一、人工感染雏鹅新型病毒性肠炎病毒的形态发生及宿主细胞的超微结构变化（论文文献综述）
林鹏[1]（2019）在《水貂肠炎病毒NS1非结构蛋白调控细胞凋亡的分子机制》文中进行了进一步梳理水貂病毒性肠炎（Mink viral enteritis,MVE）是由水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus,MEV）引起水貂一种高度接触性、急性传染病,具有高发病率和高死亡率特点,其中幼貂极易感染。MEV DNA基因组包含两个主要的开放阅读框:编码非结构蛋白NS1和NS2以及结构蛋白VP1和VP2,其中NS1非结构蛋白主要调节MEV复制,反式激活编码病毒结构蛋白。目前已经被证实多种细小病毒NS1具有细胞毒性且能诱导细胞凋亡,因此细小病毒NS1一直是研究的热点。目前MEV及其NS1诱导细胞凋亡的分子机理仍不明确。本研究旨在通过分析MEV及其NS1诱导细胞凋亡的信号途径及其作用机制,为揭示MEV引起水貂致病机理奠定理论基础。为了揭示MEV在体内、体外是否能诱导细胞凋亡的发生。体内方面,我们将MEVB细胞毒株感染健康的水貂,分析体内消化道各个组织细胞凋亡情况。结果分析发现,感染病毒的水貂消化道组织出现不同程度的病理变化;采用TUNEL方法检测凋亡细胞,发现被病毒感染水貂的食管、小肠、肠系膜淋巴结、肾脏中发现有凋亡细胞,而舌没有发现细胞凋亡情况。体外方面研究发现MEVB感染F81细胞后,能显着抑制细胞的生长,并且导致细胞在G1期的积累,诱导细胞凋亡的发生。这些结果表明MEV在体内、体外均能诱导细胞凋亡的发生。为了进一步确定MEV NS1、NS2、VP1和VP2是否能诱导细胞凋亡的发生,我们分别构建MEV NS1、NS2、VP1和VP2真核表达质粒,转染到F81和HEK293T细胞中分析诱导细胞凋亡情况。研究显示NS1能显着抑制F81和HEK293T细胞活性,对细胞产生毒性反应,然而VP1和VP2不能抑制细胞活性且不能产生细胞毒性。利用流式细胞术检测NS1、NS2、VP1和VP2对细胞周期和细胞凋亡情况的影响,结果显示NS1能导致F81和HEK293T细胞周期阻滞在G1期,同时采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测发现,NS1能诱导细胞凋亡的发生。进一步研究发现MEV NS1能导致细胞核呈现碎块状致密浓染、并且能产生DNA Ladder现象,电镜发现染色质浓缩,细胞核凝聚形成大小不等,产生凋亡小体。这些结果表明MEV NS1具有诱导细胞凋亡的能力,而NS2、VP1和VP2不能诱导细胞凋亡。在上述研究的基础上,进一步分析MEV NS1引起细胞凋亡的作用机制。利用Western blot、免疫荧光和流式细胞术分析MEV NS1对细胞内Caspase和凋亡相关蛋白的影响。发现NS1能激活Caspase-9和Caspase-3,而Caspase-8和Caspase-12没有被活化;同时发现NS1能使Bax/Bcl-2比值升高,Bcl-2（Ser 70）磷酸化;促进Bax从胞浆中转位进入线粒体,Cyt C线粒体释放进入细胞质中诱导凋亡发生;NS1能降低线粒体膜电位、提高线粒体膜通透性并且导致细胞内ROS积累;NS1能抑制p38 MAPK和p53启动子活性,还能导致p38 MAPK（Thr 180/Tyr 182）和p53（Ser 15）、p53（Ser 20）发生磷酸化;为了进一步揭示其作用机制,我们用p38 MAPK和p53特异性抑制剂预处理细胞,结果显示NS1诱导细胞凋亡的能力显着下降。综合以上研究结果表明,MEV NS1通过线粒体介导的细胞凋亡途径诱导凋亡,同时p38 MAPK和p53在NS1诱导细胞凋亡过程中起到重要的调节作用。
吴英[2]（2015）在《鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究》文中提出鸭瘟（duck plague）又称鸭病毒性肠炎（duck virus enteritis）,是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。本病发病快、死亡率高,是目前世界各国水禽业危害最严重的传染病之一。该病的病原鸭瘟病毒（Duck Plague virus, DPV）是疱疹病毒科（Herpesvirales）、α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）、马立克氏病毒属（Mardivirus）的成员之一。但由于DPV的研究起步晚,其分子生物学研究远远落后于其它疱疹病毒。一段时间以来对于DPV的研究多集中于流行病学、诊断和防治等方面；与其分子生物学特性相关的基础研究,如病毒的基因组结构、物理图谱、病毒基因功能以及病毒在机体细胞和组织中的复制及致病机理、病毒感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面研究均有许多不明之处。因此本论文的主要目的就是希望对本实验室测序获得的鸭瘟病毒基因组序列进行解析；并通过构建一个可以对DPV进行细菌遗传学操作的平台,为DPV的基因功能研究提供技术手段的支持,此外利用该平台用两步RED重组敲除UL55基因,验证此平台的可行性并初步阐释UL55功能。