一、用生物信息学手段辅助分析猪瘟病毒的基因结构（论文文献综述）
徐慧玲[1]（2021）在《基于病毒受体阻断的广谱抗病毒策略研究及其在CSFV和PRRSV防治中的应用》文中进行了进一步梳理病毒性传染病严重威胁着公共卫生及人类与动物的健康。传统的抗病毒策略主要依赖于疫苗,例如灭活和减毒疫苗,但由于完整病毒的使用导致其生产和使用过程中存在较高的生物安全风险。此外,病毒结构蛋白免疫原性差和毒株序列高变异等原因导致某些疫苗的保护效果较差。病毒通过吸附、胞吞、脱壳、复制、装配与出芽过程完成其生命周期,而阻断病毒入侵宿主细胞被认为是最彻底有效的抗病毒策略。自20世纪70年代以来,基于病毒蛋白的结构和功能来干扰病毒与宿主受体的相互作用,继而实现安全有效的广谱抗病毒作用,逐渐成为抗病毒领域的研究热点。猪瘟（Classical swine fever,CSF）和猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）均是目前广泛流行的高度接触性传染病,对全世界的养猪业造成了重大的影响。猪瘟病毒（CSFV）的囊膜蛋白E2与病毒毒力紧密相关,是主要免疫原性蛋白,可介导CSFV入侵靶细胞,诱导机体产生高水平的中和抗体,且能从血清学上区分疫苗免疫和野毒感染动物,推动猪瘟的进一步净化。因此CSFV E2可作为病毒靶向阻断策略研究的优质模型。另一方面,可导致母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统障碍的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,由于其高变异、易重组、免疫抑制等特性,导致现有病毒靶向阻断策略对其收效甚微,严重缺乏安全有效的疫苗及广谱抗病毒药物。研究表明清道夫受体CD163是PRRSV感染宿主细胞的主要受体,因此其可作为受体靶向阻断研究的理想模型。本研究分别基于病毒靶向和受体靶向的阻断策略,寻找安全有效广谱抗病毒药物,将为猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征的防控和净化提供新的思路。本研究中,首先以CSFV E2为模型评估病毒靶向策略的功效,一方面作为主动免疫策略,确定了携带新型信号肽的猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的高效性和经济性。另一方面,开展被动免疫策略研究,基于E2ZJ的免疫优势,筛选获得3株靶向猪瘟病毒的广谱中和单抗,并评估了其体内外中和活性,抗病毒作用机制,抗原识别区域及功能。继而,为进一步提升阻断策略的通用保护作用,以CD163受体为模型评价了受体阻断策略的功效。制备了2株对PRRSV有广谱抗病毒作用的单抗,并对广谱抗病毒作用及其机制,体外的预防及治疗作用,抗原识别区域及其功能进行了进一步的评估。主要研究内容及结果如下:1.靶向病毒的主动免疫策略:新型高效猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的研制鉴于猪瘟兔化弱毒疫苗不能区分免疫和感染动物,而猪瘟E2蛋白为主要的免疫原性蛋白。我们利用杆状病毒表达系统表达了融合新型信号肽的的E2蛋白。实验表明新型信号肽可促使E2蛋白在昆虫细胞中分泌表达。截短优化信号肽后发现,与其他截短信号肽相比,23aa长度的信号肽SPZJ（SP23）可诱导E2蛋白的表达量至少增加50%,且SPZJ信号肽对不同毒株的E2蛋白也具有促分泌功能。同等剂量不同毒株E2蛋白免疫小鼠后,经IFA和ELISA鉴定表明,与其他毒株的E2蛋白相比,E2ZJ可更早刺激机体产生猪瘟特异性抗体,且可诱导产生更高水平的中和抗体,其中和抗体效价在免疫28天后达到了1:2000。在仔猪攻毒实验中,单剂量免疫28天后,E2ZJ免疫组的猪瘟抗体阻断率高达75%以上,显着高于其他类型的猪瘟E2亚单位疫苗,同时产生了针对1型和2型毒株的高水平中和抗体。经强毒株攻毒后发现,与对照组比,免疫组均无猪瘟典型的体温反应、临床症状和组织病理变化,且单剂量5μg E2ZJ可对猪体提供针对石门毒株的100%保护作用。以上结果表明基于杆状病毒表达系统的猪瘟E2ZJ亚单位疫苗在蛋白表达量和免疫原性方面均具有优势,是一种经济高效的候选猪瘟亚单位疫苗。2.靶向病毒的被动免疫策略:猪瘟广谱中和单抗及其抗病毒机制的研究基于E2ZJ蛋白的免疫原性优势,通过传统的单克隆抗体筛选方法筛选出了一批具有中和活性的CSFV单克隆抗体。经IFA、Western-blot和ELISA鉴定后发现单抗6D10、8D8和3C12可特异性识别不同基因型的猪瘟病毒,且与不同型的CSFV E2蛋白均有较强的结合活性。此外三株单抗对不同的CSFV毒株具有广谱中和作用,且表现出良好的中和活性,即6.25μg/m L、3.125μg/m L和12.5μg/m L的剂量就可完全中和100 TCID50的CSFV,其中和作用呈一定的剂量依赖性。进一步的研究表明三株单抗具备多种高效的中和机制,即可抑制病毒的吸附和内化步骤从而阻断病毒的入侵。利用单抗与截短E2蛋白和E2蛋白突变体的反应性精确定位了三株单抗的线性中和表位分别为140TAVSPTTLR148、8YRYAIS13和254HECLIG259,其中后两个表位为首次发现的新表位。序列比对后发现三个表位在不同毒株中高度保守,表明其具有鉴别诊断猪瘟病毒的潜在价值。空间结构预测和病毒捕获实验结果显示140TAVSPTTLR148、8YRYAIS13表位位于囊膜蛋白表面。携带抗原表位的重组多肽可在PK-15细胞上抑制猪瘟病毒感染,表明相应的抗原表位位于受体结合域,参与了病毒入侵受体的过程。另外,在家兔体内评估了中和抗体的对猪瘟病毒的预防性和治疗性作用,这进一步证实了中和抗体在体内中和作用的有效性。以上研究为靶向猪瘟病毒的广谱抗病毒策略提供了新的思路,加深了对猪瘟病毒入侵机制的理解。3.靶向受体的抗病毒阻断策略:基于CD163受体的PRRSV广谱抗病毒策略研究CD163受体是PRRSV入侵的关键受体,基于CD163受体的SRCR5-9结构域筛选获得两株可特异性识别重组SRCR5-9蛋白以及PAMs和Marc-145细胞上CD163受体的单抗6E8和9A10。两株单抗均能呈剂量依赖性的抑制PRRSV毒株的感染,且对流行株和疫苗株均有不同程度的抑制作用。作为预防和治疗PRRSV的候选药物,两种抗体均能在在病毒附着前后成功抑制PRRSV的感染及其相关的NF-κB通路。两株单抗作用后均可导致PAMs和Marc-145细胞中CD163的转录水平显着下降。这可能是由于抗体与CD163受体结合从而封闭了蛋白酶作用位点,导致膜相关CD163过度积累并负反馈抑制CD163转录生成。利用单抗与截短SRCR5-9蛋白和SRCR5-9蛋白突变体的反应性精确定位了单抗6E8和9A10识别的关键氨基酸,分别位于SRCR5上的570SXDVGXV576和SRCR7上的Q797残基。该关键氨基酸在不同种属的CD163中高度保守。通过在不支持PRRSV感染的3D4细胞中过表达野生型CD163和关键氨基酸突变的CD163突变体进一步验证了这些氨基酸残基在PRRSV入侵CD163受体的关键作用。此外,基于实验室前期筛选到的CD163受体的抗原表位,在细胞上初步评估了靶向CD163受体的多肽疫苗的抗病毒作用。以上研究加深了对PRRSV与CD163受体作用的理解,并为PRRSV的预防和治疗提供了新的广谱抗病毒策略。
高瞻[2]（2021）在《非洲猪瘟病毒P30和P54蛋白抗原表位的分析及应用》文中提出非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）引起的猪的一种急性、烈性、高致死性传染病。ASF于2018年8月首次在我国暴发,对我国养猪业造成沉重打击。传统的抗原表位筛选工作量大,成本费用高。随着生物信息学的发展,计算机可依据不同运算法则对基因序列进行深层次信息的筛选,因其便捷、准确而被广泛使用。本研究利用生物信息学方法,以ASFV的主要结构蛋白p30和p54为基础,预测筛选得到10个优势抗原表位,以柔性Linker串联至p ET-28a表达载体中,通过原核表达系统表达、纯化得到重组多表位抗原。电泳凝胶结果显示重组蛋白大小为24KD左右,经Western Blot显示该蛋白能够和标签抗体和ASFV阳性血清反应,将重组蛋白与佐剂乳化对小鼠进行免疫,经流式细胞术对表型CD3+、CD4+、CD8+荧光染色和CCK8增殖,结果均显着高于对照组。由于如何增强细胞免疫应答和产生高水平的中和抗体是ASFV疫苗研究的关键问题。故此本研究以树突状细胞（DC）为基础制备了ASFV多表位仿生纳米颗粒。笔者从小鼠体内分离骨髓来源的DC,荧光标记CD11C抗体对其纯度检测后,使用多表位抗原对经诱导的DC进行刺激,分离含有抗原信息的DC细胞膜将其覆盖在纳米颗粒上,纳米颗粒是用PLGA纳米材料通过分散并将能够诱导CTL应答的IL-2包裹其中所制备得到。从而获得同时具有抗原提呈和释放细胞因子双重功能的仿生纳米颗粒。粒径分析仪结果显示纳米颗粒PLGA-NP大小为170 nm左右,仿生纳米颗粒粒径为190 nm左右,经透射电镜观察该仿生纳米颗粒具有明显的核膜结构,电泳凝胶证明仿生纳米颗粒上DC膜蛋白完整,使用CD11C、CD86抗体对仿生纳米颗粒Western Blot实验鉴定分析,结果证明关键膜蛋白存在并具有反应原性。使用所纯化的多表位重组蛋白作为包被抗原,建立了ASFV的抗体检测方法,使用棋盘滴定法确定最佳反应条件,测定阴性血清样本确定CUT-OFF临界值,测定大量已知背景的血清样本建立ROC曲线分析,结果证明在临界值0.338处获得了98.72%（95%CI,93.06至99.97）的诊断敏感性和98.14%（95%CI,95.31至99.49）的诊断特异性,并且与口蹄疫、猪瘟、猪圆环病等其他猪病的阳性血清均不发生交叉反应。为了探究多表位重组蛋白中所选表位反应性,将表位合成肽段用ELISA方法进行检测,证明部分p54中的两个表位与ASFV阳性血清反应性显着高于其他组。总之,本研究通过预测筛选获得了ASFV蛋白p30、p54抗原表位,将其串联作为多表位抗原,经原核表达系统纯化得到了重组蛋白,进行了免疫学实验,并以该重组蛋白为基础,对多表位仿生纳米颗粒进行了初步研究,建立了抗体的检测方法。为ASFV疫苗和诊断的研究拓宽了思路,具有重要意义。
