一、表皮细胞无血清培养基血清代用品的实验研究（论文文献综述）
胡勤[1]（2019）在《基于两种生物支架材料的3D OMM的构建及其效果评价》文中提出近年来组织工程化技术在口腔医学领域应用广泛,组织工程化技术的关键是实现细胞的3D培养。相较于培养皿等2D环境,细胞在3D支架中的生长持续时间更长,更能接近体内真实的生长情况,最终实现组织、器官的体外构建。本文利用牛脱细胞真皮基质与Matrigel两种生物支架材料实现HGF（Human gingival fibroblast,人牙龈成纤维细胞）与HOK（Human oral keratinocytes,人口腔角质形成细胞）的3D共培养,体外构建稳定的3D OMM（Three-dimensional oral mucosal model,三维口腔黏膜组织模型）。目的:通过对比两种生物支架材料的细胞3D培养效果,实现HGF与HOK的3D共培养,体外构建稳定的、均一的3D OMM。为临床及实验研究方面的应用提供基础。方法:DispaseⅡ酶分离法结合组织块法培养原代HGF,利用SV40-T（Similar vacuolating virus,猴空泡病毒40-T）抗原慢病毒载体和hTERT（Human telomerase reverse transcriptase,人端粒酶反转录酶）重组慢病毒载体实现HOK的永生化诱导。利用HE（Hematoxylin-Eosin,苏木精-伊红）染色及Vimentin/CK13（cytokeratin 13,细胞角蛋白13）免疫荧光染色完成HGF与HOK的细胞鉴定。将HGF种植于牛脱细胞真皮基质与Matrigel两种生物支架材料上培养7d,构建组织工程化结缔组织模型,通过石蜡切片及HE、DAPI（4-6-diamidino-2-phenylindole4,6-联脒-2-苯基吲哚）染色观察HGF在两种支架材料上的3D生长情况。通过设计出与包埋盒内部空间形态一致的基质胶3D培养组织粘附玻片,并改良常规石蜡切片制作步骤,解决Matrigel支架材料制作石蜡切片难的问题。进而将HGF种植于两种支架材料3D培养7d,形成组织工程化结缔组织,将HOK种植于结缔组织上继续培养7d形成上皮层,置于气-液平面培养7d后,利用针对Matrigel支架材料的改良石蜡切片法完成3D OMM的石蜡切片制作。通过HE及免疫荧光染色观察两种生物支架材料构建的3D OMM组织结构培养效果。结果:（1）利用DispaseⅡ酶分离法结合组织块法可实现HGF的原代培养,3-6代HGF生长状态良好,传至第8代后,细胞增殖活力下降,细胞形态发生改变。HOK通过永生化诱导,可传至第15代,细胞增殖活力仍然正常,细胞形态稳定,呈互不重叠的单层典型铺路石状排列。在牛脱细胞真皮基质组HGF主要集中于支架表层生长,在支架深层,细胞相对稀少。在Matrigel支架材料组可见蓝染的HGF胞核散在分布于支架全层,细胞相对密集。（2）Matrigel支架材料在常规石蜡切片制作过程中易收缩、卷曲及脱离Transwell 0.4μm微孔膜,甚至发生支架材料的断离、碎裂。冰冻切片法使得Matrigel支架材料内部容易形成冰晶,产生大量空隙,从而失去完整的组织形态,造成支架内部HGF大量流失。利用针对Matrigel支架材料的改良石蜡切片法制作组织切片,胶原支架材料完整连续,无空隙及碎裂,3D结缔组织模型结构完整。（3）在HE及免疫荧光染色下可见,在牛脱细胞真皮基质组,细胞主要集中在支架浅层生长,在支架深层,细胞相对稀少。组织的上皮层和皮下结缔组织层分界不清。对于Matrigel支架材料组,细胞均匀分布于该支架材料全层,表面形成一层连续的带状上皮细胞层,胞核蓝染的成纤维细胞散在地生长于上皮下基质胶内。结论:（1）DispaseⅡ酶分离法结合组织块法能有效地实现HGF原代培养,HOK通过永生化诱导解决了细胞扩增倍数少的问题。（2）相较于传统石蜡切片法和冰冻切片法,针对Matrigel支架材料的改良石蜡切片法更适宜用于Matrigel支架材料的石蜡切片制作。（3）相较于牛脱细胞真皮基质,Matrigel支架材料更适宜于构建3D结缔组织模型和3D OMM。
何益锋[2]（2019）在《兰坪虫草菌粉及其提取物对慢性肾功能衰竭小鼠的改善作用研究》文中提出慢性肾衰竭（Chronic renal failure,CRF）是指各种原发性或继发性慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）导致的进行性肾功能损害。慢性肾功能衰竭终末期在临床上多采用肾脏移植手术和透析治疗,但由于费用昂贵、肾源不足、患者认知和依从性差以及各种严重并发症问题,难以广泛推广,并且此类解决方法不适合早、中期的CRF患者。近年来,中医药广泛应用于慢性肾功能衰竭患者,特别是针对早、中期的CRF,表现出良好的效果。因此,研究和开发中药治疗CRF,具有重要的理论研究价值和实际应用潜力。兰坪虫草（Ophiocordyceps lanpingensis）属于线虫草属真菌,与冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）亲缘关系较近,是近几年在我国滇西北地区发现的线虫草属新种,其所含活性成分与野生冬虫夏草相似,且易于人工培养。在云南省的兰坪虫草产区,当地少数民族长期使用兰坪虫草治疗呼吸系统、泌尿系统疾病,用法与冬虫夏草相同。兰坪虫草与冬虫夏草相比具有更好的可人工培育特性,容易实现规模化培养。因此,兰坪虫草具有作为冬虫夏草代用品入药的潜力。本研究旨在探讨人工培养的兰坪虫草菌粉及其水提物对慢性肾功能衰竭小鼠的改善作用,为将来人工培养的兰坪虫草作为冬虫夏草代用品入药,提供理论依据和技术参考,同时也为临床上慢性肾衰竭的防治提供思路。本论文的研究内容包括以下两个方面:1.兰坪虫草水提物对小鼠慢性肾功能衰竭的治疗效果准备C57BL/6雄性小鼠70只,分为空白对照组（Normal组）;模型组（腺嘌呤组）;氯沙坦阳性对照组（Losartan组）;兰坪虫草菌粉水取物低、中、高剂量组（OLEL、OLEM、OLEH组）和兰坪虫草菌粉组（OL组）;共7组,每组10只。实验组小鼠灌胃腺嘌呤溶液造模（Adenine）;Normal组小鼠灌胃等体积的蒸馏水。造模30天后,分别给阳性对照组灌服氯沙坦溶液（10 mg/kg/d）;OLEL、OLEM、OLEH组灌服不同剂量的兰坪虫草菌粉水提物（0.5 g/kg/d、1.0 g/kg/d、2.0 g/kg/d）和OL组灌服兰坪虫草菌粉溶液（2.0 g/kg/d）,空白对照组和模型组小鼠分别给予20 mL/kg/d蒸馏水。各组小鼠于造模成功后第7、14和28天称量小鼠体重,在给药后的第30天处死小鼠并摘眼球取血,分离血清,检测血清尿素氮、血肌酐、还原型谷胱甘肽、血磷含量、丙二醛、血浆钙含量和超氧化物歧化酶活力,同时取肾脏组织进行HE染色、Masson染色,观察肾组织病理变化。兰坪虫草菌粉及其水提物可提高小鼠体重、血清中还原型谷胱甘肽含量、SOD活力和血浆钙含量;同时可降低小鼠血清尿素氮、血肌酐、血磷和MDA含量。此外,兰坪虫草菌粉及其水提物可以显着改善慢性肾衰小鼠肾组织损伤及肾间质纤维化。高、中、低剂量的兰坪虫草菌粉水提物对小鼠慢性肾衰竭均有改善作用,其中高剂量组（2.0 g/kg/d）对小鼠慢性肾衰竭的改善作用最好,中剂量组（1.0 g/kg/d）与菌粉组（2.0 g/kg/d）的效果相当,而2.0 g兰坪虫草菌粉约可提取1.0 g兰坪虫草菌粉水提物。以上研究结果表明,兰坪虫草菌粉及其水提物对腺嘌呤诱导的小鼠慢性肾功能衰竭具有较好的改善作用,且兰坪虫草菌粉水提物中可能存在改善慢性肾衰的主要有效药用物质。2.兰坪虫草水提物对慢性肾衰竭小鼠的改善机制研究采用实时荧光定量PCR检测肾组织促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及MCP-1 mRNA的表达水平,以及免疫调节因子IL-10和TGF-β的mRNA表达水平。用蛋白免疫印迹（Western blot）的方法检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Caspase 3、Active-Caspase 3、Caspase 9蛋白表达量,以及炎症相关蛋白IL-6、P-65、P50的蛋白表达量,明确兰坪虫草菌粉水提物对肾组织相关蛋白表达量的影响。将肾组织制成石蜡切片,用TUNEL荧光染色法观察其细胞凋亡情况,再利用免疫组化法检测组织中巨噬细胞分布情况,观察其数量的变化。结果表明,兰坪虫草菌粉及其水提物可显着降低TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β以及MCP-1 mRNA表达水平,提高了IL-10的mRNA表达水平。同时,兰坪虫草菌粉及其水提物可以降低Bax、Caspase 3、Active-Caspase 3、Caspase 9、P50、IL-6、P-65蛋白表达量,提高Bcl-2蛋白表达量。此外,研究证明兰坪虫草菌粉及其水提物可以缓解肾细胞凋亡,并可一定程度减少肾组织巨噬细胞数量。以上研究说明兰坪虫草菌粉及其水提物改善小鼠慢性肾衰竭的作用机制与炎症和细胞凋亡有关,并可以通过调控巨噬细胞数量,改善小鼠的免疫功能,最终达到改善慢性肾衰的效果。