主要研究内容如下：1鸭瘟病毒中国强毒株基因组信息解析对本实验室测序获得的鸭瘟中国强毒株的基因组序列进行生物信息学分析。鸭瘟病毒中国强毒株基因组组成为双股线状双链DNA:UL-IRS-US-TRS,是典型的D型疱疹病毒基因组结构。DPV CHv基因组全长162,175 bp,GC含量为44.89%,包括潜在的76个能编码功能蛋白的ORF。BLAST搜寻相似性序列发现五条与DPV CHv同期或之后提交的其他鸭瘟病毒毒株全基因组序列,他们间具有高度同源性,进化树分析显示六株DPV病毒按地域和毒力差异进行分类,DPV CHv处于进化树的中间位置。对基因组编码区的ORF进行扫描分析发现,六株DPV在UL、US区域分别有23、5个ORF在核苷酸水平上存在整个ORF的缺失、部分序列插入、缺失等情况出现,这些突变的产生可能是造成六株不同来源毒株毒力和地理差异的主要原因。而DPV基因组中不存在核苷酸序列插入或缺失的53个ORF在氨基酸水平上高度同源,多为DPV基因组的保守性基因,不受病毒传代致弱及地域差异的影响,编码蛋白大多为与病毒DNA代谢相关的结构蛋白。密码子使用模式分析结果显示其在基因组密码子的使用上偏向A/T结尾的密码子,其密码子使用模式主要受突变压力的影响。将其与人类、大肠杆菌、酵母的密码子使用模式进行比较,结果表明鸭瘟病毒的密码子使用模式与酵母系统更为接近。2鸭瘟病毒UL55基因生物信息学分析DPV UL55基因由561bp核苷酸组成,包括一个完整的开放性阅读框,编码一个由186个氨基酸组成的20.7981kDa蛋白质。UL55蛋白没有信号肽及跨膜区。密码子分析显示UL55基因偏向A/T结尾的密码子,密码子使用模式与人类最接近。UL55蛋白整体表现出亲水性,抗原表位主要集中在相应亲水区域的无规则卷曲,其功能与病毒的装配、出芽、成熟和释放相关。基于核苷酸序列的进化树分析显示DPV属于马立克氏病毒基因属的一员。3鸭瘟病毒UL55基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备通过将UL55基因通过克隆到表达载体pET32a（+）上实现对UL55蛋白的原核表达,试验表明重组UL55基因能在大肠杆菌BL21（DE）中进行融合表达。通过优化诱导表达条件,UL55重组蛋白能在37℃条件下,通过0.8mmM的IPTG诱导表达4h产生大量非可溶形式的包涵体蛋白。将包涵体蛋白通过裂解后进行纯化及复性处理再与兔抗DPV CHv多克隆抗体进行免疫印迹反应,结果表明纯化复性后的UL55蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。复性后的UL55蛋白免疫兔子制备的高免血清能够与UL55重组蛋白发生良好的免疫反应。4原核表达UL55蛋白作为抗原检测DPV血清的间接ELISA方法的建立本方法是基于纯化的重组UL55原核表达蛋白建立的可以检测DP血清的间接ELISA法,该方法特异性强,对抗鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、鸭疫里默氏菌（RA）、鸭大肠杆菌（E.coli）、鸭源沙门氏菌（Salmonella）、肿头性出血症病毒和鸭源流感病毒的阳性血清进行检测,结果均为阴性；该方法的对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1：6400倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清。将其与经典的中和试验及DPV全病毒包被的ELISA同时检测50份感染了DPV的临床鸭血清样本,发现其对DPV IgG的检出率介于中和试验和DPV-ELISA之间。由于其制备方法简便、操作简单,特异性、灵敏性较高。且不存在散毒的风险,具有良好的应用前景,为进一步组装成试剂盒奠定了基础。5鸭瘟病毒UL55基因转录、表达时相分析以β-actin基因作为内参基因,用相对荧光定量方法对UL55基因在体外感染宿主细胞中的转录情况进行了分析。转录时相分析结果表明UL55基因在转录后的0-8h内处于一个较低的水平；12h后开始迅速增加直至在感染后36h达到转录峰值,之后开始逐步下降,直到感染后的60h仍然可以检测到大量转录的UL55基因,UL55基因的转录过程可以被核酸抑制剂更昔洛韦抑制,说明UL55基因是严格依赖于DNA合成的γ2基因。Western-blot分析体外感染宿主细胞中UL55基因的表达时相表明UL55蛋白的表达水平也表现出相似的规律,进一步佐证了UL55基因为γ2基因的结论。6细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建通过多步克隆构建了含TK基因同源臂、报告基因EGFP和细菌人工染色体核心功能元件的重组鸭瘟病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11,将其与DPV CHv病毒核酸共转染获得了重组病毒DPV CHv-BAC-G。利用EGFP报告基因的指示作用,通过8轮噬斑纯化获得了纯化的重组病毒。提取环化时期的重组病毒DPV CHv-BAC-G,电击转化至DH10B细胞中,获得了能够在细菌中复制的重组病毒转化子。