拜小强[3]（2021）在《牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立》文中认为牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起牛病毒性腹泻病,也是导致牛呼吸道疾病综合征（BRDC）主要病原之一。牛病毒性腹泻病临床表现复杂,以孕牛流产、胎牛木乃伊化、犊牛先天性缺陷,染疫牛只呈双向热、腹泻脱水、共济失调、免疫抑制和持续感染为主。该病在世界范围内广泛流行,目前我国20多个省、市、自治区的牛群中检测到病原,牛、羊﹑猪和鹿等偶蹄类动物也存在不同程度地感染,严重影响着畜牧业的健康发展。BVDV基因组中ORF编码结构蛋白和非结构蛋白,结构蛋白包括核心蛋白C和糖基化囊膜蛋白Erns、E1、E2,在病毒适应环境和维持自身稳定方面发挥着重要的作用。本实验利用MDBK细胞对BVDV毒株培养增殖和滴度测定,设计全序列引物对编码结构蛋白的基因进行克隆和鉴定,在此基础上应用生物信息学分析工具对基因组序列以及蛋白结构、性质和功能进行预测分析。结果显示MDBK细胞接毒培养至24h开始出现细胞病变,测定BVDV TCID50=10-5.112/0.1m L,PCR扩增出结构蛋白基因条带分别为306bp、681bp、585bp和1122bp,测序结果与NCBI数据库中BVDV-1、BVDV-2、CSFV和BDV共17株同源性比对显示,与BVDV-1 NADL株同源性最高,分别为100%、99.71%、97.78%和100%;构建系统进化树显示,与BVDV-1 NADL株进化关系密切,与同属的CSFV和BDV进化关系较为疏远。BVDV Npro和Erns蛋白较为保守且具有特征性功能,是与同科不同属病毒进行鉴别的差异化蛋白,Npro和ErnsRNase在阻断干扰素诱导和引起宿主持续感染中发挥重要的作用。本实验构建BVDV Npro和Erns重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对Npro和Erns蛋白进行表达。成功构建了p CMV-Myc-Npro和p CMV-Myc-Erns真核表达质粒,并将重组质粒瞬时转染至HEK 293细胞中,经Western blot验证后,分别在21k D和27k D处出现目的条带。BVD常用的诊断方法包括临床诊断、病原学检验、免疫学检验和分子生物学检验技术。本实验建立了BVDV RT-PCR、q RT-PCR和RT-LAMP三种核酸检测方法,并对检测方法进行优化、验证和比较。实验证实建立的三种检测方法均有良好的特异性;对不同浓度标准质粒样品检测显示,q RT-PCR方法灵敏度最高（8.134×101copies/μL）,分别是RT-LAMP和RT-PCR的10和1000倍,RT-LAMP灵敏度次之（8.134×102copies/μL）,RT-PCR灵敏度最低（8.134×104copies/μL）;对67份临床样本检测结果进行Kappa和Mc Nemar校正检验分析,得出三种方法临床检出率高、检测结果一致性较好。诊断BVDV时建议在条件有限的情况下采用RT-LAMP检测方法,实验室条件允许时进一步采用q RT-PCR检测方法复检确诊。
张赫[4]（2021）在《非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备》文中认为非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是我国近年外来新发的重大动物疫病,其发病时间短,病死率高。当前尚无有效的疫苗用于ASF的防控,严重威胁全球生猪养殖业发展。因此研发特异性强、灵敏度高、安全性好的检测方法和试剂,对病毒早期的诊断、监测具有重要意义。本研究通过对CP204L基因的生物信息学分析,构建了p ET-28a-CP204L原核表达载体及pc DNA3.1-CP204L真核表达载体。对p30蛋白进行原核表达、纯化以及单克隆抗体制备。结果表明:原核表达载体p ET-28a-CP204L成功表达了含有6×His标签的p30融合蛋白。经SDS-PAGE显示,获取到单一的目的条带,能够与His标签抗体结合。纯化后的p30蛋白免疫小鼠,抗体效价达到1:102400。制备的杂交瘤细胞经ELISA方法筛选,最终获得5株稳定分泌p30蛋白抗体的阳性细胞株,单克隆抗体亚型鉴定为Ig G1、Ig G2a型。Western Blotting结果显示,筛选的5株单克隆抗体能与p30蛋白特异性结合。IFA结果显示筛选的单抗与真核质粒pc DNA3.1-CP204L表达的p30蛋白结合、且能与ASF全病毒抗原结合,具有良好的反应原性。
窦安华[5]（2021）在《江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究》文中研究表明目的:为探讨HIV感染人群血液病毒群落组成,分析HIV感染人群血液病毒群落的特点,研究病毒载量对HIV感染人群血液病毒群落的影响,本研究对江苏某地区203份HIV感染人群的血浆样本进行了病毒宏基因组学研究,以期了解HIV感染人群的血浆病毒谱以及病毒载量对血浆病毒谱的影响。方法:1.样本采集后,通过样品组合设计、样品的核酸酶消化、病毒核酸提取、逆转录及合成双链DNA即转化为cDNA,使用文库构建试剂盒构建高通量测序文库,文库纯化及质量检测合格后进行Illumina MiSeq深度测序,最后用生物信息学方法对数据分析。2.通过生物信息学方法对获取目的病毒序列分析后,用套式引物对已知序列进行反向PCR扩增,填补gap,得到全基因组序列信息,随后对病毒全基因组结构进行研究并注释获得的信息,最后构建系统进化树。3.基于203个HIV感染患者和40个健康体检者的血浆样本对指环病毒TZ19进行PCR筛查。结果:1.基于高通量测序技术,本研究得到243824条基因序列注释为病毒,可注释到至少17个不同的病毒科（含未分类病毒）,包括12种哺乳动物类病毒（99.87%）,2种昆虫病毒（0.05%）,1种植物病毒（≤0.01%）,2种其他病毒（0.02%）及未分类病毒（0.06%）。2.检出HIV病毒载量组的病毒群落中占据主导地位的是细小病毒科,其次是黄病毒科和指环病毒科;未检出HIV病毒载量组的病毒群落中占主导地位的是黄病毒科,其次为指环病毒科和细小病毒科。3.本研究获得了一个指环病毒的全基因组序列（命名为TZ19,GenBank No.MW857571）和一支人细小病毒B19的完整编码序列。对TZ19的系统进化分析显示该指环病毒与GenBank中已有的指环病毒TTVydyzj-8180（MT783407）同源性最高（同源性为89.64%）,属于同一种病毒。基于203个HIV感染患者和40个健康体检者的血浆样本我们进行了指环病毒TZ19的PCR筛查,结果显示在203个血浆样本中有9个样本阳性,40个健康体检者中有1个阳性。结论:1.利用病毒宏基因组学方法对HIV感染人群血浆病毒群落的组成有了初步认识。2.检出HIV病毒载量组与未检出HIV病毒载量组的病毒群落构成类似,但是病毒序列数和优势病毒类型差别很大。3.从HIV感染患者血浆中发现了 1支指环病毒全基因组和1支人细小病毒B19的完整编码区序列。
李静[6]（2020）在《基于宏基因组学检测猪源病毒的方法建立与应用》文中研究表明我国养殖行业的养殖规模不断壮大,集约化水平不断提高,但养殖业的疾病情况却呈现越来越复杂的态势,多种病原混合感染,原有病原不断变异和新病原不断出现等,都严重威胁我国养殖行业的发展。目前病原的检测方法主要包括单重PCR、多重PCR、定量PCR、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和胶体金试纸条等,上述方法都是建立在已知病原核酸序列的前提下才能进行,且单次试验检测病原数量有限,缺乏应对病毒变异及发现新病原的能力,无法对当今复杂的疾病情况做出较为全面准确的诊断。为了应对当前养猪业日益复杂的疾病问题,提高病原检测能力,丰富检测内容,为复杂病例提供防治思路,本研究将宏基因组学与高通量测序技术相结合,建立了检测猪源病毒的检测方法。研究内容如下:（1）基于宏基因组学与高通量测序技术建立检测猪源病毒的方法本研究以DNA病毒（猪圆环病毒2型（Porcine circovirus virus type 2,PCV2）和猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV））,RNA病毒（猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV））的混合病毒液为阳性样本,用于检测方法的建立。提取阳性样品的DNA和RNA。DNA经多重置换反应提高核酸浓度;RNA反转录为单链c DNA后利用Klenow fragment聚合酶合成c DNA第二条链并补齐末端。多重置换反应产物与双链c DNA使用随机引物进行序列非依赖性单引物扩增。将扩增的产物进行核酸纯化并浓缩。取浓缩产物500 ng进行末端修复,添加A尾,连接接头和PCR富集,从而完成文库构建。经高通量测序和生物信息学分析得出检测结果。文库质检结果显示,构建的文库浓度为37.4 ng/μL,文库峰型单一,无杂峰,无接头和引物二聚体,提示文库质量良好,满足测序需求。经高通量测序共获得了2.90 G clean data,由碱基质量分布图可知,测序碱基正确率在99.90%以上,提示测序质量良好。经生物信息学分析,阳性样品中均检测到预先加入的PCV2、PRV、PEDV和PRRSV,其中PCV2、PRV、PEDV和PRRSV的占比分别为65%、2%、12%和13%,证明该方法成功建立。（2）猪繁殖障碍病例和猪腹泻病例的病原学调查利用该方法检测10例猪繁殖障碍病例,经高通量测序及生物信息学分析,共获得2 914 036条reads,可分为与无脊椎动物相关的杆状病毒科;与细菌相关的肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科和短尾噬菌体科;与脊椎动物相关的细小病毒科、圆环病毒科、黄病毒科和星状病毒科等10科。其中1号病例检测到的主要病毒为PRV;2号病例检测到的主要病毒为猪细小病毒2型（PPV2）、猪细小病毒3型（PPV3）、猪细小病毒6型（PPV6）、猪博卡病毒5型（PBo V5）和日本乙型脑炎病毒（JEV）;3号病例检测到的主要病毒为猪细小病毒2型、猪细小病毒6型、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）和指环病毒（TTSu V）;4号病例检测到的主要病毒为PPV2、PPV3、PPV6、PCV1和PCV2;5号病例检测到的主要病毒为JEV、经典猪瘟病毒（CSFV）、PEDV和猪PRV;6号病例检测到的主要病毒为TTSu V 1b和TTSu V1a;7号病例检测到的主要病毒为JEV;8号病例检测到的主要病毒为PCV1、PCV2、PEDV、PRV、JEV和PRRSV;9号病例检测到的主要病毒为PPV2、PPV3、PPV6、PCV1、PCV2、JEV和TTSu V;10号病例检测到的主要病毒为PBo V5和猪星状病毒2型（PAst V2）。