王金明[3]（2013）在《诱导脐血造血干/祖细胞分化为红系祖细胞及其规模化扩增》文中研究说明目前血液来源紧张及输血相关传染病的发生使得临床输血治疗面临巨大的挑战,寻找更为安全、充足的血液来源一直以来都是输血医学研究的重要方向。干细胞技术的不断发展使得我们有可能在体外将干细胞定向诱导分化为红细胞作为血液替代来源,然而目前的技术条件下生产制备干细胞来源的成熟红细胞产品面临很多困难,而干细胞来源的红系祖细胞同样可以作为非应急性（或择期）输血的血液替代产品。本研究拟利用脐带血造血干/祖细胞作为起始细胞,体外诱导其向红系祖细胞分化,并添加小分子化合物对诱导扩增体系进行优化,初步探讨利用生物反应器规模化制备脐带血来源的红系祖细胞的技术方法。本课题研究首先建立了无血清体系中高效诱导脐带血造血干/祖细胞向红系祖细胞分化的技术方法,诱导效率超过90%,对获得的红系祖细胞进行了多方而的鉴定,并对诱导的红系祖细胞的不同分化阶段进行了动力学分析。为了进一步优化诱导扩增体系,实现规模化扩增脐带血造血干/祖细胞来源的红系祖细胞,本研究尝试在诱导扩增体系中添加一种小分子化合物“二甲基乙二酰基甘氨酸”（Dimethyloxalylglycine, DMOG）,在体外模拟低氧微环境,提高红系祖细胞诱导扩增效率。在前述建立的红系祖细胞诱导扩增体系的基础上,本研究初步尝试了利用WAVE波浪式生物反应器结合Fed-batch培养模式诱导扩增红系祖细胞,力求实现体外规模化扩增脐带血造血干/祖细胞来源的红系祖细胞。这些研究结果将为最终实现脐带血造血干/祖细胞体外诱导分化为红系祖细胞作为非应急性（或择期）输血的血液替代来源奠定实验基础。图33幅,表5个,参考文献96篇。
郭玲玲[4]（2012）在《肝素和白血病抑制因子对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞的作用》文中研究说明目的：本实验旨在研究不同浓度的肝素、白血病抑制因子（Leukemia inhibitoryfactor，LIF）对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stemcells，mESCs）的影响，并探索肝素联合LIF培养小鼠胚胎干细胞的最佳浓度。方法：实验以自制无血清代用品为基础培养基、经丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层培养小鼠胚胎干细胞。并观察在此基础培养基中分别添加肝素、LIF及肝素联合LIF对小鼠胚胎干细胞的培养效果。1、观察在基础培养基中加入不同浓度的肝素所培养的细胞的生长情况，初步明确肝素对小鼠胚胎干细胞生长的影响。2、观察在基础培养基中加入不同浓度的LIF所培养的细胞的生长情况，明确LIF在自制无血清代用品中对小鼠胚胎干细胞生长的影响。并用AKP染色法检测小鼠胚胎干细胞的未分化情况，同时应用流式细胞术检测SSEA-1、SSEA-3以及细胞免疫荧光法检测Oct-4的表达情况。3、观察在基础培养基中加入固定浓度的LIF和不同浓度的肝素所培养的细胞的生长情况，明确LIF和肝素在自制无血清代用品中共同对小鼠胚胎干细胞生长的影响，并用AKP染色法检测小鼠胚胎干细胞的未分化情况，同时流式细胞术检测SSEA-1、SSEA-3的表达情况以及细胞免疫荧光法检测Oct-4的表达情况。结果：1、在自制无血清的基础培养基中培养的小鼠胚胎干细胞不能贴壁，随着培养时间延长细胞逐渐死亡或是过度分化。在上述培养基中加入一定量肝素所培养的小鼠胚胎干细胞能够贴壁生长，同时对干细胞有一定的促增殖作用，呈现剂量依赖性，在该部分实验中以100ng/ml这一浓度下的细胞生长状态最佳，最高可传代6代。2、在自制无血清的基础培养基中添加一定量LIF能够明显促进小鼠胚胎干细胞的贴壁生长，并能较好的维持未分化状态生长。10ng/ml这一浓度下培养的细胞生长状态较好，连续传6代未见分化。取培养第3代的小鼠胚胎干细胞进行未分化检测：流式细胞术检测胚胎干细胞表面特异性抗原SSEA-1表达率为64.05%，SSEA-3的表达率为1.0%；AKP染色和细胞免疫荧光检测Oct-4均为阳性结果。3、在自制无血清的基础培养基中添加添加固定浓度的LIF和不同浓度的肝素培养小鼠胚胎干细胞。以10ng/ml的LIF和100ng/ml的肝素共同培养的小鼠胚胎干细胞的生长状态最佳，连续传6代未见分化。取培养第3代的小鼠胚胎干细胞做未分化检测：流式细胞术检测胚胎干细胞表面特异性抗原SSEA-1表达率为82.49%，SSEA-3的表达率为2.15%，AKP染色和细胞免疫荧光检测Oct-4均为强阳性结果。结论：1、自制无血清代用品中添加肝素后有益于小鼠胚胎干细胞贴壁，并维持小鼠胚胎干细胞的生长，其生长能力与肝素的浓度呈正比关系，但经多次传代后出现易分化倾向。2、自制无血清代用品中添加LIF有益于小鼠胚胎干细胞贴壁，并维持小鼠胚胎干细胞的生长。当LIF的浓度低于100ng/ml时，小鼠胚胎干细胞的生长能力与LIF的浓度呈正比关系。但当LIF的浓度为100ng/ml时抑制细胞的生长。3、自制无血清代用品中添加10ng/ml的LIF和不同浓度的肝素均有益于小鼠胚胎干细胞贴壁，并维持小鼠胚胎干细胞的生长，其生长能力与肝素的浓度呈正比关系。当肝素的浓度为100ng/ml时，小鼠胚胎干细胞的生长情况最佳，经多次传代细胞未见明显分化。说明在自制无血清代用品中添加LIF与肝素有助于维持小鼠胚胎干细胞增殖而又保持其未分化状态。
晁洋[5]（2011）在《旋转式生物反应器内微载体培养扩增皮肤相关细胞及微粒皮肤的初步制备》文中认为随着细胞培养技术的发展,对皮肤相关细胞的培养,特别是人表皮细胞的培养有了很大的进展。在适宜的培养条件下,单个细胞在培养中不断增殖,逐渐融合成片状,形成了类似皮肤表皮层的上皮组织。这使得在较短的时间里,用大量表皮细胞培育成小片状的上皮组织成为可能。临床工作中,外科医生和细胞生物学家们也大量培养自体表皮细胞并用来修复皮肤缺损的病人。表皮细胞培养技术也从使用含血清培养液和细胞滋养层的培养方式,到不含血清、无滋养层的培养方式。培养方法的发展也促进了临床应用,从最初的细胞悬液移植到自体异体细胞膜片移植,以及表皮细胞生物材料复合物移植。培养和移植方法的发展使人们在治疗大面积皮肤缺损方面看到了希望。细胞培养技术对研究动物细胞的结构、功能和分化过程中的作用非常重要。因此,将微载体培养技术应用到贴壁依赖型细胞的大量培养,使上述研究进入到了一个新的层次。在微载体培养环境中,通过在培养液中轻柔的转动或者搅拌,细胞在微球表面呈现单层或者复层生长,在这种无复杂结构的悬浮培养体系中,可获得2x108个/毫升的细胞量。Cytodex微载体是GE Healthcare公司为大量培养各类动物细胞专门开发的微载体,其培养体系的容器可以从数毫升到数千升,非常适合大规模扩增细胞。这种微载体的表面对细胞生长过程中的贴附和伸展过程专门优化,它的直径和密度也非常适合悬浮状态大规模培养扩增各类细胞。构成微载体球体的基质材料生物稳定性很好,提供给细胞适宜的表面生长环境。透光的球体也很容易通过显微镜观察贴附之上的细胞。通过以往的广泛使用可以看出,cytodex十分适合作为微载体培养细胞。旋转式生物反应器是由一个水平轴旋转的培养容器和与其共轴的氧合器组成,当容器以水平轴开始旋转时,充满其中的培养液作为一个整体也发生旋转,这种方式使内容物受到极小的剪切力。