将克隆化的病毒质粒pBAC-DPV转染至宿主细胞DEF,成功拯救出重组病毒DPV CHv-BAC-G。拯救出的重组病毒可以以细菌和病毒两种形式存在,能够实现在细菌和宿主细胞内的同时复制,有利于利用原核系统成熟的基因操作手段研究原本仅能在细胞水平研究的鸭瘟病毒,成功建立细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台。7重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究在构建的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台基础上,利用大肠杆菌细胞内的两步RED重组技术构建UL55基因缺失株及其回复突变株。构建的回复突变株克隆能够通过转染DEF细胞获得拯救产生与亲本相同的致细胞病变,酶切图谱与亲本株DPV CHv-BAC-G无差异,是为真正的回复突变株。空斑试验、一步生长曲线和致病性比较结果表明,构建的UL55缺失株和回复突变株与预期结果一致,能产生与亲本株DPV CHv-BAC-G相似细胞病变效应、形成形态及大小相似的空斑、在感染细胞中展现出相同的增殖周期。8 DPV UL55基因在感染宿主细胞体内的定位分析以制备的兔抗UL55多克隆抗体作为一抗,用间接免疫荧光的方法检测UL55基因编码蛋白在感染细胞内的动态分布。结果显示,UL55蛋白最早在感染后的5.5h内开始在细胞质大量表达,并随着时间的推移表达量逐渐增多,其表达量在感染后的22.5h达到峰值。之后UL55蛋白的表达量逐步下降,并从细胞质内的散在分布颗粒逐渐形成荧光斑向核膜周边转移,大量存在于核膜两极。之后随着时间的推移,UL55蛋白的荧光逐渐消失,推测其随着病毒复制周期的结束和细胞的崩解而消失。9 DPV UL55与UL26.5基因在感染宿主细胞体内的定位分析UL55蛋白和UL26.5蛋白在细胞内的共定位结果显示,UL26.5和UL55蛋白在感染细胞内邻接并部分重叠,但当DPV不表达UL55蛋白时,UL26.5蛋白的定位没有变化,表明UL55基因的缺失并不影响UL26.5在核内的定位和其功能的发挥,预示着UL26.5蛋白形成的核衣壳的装配由包括UL55在内的多个蛋白完成,UL55蛋白参与病毒的装配,但并不是必需。
朱洪伟[3]（2011）在《鸭肠炎病毒UL15及UL41基因的鉴定》文中进行了进一步梳理鸭肠炎病毒（DEV）,又称鸭疱疹病毒I型,是鸭、鹅及天鹅等雁形目水鸟的一种重要病原体,可引起急性、接触性传染的鸭病毒性肠炎（DVE）,该病在家养及野生水禽中可造成高死亡率及产蛋下降。DEV基因组DNA序列的测定工作直到最近2年才陆续完成,而其编码基因的确定大多仅停留在与其他疱疹病毒同源基因的序列分析基础上,对蛋白编码基因的探索有助于我们更好地了解该病毒的生物学特征。为此,本研究开展了DEV UL15和UL41基因及其编码蛋白的鉴定和分析工作。DEV UL15由2个外显子和1个3.5 kb的内含子组成,其编码序列可转录2个转录本:全长的UL15及N-末端截断的UL15.5。2.9 kb的UL15转录本编码一739个氨基酸的蛋白质,其分子量大小约为82 kDa,而UL15.5转录本长约1.3 kb,包含888 bp的ORF,该ORF编码一大小约为32 kDa的多肽。序列分析表明UL15编码序列在疱疹病毒科内高度保守,并且含有2个在疱疹病毒及噬菌体末端酶催化亚基序列中保守的Walker A （261VPRRHGKT267）和Walker B （354LLFVDE359）基序。基于23个疱疹病毒UL15的氨基酸序列构建的系统发育树表明DEV与α疱疹病毒亚科,Mardivirus病毒属内病毒亲缘关系较近。此外,DEV UL15的转录和表达对放线菌酮（CHX）和膦乙酸（PAA）均敏感,说明UL15在DEV复制过程中晚期表达。Western blot结果显示,抗UL15C232的抗血清可在DEV感染的细胞内检测到UL15和UL15.5的表达,而在纯化的病毒粒子中检测不到蛋白的存在。间接免疫荧光结果显示,在感染早期（6 hpi） UL15定位在CEF细胞的细胞质中,到12 hpi和24 hpi时则转运进入细胞核,而在无其他病毒蛋白参与下,UL15则滞留在细胞质内。UL41的同源蛋白编码病毒宿主关闭蛋白（VHS）,可非特异性的降解宿主及病毒mRNA。PSI-BLAST搜索显示,DEV UL41氨基酸序列具有核酸酶家族蛋白特征,且模拟的3D空间结构也与T4 RNase H和Taq DNA聚合酶的活性区域很好的叠合。此外,基于UL41氨基酸序列构建的系统发育树分析发现DEV与Mardivirus内病毒亲缘关系较近。为进一步分析编码蛋白特性,将UL41 ORF克隆至表达载体pMAL-c4x中,原核表达了可溶性全长融合蛋白MBP-UL41,并制备了抗UL41的抗血清。随后的体外VHS活性检测发现,融合蛋白具有RNase活性。CEF细胞内瞬时表达的UL41可致共转染的报告基因Luc表达量降低,证实了细胞内表达的UL41蛋白的RNase活性。此外,时序性分析发现UL41基因的表达对CHX敏感,而对PAA不敏感,说明UL41是早期表达基因。Western blot结果显示,DEV感染的细胞内可检测到UL41蛋白的存在,DEV病毒粒子中也含有UL41蛋白。在DEV感染的CEF细胞内,UL41定位在细胞质的核周区域,感染早期呈颗粒性聚集分布。在pcDNA-UL41转染的细胞中,瞬时表达的UL41主要位于细胞质的核周区域,细胞核中也有少量分布。最后,UL41蛋白上的保守性氨基酸残基的单点突变可导致蛋白的VHS活性的降低或丧失。综合突变分析及同源蛋白预测的结果推测,D253和D299可能是蛋白上的一个配体结合位点。综上所述,本研究鉴定了DEV的UL15和UL41基因和/或其编码的蛋白,为明确DEV病毒在疱疹病毒科的分类地位以及阐明这2个蛋白在DEV感染中的作用提供了实验数据。
