法检测两种细胞株在不同氧浓度下耐药性的变化,观察两株细胞在不同氧状态下的生长曲线,Western blot检测缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α,以及干细胞性标志物Oct4和CD133的表达,流式细胞仪检测ABC家族转运蛋白ABCG2和干细胞表型CD34。此外,Western blot检测Smad2蛋白的磷酸化水平；并使用不同浓度的TGF-β受体I激酶抑制剂SD-208抑制TGF-β/Smad细胞信号传导通路,Western blot方法观察K562/DOX细胞中Oct4和CD133蛋白表达在信号通路被抑制前后的变化。结果1.人外周血CD34+细胞分别经过1%和21%氧浓度培养7天,低氧组的细胞总数为（9.2±3.37）×106,正常氧组的细胞总数为（12.1±5.4）×106,两组比较差异显着（t=2.749,P<0.05）。低氧组的CD34+细胞所占的比例为（3.0±2.71）%,正常氧组CD34+细胞所占的比例为（0.9±1.95）%,两组比较差异显着（t=4.805,P<0.05）：并且低氧组的CD34+细胞总数为（0.374±0.3）×106,正常氧组的CD34+细胞总数为（0.1±0.23）×106,两组相比也有显着性差异（t=3.513, P<0.05）。CD45+和CD61+细胞比例、数量在二组比较均无显着差异（P>0.05）。2.低氧组细胞的HIF-la mRNA表达比正常氧组增高（39±18）%,两组比较差异显着（t=6.280,P<0.05）。3.干／祖细胞集落形成实验结果显示低氧组的细胞集落总数为43.5±22.9/103细胞,正常氧组的细胞集落总数为30.5±27.9/103细胞,两组比较无显着统计学差异（P>0.05）；低氧组爆式红系集落BFU-E的数量为17.5±11.2/103细胞,而正常氧组BFU-E的数量为6.5±16.1/103细胞,两组相比差异显着（t=2.327,P<0.05）；对于由较早期祖细胞形成的粒系、单核系、红系和巨核系的混合集落CFU-GEMM,低氧组的集落生成数量为1±1.6/103细胞,正常氧组的集落生成数量为0±0.7/103细胞,两组比较差异显着（t=2.764,P<0.05）；而CFU-GM集落计数显示低氧组和正常组之间无明显统计学差异（P>0.05）。4.采用逐步提高阿霉素浓度的方法诱导建立的K562多药耐药细胞（K562/DOX）中,检测阿霉素的IC50值为（78.53±15.25）μM,而野生株（K562/WT）细胞中阿霉素的IC50值为（1.24±0.24）μM,两株细胞比较差异显着（t=9.852,P<.001）; K562/DOX细胞中长春新碱的IC50值为（1.636±0.232）μM,而K562/WT细胞中则为（0.0214±0.001）μM,两株细胞比较差异显着（t=12.037, P<0.001）; K562/DOX细胞中阿糖胞苷的IC50值为（109.94±16.85）μM,而K562/WT细胞中则为（63.02±4.68）μM,两株细胞比较差异显着（t=4.648,P<0.01）。并且流式结果显示在K562/DOX细胞中ABC转运蛋白ABCG2的表达阳性率为（6.2±1.7）%,而K562/WT细胞中则为（2.6±1.8）%,两株细胞比较差异显着（t=3.195,P<0.05）。5.低氧组的K562/WT细胞中阿霉素IC50值为（3.32±0.26）μM,而正常氧组的K562/WT细胞中阿霉素的IC50值为（1.24±0.24）μM,两组比较差异显着（t=10.211,P<0.05）；对于K562/DOX细胞,低氧组的阿霉素IC50值为（88.98±15.42）μM,而正常氧组为（78.53±15.25）μM,两组比较无显着差异（P>0.05）。同样,低氧组的K562/WT细胞中ABCG2蛋白阳性率为（15.9±4.8）%,而正常氧组为（2.6±1.8）%,两组比较差异显着（t=4.766,P<0.05）；对于K562/DOX细胞,低氧组ABCG2蛋白阳性率为（20.6±2.3）%,正常氧组为（6.2±1.7）%,两组比较差异显着（t=8.804,P<0.05）。6.细胞生长曲线显示低氧明显抑制了K562/WT细胞的生长（td5＝3.286,P<0.01; td6=2.512,P<0.05; td7=12.84,P<0.001）;但K562/DOX细胞在低氧状态下的生长与正常氧浓度相比无明显变化（P>0.05）。这与HIF2a蛋白的结果一致：在K562/WT细胞中,低氧上调HIF2a蛋白的表达,与正常氧组比较有显着性差异（t=2.717,P<0.05）；而低氧组K562/DOX细胞的HIF2α表达并没有出现明显上调,与正常氧组相比无显着性差异（P>0.05）。7.流式结果显示K562/DOX细胞CD34表型的阳性率为（1.6±0.6）%,K562/WT细胞为（0.4±0.1）%,两组比较差异显着（t=3.816,P<0.05）。在K562/DOX细胞中,低氧将CD34蛋白表达从（1.6±0.6）%显着性上调至（12.4±1.9）%（t=9.265,P<0.05）；在K562/WT细胞中,则从（0.4±0.1）%显着性上调至（9.1±2.4）%（t=6.368,P<0.05）；因此低氧组中K562/WT细胞CD34表型的上调较K562/DOX细胞中的上调程度明显,两种细胞株比较差异显着（t=3.084,P<0.05）。此外,低氧组中K562/WT细胞的Oct4和CD133蛋白表达较正常氧组明显升高,两组比较差异显着（tOct4=3.229,tCD133=2.569, P<0.05）;而对于K562/DOX细胞,低氧组Oct4和CD133蛋白的表达与正常氧组比较无显着统计学差异（P>0.05）。因此,K562/WT细胞中低氧上调Oct4和CD133的作用比在K562/DOX细胞中的作用明显增强,两组细胞相比差异显着（tOct4=2.876, tcD133=3.617,P<0.05）。8. K562/DOX细胞中Smad2的磷酸化水平与K562/WT细胞株相比明显增高,两组差异显着（t=5.364,P<0.05）。并且低氧组中Smad2磷酸化水平在两种细胞株中均显着性增加,组间比较差异显着（F=5.132,P<0.05）。9.在K562/DOX细胞中抑制TGF-β受体I激酶的活性从而阻断TGF-β/Smad传导通路后,低氧状态下Oct4和CD133蛋白的表达出现了显着性的下调（FOct4=8.103, FCD133=17.43,P<0.05）,并且其下调程度呈剂量依赖性。结论1.低氧状态能够维持和增强造血干祖细胞的自我更新能力,推测造血干祖细胞在低氧的微环境可能更倾向于保持静止不分化的状态,而较高的氧分压不利于干细胞性的维持,可能会使干祖细胞更趋向于分化。2.低氧状态也促进了造血干细胞向红系祖细胞方向的分化。3.低氧微环境对于造血干／祖细胞的自我更新和增殖分化起着十分重要的调控作用,这种调控作用有可能是通过HIF-1α的激活来实现的。4.造血干细胞的培养可以通过减低氧浓度和调控转录因子HIF-1α的方法来提高体外扩增的效能。5.低氧微环境带来的的选择压力能够促进白血病细胞干细胞性的表达,从而有助于细胞多药耐药性的产生和进展。6. TGF-β/Smad信号传导通路的活化可能参与了低氧对于白血病细胞的干细胞性和多药耐药性的调节。7.针对白血病干细胞表型的免疫治疗和对TGF-β/Smad信号传导通路的抑制可能成为逆转细胞多药耐药的新靶点。