培养体系中的细胞旋转时所受的离心力、重力和科氏力抵消,因此细胞能大体维持悬浮状态。培养体系中的细胞受到极小的机械力的同时获得大量的氧、营养物质的供应。细胞所需的气体通过硅橡胶膜微量而持续的交换,避免了旋转培养体系中出现大的气泡和涡流。在临床工作中,使用自体表皮,成纤维细胞快速有效的修复各类皮肤缺损对皮肤愈合有很大意义,而足够数量的种子细胞对构建组织工程皮肤非常重要。本研究尝试使用Cytodex-3微载体和高截面纵横比的旋转式生物反应器作为培养系统,大规模扩增人真皮成纤维细胞和人表皮细胞,期待能为各类组织工程皮肤产品提供充足的种子细胞。第一部分实验成纤维细胞和表皮细胞的体外培养及鉴定1主要方法获取新生儿包皮切除术后组织,人表皮细胞使用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法获取;人真皮成纤维细胞使用胰酶消化组织块贴壁法获取。待原代培养成功后,常规传代。免疫组化方法进行抗波形丝蛋白、抗角蛋白染色,显微镜下观察。2主要结果倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。人表皮细胞呈圆形,细胞铺满培养瓶底,密度均匀。人真皮成纤维细胞呈长梭形,胞核饱满。免疫组化结果显示人真皮成纤维细胞抗波形丝蛋白染色阳性,人表皮细胞抗角蛋白染色为阳性。3主要结论通过鉴定,本实验所获取以及体外培养扩增的细胞分别为人真皮成纤维细胞和人表皮细胞。第二部分实验旋转式生物反应器培养扩增人真皮成纤维细胞1主要方法利用组织贴壁法从人皮肤中分离出人真皮成纤维细胞（hDFBs）进行体外培养,使用DIO标记细胞后结合微载体在旋转式生物反应器（RCCS）中培养,细胞贴附微载体的状况使用荧光显微镜,扫描电镜观测。并且检测细胞周期和分析细胞群体倍增时间来比较微重力培养与平面培养的体外增殖能力差异。2主要结果在旋转式生物反应器的微重力培养体系中,人成纤维细胞能快速贴附到微载体表面,在培养过程中达到很大的细胞密度,并且表现出很强的增殖能力和细胞活性。3主要结论利用生物反应器和微载体悬浮培养人皮肤成纤维细胞,是大量制备皮肤组织工程种子细胞的一种有效方法。第三部分实验使用旋转式生物反应器体外扩增人表皮细胞1主要方法使用Cytodex-3微载体和高截面纵横比的旋转式生物反应器容器作为培养系统大规模扩增人表皮细胞（hECs）。用中性蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA两步骤法从人皮肤中分离出人表皮细胞,使用DIL标记细胞后结合微载体后在旋转式生物反应器（RCCS）中培养,细胞贴附微载体的生长状态使用倒置显微镜,扫描电镜观测。并且分析细胞群体倍增时间来比较微重力培养与平面培养的体外增殖能力差异。2主要结果在旋转式生物反应器的微重力培养体系中,人表皮细胞能快速贴附到微载体表面,在培养过程中达到很大的细胞密度,并且表现出很强的增殖能力和细胞活性。3主要结论使用旋转式生物反应器和微载体悬浮培养人表皮细胞,是大量制备皮肤组织工程种子细胞的一种有效方法。第四部分实验使用旋转式生物反应器制备微粒皮肤1主要方法人表皮细胞的体外培养中,培养液中的血清成分有诱导分化作用,会使其过早的进入终末状态,增殖趋于停止,通常对表皮细胞的培养早期使用角质细胞无血清培养液（K-SFM ）。而在人成纤维细胞在体外培养过程中,含血清的培养液对其增殖有利。考虑到两种细胞对培养液的不同要求,本实验分别尝试两种不同方法:培养液血清浓度梯度降低法和表皮培养液共培养法,使用Cytodex-3微载体和高截面纵横比的旋转式生物反应器容器作为培养系统尝试制备微粒皮肤。并使用扫描电镜观察细胞的贴附生长状态。2主要结果表皮培养液共培养法中,微载体颗粒上有多角形的表皮细胞贴附,成纤维细胞贴附状态较差,部分从微载体上脱落。血清浓度梯度降低法中,微载体上有多角形的表皮细胞和梭形的成纤维细胞贴附,细胞贴附状态较好,但细胞密度较小。3主要结论使用旋转式生物反应器和微载体悬浮培养微粒皮肤,培养液的血清浓度对共培养的两种细胞影响较大,使用血清浓度梯度降低法的共培养体系效果较好。
汪长寿[6]（2008）在《绵羊毛囊培养方法的建立及雌二醇对毛囊Bcl-2、Bax表达的影响》文中研究表明毛囊是皮肤重要而复杂的附属器官,从内向外依次由毛根、内根鞘和外根鞘组成。本实验通过对绵羊毛囊的显微分离、培养,倒置显微镜观察培养毛囊早、中、后期的组织形态变化规律。目镜测微尺测量毛囊长度,同时做离体培养毛囊组织学检测,探讨体外培养毛囊的生长和周期性再生的变化特点和影响因素,从而建立了绵羊毛囊的理想的体外培养体系,为进一步研究奠定了基础;在体外培养体系中加入17-β-雌二醇,并运用RT-PCR方法、组织化学方法、实时荧光定量研究检测了雌激素对培养毛囊形态的影响及分子生物学方面培养毛囊中细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达与激素之间的相互关系。结果如下:1.生长期毛囊的鉴定结合运用显微解剖法、剪刀法、酶消化法等方法,成功地分离出了完好无损生长期毛囊。经形态学、组织切片方法鉴定,毛乳头显示为清晰椭圆,细胞紧凑且为洋葱头的纵切面形状（如图2-21～2-23）,毛囊内根鞘、外根鞘、毛根清晰可见,即所培养毛囊为生长期健康正常的毛囊,可以作为研究绵羊皮肤毛囊Bcl-2、Bax表达与激素关系的研究模型毛囊。毛乳头显示为模糊发暗无固定形状,内根鞘、外根鞘、毛干发黑毛乳头不可见,即为非生长期毛囊。本实验使用的毛囊均为生长期毛囊。2.体外培养绵羊毛囊体系的建立利用生长期健康正常的毛囊,在不同条件、不同培养液中对比培养并得出结果: 31℃、饱和湿度、5% CO2浓度的体外培养条件下,在Williams E无血清培养液中加入L-谷氨酰胺2mmol/l、Hepes 2mmol/l、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白10μg/ml、氢化可的松10ng/ml、亚硒酸钠10ng/ml、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml的体系是最佳选择。3.该体系中培养毛囊的特征:成活率达87.25%,前1～10天增长最快,前10天平均增长长度为0.36mm/d;一般15～20天都不会贴壁,前15天毛囊的形态没有明显的改变,生长后期,毛乳头紧凑成一团,且变得越来越小,整个毛囊变细。培养22天后毛囊出现贴壁,角朊细胞从外根鞘中迁出,毛囊生长减慢,从毛球至毛干逐渐发暗发黑外根鞘向外发散,表现明显的退化状态,但毛囊仍存活,总的趋势是体外培养毛囊随时间后移形态结构由清晰逐渐变为模糊。4.雌激素（17-β-雌二醇）对毛囊生长的影响在已建立好的体系中游离毛囊培养1天后筛选出生长较好的毛囊（增长速度≥0.1mm/d）,再更换添加有不同浓度雌激素的新的无血清培养液,运用倒置显微镜观察、目镜测微尺测量培养毛囊增长长度、制作培养毛囊早、中、后期的组织切片,对比观察其组织形态变化规律,记录结果并照相、数据统计分析。结果显示:雌激素对毛囊的生长有抑制作用,但有个别浓度（如:10-8mol/l）长势好于阴性对照,原因是该浓度接近体内正常生长浓度,此时体外培养毛囊生长环境接近体内稳定状态,所以长势好。10-10～10-9mol/l及10-7mol/l浓度的17-β-雌二醇对毛囊的生长有明显抑制作用。5. 17-β-雌二醇对凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达的影响本研究是在通过SYBR Green I荧光染料实时定量PCR方法,使SYBR Green I与DNA双链相结合。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱的原理,运用RT-PCR技术,对比研究凋亡调控基因Bcl-2、Bax在体外培养绵羊毛囊群中各个时间段的表达水平及两种基因表达与17-β-雌二醇之间的关系。从反转录水平评估及鉴定细胞凋亡相关基因的相互关系显示:（1） Bcl-2表达情况,体外培养1～6天的绵羊皮肤毛囊群Bcl-2表达情况:体外培养1～6天的绵羊皮肤毛囊群Bcl-2表达随雌激素浓度10-10mol/l至10-7mol/l范围内,呈现“倒V字”型表达,在10-8mol/l浓度中表达量达顶峰,但这浓度中的表达量远不如阴性对照组中的表达量高。对照组与其它不同浓度雌激素组之间差异极显着（p<0.01）。（2） Bax表达情况:体外培养1～6天的绵羊皮肤毛囊群Bax表达随雌激素浓度10-10mol/l至10-7mol/l范围内,与Bcl-2的表达趋势相似,也呈“倒V字”型表达,但表达量过低。（3） Bcl-2和Bax表达量的比值:培养1～6天的绵羊毛囊群Bcl-2和Bax表达量的比值比较,10-8mol/l浓度组极显着高于其它各组（p<0.01）。（4）在试验检测的培养1～6天的绵羊毛囊群Bcl-2、Bax表达中,Bcl-2/Bax值与培养毛囊形态学观察到的规律是一致的。在体外培养蒙古绵羊毛囊生长发育过程中,Bcl-2和Bax共同参与了凋亡的调节作用。