其中,JEV检出率为50%（5/10）;PPV2、PPV6、PCV2、PCV1、TTSu V检出率均为40%（4/10）;PPV3、PRV检出率均为30%（3/10）;PBo V5、PEDV检出率均为20%（2/10）;CSFV、PRRSV、PAst V检出率均为10%（1/10）。利用该方法检测4例猪腹泻病例,经生物信息学分析,共获得1 958 451条病毒reads,其中注释到与无脊椎动物相关的病毒主要包括:杆状病毒科;与细菌相关的病毒主要包括:肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科和短尾噬菌体科;与脊椎动物相关的病毒主要包括:布尼亚病毒科、细小病毒科、圆环病毒科、冠状病毒科、指环病毒科和黄病毒科。其中1号病例检测到的主要病毒为PPV3、PPV6和TTSu V1b;2号病例检测到的主要病毒为PEDV、PPV3和PPV6;3号病例检测到的主要病毒为PCV2、PEDV、PPV2、PPV3和PPV6;4号病例检测到的主要病毒为PCV3和PEDV。其中PPV3、PPV6、PEDV检出率均为75%（3/4）;PPV3、PCV2、PCV3、JEV、TTSu V检出率均为25%（1/4）。通过序列拼接得到PCV2、PPV2、PPV3、PPV6和PAst V2全基因组序列。遗传进化分析结果显示5种病毒的核酸序列与其相应病毒的核酸序列同源性较高,且存在氨基酸位点改变。（3）猪细小病毒2、3和6基因型多重PCR方法建立与应用通过前期的研究,发现PPV不论是在猪繁殖障碍病例中还是在猪腹泻病例中均有检出,且存在多型PPV混合感染的情况。目前尚无能同时检测PPV2、PPV3和PPV6的检测方法。为快速检测3种PPV,有必要建立一种检测速度快,特异性好,敏感度高的检测方法,为进一步了解PPV在我国猪场的流行情况提供技术支持。本研究针对PPV2、PPV3和PPV6的部分NS基因,分别设计3对特异性引物,分别扩增PPV2、PPV3和PPV6部分NS基因。通过对引物终浓度、退火温度和反应循环数等条件进行优化,建立多重PCR方法。通过特异性试验和敏感性试验等检验该方法的特异性和敏感性。试验结果证明,本方法敏感性良好,对PPV2、PPV3和PPV6的标准质粒最低检测值分别为4.32×103copies/μL、9.62×103copies/μL和4.25×103copies/μL。该方法特异性良好,对PCV2、PEDV、PRRSV、PRV、JEV、副猪嗜血杆（Haemophilus parasuis,HPS）和猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）等病原的核酸均无扩增。检测25份临床样品,PPV2、PPV3和PPV6检出率分别为12.00%（3/25）、16.00%（4/25）和16.00%（4/25）,与单重PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床样品检测。进一步检测来自湖北等地40个猪场共计250份猪繁殖障碍样品,结果显示PPV2、PPV3和PPV6的检出率分别为8.40%、11.60%和9.60%,其中PPV2与PPV3、PPV6的混合感染率分别为6.80%和7.20%;PPV3和PPV6混合感染率为8.00%;3种PPV混合感染率为6.40%。3种PPV均有较高检出率,多种PPV混合感染情况普遍存在,检出率无季节性差异。本研究建立了可用于检测猪源病毒的病毒宏基因组方法和能同时检测3种PPV的多重PCR方法,丰富了本实验室的病原检测技术。
何延华[7]（2020）在《非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索》文中提出牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种重要的牛传染性疾病,其隐秘性、长时间一过性感染以及持续感染动物形成的病毒存储库使得BVD-MD在全球牛群中肆虐,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NCP（noncytopathic）BVDV感染能够引起牛免疫力下降,继发其它病原微生物感染,其主要原因是NCP BVDV感染不能很好地诱导细胞产生固有免疫应答。Ⅰ型干扰素（type I interferon,IFN-Ⅰ）通路是固有免疫的主要组成部分,在机体控制并清除病原体的过程中扮演关键角色。目前,BVDV免疫抑制及持续感染的分子机制仍然不清楚,为了进一步明确NCP BVDV的致病机理,了解病毒与宿主之间的相互作用关系,本论文对NCP BVDV抑制IFN-Ⅰ产生的分子机制进行探索性研究。目的:（1）通过转录组测序技术获得NCP BVDV感染宿主细胞的m RNA文库,以生物信息学为平台分析NCP BVDV诱导的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）富集的通路和参与的细胞过程,为理解病毒与宿主之间的相互作用奠定基础（2）构建牛IFN-β（Bo IFN-β）启动子荧光素酶报告系统分析了NCP BVDV及其非结构蛋白对干扰素表达的影响,鉴定NCP BVDV抑制宿主干扰素生成的靶标。同时,为今后研究病毒抑制Bo IFN-β的作用机理提供便利工具。（3）对NCP BVDV诱导宿主细胞上调表达的牛SIKE1（Bo SIKE1）基因进行功能研究,确定Bo SIKE1与BVDV增殖的关系,为阐明SIKE1在固有免疫应答中作用机制提供依据。方法:（1）首先,利用牛外周血单核细胞分离液分离了牛外周血单核细胞,经流式细胞仪检测单核细胞表面抗原CD14的表达水平,然后用NCP BVDV感染牛单核细胞,在感染不同时期收集样本。在Illumina Hiseq 2500测序平台测序,测序结果利用生物信息学方法分析DEGs,随后对DEGs进行GO和KEGG聚类分析,筛选IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs进行荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证。（2）其次,利用分子生物学技术克隆牛的IFN-β启动子功能元件序列,构建荧光素酶报告系统,利用荧光素酶报告基因分析方法检测NCP BVDV及其非结构蛋白对poly（I:C）诱导的IFN-β、NF-κB和IRSE的荧光素酶活性,采用蛋白免疫印迹法检测IFN-Ⅰ通路相关分子IRF7、IRF7磷酸化和RIG-I蛋白的表达情况,验证NCP BVDV及非结构蛋白对抑制宿主IFN-Ⅰ产生的影响。（3）最后,克隆及表达Bo SIKE1基因,制备相应的多克隆抗体,通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹法验证过表达和干扰Bo SIKE1对BVDV增殖的影响。采用LC-MS/MS和Co-IP等方法筛选Bo SIKE1的互作蛋白。结果:（1）NCP BVDV感染牛单核细胞后,细胞免疫荧光检测显示成功构建了NCP BVDV体外原代细胞感染模型;对转录组测序分析,在感染2 h后,筛选出DEGs 9959个,其中4968个DEGs上调;在感染24 h后,筛选出DEGs 7977个,其中4184个DEGs表达上调;进一步分析免疫应答途径相关DEGs,对感染2 h与24 h的DEGs进行比较,感染2 h与免疫反应或抗病毒活性相关的DEGs明显高于24 h;利用KEGG聚类分析筛选95个Ⅰ型干扰素信号通路相关的DEGs,利用q RT-PCR证实了筛选的干扰素信号通路、干扰素刺激基因（Interferon（IFN）-stimulated genes,ISGs）和参与固有免疫应答的基因（IRF7、DDX3X、TLR13、DDX 58、MVAS、TLR9、TRAF6、IRF1、IFIT1、STAT1、ISG20、TRIM25、Mx1、NLRX1、CYLD、SIKE1和ZAP70）的差异表达水平与转录组测序结果基本一致。（2）克隆Bo IFN-β的启动子功能元件序列,成功的构建Bo IFN-β基因启动子荧光素酶报告系统;利用抗性基因筛选获得Bo IFNβ3-Luc-MDBK细胞系,用NCP BVDV感染Bo IFNβ3-Luc–MDBK细胞发现NCP BVDV毒株感染可明显抑制poly（I:C）诱导的IFN-β3的转录活性,同时也抑制了下游抗病毒基因的表达;基因合成NCP BVDV的7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)基因并连接慢病毒载体,酶切鉴定和测序表明重组慢病毒载体构建成功,并且包装的慢病毒感染MDBK后能够表达目的基因;通过荧光素酶报告系统检测NCP BVDV及7个非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu IRSE和Bo IFN-β的荧光素酶活性,结果表明,NCP BVDV能够抑制IFN-β的转录表达,其中非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-β的转录表达有显着的抑制作用;在HEK293T细胞中过表达NS4B蛋白,可以显着抑制IRF7的表达以及磷酸化水平,对RIG-I的表达没有抑制作用。（3）克隆到Bo SIKE1基因的ORF为642 bp,同源性分析发现,Bo SIKE与羊、猪、人和鼠的氨基酸相似度分别为99%、96.1.0%、94.2%和91.1%;构建原核重组表达质粒p ET22b-Bo SIKE1,转化大肠杆菌并表达了约为25 k Da的目的条带,通过诱导条件优化Bo SIKE1融合蛋白均以包涵体形式表达,纯化Bo SIKE1蛋白并成功制备了兔多克隆抗体,抗体ELISA效价检测抗体滴度达到1:128000以上;通过过表达和干扰验证了Bo SIKE对BVDV增殖的影响,Bo SIKE1过表达后引起BVDV复制增强,干扰Bo SIKE1的表达会引起BVDV复制降低,Bo SIKE具有抑制抗病毒免疫的作用。LC-MS/MS和Co-IP数据显示Bo SIKE1与微管蛋白TUBA1D之间存在直接相互作用。推测SIKE可能介导固有免疫所需的细胞骨架重排,是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。结论:（1）成功构建NCP BVDV感染牛原代免疫细胞模型并获得不同感染时间转录组差异表达谱,筛选了95个IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs。（2）通过干扰素启动子荧光素酶报告系统检测发现,NCP BVDV非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-Ⅰ的产生具体抑制作用。（3）Bo SIKE1能够影响NCP BVDV的增殖,Bo SIKE1与TUBA1D之间存在直接相互作用,推测Bo SIKE1蛋白可能是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。