陈静园[6]（2012）在《Notch信号途径对小鼠骨髓EPC和EOC的调控》文中指出EPC是成熟血管内皮细胞的前体细胞，属干细胞群体，和HSC来自同一祖先细胞。在胚胎，EPC参与胚胎发育的血管发生，出生后，与HSC共同存在于骨髓干细胞龛中，也存在于外周血、脐血中，具有缺血区定向归巢并分化为成熟内皮细胞、促进受损内皮修复、血管新生等重要作用，不仅可应用于对于缺血性疾病的治疗，对肿瘤的防治也有重要价值。EPC最早是从外周血中分离CD34+细胞得到的，其表面标志被认定为CD34CD133KDR，但是随着进一步的研究发现EPCs是一组异质性的细胞群，它是由众多处于不同分化阶段的细胞组成，它的表面标记随时间改变而变化。研究显示，虽然不同的培养方法和细胞来源使EPC的表面标志不完全一致，但是目前体外培养的EPC有两类，一类是梭型、增殖潜力有限、培养不超过8周的early EPC（EEPC），另一类是鹅卵石样的、具有高增殖潜能、可以持续传代培养的外向型生长内皮细胞late EPC （EOC）。研究显示，EEPC和EOC都具有一定的血管形成和组织修复作用，但EEPC和EOC在血管的形成和受损组织修复的过程中具体发挥什么作用，与哪些信号通路和调控机制有关目前尚不清楚。Notch信号途径从胚胎发育到成年个体的多个系统中发挥重要作用，对不同组织中的细胞命运起着决定性作用。以往的研究提示Notch信号途径对EPC的定植、迁移和归巢有重要作用，我们前期的实验也表明，小鼠肝脏部分切除后，EPC可以迁移至受损的肝脏组织参与肝组织的再生，但对EOC的影响未见报道。为了进一步分析Notch信号途径对内皮干/祖细胞的调控机制，我们研究Notch信号途径对不同分化阶段的EPC的调控作用，由于转录因子RBP-J是Notch受体下游的关键效应分子，可以介导四种Notch受体在核内的转录激活作用，因此是整个Notch信号途径调控的汇集点。我们通过建立RBP-J条件性剔除小鼠，拟表达了Notch在多种组织中的缺失，研究结果显示Notch信号途径在维持血管平衡和组织修复方面有重要的作用。主要研究成果如下：1．通过体外贴壁扩增培养，从小鼠骨髓细胞中成功培养出EEPC和EOC，表达CD34+/CD133+/VEGFR2+的EEPC数目从最初的0.08%能够增长至50%以上；2．我们发现，在三维管腔形成实验中，EEPC不能形成管腔样结构，而EOC能够形成管腔样结构并且受到Notch-RBP-J信号通路的调控；阻断Notch-RBP-J信号通路后，EEPC的增殖，迁移，CXCR4的表达均呈下降趋势而EOC的增殖、迁移以及CXCR4的表达呈上升趋势。提示Notch信号通路对EEPC和EOC的调控不相同；3．通过RBP-J条件性基因剔除小鼠模型，我们进一步观察到，小鼠肝大部切除术后（PHx），通过Notch信号通路的调控EEPC可以迅速募集到受损肝脏，促进肝脏血管的重建、肝细胞的增殖以及肝功能的恢复，而EOC并没有有效促进肝脏的再生和肝细胞的增殖，提示Notch-RBP-J信号通路在EEPC和EOC参与的肝再生进程中的调控作用不同，并且发现EEPC和EOC在肝再生过程中发挥着不同的作用。综上所述，我们通过RBP-J剔除小鼠，观察了Notch-RBP-J信号对于EEPC和EOC参与的肝再生进程的调控作用。我们的结果表明， Notch信号参与调控EEPC和EOC对肝细胞的再生，肝脏的修复，以及肝功能的恢复，并且EEPC和EOC的增殖、分化和迁移受到Notch-RBP-J信号途径的调控；EEPC和EOC在肝再生进程中发挥着不同的作用。这些研究为进一步了解内皮干/祖细胞的功能，深入分析Notch对内皮干/祖细胞的调控机制奠定了基础，
王颖超[7]（2012）在《急性单核细胞白血病THP-1细胞系白血病干细胞的分选、鉴定及靶向治疗的初步研究》文中研究表明白血病（leukemia）是以骨髓和/或外周血中幼稚细胞增多为特征的血液系统恶性克隆性疾病,白血病干细胞（leukemia stem cell, LSCs）在白血病发生、发展、耐药和复发等方面起重要作用。只有靶向消灭白血病干细胞,才能彻底治愈白血病。因此,识别和清除白血病患者体内的白血病干细胞,对了解白血病成因及治疗具有重要意义。流式细胞仪细胞技术具有精确度高,速度快等特点,是研究白血病细胞中干细胞分选、LSCs生物学特性的强有力工具。THP-1细胞株是从一个急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）男性患儿的周围血培育出的,为儿童AML的实验和临床前期研究提供了很好的模板。阿糖胞苷（Ara-C）是白血病临床治疗常用药物,主要通过抑制细胞DNA的合成,干扰S增殖期细胞的增殖,而对处于静止期（GO期）的LSCs无效。所以,迫切需要新的治疗策略,以提高白血病的不良预后。本课题旨在探讨急性单核细胞白血病THP-1细胞系中LSCs比例及生物学特性,并建立人THP-1白血病小鼠模型,探讨THP-1LSCs与非LSCs致瘤能力的差别,研究CD47在白血病中的表达特点,为LSCs清除寻找靶点。同时探讨抗CD47单克隆抗体单独或联合阿糖胞苷作用时的抗白血病效应,以寻找白血病靶向治疗新策略。第一部分急性单核细胞白血病细胞系THP-1白血病干细胞的检测、分选及鉴定目的：探讨人急性单核细胞白血病THP-1细胞株中是否存在白血病干细胞（LSCs）,并观察该LSCs细胞亚群与非LSCs细胞亚群在细胞周期、生长增殖情况、耐药性及耐药蛋白、凋亡基因表达差异,从而进一步鉴定LSCs细胞,了解其生物学活性及特性。方法：应用流式细胞术（FCM）测定THP-1细胞株中干细胞在对数生长期THP-1细胞中的比例,然后分选THP-1白血病干细胞,FCM分析该LSCs亚群与非LSCs亚群细胞周期。细胞生长曲线法和集落培养法比较LSCs亚群与非LSCs亚群细胞的增殖能力和集落形成能力。