吴纲[7]（2008）在《毛囊源性干细胞成牙能力的实验研究》文中研究说明牙齿的发生和发育是在上皮-间充质相互作用的精确调控下完成的,这提示我们在选择种子细胞的时候必须同时考虑两种细胞,即上皮细胞和间充质细胞。目前发现的有望应用于牙组织工程的细胞大部分源于牙本身,如牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、根尖牙乳头干细胞等。在非牙源性成体干细胞方面,目前仅发现骨髓来源的细胞具有成牙潜能,而且必须依靠胚胎期的诱导条件才能分化为牙齿形成细胞。目前利用非牙源性细胞实现牙齿再生面临着种子细胞匮乏、诱导条件短缺的困难,另外,在成体中寻找适用于釉质再生的干细胞一直都是牙齿再生的瓶颈问题。毛囊是近年来干细胞研究的热点,毛囊中包含上皮和间充质两种来源的干细胞。本研究从成体干细胞可塑性和干细胞定向分化微环境两个方面入手,探讨利用毛囊来源的干细胞进行牙齿再生的可能性。1毛囊真皮细胞的分离培养和干细胞生物学特性的研究采用酶消化联合机械分离的方法在体外成功培养了具有较强增殖能力、克隆形成能力的毛囊真皮鞘细胞和毛乳头细胞。通过对其可塑性的研究证实这两类细胞中包含具有多向分化能力的干细胞。但是这些干细胞具有异质性,缺乏特异性表面标志物,难以有效分选。而含有干细胞的混杂细胞可以用来进行干细胞定向分化研究,未经纯化的毛囊真皮细胞在成脂、成骨诱导条件下,其中的所包含的干细胞表现出成脂和成骨潜能。在相同的成骨诱导条件下,毛乳头细胞的碱性磷酸酶活性比真皮鞘细胞更强,因此可能更适用于硬组织再生。2毛乳头间充质干细胞分化为成牙本质细胞在出生后小鼠下颌切牙根尖蕾牙胚细胞与毛乳头间充质干细胞混合共培养体系中,来自根尖蕾上皮的成牙信号能够促使毛乳头间充质干细胞分化为成牙本质细胞,说明诱导非牙源性干细胞成牙的微环境可以脱离发育早期牙胚的限制。在根尖蕾牙胚细胞条件培养液诱导下,毛乳头间充质细胞的形态和细胞周期明显改变并表达Dspp和Dmp1基因,说明来自根尖蕾细胞的上皮信号也能启动毛乳头间充质细胞的牙向分化。3毛乳头间充质干细胞构建牙本质牙髓复合体的实验研究为了研究利用非牙源性干细胞在脱离牙胚组织的条件下构建组织工程牙齿的可能性,我们将把经过根尖蕾牙胚细胞条件培养液诱导的毛乳头间充质细胞团进行体内移植后,仅形成骨样组织。将根尖蕾牙胚细胞条件培养液结合到脱蛋白牙本质片制成的支架材料上,种子细胞以细胞团的形式与支架材料进行复合后体内移植。取材结果显示:在结合在支架材料上的条件培养基的作用下,对照组的牙髓干细胞可以分化为成牙本质细胞,规则地排列在支架材料表面,并且形成管状牙本质。而毛乳头细胞只在支架材料表面形成少量无定形基质。这一结果也说明仅仅依靠信号分子的作用,不能实现非牙源性细胞分化为成熟的成牙本质细胞。4毛囊表皮干细胞应用于釉质再生的可能性利用组织块法成功培养毛囊上段的外根鞘细胞,这些细胞的自我更新能力强,呈克隆样生长,表达表皮干细胞的表面标志物β1整合素和角蛋白19,具有典型的表皮干细胞特征。在此基础上,我们利用E17胎鼠下颌第一磨牙牙乳头和出生后7 d C57BL/6 GFP小鼠下颌切牙根尖蕾间充质,分别与E17胎鼠表皮和体外培养的毛囊表皮干细胞进行重组,结果显示,E17胎鼠下颌第一磨牙牙乳头与生后7 d C57BL/6 GFP小鼠下颌切牙根尖蕾间充质均具有诱导E17胎鼠表皮细胞分化为成釉细胞的能力,但是没有充分的证据表明体外培养的毛囊表皮干细胞在这两种诱导条件下可以分化为成釉细胞。综上所述,本研究首次证实了毛乳头间充质干细胞在小鼠下颌切牙根尖蕾上皮信号的诱导下能够分化为成牙本质细胞,但是仍无法在脱离牙胚组织的条件下独立成牙。根尖蕾间充质对非牙源性上皮的诱导能力与E17下颌第一磨牙牙乳头相似,本实验暂无直接证据可以证明新生鼠触须部毛囊表皮干细胞具有分化为成釉细胞的潜能。
刘鹏[8]（2007）在《复合骨髓间充质干细胞组织工程皮肤的构建及其促进皮肤创伤愈合的研究》文中研究指明骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是干细胞与组织工程领域新的研究热点,BMMSCs是一种可以多向分化的成体干细胞,具有取材方便,易分离培养,增殖能力强,来源于自体无排斥反应的特点。近年来,尽管已成功应用自体成熟细胞如成纤维细胞来修复皮肤缺损,但BMMSCs与这些分化的细胞相比具有更大的优势。因为BMMSCs是中胚层来源的干细胞,在体外培养的过程中,BMMSCs可以保持未分化表型不断增殖,达到所需数量,再经诱导可分化为所需表型;另外,BMMSCs易于从骨髓中分离获得,避免了通过手术从患者自身获取成熟细胞所造成的二次损伤。本研究在实验室成功培养了组织工程皮肤的种子细胞:角朊细胞,成纤维细胞和骨髓间充质干细胞;建立皮肤损伤动物模型:直接切除模型和烧伤模型;用构建的组织工程全层皮肤和含BMMSCs的组织工程真皮修复损伤模型,观察修复效果,为构建具有生理功能的组织工程皮肤奠定基础。第一部分:种子细胞的培养以免疫原性较低的新生猪背部皮肤为取材对象,Dispase酶消化过夜仔细分离表皮层和真皮层,表皮层用胰酶消化后得到的细胞用角朊细胞培养基（K-SFM）培养;真皮层剪碎用胶原酶消化后得到的成纤维细胞用4种不同培养基培养,MTT和BrdU检测活力。角朊细胞和成纤维细胞在体外生长状态良好,增殖快,呈典型的铺路石样和长梭形。从猪髂骨处抽取骨髓,本实验采用Percoll密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合分离纯化BMMSCs,多次传代后的BMMSCs为形态均一、排列有序的成纤维细胞样,提示传代过程对纯化骨髓单个核细胞中的BMMSCs有一定作用。猪BMMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持良好的状态,有分化的潜能,可作为组织工程皮肤的种子细胞。第二部分:组织工程皮肤的研制将成纤维细胞种植入Ⅰ型胶原凝胶中,培养3 d后,将表皮细胞接种在凝胶的表面,继续培养2 d ,然后将凝胶移至气液面进行复层化3 d。结果发现所培养的人工皮肤具备表皮层和真皮层,其结构和正常皮肤的结构相似。证明了以新生猪皮肤为细胞来源、Ⅰ型胶原为支架构建的全层组织工程皮肤,在组织学上与皮肤组织结构相类似,可以作为皮肤替代物。体外培养并扩增猪BMMSCs,用PKH26荧光染色试剂盒进行荧光标记,将标记好的细胞种植入Ⅰ型胶原凝胶中,培养3 d后后将凝胶移至气液面继续培养2 d。光镜下可见与正常皮肤的真皮部分相似,表皮层缺如,真皮层较厚,但组织工程皮肤中缺少毛囊、汗腺和血管结构等。荧光显微镜观察可见,在真皮层中富含PKH26标记的细胞（胞膜呈红色荧光）。第三部分:组织工程皮肤修复动物皮肤缺损的实验研究用构建的组织工程全层皮肤和含BMMSCs的组织工程真皮修复动物的急性切除模型,观察创面愈合情况。TE全层组和BMMSCs组在皮片成活率和创面收缩率上无明显差异,HE、Masson、网状纤维和PAS染色观察组织学变化,发现BMMSCs组具有良好的组织相容性和生物学活性,与受者愈合良好,未见显着的免疫排斥反应。用实验室自行研制的烫伤仪,根据调整烫头和皮肤接触的时间和温度,调节烫伤仪至:温度100℃,时间20 s,模拟深Ⅱ度烫伤模型。用组织工程全层皮肤和复合BMMSCs（PKH26标记）的组织工程真皮修复烫伤创面,移植2 wk后实验组创面基本愈合,TE全层组和BMMSCs组的愈合时间、效果没有差异。BMMSCs组真皮层毛细血管增生,6 wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质细胞,免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性。含有BMMSCs的组织工程皮肤移植后促进了烫伤创面愈合,获得了较理想的愈合效果,为临床治疗提供了新的思路。