袁婧馨[8]（2020）在《几种非洲猪瘟蛋白的筛选表达及纯化》文中研究指明非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染猪科动物可以引起非洲猪瘟（African swine fever,ASF）。ASF是一种急热高度接触性传染病。病程短,发病死亡率高,家猪感染十天内病死率接近100%。我国辽宁省沈阳市于2018年8月发现首例非洲猪瘟病例。非洲猪瘟病毒在国内的蔓延对生猪养殖业、猪肉产品贸易及相关领域造成较为严重的经济冲击,但目前尚无有效商品化疫苗问世。ASFV基因编码150-200种蛋白质,其中约一半的ASFV蛋白功能尚不清楚,蛋白结构的解析对研究蛋白功能,作用结合位点,以及相关疫苗药物的开发,均有重要意义。目前大多数的ASFV蛋白的结构信息尚未可知,截至2020年5月PDB数据库显示八种ASFV蛋白（p B119L、A179L、A238L、NP419L、p A104R、p S273R、E165R、B646L）的三十余种形态被解析,其中半数以上的蛋白结构为近一年的研究结果。本课题利用荧光检测分子筛（FSEC）技术对ASFV推测具有较为关键功能的蛋白CP123L、X69R、EP152R、E199L、E66L、E183L、I329L、B475L、C84L、C217R、E248R、KR177R、MGF110-1L、B169L、O61R、EST-B在哺乳动物表达体系下进行筛选表达,发现表达水平良好的CP123L、B475L、KR177R、E199L、E248R。在优化B475L、KR177R蛋白的表达纯化后。能够获得高纯度的MBP-B475L融合蛋白、无标签KR177R蛋白和带有组氨酸标签的KR177R蛋白。对高纯度带有组氨酸标签的KR177R蛋白进行结晶筛选,获得六边形晶体。对KR177R蛋白晶体的获得,可以进一步利用X-射线衍射法进行结构解析。对非洲猪瘟病毒KR177R结构蛋白结构的解析将对相关机理功能的探究、侵染靶点的确定、相关亚疫苗的开发均有积极的作用。对B475L蛋白的表达纯化优化,及其他ASFV蛋白的筛选也为ASFV功能机制的研究提供一定的思路。
闫晓敏[9]（2020）在《基于纳米孔测序技术在动物病毒快速检测方法中的建立与评估》文中认为近年来,新发和再发传染病给我国公共卫生与畜禽养殖带来严重挑战,病原的快速筛查与诊断都依赖于实验室的分子生物学检测。纳米孔（Nanopore）测序是牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies,ONT）研发的新一代高通量测序技术。由于其便于携带、长读长和实时数据处理等特点可为疫病快速诊断与处置提供病原信息,革新了传统高通量测序技术在相关领域的应用模式。为了评估纳米孔测序技术在未知病原以及DNA和RNA病毒中的测序性能,因此本研究首次利用纳米孔技术快速确诊了内蒙古阿尔山地区突发的一起饲养野猪未知病原疫情,在接到样品150 min后实时检测出213条非洲猪瘟病毒序列,覆盖其28.1%全基因组序列。进一步纳米孔连接法测序获得1,826条ASFV序列,拼接出99%的全基因组,平均测序深度为5.02x。通过该方案实现了非洲猪瘟疫情的早期检测,在阻击病毒在野猪群体中的传播具有重要意义。为了进一步拓展纳米孔测序技术在病毒性疫病快速诊断中的应用,本研究利用纳米孔RAD004快速建库策略对一份猪圆环病毒和博卡病毒混合感染的阳性病料进行测序探索,成功检测到了17条单股线性的猪博卡病毒序列,2.4x的测序深度,覆盖了87%的基因组,准确度为92%。但是该策略不适用于单股环状DNA病毒的纳米孔测序。本研究为进一步探索纳米孔测序技术在RNA病毒中的应用,因此对单股负链的狂犬病毒末端加Poly A后进行纳米孔直接c DNA测序,12 h后获得1.03 G数据,仅8.7%的覆盖率。而后经LSK109方案测序12 h后获得3.44 G数据,其中包含577条RABV序列。进一步通过设计特异性引物对狂犬病毒L基因进行纳米孔扩增子测序获得1,558条RABV序列,测序深度可达58x,测序准确度达99.2%。随后将连接法测序得到的全部数据用于拼接后获得80.5%全基因组读长。本研究进一步通过PCS109建库策略对低起始样本量的分节段的RNA黄病毒-阿龙山病毒进行了测序研究,获得的599 M数据里包含18条ALSV序列,且涵盖了4条基因节段,经PCR建库后的序列N50仅208 bp,但是以短片段的序列为参考扩增出了1,531 bp的NS3-like基因编码区,辅助了ALSV的全基因组的研究进展。上述研究结果表明,纳米孔测序平台可以很好的应用于新发、再发病原快速鉴定与研究,验证与优化了纳米孔测序在多种DNA/RNA病毒全基因组测序方面的建库流程以及相关的生物信息分析方案,促进纳米孔测序在病毒病防控领域的应用,并为分子病毒学的研究拟提供一种便捷实时高效的基因测序方案,在人兽共患病的防控中体现出重要意义。
梅建国[10]（2019）在《猪瘟病毒新型微载体悬浮培养技术研究》文中进行了进一步梳理猪瘟是由猪瘟病毒引起的发热、急性、高度接触性传染病。该病死亡率高,不同年龄、性别和品种的猪均可发病,一年四季均可发生。目前,该病尚无十分有效的药物和治疗方法。采用品质优良的猪瘟疫苗进行预防接种,仍是当今猪瘟防控过程中行之有效的重要手段之一。于是,猪瘟疫苗质量优劣及其预防免疫效果,已成为决定猪瘟防疫成败的关键因素。从多年的免疫接种和市场应用效果来看,我国的HCLV株在安全性和有效性方面表现十分优异,已成为世界公认的猪瘟活疫苗标准毒株。一直以来,传统猪瘟疫苗以兔源组织苗（包括脾淋苗、乳兔苗）和原代细胞苗为主。其生产成本高、污染难以控制、动物需求量大、工艺过程难以监测等缺点,已成为猪瘟疫苗大规模生产中一时无法逾越的瓶颈难题。随着猪瘟ST传代细胞源活疫苗的成功开发与应用,这些技术难题便迎刃而解。由于传统转瓶细胞培养技术的长期普遍应用,疫苗批间差异大、质量稳定性差、抗原滴度低、免疫效果差、不良反应大等新的影响猪瘟疫苗质量的难题也随之而来。本课题采用自主研发的细胞培养微载体及其应用技术,结合细胞生物反应器大规模高密度悬浮培养ST细胞,制备稳定均一的CSFV抗原,从根本上解决传统工艺面临的各种难题。同时,通过反应器细胞培养技术条件优化,有效提高病毒滴度,稳定病毒生产过程,建立一套完善的猪瘟病毒抗原大规模生产技术工艺,为制造稳定高效的猪瘟疫苗奠定良好的技术基础。为此,本课题的研究内容主要包括以下五个部分:第一部分:ST细胞单层静置培养特性及CSFV转瓶培养工艺研究。通过对ST细胞株培养特性的研究,可以看出,该细胞株生长速度快,细胞状态好。细胞倍增时间（DT）为16.1 h,72 h转瓶ST细胞密度达7.6×105 cells/mL,具有较强的生长扩增能力。在细胞培养至48 h,按4%（v/v）接种量接种CSFV种子细胞毒。CSFV并不引起ST细胞产生特征性CPE。从细胞日糖耗量看,CSFV感染细胞糖耗水平略高于正常细胞。病毒收获从接毒后第5 d开始,共5收。除第1收外,各收次病毒滴度为5×105 RID/mL。结果表明,CSFV能在经人工选育的ST细胞株上正常增殖,为病毒的大规模培养准备了很好的前提条件。第二部分:微载体细胞培养性能研究与微载体选择。本研究分别从细胞上球率、贴壁时间、最大细胞生长密度等多项指标上考察了Cephodex和CephodexD两款细胞微载体的生物相容性和对ST细胞的适应性。从细胞上球阶段培养效果来看,ST细胞在CephodexD微载体上的上球时间为2 h,上球率为92.7%,细胞在载体表面能在较短时间内表现出良好的铺展性。而ST细胞在Cephodex载体上的上球时间为6 h,上球率为62.3%,且细胞在载体表面的延展性较差。从最大细胞生长密度来看,ST细胞在CephodexD上72 h细胞密度为1.9×106cells/mL,而在Cephodex上为1.3×106cells/mL,两者相差约50%。在不更换培养液的条件下,ST细胞能在CephodexD微载体上维持存活7 d以上,而在Cephodex微载体上则存活不足5 d。一系列研究表明,CephodexD微载体在生物相容性、ST细胞适应能力等方面明显优于Cephodex载体,而且更能满足CSFV大规模培养的技术工艺要求。第三部分:CSFV微载体摇瓶培养及其放大工艺研究。本研究采用摇瓶培养法进行新型微载体细胞培养技术工艺研究,主要从载体用法用量、细胞接种与微载体悬浮培养步骤方法以及糖耗测定与病毒效价测定等各个方面做了详细的条件探索。初步确定了4 g/L的微载体用量、细胞培养48 h的CSFV接种时间以及1:5的工艺放大比率。通过中间过程补料技术,可以达到1.86×106 cells/mL的最大细胞培养密度。选择ST细胞培养48 h进行病毒接种,可以使CSFV滴度达到7.5×105RID/mL,较转瓶工艺略有提升。按1:5的比率进行放大培养,既降低了种子制备的工作压力,又兼顾了操作过程的可行性,同时也保证了放大培养的终端规模。第四部分:CSFV微载体反应器悬浮培养及其放大工艺建立。本部分研究了采用细胞生物反应器和新型细胞微载体CephodexD进行ST细胞的大规模悬浮培养,并以此为基础建立了一套完善的CSFV大规模生产技术工艺。参考摇瓶培养法的技术数据,完成了微载体悬浮培养从3 L到15 L反应器级联放大工艺过程。采用胰酶二步消化法,实现了细胞与微载体的完全分离以及细胞之间的相互分散。反应器内ST细胞生长72 h,最大细胞密度可达2.93×106 cells/mL。ST细胞培养48 h后,按4%（v/v）接种CSFV种子细胞毒。从接毒后第4 d开始收毒,之后每3 d收获一次,共5收。病毒滴度为1×106 RID/mL,是转瓶工艺的2倍。整个收毒过程维持16 d,较转瓶工艺缩短5 d。研究表明,猪瘟病毒的新型微载体反应器悬浮培养技术较传统转瓶培养工艺,不仅大大提高了生产效率,而且很好地提高了病毒抗原的质量水平。这也为今后高质量猪瘟ST传代细胞源活疫苗的工业化生产奠定了良好的技术基础。第五部分:免疫原性及免疫效果评价。本部分将新型微载体反应器工艺生产的CSFV接种试验猪,14 d后采血。ELISA试验测出试验猪血清中含有较高水平的CSFV抗体。采用IFA法,研究了反应器培养的CSFV的抗原特异性。在荧光显微镜下,可见感染CSFV的ST细胞胞浆内有明显的颗粒状或弥散性荧光,且荧光反应主要集中于细胞浆中,而未感染的ST细胞则无荧光。这些研究表明,反应器培养的CSFV具有良好的免疫原性和反应原性。同时,将新工艺制备的CSFV接种试验组猪和对照组猪各5只。14 d后,进行CSFV强毒攻毒试验。观察16 d,免疫猪无明显的临床症状,也无明显的发热反应,保护率达100%。对照组猪临床症状明显,有发热反应,全部死亡。结果表明,新型微载体悬浮培养技术制备的CSFV抗原具有良好的免疫保护效果。