MTT法检测两亚群细胞对阿糖胞苷（Ara-C）敏感性。实时荧光定量PCR检测ABCG2, ABCB1耐药基因和Bcl-2、Bax凋亡基因在两亚群细胞中表达差异。结果：1.在白血病THP-1细胞株中存在免疫表型为CD34+CD38-的LSCs,比例为0.12±0.06%；收集分选后LSCs管细胞再次上流式细胞仪进行LSCs细胞纯度检测示：细胞集中于之前的LSCs区域,比例高达97.0±1.7%。2.收集分选后的THP-1LSCs和非LSCs,流式细胞仪检测两群细胞各样本的细胞周期,可见在分选后的LSCs亚群中大部分的细胞处于静止期,G0/G1期比例达94.03±1.61%,明显高于非LSCs比例,差异有统计学意义；非LSCs亚群增殖期细胞比例相对较高,分别为S/G2/M期细胞比例为56.58±1.59%。3.LSCs和非LSCs细胞的生长曲线不同。在接种后的第1和2天,二者无明显差异,从第3天起LSCs细胞大量增加,快速增殖至指数生长期；非LSCs细胞生长、增殖缓慢,在第5天进到平台期。LSCs和非LSCs生长速度差异显着（P<0.05）。分选后的THP-1细胞及未分选的THP-1细胞进行集落培养96小时后显微镜下观察发现LSCs细胞集落形成率明显大于非LSCs组（P<0.05）,且每个集落细胞数量高于非LSCs组。4.在12-48小时各时间点,阿糖胞苷作用于THP-1LSCs细胞的IC5o均高于非LSCs细胞,24小时对THP-1LSCs细胞的及非LSCs的IC5o分别为216uM和149uM,48小时对THP-1LSCs的IC50值为198uM,非LSCs的IC50值为138uM（P=0.042）。5.实时荧光定量PCR结果显示：LSCs和非LSCs细胞亚群表达ABCG2的水平分别是9.01+1.12和0.65+0.04（P<0.05）,表达ABCB1的水平同样高于非LSCs亚群（P<0.05）；LSCs亚群中,Bcl-2表达值为0.99±0.08,非LSCs亚群表达值为0.29±0.13,二者差异有统计学意义（P<0.05）；LSCs亚群中,Bax表达值为0.68+0.05,非LSCs亚群Bax表达值为0.85±0.09,统计学比较后,差异没有统计学意义（P>0.05）,但是Bcl-2/Bax比值显着高于非LSCs细胞亚群（P<0.05）。结论：在人急性单核细胞白血病THP-1细胞株中确实存在LSCs细胞,这群LSCs细胞比例少,其和主群细胞相比在集落形成能力、生长增殖能力和耐药蛋白、凋亡基因表达上有异质性,大部分处于静止期,可能与肿瘤的耐药和复发有关。第二部分NOD/SCID小鼠THP-1细胞系急性单核细胞白血病模型的建立目的：研究CD47在不同细胞亚群中的表达,为寻找儿童急性髓细胞白血病治疗的靶点提供实验基础；通过将分选的人急性单核细胞白血病THP-1干细胞移植到NOD/SCID小鼠,探讨其致瘤能力。方法：应用流式分选技术分选THP-1LSCs,并用阿糖胞苷富集THP-1中的LSCs,流式细胞仪检测CD47在不同亚群THP-1细胞中的表达,计算检测到的CD47+比例。NOD/SCID小鼠分别经尾静脉接种不同亚群及剂量的THP-1细胞，比较不同实验组小鼠的生存时间、组织病理改变及通过流式细胞术检测CD33、CD45在模型鼠外周血、骨髓及肝、肺组织中的表达,比较不同细胞数量和种类接种小鼠的成瘤率及生存率。结果：1.CD47在THP-1细胞不同亚群中的表达有差异,在未分选的THP-1细胞的表达最低,随着与阿糖胞苷作用时间增长,LSCs比例增高,CD47表达升高,在分选的THP-1LSCs中表达最高,差异有统计学意义（P<0.05）。2.1×103数量的THP-1LSCs可在4周后形成典型的NOD/SCID小鼠白血病浸润模型,未分选的THP-1细胞至少需要1×106才能成瘤,1×103数量的THP-1LSCs与抗CD47单克隆抗体共移植组仅有1只检测到白血病细胞,成瘤率低于THP-1LSCs移植组。各组间白血病发病率差异有统计学意义（P<0.05）。3.THP-1干细胞NOD/SCID小鼠腹腔可见实体肿瘤块,取瘤块做病理,可见大量白血病细胞。接种后3周外周血可见白血病细胞,骨髓形态学检测见大量原始和幼稚细胞,流式细胞仪检测有CD33、CD45表达。结论：1.静脉或腹腔接种小剂量THP-1LSCs细胞于NOD/SCID小鼠能建成全身播散的白血病模型,该模型较好地反映白血病干细胞在体内有较强的致瘤能力,是进行新药疗效试验、生物导向治疗及基因治疗的理想工具。2.CD47在分选的THP-1LSCs中表达较高,可作为清除白血病干细胞的重要靶点。第三部分抗人CD47单克隆抗体靶向治疗NOD/SCID小鼠急性单核细胞白血病的实验研究目的：通过研究CD47在人急性单核细胞白血病THP-1细胞移植白血病小鼠中的表达,探讨CD47在急性髓细胞白血病的预后意义；研究小鼠抗人CD47单克隆抗体在体内和体外对人THP-1LSCs的清除作用,探讨急性髓细胞白血病靶向治疗的最佳策略。方法：流式细胞仪检测CD47在正常和THP-1NOD/SCID白血病小鼠中的表达,观察CD47对NOD/SCID白血病小鼠预后的影响。将分选的THP-1LSCs细胞与人外周血巨噬细胞或小鼠巨噬细胞在终浓度为7μg/ml鼠抗人CD47单克隆抗体和鼠抗人CD45单克隆抗体的培养液中共培养2h,倒置荧光显微镜观察巨噬细胞的吞噬指数。应用单独阿糖胞苷、单独鼠抗人CD47单克隆抗体或阿糖胞苷联合鼠抗人CD47单克隆抗体治疗NOD/SCID白血病小鼠,流式细胞仪检测白血病小鼠外周血及骨髓CD33、CD45细胞,进行疗效分析。结果：1.CD47在正常NOD/SCID小鼠外周血单个核细胞表达值为14.1±2.14%,在骨髓单个核细胞中表达值为30.7±3.09%,在BULK THP-1中表达值为56.3±3.49%,在THP-1LSCs表达值为73.8±5.34%,几组间差异有统计学意义（P<0.05）。2. CD47high组小鼠肝、肺、脾、腹水、睾丸、椎旁肌肉、淋巴结和面颊肌肉等脏器及组织均能发现白血病细胞的浸润,CD47low组则浸润不明显。CD47high组总生存时间明显长于CD47low组,二者差异具有统计学意义（P<0.05）。3.在体外实验中,小鼠抗人CD47单克隆抗体可明显增加巨噬细胞对LSCs的吞噬能力,吞噬指数明显高于鼠抗人CD45单克隆抗体组,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.在白血病小鼠体内,阿糖胞苷联合抗CD47单克隆抗体可有效靶向杀灭白血病细胞,而骨髓抑制与单独用阿糖胞苷无区别。K-M生存分析发现,阿糖胞苷联合抗CD47单克隆抗体生存时间明显长于其它各组。结论：1.CD47高表达是急性髓细胞白血病一项独立的不良预后因素。2.阿糖胞苷联合抗CD47单克隆抗体可有效靶向杀灭白血病细胞,对清除白血病干细胞、彻底治愈急性髓细胞白血病具有重要的方法学意义。