易先锋,宋春红,林映莲[9]（2007）在《猪真皮基质上培养人表皮细胞重组皮肤的实验研究》文中研究指明目的:在猪真皮基质培养人表皮细胞重组复合皮。方法:取成人健康的包皮（包皮切除术自愿的提供者）1cm2全层皮片中用Th-Tr法分离表皮细胞并进行计数,以无血清完全培养基培养法作为原代细胞培养,空白对照组不放任何培养支持物。脱细胞猪真皮基质作为支架的气液界面培养法培养表皮细胞为实验组。形态学、常规组织学、HE染色观察,免疫组织染色（SABC法）检测复合皮肤中Pancy-tokeratin和层粘连蛋白（laminin）。结果:HE染色显示有2层上皮细胞形成和无基底膜形成,稍有角质化,免疫组化染色显示Pancy-tokeratin（+++）,提示在猪真皮基质上生长的为人表皮细胞;Laminin（±）,提示培养的人表皮细胞产生的新的基底膜不明显。结论:在猪真皮基质上能进行人表皮细胞的培养,这种人表皮细胞能存活,但生长不太活跃。基底膜形成不明显。实验证明能在体外构建具有表皮与真皮复合皮肤,但这种复合皮能否作为一种临床有效皮肤还需进一步证实。
史明艳[10]（2006）在《山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究》文中研究指明组织工程皮肤自发展20多年来取得了很大的进展,目前已有数种组织工程皮肤应用于临床,为大面积烧伤以及和各种原因引起的皮肤大面积溃烂患者带来了福音。但是,已有的组织工程皮肤只是在结构上具有了皮肤的屏障功能,而不能形成毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器官。临床移植后发现,创面干燥、皴裂、缺乏韧性和弹性等,给患者造成一定的痛苦。因此,构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤是未来组织工程发展的方向。研究发现,皮肤中的干细胞主要位于毛囊外根鞘隆突部位,毛囊干细胞具有多能性,它们在相关信号的作用下,可向上迁移参与皮脂腺和表皮的形成,向下迁移参与毛囊的形成。因此,以毛囊干细胞为种子细胞构建具有毛囊的组织工程皮肤,是一个理想的方案。但是由于毛囊干细胞存在部位隐蔽,缺乏特异性表面标志,从而限制了毛囊干细胞的体外研究和应用。本研究从山羊毛囊干细胞分离、培养、生物学特性以及分化潜能等方面进行了研究,并以毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞构建组织工程皮肤。主要内容包括:1.山羊毛囊干细胞分离培养体系的建立（1）将关中奶山羊耳部皮肤样本清洗干净剪碎后,用0.5%的胶原酶I,37℃消化1.5～2h,在体视显微镜下分离、挑选出完整毛囊,用0.25 %胰酶消化毛囊,37℃消化20～30min,获得单个细胞。将细胞以5×105/mL的密度分别接种与20μg/mL IV胶原包被的6孔板中,20min后,吸出未贴附细胞,加入无血清培养液培养（DMEM/F12 +2%BSA+5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortisone+10ng/mLEGF+10 ng/mL IGF +10%条件培养基）,5d后消化传代。（2）对比了DMEM/F12和F12基础培养体系以及不同浓度的EGF、IGF-1以及条件培养液对山羊毛囊干细胞增殖的影响,筛选出以DMEM/F12 +2%BSA +5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortison+15ng/mLEGF+10ng/mLIGF-1+20%条件培养液为山羊毛囊干细胞的优化培养体系。在此培养体系中,山羊毛囊干细胞可连续传至19代。2.山羊毛囊干细胞生物学特性研究（1）本研究所分离的毛囊干细胞为上皮细胞形态,在体外呈克隆性生长;电镜观察显示,细胞表现出原始细胞特征:细胞体积小,直径≤10μm;细胞表面微绒毛发达;核质比高;核内以常染色质为主,异染色质少,细胞器不发达等。（2）细胞生长曲线显示,前13代细胞生长良好,至16代,增值能力有所下降。这可能是随着细胞传代的增加,体外培养条件不能维持其未分化状态。分离的山羊毛囊干细胞液氮冷冻保存2×108,解冻成活率≥95%。
二、表皮细胞无血清培养基血清代用品的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、表皮细胞无血清培养基血清代用品的实验研究（论文提纲范文）
（1）基于两种生物支架材料的3D OMM的构建及其效果评价（论文提纲范文）
| 中英文缩略词索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 HGF与HOK的体外培养及3D结缔组织模型的构建 |
| 引言 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 针对Matrigel支架材料组织切片方法的改良 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 两种不同生物支架材料构建3D OMM的效果对比 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）兰坪虫草菌粉及其提取物对慢性肾功能衰竭小鼠的改善作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性肾衰竭的研究概况 |
| 1.1.1 慢性肾功能衰竭的发病机制 |
| 1.1.2 慢性肾功能衰竭的治疗现状 |
| 1.2 虫草的药用研究 |
| 1.3 本课题研究的目的和意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 第2章 兰坪虫草菌粉及其水提物对慢性肾衰竭小鼠的改善作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 动物材料 |
| 2.2.2 实验药物 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 实验样本制备 |
| 2.2.5 实验主要试剂的配制 |
| 2.2.6 小鼠慢性肾衰竭模型制备方法 |
| 2.2.7 实验动物的分组和给药方法 |
| 2.2.8 实验动物的处理和标本的收集 |
| 2.3 检测指标 |
| 2.3.1 小鼠生活状况 |
| 2.3.2 肾脏组织病理学检查 |
| 2.3.3 小鼠血清尿素氮含量测定(脲酶法) |
| 2.3.4 小鼠血肌酐的含量测定(苦味酸比色法) |
| 2.3.5 小鼠血磷的含量测定 |
| 2.3.6 小鼠血钙的含量测定 |
| 2.3.7 小鼠血清超氧化物歧化酶活力测定 |
| 2.3.8 小鼠血清丙二醛含量测定(TBA法) |
| 2.3.9 小鼠血清谷胱甘肽的含量测定 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 兰坪虫草影响小鼠的生活状态 |
| 2.5.2 兰坪虫草对小鼠肾脏组织病理学变化的影响 |
| 2.5.3 兰坪虫草影响小鼠血清尿素氮的含量 |
| 2.5.4 兰坪虫草影响小鼠血肌酐的含量 |
| 2.5.5 兰坪虫草影响小鼠血磷的含量 |
| 2.5.6 兰坪虫草影响小鼠血钙的含量 |
| 2.5.7 兰坪虫草影响小鼠血清超氧化物歧化酶活力 |
| 2.5.8 兰坪虫草影响小鼠血清丙二醛的含量 |
| 2.5.9 兰坪虫草影响小鼠血清谷胱甘肽的含量 |
| 2.6 小节 |
| 2.7 讨论 |