二、用生物信息学手段辅助分析猪瘟病毒的基因结构（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用生物信息学手段辅助分析猪瘟病毒的基因结构（论文提纲范文）
（1）基于病毒受体阻断的广谱抗病毒策略研究及其在CSFV和PRRSV防治中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 阻断病毒与宿主受体作用的广谱抗病毒策略 |
| 1.1 靶向病毒的广谱抗病毒阻断策略 |
| 1.2 靶向受体的广谱抗病毒阻断策略 |
| 2 猪瘟病毒及猪瘟研究进展 |
| 2.1 猪瘟病毒的研究进展 |
| 2.2 猪瘟的研究进展 |
| 3 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其相关受体研究进展 |
| 3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的概述 |
| 3.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控 |
| 3.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒的相关受体 |
| 3.4 CD163 受体及其功能 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 靶向病毒的主动免疫策略:新型高效猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 载体和菌株 |
| 1.3 抗体与试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪瘟E2ZJ蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.2 重组杆粒的构建 |
| 2.3 重组E2ZJ蛋白的表达及纯化 |
| 2.4 分泌型信号肽的优化 |
| 2.5 分泌型信号肽的通用性 |
| 2.6 序列比对分析 |
| 2.7 抗原制备 |
| 2.8 不同基因型猪瘟E2 蛋白的免疫原性比较 |
| 2.9 猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的最小免疫剂量的确定 |
| 2.10 猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的免疫原性评价 |
| 2.11 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组SP-E2ZJ蛋白的表达及鉴定 |
| 3.2 猪瘟重组E2ZJ蛋白表达条件的优化 |
| 3.3 新型信号肽的截短优化 |
| 3.4 新型信号肽的通用性 |
| 3.5 不同基因型猪瘟E2 蛋白的免疫原性的比较 |
| 3.6 猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的仔猪攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 第二章 靶向病毒的被动免疫策略:猪瘟广谱中和单抗及其抗病毒机制的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 载体与菌株 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 单克隆杂交瘤细胞株的制备和筛选 |
| 2.2 单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 2.3 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 2.4 单克隆抗体的纯化 |
| 2.5 单克隆抗体中和效价的评估 |
| 2.6 细胞吸附内化实验 |
| 2.7 单克隆抗体识别抗原表位的鉴定 |
| 2.8 抗原表位多肽的封闭试验 |
| 2.9 与CSFV E2 多肽互作的宿主蛋白的筛选 |
| 2.10 抗原表位的空间分布 |
| 2.11 抗原表位的保守性分析 |
| 2.12 中和单抗的兔体保护实验 |
| 2.13 荧光定量PCR方法测定病毒基因组拷贝数 |
| 3 结果 |
| 3.1 E2ZJ蛋白免疫后小鼠的抗体水平 |
| 3.2 猪瘟E2 单克隆抗体的制备及反应性鉴定 |
| 3.3 单抗6D10、8D8和3C12 的亚型鉴定和纯化 |
| 3.4 单抗6D10、8D8和3C12 的广谱中和活性 |
| 3.5 单抗6D10、8D8和3C12 的中和作用机制 |
| 3.6 单抗6D10、8D8和3C12 抗原表位的鉴定 |
| 3.7 抗原表位多肽的抗病毒作用 |
| 3.8 单抗6D10、8D8和3C12 抗原表位的生物信息学分析 |
| 3.9 中和单抗在兔体内的预防和治疗作用 |
| 3.10 与CSFV E2 多肽互作的宿主蛋白的筛选 |
| 4 讨论 |
| 第三章 靶向受体的抗病毒阻断策略:基于CD163 受体的PRRSV广谱抗病毒策略研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 菌株与载体 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)的制备 |
| 2.2 CD163 SRCR5-9 蛋白的真核表达 |
| 2.3 CD163 SRCR5-9 蛋白的病毒阻断试验 |
| 2.4 CD163 单克隆抗体的制备 |
| 2.5 CD163 单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 2.6 CD163 单克隆抗体的受体阻断作用 |
| 2.7 基于CD163 单抗8H2和7H4 的表位多肽抗病毒作用 |
| 2.8 单抗6E8、9A10 的抗原表位鉴定 |
| 2.9 单抗6E8、9A10 的抗原表位的生物信息学分析 |
| 2.10 CD163 及其突变体过表达细胞系的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 CD163 SRCR5-9 的抗病毒作用 |
| 3.2 CD163 单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 3.3 单抗6E8和9A10对PRRSV的抗病毒作用 |
| 3.4 单抗6E8和9A10 对不同PRRSV毒株的广谱抗病毒作用 |
| 3.5 单抗6E8和9A10对PRRSV的预防及治疗作用 |
| 3.6 单抗6E8和9A10 的抗病毒作用机制 |
| 3.7 单抗6E8和9A10 抗原表位的鉴定 |
| 3.8 基于单抗8H2和7H4 表位多肽的抗病毒作用 |
| 3.9 单抗6E8和9A10 表位的生物信息学分析 |
| 3.10 ~(570)SXDVGXV~(576)和Q~(797)是PRRSV入侵的关键结合位点 |
| 4 讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 创新性 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（2）非洲猪瘟病毒P30和P54蛋白抗原表位的分析及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 非洲猪瘟与非洲猪瘟病毒 |
| 1.1.1 非洲猪瘟病毒流行病学 |
| 1.1.2 临床症状与发病机理 |
| 1.2 非洲猪瘟病毒疫苗研究进展 |
| 1.2.1 灭活疫苗和减毒活疫苗 |
| 1.2.2 核酸疫苗、亚单位疫苗和病毒活载体疫苗 |
| 1.3 非洲猪瘟病毒表位的研究进展 |
| 1.4 非洲猪瘟诊断技术研究进展 |
| 1.4.1 病原学诊断技术 |
| 1.4.2 血清学诊断技术 |
| 1.4.3 小结 |
| 1.5 总结和展望 |
| 第二章 ASFV p30和p54 蛋白多表位重组蛋白免疫原性的初步研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 p30、p54 蛋白的表位预测筛选 |
| 2.1.5 多表位重组蛋白的设计、理化性质预测分析及重组质粒合成 |
| 2.1.6 重组质粒的转化及其在大肠杆菌中的诱导表达及分析 |
| 2.1.7 重组蛋白的纯化及复性 |
| 2.1.8 重组蛋白的Western blot分析 |
| 2.1.9 免疫原的制备 |
| 2.1.10 动物免疫 |
| 2.1.11 小鼠血清特异性抗体的ELISA检测 |
| 2.1.12 脾细胞的制备与培养 |
| 2.1.13 淋巴细胞增殖试验 |
| 2.1.14 淋巴细胞亚型的流式细胞仪分析 |
| 2.1.15 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 表位的选择及表位盒的构建 |
| 2.2.2 重组蛋白的理化性质预测分析 |
| 2.2.3 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.4 Western blot鉴定结果 |
| 2.2.5 小鼠血清特异性抗体的ELISA检测 |
| 2.2.6 淋巴细胞增殖实验 |
| 2.2.7 淋巴细胞分化流式细胞仪分析结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 基于树突状细胞的ASFV多表位仿生纳米颗粒的构建及表征鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂、仪器和试验动物 |
| 3.1.2 BMDC细胞的分离培养与纯度检测 |
| 3.1.3 淋巴细胞混合培养 |
| 3.1.4 树突状细胞膜的分离 |
| 3.1.5 仿生纳米颗粒的制备 |
| 3.1.6 纳米颗粒表征的测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 BMDC的纯度分析 |
| 3.2.2 仿生纳米疫苗的制备及电镜表征分析 |
| 3.2.3 粒径的检测结果 |