沈福晓[4]（2010）在《鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律》文中指出本研究围绕鸭瘟病毒（DPV）的纯化、DPV gC抗原检测方法的建立和优化、DPVgC基因疫苗（pcDNA-DPV-gC）在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律及DPV弱毒疫苗在雏鸭体内的增殖和分布规律等4个方面开展以下研究：①DPV的纯化和超显微结构观察；②特异性检测DPV gC抗原的间接免疫组化和间接免疫荧光方法的建立和优化；③将pcDNA-DPV-gC分别以每只6μg、3μg、1μg基因枪轰击和200μg、100μg、50μg肌肉注射免疫20日龄的雏鸭；④将100μg脂质体/DNA基因疫苗和壳聚糖/DNA基因疫苗以肌注、口服和滴鼻等不同免疫途径免疫20日周龄的雏鸭；⑤在对照组中,将0.5mL DPV弱毒疫苗、100μg空白质粒和0.5mL生理盐水以皮下和肌注等不同免疫途径免疫20日龄的雏鸭,免疫后不同的时间点（4h、12h、1d、3d、5d、7d、2w、4w、6w和10 w）,随机采集雏鸭的心、肝、脾、肺、肾、胰、脑、食道、胸腺、法氏囊、哈氏腺、十二指肠、盲肠、直肠和注射部位等组织,通过建立的间接免疫组化和间接免疫荧光方法检测pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律及DPV弱毒疫苗在雏鸭体内的增殖和分布规律。获得结果如下：1.利用差速离心和蔗糖密度梯度离心法纯化DPV,在电镜下可观察到多量、纯净的病毒粒子,纯化DPV具有典型的疱疹病毒的形态结构；将纯化DPV抗原多次免疫家兔可获得效价为1：32的兔抗DPV高免血清,经饱和硫酸铵粗提和High-Q柱纯化可获得较纯的兔抗DPV IgG。2.建立的间接免疫组化和间接免疫荧光方法具有主观,敏感性强,特异性高等优点,是进行DPV gC抗原检测和定位的可靠方法,pcDNA-DPV-gC免疫后1d即可在雏鸭体内检测到DPV gC蛋白且持续表达至10 w。3.基因枪轰击和肌肉注射免疫pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：各剂量免疫组第1d在肝、十二指肠、盲肠、直肠和注射部位检测到DPV gC蛋白,其中注射部位的阳性信号最强；第2w时各组织中的抗原表达量达到高峰,随着时间推移,阳性信号以不同速度逐渐衰减；第10w时各剂量免疫组仍在肝、法氏囊、脑、十二指肠、盲肠和直肠检测到持续表达DPV gC蛋白；而胰在所有时间点均未检出阳性信号；pcDNA-DPV-gC在不同组织的表达量也存在差异,肝、脾、法氏囊、脑、十二指肠、盲肠和直肠是DPV gC抗原主要的分布器官；阳性信号主要出现在肝脏的肝细胞、脾脏白髓或红髓淋巴细胞、法氏囊皮质或髓质淋巴细胞、脑皮质神经胶质细胞及肠黏膜上皮细胞和固有层细胞等部位。4.脂质体/DNA基因疫苗和壳聚糖/DNA基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：肌注组免疫后1d,肝脏、法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠出现阳性信号；滴鼻组免疫12 h,肺脏出现阳性反应细胞,免疫后1 d,哈氏腺和法氏囊检测到DPV gC蛋白；口服组免疫雏鸭12 h,食道出现中等强度的阳性染色,免疫后1d,法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠检测到DPV gC蛋白。其中肺脏、食道、哈氏腺、法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠阳性信号较强,且持续时间长。阳性信号主要出现在肺脏和食道的上皮细胞、法氏囊和哈氏腺淋巴细胞、肠黏膜上皮细胞和固有层细胞等部位。5.不同剂量pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：不同剂量pcDNA-DPV-gC免疫雏鸭后,各组织的抗原表达量呈现的总体规律为6μg组>3μg组>1μg组,200μg组>100μg组>50μg组,说明基因疫苗pcDNA-DPV-gC的免疫剂量与DPV gC抗原的表达和分布呈现一定的正相关,但非等比例增长。6.不同免疫途径免疫pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：基因枪轰击和肌肉注射免疫pcDNA-DPV-gC后,DPV gC抗原可在雏鸭体内广泛表达和分布。