| 第3章 兰坪虫草菌粉及其水提物对慢性肾衰竭小鼠的改善作用机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 动物材料 |
| 3.2.2 实验药物 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.2.4 实验主要试剂的配制 |
| 3.2.5 实验动物组织的的收集和处理 |
| 3.2.6 制备肾小管上皮细胞悬液 |
| 3.2.7 炎症相关细胞因子qRT-PCR引物的设计 |
| 3.2.8 小鼠肾脏蛋白的提取及浓度检测(BCA法) |
| 3.3 检测指标 |
| 3.3.1 ROS(活性氧)含量检测 |
| 3.3.2 炎症相关细胞因子的基因相对表达水平检测 |
| 3.3.3 炎症相关细胞因子蛋白表达量检测 |
| 3.3.4 凋亡相关细胞因子蛋白表达量检测 |
| 3.3.5 肾脏组织细胞凋亡检测 |
| 3.3.6 肾脏组织巨噬细胞数量检测 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 兰坪虫草影响肾脏组织中ROS(活性氧)含量 |
| 3.5.2 兰坪虫草影响炎症相关细胞因子的基因相对表达水平 |
| 3.5.3 兰坪虫草影响炎症相关细胞因子的蛋白表达量 |
| 3.5.4 兰坪虫草对小鼠肾脏组织细胞凋亡的影响 |
| 3.5.5 兰坪虫草影响小鼠肾脏组织中巨噬细胞的数量 |
| 3.6 小节 |
| 3.7 讨论 |
| 第4章 结论及展望 |
| 4.1 研究结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（3）诱导脐血造血干/祖细胞分化为红系祖细胞及其规模化扩增（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 前言 |
| 2 红系祖细胞诱导扩增体系的建立 |
| 2.1 红系祖细胞诱导扩增体系的建立与验证 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 实验结果 |
| 2.2 诱导扩增后红系祖细胞的表型与功能鉴定 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 红系祖细胞诱导扩增体系的优化 |
| 3.1 添加小分子优化红系诱导扩增体系 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.2 Fed-batch的二维模拟优化培养模式 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 红系祖细胞的规模化扩增 |
| 4.1 利用WAVE生物反应器扩增红系祖细胞 |
| 4.1.1 材料与方法 |
| 4.1.2 实验结果 |
| 4.2 红系祖细胞的体内存活及安全性检测 |
| 4.2.1 材料与办法 |
| 4.2.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的主要研究成果目录 |
| 致谢 |
（4）肝素和白血病抑制因子对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 第一部分 肝素对自制无血清代用品培养的小鼠胚胎干细胞影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 仪器和设备 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制备原代 MEF |
| 2.2 MEF 的传代、冻存 |
| 2.3 制备 MEF 饲养层 |
| 2.4 MEF 复苏 |
| 2.5 小鼠 ESC 复苏 |
| 2.6 小鼠 ESC 的培养 |
| 3 实验分组及实验步骤 |
| 3.1 实验分组 |
| 3.2 实验步骤 |
| 第二部分 白血病抑制因子对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 仪器和设备 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 经丝裂霉素 C 处理过的 MEF 复苏 |
| 2.2 小鼠 ESC 复苏 |
| 2.3 mESCs 的培养 |
| 2.4 mESCs 的传代、冻存 |
| 3 实验分组和实验步骤 |
| 3.1 实验分组 |
| 3.2 实验步骤 |
| 第三部分 肝素和 LIF 协同对自制无血清培养小鼠胚胎干细胞的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂、仪器和设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 经丝裂霉素 C 处理过的 MEF 复苏 |
| 2.2 小鼠 ESC 复苏 |
| 2.3 ESC 的培养 |
| 2.4 ESC 的传代、冻存 |
| 3. 实验分组及实验步骤 |
| 3.1 实验分组 |
| 3.2 实验步骤 |
| 第3章 实验结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 全文结论与总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）旋转式生物反应器内微载体培养扩增皮肤相关细胞及微粒皮肤的初步制备（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 皮肤的组织学与创伤愈合 |
| 2 组织工程化皮肤的硏究 |
| 3 规模化细胞培养 |
| 4 生物反应器 |
| 5 旋转式细胞培养系统（The Rotary Cell Culture System, RCCS） |
| 6 细胞微载体培养技术 |
| 实验一 人真皮成纤维细胞和人表皮细胞的体外培养及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 旋转式生物反应器培养扩增人皮肤成纤维细胞的特性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 使用旋转生物反应器体外扩增人表皮细胞 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 使用旋转式生物反应器制备微粒皮肤 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）绵羊毛囊培养方法的建立及雌二醇对毛囊Bcl-2、Bax表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 毛囊结构研究的进展 |
| 1.1.1 毛囊的基本结构 |
| 1.1.2 毛囊的组织发生 |
| 1.1.3 毛与毛囊的周期性变化 |
| 1.1.4 影响毛囊生长相关因子的研究进展 |
| 1.1.5 毛囊干细胞的研究进展 |
| 1.1.6 毛囊体外培养的研究现状 |
| 1.1.7 毛囊的分离方法 |
| 1.1.8 毛囊的培养 |
| 1.1.9 毛囊体外培养主要的研究模型 |
| 1.2 毛囊体外培养研究的价值及前景 |
| 1.2.1 离体毛囊体外培养的应用 |
| 1.2.2 离体毛囊体外培养在雄激素源性脱发治疗中的应用 |
| 1.2.3 离体毛囊体外培养在痤疮治疗中的应用 |
| 1.3 毛囊体外培养的研究要解决的问题 |
| 1.4 毛囊细胞凋亡的研究进展 |
| 1.4.1 细胞凋亡的研究 |
| 1.4.2 细胞凋亡的基因调控 |
| 1.5 毛囊细胞凋亡的研究现状及研究意义 |
| 1.6 PCR 技术进展 |
| 1.6.1 定量PCR 方法研究进展 |
| 1.6.2 竞争性RT-PCR 方法原理 |
| 1.6.3 基因组文库 |
| 1.6.4 cDNA 基因文库 |
| 1.6.5 PCR 法分离目的基因 |
| 1.7 定量PCR |
| 1.7.1 常用的实时定量PCR 方法 |
| 1.7.2 影响QRTPCR 的因素 |