徐曼[8]（2011）在《人脐带不同组织来源间充质干细胞的分离培养及其免疫调控能力和支持造血的实验研究》文中研究指明间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,广泛存在于全身多种组织中。大量研究证明,MSC具有低免疫原性、多向分化潜能、调节免疫以及分离培养操作简便等特点。MSC的临床研究已经在许多国家开展,作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤等多种难治性疾病,如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等;作为免疫调节和造血支持细胞,用于治疗免疫排斥和自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病等。MSC最早在骨髓中发现,但骨髓中含量极少,且骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能,并且随着年龄的增长其细胞数量和扩增分化能力亦显着降低。近年来,国内外大量研究证明脐带作为胎儿发育的一部分,含有大量的多能干细胞,细胞生长扩增速度快,且脐带属于胚胎外组织,在胎儿娩出后成为“废弃物”,取材方便,来源丰富,无伦理学问题,因此,被看作是骨髓间充质干细胞的主要替代品,具有巨大的临床应用价值。不同学者分别从整条脐带、脐带的基质、脐静脉内皮中分离获得MSC,还有为数不少的学者从胎盘羊膜中分离获得MSC。考虑到脐带组织构成简单,包括表皮（羊膜上皮细胞）、基质（Wharton’s jelly）及血管,既无毛细血管也无淋巴管,但其超微结构、免疫组化和活体功能研究显示,羊膜下、血管间和血管周围区域在细胞数量和特性上均有显着差异,为此,我们拟将这三种组织分开,从中分别分离、培养、扩增MSC,并研究其生物学特性、免疫调控能力及造血支持作用,为临床应用提供重要依据。首先,我们通过机械分离及胶原酶消化法分别从人脐带的羊膜（Amnion）、基质（Wharton’s jelly）及血管（Vessel）中获得组织细胞,通过反复贴壁纯化获得AM-MSC、WJ-MSC、VS-MSC;从整条脐带（Umbilical cord）中获得UC-MSC;通过密度梯度离心法从骨髓（Bone marrow）中分离得到单个核细胞,同样通过反复贴壁纯化获得BM-MSC。然后,从细胞形态、细胞生长曲线、细胞周期、多向分化潜能特性及细胞免疫表型五个方面进行比较和鉴定。结果表明,五组MSC具有相似的生物学特征:1)细胞培养至第3代细胞形态相对均一,为典型的成纤维样,呈平行或漩涡状排列;2)细胞具有强大的体外扩增能力;3)均有80%以上的细胞处于G0/G1,提示脐带不同来源的MSC同BM-MSC一样均具有典型的干细胞增殖特点,即只有少数细胞处于活跃的增殖期;但BM-MSC的培养需添加低浓度的细胞生长因子bFGF,且培养至5代后扩增能力逐渐减低,而脐带来源的MSC仅在低营养条件下即能大量扩增,传代至第14代,细胞生物学特性无明显改变;4)对其诱导多向分化,结果表明,细胞可向成骨、成脂肪和成软骨方向分化,但与BM-MSC相比脐带来源的MSC成骨能力略低,脐带来源的MSC各组间无差异;5)流式细胞仪检测细胞免疫表型,结果表明,脐带不同组织来源的MSC同BM-MSC类似,均表达间充质干细胞特异性抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、HLA-ABC及多能干细胞标志物TRA-1-60,低表达或不表达造血及内皮细胞表面标志即CD14、CD31、CD34、CD45,以及移植免疫排斥相关的表面标志HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L;各组细胞表型进行比较,CD166表达有显着差异,CD31、CD106、HLA-DR的表达具有高度的显着差异。其次,通过淋巴母细胞转化实验及混合淋巴细胞反应检测其免疫调控能力。结果表明,对于有丝分裂原及异体抗原诱导的T淋巴细胞的增殖各组MSC均有抑制作用,且这种抑制作用具有剂量依赖性,随MSC的细胞数量逐渐增加,其抑制效应逐渐增强;实时定量PCR和RT-PCR方法检测与免疫相关的细胞因子IL-10、IL-11和TGF-β1的表达亦无显着差别,但UC-MSC组分泌的IL-6与WJ-MSC、VS-MSC、AM-MSC、BM-MSC组相比差异极其显着（P=0.0000）,WJ-MSC与AM-MSC相比也有明显差别（p=0.008）。最后,探讨脐带不同组织来源的MSC的造血支持作用。以脐带不同组织来源的MSC为饲养层,与脐带血造血干/祖细胞在无血清培养体系下共培养7天,检测有核细胞、CD34+细胞和造血集落的扩增效率。结果显示,MSC可以在体外有效支持造血干/祖细胞的扩增,与对照组相比差异高度显着;且UC-MSC组的有核细胞、CD34+细胞及CFU-C的扩增效率均显着高于WJ-MSC、VS-MSC和AM-MSC组,多能干细胞集落CFU-Mix的扩增效率未见显着差异;后三者之间进行比较,WJ-MSC组和VS-MSC组对红系祖细胞及粒、单核系祖细胞的扩增效率高于AM-MSC组,且经实时定量PCR和RT-PCR方法检测MSC分泌的造血生长因子的mRNA相对表达量,其差异也支持了这一结论,其中IL-3、IL-11、HGF、TPO、EPO、VEGF、M-CSF和G-CSF的表达水平无显着差异,而UC-MSC组IL-6、SCF、FLT3、LIF的表达量显着高于其它各组。上述结果提示,脐带不同组织来源的MSC的生物学特性及免疫调控作用与骨髓来源的MSC无明显差异,但在支持造血的功能有所不同,随着对MSC研究的不断深入,其应用的范围将更为广泛。而作为种子细胞,不同组织来源的MSC的功能亦有不同,值得我们进一步深入探讨和研究。