| 3.2.4 SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 基于多表位抗原的 ASFV 间接 ELISA 方法建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂、仪器和血清样本 |
| 4.1.2 ELISA最佳反应条件的优化 |
| 4.1.3 临界值的确定 |
| 4.1.4 特异性测试 |
| 4.1.5 多肽反应性鉴定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 ELISA最佳反应条件的确定 |
| 4.2.2 临界值的确立 |
| 4.2.3 特异性测试结果 |
| 4.2.4 多肽反应性鉴定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛病毒性腹泻病概述 |
| 2 BVDV病原学特性 |
| 2.1 病毒培养及理化性质 |
| 2.2 病毒分型 |
| 3 BVDV分子生物学特性 |
| 3.1 病毒基因组 |
| 3.2 病毒的结构蛋白 |
| 3.3 病毒的非结构蛋白 |
| 3.4 病毒生物型NCP向CP转化 |
| 4 流行病学与临床表现 |
| 4.1 流行病学 |
| 4.2 流行特点 |
| 4.3 临床表现 |
| 4.4 BVDV感染对机体免疫系统的影响 |
| 5 BVDV检测技术 |
| 5.1 病原学检查 |
| 5.2 免疫学诊断技术 |
| 5.3 分子生物学检查技术 |
| 6 防控措施 |
| 6.1 预防与治疗 |
| 6.2 疫苗免疫 |
| 6.3 牛场BVD的净化 |
| 7 研究内容及意义 |
| 第二章 BVDV结构蛋白的基因克隆及生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞、质粒和病毒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液及培养基配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒的增殖及滴度测定 |
| 2.2 C、E~(rns)、E1和E2 基因扩增 |
| 2.3 目的基因克隆及序列测定 |
| 2.4 目的基因及蛋白的生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的增殖 |
| 3.2 病毒TCID_(50)测定 |
| 3.3 C、E~(rns)、E1和E2 基因全序列扩增 |
| 3.4 C、E~(rns)、E1和E2 生物学信息分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 BVDV N~(pro)、E~(rns)蛋白的真核表达 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 N~(pro)和E~(rns)基因扩增 |
| 2.2 真核表达载体的构建及双酶切鉴定 |
| 2.3 N~(pro)和E~(rns)蛋白真核表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 BVDV N~(pro)、E~(rns)基因PCR扩增 |
| 3.2 菌液PCR筛选 |
| 3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.4 转染细胞目的基因检测 |
| 3.5 Western blot蛋白表达验证 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 BVDV三种核酸检测方法的建立、比较与应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计合成 |
| 2.2 临床样品处理 |
| 2.3 重组质粒标准品的构建 |
| 2.4 RT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.5 qRT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.6 RT-LAMP方法的建立及条件优化 |
| 2.7 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2 qRT-PCR检测方法的建立 |
| 3.3 RT-LAMP检测方法的建立 |
| 3.4 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（4）非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 非洲猪瘟病毒的概述 |
| 1.1.1 病毒的形态和基本结构 |
| 1.1.2 病毒的基因组结构组成 |
| 1.2 病毒的蛋白与功能 |
| 1.2.1 主要的结构蛋白 |
| 1.3 非洲猪瘟病毒主要感染细胞机制 |
| 1.3.1 病毒进入细胞机制 |
| 1.3.2 病毒基因的复制与表达 |
| 1.3.3 病毒组装及子代病毒的释放 |
| 1.4 非洲猪瘟流行病学现状 |
| 1.5 非洲猪瘟疫苗 |
| 1.5.1 灭活疫苗 |
| 1.5.2 弱毒活疫苗 |
| 1.5.3 基因工程疫苗 |
| 1.6 非洲猪瘟的诊断 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 基因、载体及菌株 |
| 2.1.2 抗原、细胞、实验动物 |
| 2.1.3 主要试验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因筛选与合成 |
| 2.2.2 原核表达载体的双酶切验证 |
| 2.2.3 原核表达载体琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 2.2.4 酶切产物的回收与纯化 |
| 2.2.5 真核表达载体的构建 |
| 2.2.6 p30 原核蛋白的表达和SDS-PAGE验证 |
| 2.3 P30 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.3.1 动物免疫 |
| 2.3.2 检测免疫小鼠血清ELISA试验方法 |
| 2.3.3 细胞融合实验 |
| 2.3.4 阳性杂交瘤筛选 |
| 2.3.5 单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.3.6 单克隆细胞株亚类鉴定 |
| 2.3.7 重组质粒pc DNA3.1-CP204L基因的瞬时转染 |
| 2.3.8 单克隆抗体的特异性检测 |
| 2.3.9 p30 抗体与ASF全病毒间接免疫荧光试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 P30 蛋白的制备 |
| 3.1.1 p30 蛋白的生物信息学分析 |
| 3.1.2 p ET-28a-CP204L基因的构建与鉴定 |
| 3.1.3 重组质粒pc DNA3.1-CP204L鉴定 |
| 3.1.4 p30 蛋白的原核表达 |
| 3.1.5 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.6 重组蛋白的Western Blotting验证 |
| 3.2 单克隆抗体制备 |
| 3.2.1 p30 蛋白免疫效价测定 |
| 3.2.2 单克隆抗体细胞株的筛选 |
| 3.2.3 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.2.4 p30 蛋白单抗的Western Blotting验证 |
| 3.2.5 p30 单克隆抗体IFA验证 |
| 3.2.6 单克隆抗体的特异性检测 |
| 3.2.7 p30 单抗与ASF全病毒抗原反应性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 病毒宏基因组学的概念 |
| 1.2 病毒宏基因组学的研究过程 |
| 1.2.1 样品处理和病毒浓缩 |
| 1.2.2 核酸提取和扩增 |
| 1.2.3 高通量测序 |
| 1.2.4 生物信息学分析 |
| 1.3 病毒宏基因组学的应用 |
| 1.4 病毒宏基因组学的研究现状和发展趋势 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 本研究的总体技术路线 |
| 第二章 江苏某地区HIV感染患者血浆病毒群落分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 样品前处理 |
| 2.1.4 样品组合设计 |
| 2.1.5 样品的核酸酶消化 |
| 2.1.6 病毒核酸提取 |
| 2.1.7 逆转录及合成双链DNA |
| 2.1.8 高通量测序文库的构建 |
| 2.1.9 文库的扩增 |
| 2.1.10 文库的纯化 |
| 2.1.11 病毒文库质量检测 |
| 2.1.12 文库的Miseq深度测序 |
| 2.1.13 文库测序结果的生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 病毒宏基因组DNA文库的质量检测 |
| 2.2.2 Miseq测序质量 |
| 2.2.3 HIV感染人群血浆的病毒宏基因组学分析结果 |
| 2.2.4 HIV感染人群血浆的病毒群落组成 |
| 2.2.5 HIV感染人群血浆病毒群落按宿主分类 |
| 2.2.6 检出病载组与未检出病载组的比较 |
| 2.2.7 主要潜在致病性病毒比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 未知病毒的鉴定和遗传特征分析 |
| 3.1 HIV感染人群血浆样本中指环病毒的研究 |
| 3.1.1 材料和方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 HIV感染人群血浆样本中细小病毒的研究 |
| 3.2.1 材料和方法 |
| 3.2.2 实验结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 第四章 主要结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）基于宏基因组学检测猪源病毒的方法建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(ABBREVIATION) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 主要的病原检测方法 |