免疫早期,基因枪组各组织的DPV gC蛋白表达量大于肌注组,尤其是皮肤的DPV gC蛋白表达量高于注射部位肌肉；免疫中期,基因枪组和肌注组的阳性信号都有强烈的增加,肌注组略高于基因枪组,但差别不明显；免疫后期,基因枪组和肌注组各组织的阳性信号不断减少,免疫后10 w大部分组织检测不到阳性信号。肌注、滴鼻和口服免疫脂质体/DNA基因疫苗和壳聚糖/DNA基因疫苗后,阳性信号在雏鸭不同组织的分布也产生一定的差异,如滴鼻组哈氏腺的阳性信号比肌注组和口服组高,口服组食道的阳性信号比肌注组和口服组高,DPV gC抗原在雏鸭各组织中的表达量和持续时间的总体规律为肌注组>滴鼻组>口服组。7.不同免疫佐剂包裹的pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：免疫佐剂脂质体和壳聚糖都能促进pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内抗原的表达和分布。壳聚糖/DNA组在雏鸭各组织中的阳性信号强度比脂质体组更强,持续时间也比脂质体组长。因此壳聚糖可作为pcDNA-DPV-gC免疫佐剂的首选。8.DPV弱毒疫苗在雏鸭体内增殖和分布规律：DPV弱毒疫苗免疫雏鸭后,第12 h肝脏和脾脏检测到DPV抗原,随着时间推移,阳性信号在1 d-7 d呈现上升趋势,2w-4 w达到最大值,但免疫后10 w仍可在雏鸭大部分组织检测到DPV抗原。鸭瘟疫苗病毒对雏鸭各组织表现出强烈的泛嗜性,肝脏,法氏囊,胸腺、十二指肠、盲肠和直肠是DPV主要的易感器官,而心脏、胰脏和食道的检测率低。
张娜[5]（2010）在《鸭病毒性肿头出血症病毒强毒生物学特性》文中认为鸭病毒性肿头出血症（Duck viral swollenhead hemorrhagic disease, DVSHD）是由鸭病毒性肿头出血症病毒（Duck viral swollenhead hemorrhagic disease virus, DSHDV）引起鸭的急性传染病。临床症状表现为病鸭头颈肿胀、眼结膜充血出血、肝脏肿大呈土黄色并伴有出血斑点、体温升至43℃以上、排草绿色稀粪等。该病发病率高死亡率高,各种年龄阶段、各品种的鸭均可感染,涉及品种有天府肉鸭、樱桃谷鸭、北京鸭等,最早3日龄开始发病,最迟500日龄仍然有发病,该病是近年来严重危害养鸭业的一种新的传染病。经过流行病学调查、病理剖解、病原的分离鉴定、超薄切片观察、理化特性测定、交叉中和试验等一系列研究,初步认为该病是由呼肠孤病毒引起的一种新型传染病,目前只有少量资料报道。本研究对DSHDV强毒生物学特性及其免疫原性展开研究,获得以下系列结果：1.鸭病毒性肿头出血症病毒强毒对鸭胚成纤维细胞的适应及其增殖规律：将DSHDV人工感染青年鸭成功复制出典型的临床病例,症状与之前报道一致。病毒可适应在10日龄鸭胚中增殖；将DSHDV鸭胚尿囊液感染DEF细胞,盲传2次即可适应DEF细胞,连续传代5次后细胞病变时间稳定,CPE一般出现于感染后72 h; DSHDV在DEF上的病毒滴度（TCID50）随传代次数增加而逐渐增加,到第5代时趋于稳定的水平,达到106.55-106.91／ml。病毒在接种细胞后,毒价呈现出先下降再逐渐上升的特点,0 h-8 h毒价直线下降,8 h-72 h快速上升,72 h-120 h毒价较高,是收获该DSHDV细胞毒的最适时间。2.鸭病毒性肿头出血症病毒强毒的形态发生学和鸭胚成纤维细胞的病理变化：电镜下可见DSHDV病毒粒子呈圆形或椭圆形,无囊膜,具有双层核衣壳,成熟病毒外衣壳直径75 nm-85 nm,平均80 nm左右；病毒空衣壳直径为60 nm-75 nm；病毒粒子复制早期多散在于细胞胞浆内,随着子代病毒的增多,聚集在胞浆包涵体结构中。DSHDV病毒粒子通过吸附于DEF细胞膜表面而进入细胞,在胞浆中完成脱壳、复制和装配过程,子代病毒粒子通过细胞膜破裂的方式释放到胞外。在感染后12 h首次于细胞浆中观察到子代病毒粒子；在感染后24 h首次观察到包涵体结构。被DSHDV感染的DEF细胞的超微结构病变主要表现为：细胞核变形,染色质异常聚集,线粒体和粗面内质网严重扩张,胞浆出现大量空泡,部分细胞发生融合和凋亡变化,感染后期细胞中还出现大量的不规则形状的包涵体。3.鸭病毒性肿头出血症病毒强毒致体外培养的鸭胚成纤维细胞凋亡：（1）光学显微镜和电子显微镜下均可观察到DSHDV诱导DEF细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化：如细胞质浓缩,细胞核变形严重,染色质高度凝集、边缘化,内质网、线粒体空泡化,晚期出现大量大小不一、形态各异的凋亡小体；（2）琼脂糖凝胶电泳检测显示,受感染细胞的DNA降解形成的典型梯状条带；（3）Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测显示,凋亡细胞的比率从感染后24 h快速上升,96 h的达到凋亡的最高峰,而后逐渐下降,同时伴随着坏死细胞的比例逐渐升高；（4）AnnexinV-FITC/PI双标记的感染DEF细胞经荧光显微镜可观察到发出阳性荧光信号的凋亡细胞。4.鸭病毒性肿头出血症病毒的提纯及其形态观察：通过对多种DSHDV纯化方法的比较研究,最后采取了反复冻融、差速离心、PEG 6000沉淀、30%蔗糖垫底超速离心以及CsCl不连续密度梯度离心相结合的方法对DSHDV进行纯化,结果证实该方法快速高效,纯化的病毒纯净。