张静[9]（2010）在《bFGF、SCF诱导人脐血CD34+、CD133+细胞基因表达变化的研究》文中研究表明研究背景与目的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白,具有较为广泛的生物学活性,可诱导多种细胞的增殖与分化,在血管生长、创伤愈合、组织再生和修复、神经再生等方面均有重要作用。bFGF已较广泛的用于神经损伤再生的研究,并从基础研究走向临床应用。文献显示,bFGF可体外诱导人脐血单个核细胞向多种神经细胞的分化,将该细胞给神经损伤动物模型移植,有明显神经修复作用。由于bFGF具备生物活性的.多效性和神经营养的广谱性,且基因重组的人类bFGF也已问世,bFGF显露出光明的临床应用前景。但迄今为止,bFGF诱导脐血单个核细胞分化的机制尚不清楚,为探讨bFGF对不同分化阶段造血干/祖细胞分化的影响、促进bFGF诱导脐血单个核细胞的临床应用,本研究利用基因芯片技术,分析bFGF、SCF体外诱导脐血CD34+和CD133+细胞分化的基因表达变化,为探讨bFGF诱导脐血CD34+和CD133+细胞分化机制提供理论支持和实验数据,为相关细胞生物学临床应用打下基础。方法利用MiniMACS免疫磁珠法从脐静脉血单个核细胞中分离出CD34+和CD133+细胞,流式细胞仪检测CD34+和CD133+细胞分选纯度；经含有干细胞因子（SCF）、bFGF、B27的DMEM/F12细胞营养液培养10-15d,显微镜下观察bFGF诱导前后CD34+细胞和CD133+细胞形态变化；提取培养前后细胞总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA的浓度和纯度,利用Oligo GEArray（?）芯片和GEArray表达分析软件进行芯片数据分析。结果（1）分选CD34+细胞和CD133+细胞纯度：对20份脐血分别进行CD34+细胞和CD133+细胞分选,CD34+细胞纯度为（77.52±5.06）%,回收率为（2.74±1.59）%；CD133+细胞纯度为（79.16±3.37）%,回收率为（1.12±0.94）%。再次过柱分选后CD34+和CD133+细胞纯度均可达90%以上,台盼兰染色活细胞比率达95%以上。（2）培养前后CD34+细胞、CD133+细胞形态：新分选的CD34+细胞、CD133+细胞均呈球形,经bFGF、SCF联合培养15天后,细胞明显扩增,计数扩增2-3倍。多数细胞形态变化不明显,部分细胞呈现出不规则形,部分细胞贴壁生长。（3）培养前后CD34+细胞基因变化：对细胞因子诱导前后的CD34+细胞进行了263个干细胞相关基因的检测,发现培养后有10个基因表达上调,20个基因表达下调；在细胞分化标志中,造血细胞系标志CD19、CD3D表达下调,间叶细胞系标志PPARG、SPP1表达上调,神经细胞系标志S100B表达上调,说明CD34+细胞在bFGF诱导下向间叶细胞和神经细胞分化的趋势增强。（4）培养前后CD133+细胞基因变化：对细胞因子诱导前后CD133+细胞进行了263个干细胞相关基因的检测,CD133+细胞在培养后有21个基因表达显着上调,7个基因表达显着下调；这些基因主要涉及干细胞特异性标志、细胞周期、干细胞分化标志、以及与干细胞相关的信号转导、细胞因子及其受体等。培养后,血细胞系标志CD3D、CD247表达降低,CD4表达增加,间叶细胞系标志PPARG、SPP1表达增加,神经细胞系标志S100B表达增加。说明CD133+细胞在bFGF诱导下向间叶细胞和神经细胞分化的趋势增强。（5）在所检测的263个干细胞相关基因中,脐血CD133+细胞与CD34+细胞基因表达差异2倍以上的基因仅有10种；bFGF诱导培养后,CD133+细胞有32种基因表达显着高于CD34+细胞,在检测的263个基因中,未见低于CD34+细胞的基因。结论在检测的263个干细胞相关基因中,脐血CD133+细胞和CD34+细胞基因表达仅有少数基因存在差异；CD133+细胞对bFGF的反应性显着强于CD34+细胞,表现为细胞周期调节、信号转导和分化等基因表达增强；CD34+细胞和CD133+细胞经bFGF、SCF诱导后向间叶细胞和神经细胞分化趋势增强。
汪家敏[10]（2009）在《抗人CD133-2单克隆抗体的研制及CD133-2分子在肿瘤细胞中的表达及其临床意义》文中研究指明CD133（prominin-1）是一种局限性分布于胞浆膜的突出处,如上皮微绒毛、附睾导管上皮的硬纤毛处的糖蛋白,因此根据拉丁文prominere,取名为prominin.1997年,Yin等首次报道了一个新的造血干/祖细胞（HSPC）表面抗原AC133并制备了该抗原的单克隆抗体,2000年6月由国际白细胞分化抗原工作组会议（ILDAW）命名为CD133。CD133分子在蛋白结构上不同于4次跨膜（4-TM）和7次跨膜（7-TM）受体家族成员,它是5次跨膜（5-TM）受体家族中的第一个成员,分子量约为120kDa,其分子转录由5个不同的启动子控制。CD133分子具有胞外的氨基末端和胞内的羧基末端,以及胞外的8个一样的N-糖基化位点。CD133的分子结构和蛋白表达的特点提示它可能是作为生长因子受体发挥生物学作用。此外,有12个不同氨基酸序列的prominin-1剪接体相继在啮齿类和灵长类被发现。CD133分子在干/祖细胞表达并随细胞分化快速下调,该特点使之成为内皮、脑、骨髓、肝脏、肾脏、前列腺、胰腺和包皮等组织检测和分离干/祖细胞的标记分子。此外,除了在正常组织表达外,在白血病细胞、脑胶质瘤、结肠癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中也能检测到CD133分子的表达。已有的研究结果表明CD133+肿瘤细胞具有很强的自我更新、增殖能力强和多向分化的潜能,提示CD133是研究肿瘤干细胞的重要靶分子之一。同时还有研究显示CD133分子可能在肿瘤免疫逃逸、药物耐受以及放疗抵抗中发挥了重要作用。人CD133有2种亚型,继Yin克隆并鉴定了CD133-1后Yu等克隆出CD133-2,并发现与CD133-1仅在胎脑和骨骼肌中呈优势表达特性不同,CD133-2在许多胎儿组织和成熟组织中呈优势性表达,并在一些肺癌、前列腺癌、结肠癌和乳腺癌细胞株中也有表达。两种异构体的表达谱不同,它们的功能是否有差异目前尚不清楚。虽然,自CD133分子发现后的10多年来一直为广大科研工作者所关注,但研究CD133分子的手段尚缺乏,特别是与其相互作用的分子尚未克隆,CD133的生物学功能及参与的信号通路至今尚不清楚。目前使用的商品化抗CD133抗体（293C3,AC133,AC141,Miltenyi Biotec）在运用中存在一定的局限性（主要针对该分子的糖基化位点,故糖基化水平的变化影响直接影响了CD133检测到的表达水平）。因此,研制抗人CD133功能性单克隆抗体将有助于揭示CD133的生物学功能,研究该分子在肿瘤发生、发展中作用机制,也为肿瘤干细胞的研究提供了一种新的手段。本论文旨在通过克隆人CD133-2全长基因构建稳定表达CD133-2的L929转基因细胞,研制鼠抗人CD133-2单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步研究;同时初步探讨CD133-2分子在肺癌中的表达及其临床意义。