| 3 测序技术发展 |
| 3.1 一代测序 |
| 3.2 二代测序 |
| 3.3 三代测序 |
| 4 宏基因组学 |
| 4.1 宏基因组学的概念 |
| 4.2 宏基因组学的研究方法 |
| 4.3 宏基因组学的应用 |
| 4.3.1 病原检测 |
| 4.3.2 微生物群落的研究 |
| 4.3.3 生物酶的发现 |
| 4.3.4 其他 |
| 5 猪细小病毒 |
| 5.1 猪细小病毒的病原特点 |
| 5.2 猪细小病毒的流行情况 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 病毒宏基因组学检测方法的建立与应用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 试验毒株 |
| 2.1.3 试验临床样品 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 去除外源核酸 |
| 2.2.2 核酸酶灭活 |
| 2.2.3 DNA提取 |
| 2.2.4 DNA多重置换扩增反应 |
| 2.2.5 单引物扩增 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 单链c DNA(ssc DNA)合成 |
| 2.2.8 双链c DNA(dsc DNA)合成 |
| 2.2.9 单引物扩增 |
| 2.2.10 PCR产物的纯化 |
| 2.2.11 产物浓缩 |
| 2.2.12 浓缩产物质检 |
| 2.2.13 末端修复 |
| 2.2.14 接头连接 |
| 2.2.15 目的片段的分离和选择 |
| 2.2.16 PCR扩增 |
| 2.2.17 PCR产物回收 |
| 2.2.18 高通量测序 |
| 2.2.19 生物信息学分析 |
| 2.2.20 猪繁殖障碍病例与猪腹泻病例的病毒宏基因组学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 病毒宏基因组学平台的建立及完善 |
| 3.1.1 浓缩样本质量检测 |
| 3.1.2 文库构建 |
| 3.1.3 生物信息学分析 |
| 3.2 10例猪繁殖障碍病例病毒宏基因组学检测 |
| 3.3 4例猪腹泻病例病毒宏基因组学检测 |
| 3.4 遗传进化分析 |
| 3.4.1 猪圆环病毒2型遗传进化分析 |
| 3.4.2 猪细小病毒遗传进化分析 |
| 3.4.3 猪星状病毒2型遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒宏基因组学方法优化 |
| 4.2 猪繁殖障碍及腹泻病例的检测 |
| 4.3 展望 |
| 第三章 猪细小病毒2、3和6型多重PCR方法建立及应用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒株、菌株及核酸样品 |
| 2.1.2 临床样品 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 相关试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 核酸提取 |
| 2.2.3 单重PCR扩增 |
| 2.2.4 PPVNS基因重组质粒构建 |
| 2.2.5 多重PCR反应条件及体系优化 |
| 2.2.6 特异性试验 |
| 2.2.7 敏感性试验 |
| 2.2.8 临床样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 单重PCR扩增及重组质粒鉴定 |
| 3.2 多重PCR扩增条件的优化 |
| 3.3 特异性试验结果 |
| 3.4 敏感性试验结果 |
| 3.5 临床样品检测 |
| 3.6 PPV感染率调查 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪细小病毒2、3和6型多重PCR方法的建立与优化 |
| 4.2 临床样品检测 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒-黏膜病(BVDV-MD) |
| 2.1.1 BVDV流行病学 |
| 2.1.2 BVDV分子生物学特征 |
| 2.1.3 BVDV基因组及其编码蛋白 |
| 2.1.4 BVDV感染机制 |
| 2.1.5 BVDV持续性感染 |
| 2.1.6 BVDV免疫逃避 |
| 2.2 RNA-Seq技术筛选病毒相关宿主基因 |
| 2.2.1 RNA-Seq技术的发展 |
| 2.2.2 RNA-Seq技术的应用 |
| 2.2.3 单细胞测序技术(Sc RNA-Seq) |
| 2.3 抗病毒固有免疫 |
| 2.3.1 TLRs及其介导的信号通路 |
| 2.3.2 RLRs及其介导的信号通路 |
| 2.4 Ⅰ型干扰素(IFN-I) |
| 2.4.1 JAK-STAT通路 |
| 2.4.2 ISGs的抗病毒作用 |
| 2.5 病毒逃避Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 2.5.1 病毒抑制Ⅰ型干扰素上游信号通路 |
| 2.5.2 病毒抑制Ⅰ型干扰素下游信号通路 |
| 2.6 IFN信号的复杂性和宿主趋向性 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 3.2 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 3.3 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒分离株和实验动物 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 1.2.2 免疫荧光实验(IFA) |
| 1.2.3 NCP BVDV-LC病毒TCID50测定 |
| 1.2.4 BVDV感染牛外周血单核细胞 |
| 1.2.5 RNA提取 |
| 1.2.6 建库及测序 |
| 1.2.7 生物信息学分析 |
| 1.2.8 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 1.2.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 流式细胞术鉴定牛单核细胞 |
| 2.2 NCP BVDV感染牛外周血单核细胞免疫荧光检测 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)的筛选 |
| 2.4 GO聚类分析 |
| 2.5 KEGG分析 |
| 2.6 Ⅰ型干扰素信号通路相关DEGs分析 |
| 2.7 qRT-PCR验证部分DEGs |
| 3 讨论 |
| 3.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 3.2 NCP BVDV感染牛单核细胞DEGs分析 |
| 4 小结 |
| 试验二 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 牛Ⅰ型干扰素IFN-β启动子报告载体的构建和分析 |
| 1.2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核表达载体的构建及对干扰素启动子活性的影响 |
| 1.2.3 NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.4 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒载体构建及对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛Ⅰ型干扰素IFNβ的启动子报告载体构建及活性分析 |
| 2.1.1 牛IFN-β启动子序列的克隆 |
| 2.1.2 BoIFN-β启动子报告载体的构建 |
| 2.1.3 BoIFNβ3-Luc-MDBK细胞的制备 |
| 2.1.4 BoIFNβ3-Luc MDBK细胞对BVDV复制的影响 |
| 2.1.5 ploy(I:C)对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建及对BoIFNβ3 启动子活性的影响 |
| 2.2.1 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建 |
| 2.2.2 BoIRF7和Bo DDX58对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.3 NCP BVDV在 MDBK细胞对干扰素信号通路的影响 |
| 2.3.1 NCP BVDV在 MDBK细胞上对干扰素通路相关分子转录的影响 |
| 2.3.2 NCP BVDV感染对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.4 NCP BVDV非结构蛋白对干扰素信号通路的影响 |
| 2.4.1 NCP BVDV非结构蛋白真核表达载体构建 |
| 2.4.2 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒的包装及感染MDBK细胞 |
| 2.4.3 NCP BVDV非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu-IRSE、BoIFN-β转录活性的影响 |
| 2.4.4 NCP BVDV非结构蛋白NS4B对 poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ通路蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞转染效率 |
| 3.2 病毒抑制IFN-Ⅰ信号通路的机制 |
| 3.3 BVDV非结构蛋白对IFN-Ⅰ通路的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物、细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BoSIKE1 基因的克隆及表达载体构建 |