负染可见成熟的DSHDV病毒粒子呈球形,无囊膜,直径在80 nm-85 nm之间,表面颗粒状突起,内部有电子密度较深的区域。5.鸭病毒性肿头出血症病毒结构蛋白分析：将纯化获得的DSHDV病毒制备成抗原多点多次免疫家兔,成功制备了兔抗DSHDV的高免血清,并通过辛酸-硫酸铵粗提及High Q阴离子交换柱纯化兔抗DSHDV的血清IgG。蛋白质变性凝胶电泳结果显示：DSHDV病毒颗粒由10条主要结构蛋白（Virus structural protein, VP）组成,分子量由大到小依次为VP1、VP2、VP3...VP10 （MW:151、129、115、90、76、66、56、52、39、35kDa）;免疫印迹结果显示VP2、VP4、VP5 （MW:129、90、76kDa）三种结构蛋白具有免疫原性。
李传峰[6]（2010）在《鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究》文中提出1998-2003年四川省、重庆市、贵州省和云南省等养鸭省份发生了一种以鸭头肿胀、眼结膜充血、出血,全身皮肤广泛性出血,肝肿胀呈土黄色,并伴有出血斑点,体温43℃以上,排草绿色稀粪等特征性的急性病毒性传染病。该病目前给养鸭业带来了巨大的经济损失。程安春等通过流行病学调查、临床症状和病理学变化观察、病理组织学检查、病原的分离鉴定、人工感染试验、电镜观察、防治试验,确诊为一种新的鸭病,并命名为“鸭病毒性肿头出血症（Duck viral swollen head hemorrhagic disease, DVSHD）”。国内其他学者也称之为“鸭传染性肿头症”或“鸭肿头败血症”。本病与鸭瘟在临床特征和尸检变化上有许多相似之处,鸭病毒性肿头出血症病毒（Duck swollen head hemorrhagic disease virus, DSHDV）是该病的病原。目前有关该病的研究资料报道较少,特别是有关DSHDV感染特性以及特异、敏感、快速的检测方法等更是缺乏深入研究。因此,本文对鸭病毒性肿头出血症病毒的对成年鸭和鸭胚感染特性以及相关的免疫检测技术进行了一系列的研究。本研究获得以下系列结果：1.鸭病毒性肿头出血症实验感染模型的建立：本实验用鸭病毒性肿头出血症病毒强毒（HY-99株）作为种毒,通过肌注、口服和滴鼻三种方式感染28日龄健康鸭,攻毒后每天观察临床症状和发病鸭及死亡鸭的剖检变化。结果显示,感染鸭出现以体温升高、头颈肿胀、眼结膜充血、出血、排灰白色或草绿色稀粪为主要特征的临床症状和肝脏肿大、出血呈土黄色、免疫器官和消化道严重充血、出血为主要特征剖检变化。结果表明,临床症状和剖检变化与自然感染鸭基本一致,本实验成功构建了鸭病毒性肿头出血症实验感染模型。2. DSHDV强毒人工感染鸭组织病理学发展规律研究：本研究对实验感染模型中感染鸭各个组织器官进行了动态组织病理学变化观察。结果表明,实验感染模型中三组鸭出现的组织病理学变化基本一致,但时间存在差异：肌注组鸭于感染后72h内、滴鼻组和口服组144h内组织病理学变化以充血、出血和炎性细胞浸润为主；肌注组鸭于感染72h后、滴鼻组和口服组144h后组织病理学变化以弥漫性出血、大小不等坏死灶或粘膜上皮细胞的坏死为主。免疫器官、消化腺、消化道、呼吸器官、心脏和肾脏等是主要的靶器官。这表明DSHDV是一种泛嗜性病毒,对全身各个组织器官具有严重破坏作用。3. DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究：电镜下,完整DSHDV粒子呈圆形或椭圆形,无囊膜,直径为70nm-85nm。病毒粒子仅出现在感染细胞的胞浆中。电镜下,可观察到病毒粒子于感染4h后吸附于法氏囊靶细胞表面,并通过细胞的内吞作用进入细胞后,在胞浆内脱去双层衣壳,随后在胞浆内复制并合成病毒相关蛋白。这些合成结构蛋白、非结构蛋白及成熟或不成熟的病毒粒子在胞浆内聚集成圆形、椭圆形或不规则形的包涵体结构。感染后24h-72h,病毒核酸在这些基质上组装和成熟形成完整的病毒粒子。感染144h后,成熟病毒通过细胞的崩解而释放到细胞间隙。DSHDV强毒人工感染成年鸭后能够引起宿主细胞明显的超微结构变化（坏死和凋亡）。该病毒的主要靶器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、消化道和肾脏等器官。病毒侵染靶细胞主要有：淋巴细胞、肝细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、上皮性网状细胞、粘膜上皮细胞、肠腺细胞等。4. DSHDV强毒致人工感染鸭和鸭胚宿主细胞凋亡的研究：通过TEM法观察发现,DSHDV经尿囊腔感染10日龄鸭胚后尿囊膜上皮细胞、肝细胞、肠道上皮细胞和心肌细胞发生凋亡。凋亡细胞时间分布在感染后24h-96h,同时在部分宿主细胞的胞浆内发现少量病毒粒子。本研究利用HE染色法、TEM法和TUNEL法三种方法均观察到DSHDV感染诱导鸭宿主细胞的凋亡。发生凋亡的器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、心脏、食管、腺胃和肠道。宿主细胞的凋亡指数从感染后2h到72h逐渐增加,72h达到最高值。感染72h后,濒死鸭和死亡鸭宿主细胞死亡以典型坏死为主。