第一部分人CD133-2基因转染细胞株的构建以及生物学功能的初步研究【目的】克隆人CD133-2基因编码区全长基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-CD133-2,获得稳定表达CD133-2基因的转基因细胞并初步研究其对T细胞的体外生物学作用。【方法】通过重叠PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出CD133-2的全长编码区cDNA,并克隆入pMDT-18载体中,双酶切后装入真核表达载体p IRES2-EGFP中,通过脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选出稳定表达CD133-2分子的L929细胞株;采用RT-PCR、Western-blot和流式细胞仪等分析鉴定CD133-2分子的表达;采用MTT、流式细胞术和ELISA等初步观察CD133-2基因转染细胞对T细胞体外生物学功能的影响。【结果】成功克隆出CD133-2全长编码区基因,构建了含人CD133-2基因的重组真核表达载体,并获得能稳定高表达人CD133-2分子的L929转基因细胞,初步功能学研究结果提示,CD133-2转基因细胞可能具有体外抑制T细胞增殖的作用。【结论】成功建立了可稳定高表达人CD133-2膜型分子的基因转染细胞,为研制抗人CD133-2单克隆抗体提供了有效的免疫原,也为进一步研究CD133-2分子生物学功能提供了有价值的工具。第二部分鼠抗人CD133-2单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究【目的】研制鼠抗人CD133-2单克隆抗体,分析人CD133-2分子在肿瘤细胞上的表达,并对其生物学特性进行初步探讨。观察单克隆抗体对CD133-2表达的肿瘤细胞系U937和SW480的体外生物学作用,为抗体用于肿瘤干细胞研究提供必备的物质手段和实验依据。【方法】以高表达人CD133-2分子的基因转染细胞L929/CD133-2为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,以CD133-2的基因转染细胞和表达CD133-2的视网膜母细胞瘤细胞株WERI-Rb1和Y79为抗原筛选阳性细胞,L929/mock细胞为抗原阴性筛选细胞;经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,获得2株特异分泌鼠抗人CD133-2分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑制以及Western blot等试验,对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定;用间接免疫荧光法初步分析单抗对不同来源人肿瘤细胞株的结合反应;免疫组织化学方法分析胚胎组织和胎盘组织中CD133-2分子的表达;观察CD133单克隆抗体对髓性白血病细胞株U937和结肠癌细胞株SW480的体外生物学效应,包括:苔盼蓝活细胞计数、CCK8、集落形成实验分析U937细胞的增值;PI染色和流式细胞术分析细胞周期分布。【结果】成功获得2株持续、稳定分泌鼠抗人CD133-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B3和9G4。经过快速定性试纸分析显示,2株单抗轻链均为κ链,重链均为IgG2b亚类;Western blot结果显示6B3和9G4均能和CD133-2/L929和WERI-Rb1细胞的蛋白结合,特异性识别和结合约120kDa的蛋白;免疫组织化学试验显示6B3能特异性结合6周胚胎的大脑皮层组织、肝脏组织和肾脏组织。在胎盘组织的绒毛上皮细胞中亦有表达。竞争结合抑制实验显示2株抗体间不产生竞争作用。对mAb生物学特性的研究结果表明,2株mAb均能识别U937、THP-1、SW480、WERI-Rb1和Y79等肿瘤细胞株表面的CD133-2分子。活细胞计数和CCK-8检测显示,单抗6B3可以促进细胞株U937和SW480的体外增殖,并呈一定的剂量依赖性效应。此外,单抗6B3能增加U937细胞集落的形成,使U937细胞S期增加。单抗9G4没有类似的作用。【结论】成功获得2株稳定分泌特异性鼠抗人CD133-2单抗的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体与商品化抗人CD133-2单抗识别不同的抗原表位。免疫荧光标记和流式细胞分析显示,CD133-2分子在一些肿瘤细胞株表达。免疫组化分析表明CD133-2分子在胚胎组织和胎盘组织中有表达。单抗6B3可以促进CD133-2表达的U937和SW480细胞株在体外的增殖。由此表明,CD133-2分子不仅仅是细胞膜表面的一种标记分子,它具有其特定的生物学功能。单抗6B3是一株激发型的抗人CD133-2的功能性抗体,该抗体的获得为探讨CD133-2分子的表达谱及CD133-2的生物学功能提供了有价值的研究工具。第三部分CD133-2在肺癌中的表达及其临床意义【目的】研究非小细胞肺癌（NSCLC）组织中CD133-2分子的表达及其临床意义。【方法】通过免疫组织化学技术分析NSCLC组织103例、癌旁组织25例和肺部良性病变组织24例中CD133-2的表达,并结合临床资料,采用病例对照设计统计分析CD133-2的表达与非小细胞肺癌患者临床特征之间的关系。【结果】免疫组织化学结果显示,NSCLC组织中CD133-2分子的表达与肿瘤细胞分化程度有关（P＜0.01）,与抑制性免疫调节分子B7-H4的表达存在一定相关性（P＜0.01）。COX风险分析显示:单因素和多因素分析都显示CD133-2是非小细胞肺癌患者长期生存率的独立风险因素（危险系数4.202,P＜0.001）。【结论】本研究发现人非小细胞肺癌组织中有CD133-2的表达,并与肺癌细胞分化程度相关。此外,我们还发现肺癌组织中CD133-2的表达与抑制性协同刺激分子B7-H4的表达呈正相关。该研究为揭示CD133-2在肺癌发生、发展中的作用提供了新的线索。综上所述,本课题通过克隆人CD133-2全长基因,构建基因转染细胞株L929/CD133-2;以L929/CD133-2为免疫原免疫小鼠研制获得2株特异性鼠抗人CD133-2单克隆抗体6B3和9G4;进一步对单抗的生物学特性进行研究证实单抗6B3为激发型单抗,能在体外促进CD133-2表达的细胞株U937和SW480的增殖。同时,通过免疫组织化学检测了非小细胞肺癌组织中CD133-2分子的表达,并通过统计学分析了CD133-2表达与负性协同刺激分子B7-H4的表达及其与临床资料的相关性,为肿瘤的免疫治疗提供了新的靶点和策略。