| 1.2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1.2.3 NCP BVDV病毒感染MDBK细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 1.2.4 BoSIKE1 过表达和干扰对NCP BVDV复制的影响 |
| 1.2.5 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 1.2.6 BoSIKE1 与互作蛋白的Co-IP实验 |
| 1.2.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BoSIKE1 基因的克隆及同源性分析 |
| 2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.1 BoSIKE1 基因的原核表达 |
| 2.2.2 BoSIKE1 抗体的制备与鉴定 |
| 2.3 BVDV病毒感染宿主细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 2.4 BoSIKE1 过表达和干扰细胞的构建 |
| 2.5 BoSIKE1 过表达和干扰对BVDV复制的影响 |
| 2.6 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 2.7 BoSIKE1与TUBA1D蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BoSIKE对 NCP BVDV复制的影响 |
| 3.2 BoSIKE1 互作蛋白的鉴定及分析 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）几种非洲猪瘟蛋白的筛选表达及纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 非洲猪瘟病毒 |
| 1.2.1 非洲猪瘟病毒的传播 |
| 1.2.2 非洲猪瘟病毒粒子及基因组结构 |
| 1.2.3 疫苗研究进展 |
| 1.2.4 药物及防控 |
| 1.3 非洲猪瘟病毒蛋白 |
| 1.3.1 ASFV主要结构蛋白 |
| 1.3.2 ASFV编码复制修饰转录相关蛋白 |
| 1.3.3 免疫逃逸相关蛋白 |
| 1.4 非洲猪瘟病毒蛋白的结构生物学研究 |
| 1.5 本文的主要研究内容 |
| 1.6 本文的技术路线 |
| 第2章 实验试剂与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 目的片段的获得 |
| 2.4.2 克隆的构建 |
| 2.4.3 重组连接产物的转化 |
| 2.4.4 质粒的提取与验证 |
| 2.4.5 哺乳动物体系瞬时转染表达 |
| 2.4.6 蛋白收集及荧光检测分子筛筛选 |
| 2.4.7 细胞的传代冻存复苏 |
| 2.4.8 非洲猪瘟蛋白的表达优化 |
| 2.4.9 非洲猪瘟相关蛋白的纯化 |
| 2.4.10 非洲猪瘟蛋白的结晶及优化 |
| 第3章 ASFV蛋白哺乳动物体系下的表达筛选 |
| 3.1 本章引论 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 ASFV蛋白生物信息学分析结果 |
| 3.2.2 ASFV蛋白克隆构建结果 |
| 3.2.3 ASFV蛋白转染、小量表达、筛选结果 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 ASFV蛋白表达优化、纯化、结晶 |
| 4.1 本章引论 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 MBP-B475L融合蛋白表达体系的优化结果 |
| 4.2.2 利用MBP标签对KR177R蛋白的表达与纯化结果 |
| 4.2.3 组氨酸标签KR177R蛋白的表达与纯化结果 |
| 4.2.4 KR177R蛋白的结晶结果 |
| 4.3 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）基于纳米孔测序技术在动物病毒快速检测方法中的建立与评估（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 纳米孔测序技术的研究进展 |
| 1.1.1 核酸测序技术的发展 |
| 1.1.2 纳米孔测序技术的发展历程 |
| 1.1.3 纳米孔测序技术的应用 |
| 1.2 纳米孔测序测序原理 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 纳米孔测序在未知病原检测中的应用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品信息 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 生物信息学软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核酸提取 |
| 2.2.2 快速建库测序 |
| 2.2.3 连接法建库测序 |
| 2.2.4 非洲猪瘟病毒的定性与定量检测 |
| 2.2.5 Sanger全基因组测序 |
| 2.2.6 数据处理 |
| 2.2.7 ASFV有参组装与可视化分析 |
| 2.2.8 多序列比对与系统发育分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 未知病原的快速检测 |
| 2.3.2 ASFV的荧光定量检测及全基因扩增 |
| 2.3.3 Sanger全基因组测序结果 |
| 2.3.4 测序数据统计分析 |
| 2.3.5 ASFV序列统计 |
| 2.3.6 ASFV序列的可视化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 纳米孔测序在DNA病毒研究中的应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样品信息 |
| 3.1.2 主要试剂耗材 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 生物信息学软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 核酸提取 |
| 3.2.2 圆环病毒阳性率检测与全基因组扩增 |
| 3.2.3 病毒分离 |
| 3.2.4 快速纳米孔文库构建 |
| 3.2.5 纳米孔测序数据处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 猪圆环病毒阳性率检测与病毒分离结果 |
| 3.3.2 猪圆环病毒全基因组扩增结果 |
| 3.3.3 系统发育分析结果 |
| 3.3.4 纳米孔测序结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 纳米孔测序在RNA病毒中的应用研究 |
| 4.1 Nanopore测序技术在狂犬病毒检测中的应用 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.1.4 讨论 |
| 4.1.5 小结 |
| 4.2 Nanopore技术在低起始量样本中的测序应用 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.2.4 讨论 |
| 4.2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 项目支持 |
| 致谢 |
（10）猪瘟病毒新型微载体悬浮培养技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 猪瘟及其疫苗的研究进展 |
| 1.1 猪瘟概述 |
| 1.2 猪瘟疫苗研究与进展 |
| 第2章 细胞微载体与悬浮培养技术 |
| 2.1 细胞微载体的类型 |
| 2.2 细胞微载体培养技术的应用 |
| 2.3 目的与意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第3章 ST细胞单层静置培养特性及CSFV转瓶培养工艺研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 微载体细胞培养性能研究与微载体选择 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 CSFV微载体摇瓶培养及其放大工艺研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CSFV微载体反应器悬浮培养及其放大工艺建立 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CSFV的免疫原性及免疫效果评价 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、用生物信息学手段辅助分析猪瘟病毒的基因结构（论文参考文献）
- [1]基于病毒受体阻断的广谱抗病毒策略研究及其在CSFV和PRRSV防治中的应用[D]. 徐慧玲. 浙江大学, 2021(02)
- [2]非洲猪瘟病毒P30和P54蛋白抗原表位的分析及应用[D]. 高瞻. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立[D]. 拜小强. 西北民族大学, 2021(08)
- [4]非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备[D]. 张赫. 内蒙古农业大学, 2021(02)
- [5]江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究[D]. 窦安华. 扬州大学, 2021(08)
- [6]基于宏基因组学检测猪源病毒的方法建立与应用[D]. 李静. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索[D]. 何延华. 石河子大学, 2020
- [8]几种非洲猪瘟蛋白的筛选表达及纯化[D]. 袁婧馨. 哈尔滨工业大学, 2020(01)
- [9]基于纳米孔测序技术在动物病毒快速检测方法中的建立与评估[D]. 闫晓敏. 福建农林大学, 2020(02)
- [10]猪瘟病毒新型微载体悬浮培养技术研究[D]. 梅建国. 吉林大学, 2019(02)