DSHDV感染诱导的细胞凋亡在DVSHD的致病机制中起到重要作用。5.免疫酶组织化学检测DSHDV抗原方法的建立和应用：本研究以兔抗DSHDVIgG作为一抗、HRP-羊抗兔IgG作为二抗建立并优化了在石蜡切片中检测DSHDV抗原的间接免疫酶SP法,研究证实本方法具有较高的特异性和敏感性。该方法的应用研究揭示,三组鸭感染DSHDV后,肌注组（4h）、滴鼻组（12h）和口服组（24h）依次首先从法氏囊组织中检测阳性信号,随后抗原在多个组织中检出,包括免疫器官、消化腺、消化道、肾脏、心脏、肺脏和气管等。DSHDV侵染的靶细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、网状细胞、粘膜上皮细胞、肝细胞、间质细胞、腺泡细胞、肠腺细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞和柱状上皮细胞等。6.间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用：本研究以浓缩纯化的DSHDV作为包被抗原,建立了检测DSHDV抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。试验最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：40,高免血清为1：80稀释,最佳反应时间为60min；酶标抗体为1：2000稀释,最佳反应时间为60min；封闭液为1%BSA-PBST,封闭时间为60min；包被抗原最佳工作条件为37℃孵育1h后过夜；底物的最佳反应时间为37℃孵育15min。本实验建立的方法可成功应用于临床样品的检测和鸭免疫后抗体水平的评估。因此,本方法具有良好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性,可用于DVSHD抗体的检测。
刘晓玫[7]（2010）在《鸭肠炎病毒US2蛋白细胞定位及感染相关功能的研究》文中指出鸭病毒性肠炎（duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（duck plague, DP）,是鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾相继在多个国家和地区流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。本病病原为鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）,属疱疹病毒科未分类病毒,尚未定亚科及属。疱疹病毒us2基因为病毒复制非必需基因,但对病毒的侵入及细胞间传递有一定的抑制作用。US2蛋白参与病毒的免疫逃避机制,与主要组织相容性复合体特异性结合能诱发其降解,从而抑制抗原向T淋巴细胞提呈。针对US2蛋白的功能研究对进一步了解病毒感染机制有重要意义。本研究以鸭肠炎病毒（DEV） C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2 ORF,并对其进行了包括氨基酸同源性、编码蛋白结构及抗原性等较为详尽的生物信息学分析。利用大肠杆菌表达系统pET32a（+）（E. coli Rosetta）获得大小为46 KDa的重组蛋白。将纯化的蛋白免疫家兔,制备兔抗重组US2蛋白多克隆抗体,琼脂扩散试验测定血清效价为1：8。经western blot及间接免疫荧光试验分析此抗体针对DEV US2蛋白有良好的反应性。以制备的兔抗US2蛋白血清作为一抗,与病毒接种的CEF进行间接免疫荧光反应,经激光共聚焦显微镜观察,发现特异性荧光染色主要集中于细胞膜和核周围的胞质区。在接种DEV的鸡胚成纤维细胞培养液中添加US2抗体,分别检测US2蛋白在病毒的吸附、侵入、细胞到细胞间的直接传播中的作用,以及对病毒滴度的影响。结果表明,加入US2抗体实验组与对照组相比,病毒侵入率及形成的噬斑大小有明显差异,但是吸附率差异不明显,说明DEV US2蛋白可能参与病毒侵入及细胞间传递的过程。
陈舜[8]（2009）在《雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究》文中研究表明雏鹅新型病毒性肠炎（new type gosling viral enteritis,NGVE）是一种主要发生于30日龄以内的雏鹅的一种以小肠出血性、纤维素性、渗出性、坏死性炎症为特征的急性传染病。经流行病学调查、病理剖解、病原的分离、初步鉴定、病毒提纯与负染电镜观察其形态学特征、及病毒结构蛋白分析等一系列研究,初步认为该病是由禽腺病毒引起的雏鹅的一种新型病毒性肠炎。该病目前对养鹅业带来了巨大的经济损失。关于鹅腺病毒,特别是致病的鹅腺病毒,目前国内外的研究资料很少。电子显微学技术是研究病毒形态结构、鉴定新病毒、阐明病毒的发育循环、研究感染宿主病理学的一个重要方法,它在病毒学研究中具有不可替代的作用。本研究首先将NGVEV鹅胚尿囊液适应10日龄鸭胚,再将NGVEV鸭胚尿囊液适应体外培养的鸭胚成纤维细胞（DEF）,并对病毒在感染鸭胚体内及DEF细胞上的形态特征和病毒形态发生学进行系统地研究,同时观察被感染宿主细胞的超微结构病变和细胞凋亡的情况,以期了解NGVEV的入侵、分布及释放特点,为揭示该病毒致宿主细胞病变的机制提供科学依据。