| 1.7.3 Ct 值 |
| 1.8 RT-PCR 简介 |
| 1.8.1 RT-PCR 引物的选择 |
| 1.8.2 RT-PCR 影响因素 |
| 1.9 我们开展绵羊皮肤毛囊培养的目的与意义 |
| 2 实验一不同培养条件对体外培养绵羊毛囊生长的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验药品与试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶液的配置 |
| 2.2.2 绵羊皮肤毛囊的分离 |
| 2.2.3 Sacpic 染色 |
| 2.2.4 绵羊皮肤毛囊HE 染色 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 培养毛囊的形态观察 |
| 2.3.2 培养毛囊的组织结构观察 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 能挑选出完好无损健康的生长期毛囊是体外培养毛囊研究的首要问题 |
| 2.4.2 绵羊皮肤毛囊培养液的选择是体外培养毛囊研究的核心问题 |
| 2.4.3 绵羊皮肤毛囊培养液相关因子的加入 |
| 2.4.4 绵羊皮肤毛囊培养条件的选择 |
| 2.4.5 毛囊的体外生长特点的分析 |
| 2.5 结论 |
| 3 实验二17-β-雌二醇对体外培养毛囊生长影响的形态学上的观察 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 仪器与主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液的配置 |
| 3.2.2 绵羊皮肤毛囊的分离 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 培养毛囊的形态观察 |
| 3.3.2 不同浓度17-β-雌二醇组与对照组之间的对比观察结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 生理状态下雌激素和实验中 17-β-雌二醇的浓度确定 |
| 3.4.2 雌激素对毛囊和毛发生长的影响 |
| 3.4.3 雄激素对毛囊和毛发生长的影响 |
| 3.5 结论 |
| 4 实验三 蒙古绵羊皮肤毛囊 Bcl-2、Bax 基因表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物及组织 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 PCR 引物的设计及合成 |
| 4.1.4 蒙古绵羊皮肤毛囊群总 RNA 的提取及检测 |
| 4.1.5 RT-PCR 产物 cDNA 的序列测定 |
| 4.1.6 序列分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 蒙古绵羊皮肤毛囊总 RNA 的检测结果 |
| 4.2.2 蒙古绵羊皮肤毛囊 RT-PCR 扩增结果 |
| 4.2.3 蒙古绵羊皮肤毛囊 PCR 产物的序列分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 Bcl-2、Bax 的表达 |
| 4.3.2 蒙古绵羊皮肤毛囊 Bcl-2、Bax 基因表达情况 |
| 4.3.3 提取样品总RNA 时注意的问题 |
| 4.4 结论 |
| 5 实验四 实时定量 PCR 检测 17-β-雌二醇对培养毛囊 Bcl-2、Bax 表达的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料处理同本论文4.1.1 |
| 5.1.2 实验材料 |
| 5.1.3 仪器及试剂 |
| 5.1.4 PCR 引物的设计及合成 |
| 5.2 实验设计 |
| 5.2.1 添加雌激素 17-β-雌二醇 |
| 5.2.2 毛囊总RNA 的提取 |
| 5.2.3 荧光定量 RT-PCR 检测培养的毛囊 Bcl-2、Bax 表达的定量方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 荧光定量 RT-PCR 检测培养的毛囊 Bcl-2、Bax 表达定量方法的确定 |
| 5.3.2 添加 17-β-雌二醇对培养毛囊 Bcl-2 和 Bax 表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 毛囊群的培养 |
| 5.4.2 Bcl-2 的表达 |
| 5.4.3 Bax 的表达 |
| 5.4.4 Bcl-2、Bax 基因在毛囊中表达的意义 |
| 5.4.5 PCR 反应体系的探讨 |
| 5.5 结论 |
| 6 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）毛囊源性干细胞成牙能力的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾一 牙齿再生的研究进展 |
| 1 牙齿再生的基础:深入理解正常牙齿发育过程 |
| 2 牙齿再生的关键:种子细胞 |
| 3 展望 |
| 文献回顾二 毛囊干细胞研究进展 |
| 1 毛囊的解剖结构 |
| 2 毛囊形态发生及周期性生长 |
| 3 毛囊中的干细胞 |
| 第一部分 毛囊真皮细胞的分离培养和与生物学特性研究 |
| 实验一 真皮鞘细胞的分离培养和鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 毛乳头细胞的分离培养和鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 毛囊真皮干细胞生物学特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 毛乳头间充质干细胞成牙能力的实验研究 |
| 实验一 根尖蕾诱导毛乳头间充质干细胞分化为成牙本质细胞 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 利用毛乳头间充质干细胞组织工程牙本质牙髓复合体 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 毛囊表皮干细胞应用于釉质再生的实验研究 |
| 实验一 毛囊表皮干细胞的体外培养和鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 毛囊表皮干细胞分化为成釉细胞潜能的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）复合骨髓间充质干细胞组织工程皮肤的构建及其促进皮肤创伤愈合的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 种子细胞的培养 |
| 实验一 皮肤种子细胞的分离培养 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 骨髓间充质干细胞的分离培养 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 组织工程皮肤的研制 |
| 实验一 猪全层组织工程皮肤的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 复合骨髓间充质细胞组织工程真皮的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 组织工程皮肤修复动物皮肤缺损的实验研究 |
| 实验一 组织工程皮肤修复动物急性皮肤缺损的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 组织工程皮肤修复烫伤创面的实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
| 附图 |