二、应用免疫磁珠法富集慢性髓性白血病骨髓CD_(34)~+细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用免疫磁珠法富集慢性髓性白血病骨髓CD_(34)~+细胞（论文提纲范文）
（1）骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 急性髓性白血病骨髓微环块中神经破坏与Th免疫失衡的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 交感神经递质对Th亚群及急性髄性白血病细胞作用的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NLRP3炎性小体相关基因单核苷酸多态性在急性淋巴细胞白血病中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（2）UM171类似物体外扩增脐血造血干/祖细胞的效果评价及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.造血干细胞 |
| 1.1 造血干细胞研究历史 |
| 1.2 造血干细胞的功能 |
| 1.3 造血干细胞的临床应用 |
| 2.脐血造血干细胞体外扩增培养 |
| 2.1 扩增培养的意义 |
| 2.2 研究进展 |
| 3.研究意义 |
| 第二部分 实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2.技术路线 |
| 3.实验方法 |
| 第三部分 实验结果 |
| 1.37 个小分子化合物的合成及结构 |
| 2.37 个小分子化合物初筛 |
| 3.潜力化合物复筛 |
| 4.化合物4和11 生物活性检测 |
| 5.最佳化合物11最适浓度选取及扩增效果评价 |
| 6.细胞凋亡 |
| 7.细胞周期检测 |
| 8.CFSE细胞增殖检测 |
| 9.相关基因表达分析 |
| 第四部分 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新 |
| 3.展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）急性髓系白血病干细胞新靶点3A4抗原的生物学特性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACTS |
| 英文缩略词表 |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一部分 3A4抗原表达规律的分析 |
| 第一章 3A4及相关抗原在白血病干细胞及各亚群细胞上表达 |
| 材料和对象 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 3A4抗原在多器官正常和肿瘤组织的分布情况 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 3A4抗原表位的研究 |
| 第一章 CD45RC各截短型真核表达载体的构建及表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 表位肽扫描法测定3A4抗原表位 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 3A4抗原相关干细胞特性研究 |
| 第一章 体外实验测定3A4抗原相关干细胞特性 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 体内实验测定3A4抗原相关干细胞特性 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 3A4-HHT抗体偶联物的制备及靶向杀伤活性检测 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（5）低氧微环境对造血干细胞特性及白血病细胞多药耐药性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 低氧对体外扩增人骨髓CD34+细胞的自我更新和增殖分化的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低氧条件对K562白血病细胞干细胞特性和多药耐药性的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（6）Notch信号途径对小鼠骨髓EPC和EOC的调控（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 小鼠骨髓 EEPC 和 EOC 的培养和鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Notch-RBP-J 信号通路对 EEPC 和 EOC 的影响 |
| 1 实验材料和主要仪器： |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Notch-RBP-J信号通路对EEPC和EOC参与肝脏再生能力的影响 |
| 1 实验材料和主要仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）急性单核细胞白血病THP-1细胞系白血病干细胞的分选、鉴定及靶向治疗的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 急性单核细胞白血病细胞系THP-1白血病干细胞的检测、分选及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NOD/SCID小鼠THP-1细胞系急性单核细胞白血病模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 抗人CD47单克隆抗体靶向治疗NOD/SCID小鼠急性单核细胞白血病的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 综述：肿瘤干细胞及其靶向治疗研究进展 |