（10）山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 皮肤结构与皮肤干细胞 |
| 1.1 皮肤的组成结构 |
| 1.2 毛囊、汗腺、皮脂腺关系 |
| 1.3 皮肤干细胞 |
| 1.4 表皮干细胞和毛囊干细胞 |
| 第二章 表皮干细胞研究概况 |
| 2.1 表皮干细胞分布模式学说 |
| 2.1.1 表皮增殖单位（Epidermal Proliferation unit. EPU）学说 |
| 2.1.2 网状嵴分布模式 |
| 2.2 表皮干细胞的特点 |
| 2.3 表皮干细胞表面标志 |
| 2.3.1 整合素家族 |
| 2.3.2 角蛋白（keratin） |
| 2.3.3 P63 转录因子 |
| 2.3.4 Connexi1143（Cx43）连接蛋白 |
| 2.4 表皮干细胞应用前景 |
| 第三章 毛囊及毛囊干细胞 |
| 3.1 毛囊的胚胎发生 |
| 3.2 毛囊组成结构 |
| 3.3 毛囊的生长周期 |
| 3.4 毛囊各种细胞生物学特性研究 |
| 3.4.1 毛乳头细胞 |
| 3.4.2 毛囊真皮鞘成纤维细胞 |
| 3.4.3 毛囊真皮细胞成分在皮肤创伤修复中的应用 |
| 3.4.4 毛囊干细胞研究 |
| 第四章 成体干细胞可塑性研究 |
| 4.1 成体干细胞可塑性概念的提出 |
| 4.2 成体干细胞可塑性研究概况 |
| 4.2.1 骨髓干细胞可塑性研究 |
| 4.2.2 神经干细胞可塑性研究 |
| 4.2.3 肝脏干细胞可塑性研究 |
| 4.2.4 皮肤干细胞可塑性 |
| 4.2.5 其他组织干细胞可塑性 |
| 4.3 成体干细胞可塑性分化机制 |
| 4.4 成体干细胞可塑性引发的争议 |
| 4.5 成体干细胞可塑性引发的思考 |
| 4.5.1 在不同组织中是否存在一种统一的干细胞（Universal Stem Cell） |
| 4.5.2 建立评价成体干细胞可塑性的标准 |
| 4.6 结论和前景 |
| 第五章 组织工程皮肤研究进展 |
| 5.1 组织工程学概念及原理 |
| 5.2 组织工程皮肤种类 |
| 5.2.1 表皮替代物 |
| 5.2.2 真皮替代物 |
| 5.2.3 人工全层皮肤 |
| 5.3 组织工程皮肤临床应用 |
| 5.3.1 Integra |
| 5.3.2 Apligraft |
| 5.3.3 Dermagraft |
| 5.3.4 AlloDerm |
| 5.4 存在问题及展望 |
| 5.4.1 种子细胞问题 |
| 5.4.2 支架材料 |
| 实验研究 |
| 第六章 山羊毛囊干细胞分离培养方法研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 不同浓度的IV 胶原对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.2 不同粘附时间对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.3 粘附法对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.4 毛囊干细胞在不同培养液中增殖特征 |
| 6.2.5 不同浓度的EGF 对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.2.6 不同浓度的IGF-1 对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.2.7 不同浓度的条件培养液对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 山羊毛囊干细胞分离方法探讨 |
| 6.3.2 山羊毛囊干细胞培养体系的筛选 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 山羊毛囊干细胞生物学特性 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 山羊毛囊干细胞形态特征 |
| 7.2.2 山羊毛囊干细胞扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）分析 |
| 7.2.3 山羊毛囊干细胞透射电镜（transmission electron microscope，TEM）分析 |
| 7.2.4 山羊毛囊干细胞生长曲线分析 |
| 7.2.5 山羊毛囊干细胞冷冻解冻效果 |
| 7.2.6 山羊毛囊干细胞表面标志的免疫组化检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 山羊毛囊干细胞形态特征 |
| 7.3.2 山羊毛囊干细胞生长曲线分析 |
| 7.3.3 山羊毛囊干细胞的细胞的冷冻与复苏 |
| 7.3.4 山羊毛囊干细胞表面标志检测 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 山羊毛囊干细胞诱导分化 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 山羊毛囊干细胞向心肌细胞分化 |
| 8.2.2 山羊毛囊干细胞向成骨细胞分化 |
| 8.2.4 山羊毛囊干细胞向神经细胞分化 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 山羊毛囊干细胞向心肌诱导分化 |
| 8.3.2 山羊毛囊干细胞向成骨诱导分化 |
| 8.3.3 山羊毛囊干细胞向脂肪诱导分化 |
| 8.3.4 山羊毛囊干细胞向神经诱导分化 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 山羊组织工程皮肤构建及移植效果检测 |
| 9.1 材料和方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果与分析 |
| 9.2.1 羊膜可有效地降低胶原凝胶的收缩 |
| 9.2.2 组织工程皮肤检测 |
| 9.2.3 组织工程皮肤移植及观察 |
| 9.3 讨论 |
| 9.3.1 真皮支架的制作 |
| 9.3.2 毛囊干细胞、毛囊真皮细胞在毛囊形成中的作用 |
| 9.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 下一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、表皮细胞无血清培养基血清代用品的实验研究（论文参考文献）
- [1]基于两种生物支架材料的3D OMM的构建及其效果评价[D]. 胡勤. 福建医科大学, 2019(07)
- [2]兰坪虫草菌粉及其提取物对慢性肾功能衰竭小鼠的改善作用研究[D]. 何益锋. 昆明理工大学, 2019(04)
- [3]诱导脐血造血干/祖细胞分化为红系祖细胞及其规模化扩增[D]. 王金明. 中南大学, 2013(05)
- [4]肝素和白血病抑制因子对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞的作用[D]. 郭玲玲. 南昌大学, 2012(01)
- [5]旋转式生物反应器内微载体培养扩增皮肤相关细胞及微粒皮肤的初步制备[D]. 晁洋. 第四军医大学, 2011(04)
- [6]绵羊毛囊培养方法的建立及雌二醇对毛囊Bcl-2、Bax表达的影响[D]. 汪长寿. 内蒙古农业大学, 2008(11)
- [7]毛囊源性干细胞成牙能力的实验研究[D]. 吴纲. 第四军医大学, 2008(03)
- [8]复合骨髓间充质干细胞组织工程皮肤的构建及其促进皮肤创伤愈合的研究[D]. 刘鹏. 第四军医大学, 2007(04)
- [9]猪真皮基质上培养人表皮细胞重组皮肤的实验研究[J]. 易先锋,宋春红,林映莲. 实用医学杂志, 2007(05)
- [10]山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究[D]. 史明艳. 西北农林科技大学, 2006(05)