| 1. 肿瘤干细胞起源及特征 |
| 2. 白血病干细胞的研究进展 |
| 3. 白血病干细胞的靶向治疗 |
| 4. 实体瘤肿瘤干细胞的研究进展 |
| 5. 实体瘤肿瘤干细胞的靶向治疗 |
| 6. 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历、攻读学位期间发表的文章题录 |
| 致谢 |
（8）人脐带不同组织来源间充质干细胞的分离培养及其免疫调控能力和支持造血的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 脐带羊膜、Wharton’s jelly、血管及骨髓来源的间充质干细胞的分离培养及生物学特性的鉴定 |
| 实验流程 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 不同组织来源的间充质干细胞的免疫调控能力 |
| 实验流程 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 脐带不同组织来源间充质干细胞的造血支持作用 |
| 实验设计 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）bFGF、SCF诱导人脐血CD34+、CD133+细胞基因表达变化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 论文题目 bFGF、SCF诱导人脐血CD34~+、CD133~+细胞基因表达变化的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 脐血来源 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要实验仪器及设备 |
| 2.4 主要试剂的制备 |
| 2.5 干细胞基因芯片检测内容 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 脐血的收集 |
| 3.2 分离脐血单个核细胞 |
| 3.3 CD34~+/CD133~+细胞分选 |
| 3.4 bFGF和SCF对CD34~+细胞和CD133~+细胞诱导 |
| 3.5 CD34+细胞和CD133+细胞培养前后总RNA提取 |
| 3.6 RNA浓度和纯度的测定 |
| 3.6.1 使用NanoDrop~(?)ND-1000测定 |
| 3.6.2 变性琼脂糖凝胶电泳测定 |
| 3.7 cDNA合成 |
| 3.8 cRNA的合成,标记和扩增 |
| 3.9 质量控制(定量实验) |
| 3.10 芯片杂交 |
| 3.10.1 预杂交 |
| 2.10.2 杂交 |
| 3.10.3 洗膜 |
| 3.11 用化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit做化学发光检测 |
| 3.12 图像采集和数据分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 脐血CD34~+细胞和CD133~+细胞的分选纯度和收获率 |
| 4.2 SCF和bFGF诱导CD34+细胞和CD133+细胞的形态学变化 |
| 4.3 CD34~+细胞和CD133~+细胞的RNA质量 |
| 4.4 CD34~+细胞培养前后干细胞相关基因的变化 |
| 4.5 CD133~+细胞培养前后干细胞相关基因的变化 |
| 4.6 CD34~+细胞和CD133~+细胞培养前后干细胞相关基因的变化 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 脐血移植与免疫重建的研究进展 |
| 参考文献 |
| 硕士学位学习期间发表文章 |
| 致谢 |
（10）抗人CD133-2单克隆抗体的研制及CD133-2分子在肿瘤细胞中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 第一部分 人CD133-2基因的克隆、基因转染细胞株的构建以及生物学功能的初步研究 |
| 1.材料与试剂 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鼠抗人CD133-2单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 人CD133-2分子在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 缩略词表 |
| 本研究获得的基金资助 |
| 致谢 |
四、应用免疫磁珠法富集慢性髓性白血病骨髓CD_(34)~+细胞（论文参考文献）
- [1]骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究[D]. 张琛. 山东大学, 2020(08)
- [2]UM171类似物体外扩增脐血造血干/祖细胞的效果评价及机制研究[D]. 冯悦. 暨南大学, 2019(02)
- [3]慢性髓性白血病患者CD34+细胞BCR-ABL融合基因的检测意义[J]. 马轶轩,王璐,米瑞华,王献伟,吕晓东,范瑞华,魏旭东. 中华血液学杂志, 2017(02)
- [4]急性髓系白血病干细胞新靶点3A4抗原的生物学特性研究[D]. 程玉萍. 浙江大学, 2015(09)
- [5]低氧微环境对造血干细胞特性及白血病细胞多药耐药性的影响[D]. 崔雪艳. 郑州大学, 2012(10)
- [6]Notch信号途径对小鼠骨髓EPC和EOC的调控[D]. 陈静园. 第四军医大学, 2012(05)
- [7]急性单核细胞白血病THP-1细胞系白血病干细胞的分选、鉴定及靶向治疗的初步研究[D]. 王颖超. 郑州大学, 2012(05)
- [8]人脐带不同组织来源间充质干细胞的分离培养及其免疫调控能力和支持造血的实验研究[D]. 徐曼. 中国人民解放军军事医学科学院, 2011(07)
- [9]bFGF、SCF诱导人脐血CD34+、CD133+细胞基因表达变化的研究[D]. 张静. 郑州大学, 2010(06)
- [10]抗人CD133-2单克隆抗体的研制及CD133-2分子在肿瘤细胞中的表达及其临床意义[D]. 汪家敏. 苏州大学, 2009(11)
标签：白血病论文; 急性髓性白血病论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 细胞免疫论文; 诱导多能干细胞论文;