通过人工感染NGVEV-CN强毒而复制出NGVE急性病例,建立并利用间接免疫酶组织化学SP法及间接免疫荧光抗体法探究NGVEV对感染雏鹅组织的侵染特点及病毒抗原随感染时间延伸在宿主体内的动态分布规律,同时对病毒诱导雏鹅宿主的细胞凋亡进行检测,以期为阐明该病的发病机制提供实验数据及为NGVEV的实验室诊断提供科学的方法。将制备的NGVEV灭活疫苗及添加GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅,对其诱导鹅产生的体液免疫抗体水平和细胞免疫抗体水平进行了监测,确定了该疫苗的免疫原性和最佳免疫剂量。进而将该疫苗免疫开产前种鹅,对免疫种鹅的血清抗体水平、免疫种鹅的后代卵黄抗体消长规律及后代雏鹅的攻毒免疫保护力进行监控,为研制高效NGVEV灭活疫苗提供科学依据,为防治雏鹅新型病毒性肠炎的提供了新的手段。本研究获得以下系列结果：1.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株感染鸭胚宿主细胞的超微结构变化和病毒形态发生学：在不同时间剖杀的和死亡的鸭胚的尿囊膜、心、肝、肠、脑及肌胃中均发现NGVEV粒子,其直径以70 nm-80 nm为主,以散在的形式分布,多见于细胞核内。NGVEV粒子通过与细胞膜的特异性吸附而进入宿主细胞,装配成熟的病毒粒子通过细胞核膜及细胞膜破裂的方式被释放。被NGVEV感染宿主细胞的超微结构病变以细胞核膜严重的扩张,内质网的肿胀,线粒体嵴断裂溶解成空泡样为主,其中尿囊膜上皮细胞中线粒体的凝集、固缩变化是该病毒引起的特征性超微病变。2.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株对体外培养的鸭胚成纤维细胞的适应及其增殖规律：将NGVEV鸭胚尿囊液感染DEF细胞并经连续传代获得了适应DEF细胞生长的NGVEV-CN细胞毒。细胞病变一般出现于感染后72 h,到120 h细胞病变达80%。NGVEV在DEF上的病毒滴度（TCID50）随传代次数增加而逐渐增加,直到第5代后维持在较高的水平。病毒滴度随感染时间变化表现为：感染初期首先呈现一个下降过程,4h后毒价开始迅速上升,于96h-144h病毒滴度达到并维持最高水平。NGVEV感染DEF细胞后96h-120 h是收获该NGVEV细胞毒的最适时间。3.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构变化和病毒形态发生学：NGVEV在DEF细胞中呈圆形,无囊膜,直径为75nm-90 nm。病毒粒子多散在于细胞核内和集中分布于胞浆空泡内。NGVEV粒子通过吸附于DEF细胞膜表面而进入细胞,成熟的病毒粒子经由细胞核膜的破裂而进入胞浆,再通过出芽、细胞膜破裂及细胞空泡破裂的方式被释放出细胞。被NGVEV感染的DEF细胞的超微结构病变主要表现为：线粒体的固缩及聚集变化,粗面内质网扩张,胞浆出现空泡或空池样结构,及细胞凋亡现象。伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中还出现大量的不规则形状的高电子致密物及三种不同特点的胞浆包涵体结构。4.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致体外培养的鸭胚成纤维细胞凋亡：光学显微镜及电子显微镜观察到NGVEV可诱导DEF细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化；经琼脂糖凝胶电泳检测到感染细胞核酸降解为不同倍数的180bp-200 bp的典型梯状条带；用Annexin V-FITC/PI双标记感染DEF细胞经流式细胞仪检测发现凋亡细胞的比率从感染后48 h随感染时间延伸而明显增加,于120 h达到凋亡峰,而Annexin V-FITC/PI双标记的感染DEF细胞经荧光显微镜可观察阳性荧光信号的凋亡细胞。5.雏鹅新型病毒性肠炎病毒的提纯、超微形态观察和兔抗NGVEV高免血清IgG的制备：通过对NGVEV纯化方法的比较研究,确定以结合差速离心、氯仿处理、氯化铯不连续梯度和等密度梯度超速离心的方法来纯化NGVEV.通过该方法不仅可获得较纯净、多量的NGVEV粒子,还可区分完整的NGVEV粒子和不完整的病毒粒子。经负染电镜观察发现完整的NGVEV粒子具有腺病毒典型形态特征：圆形,无囊膜,直径75nm-90 nm,核心、核衣壳及壳粒清晰可见。最后,以纯化的病毒为免疫原成功制备了兔抗NGVEV的高免血清,并通过辛酸-硫酸铵粗提及High Q阴离子交换柱纯化兔抗NGVEV的血清IgG。6.建立并应用间接免疫酶组织化学SP法和间接免疫荧光抗体法检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒在人工感染雏鹅组织的定位和侵染规律：以纯化的兔抗NGVEV的血清IgG为一抗,分别建立检测石蜡切片NGVEV的间接免疫酶组织化学SP法和间接免疫荧光双染法,并应用该方法研究NGVEV-CN强毒株在人工感染雏鹅组织中病毒定殖及动态侵染规律。结果表明：NGVEV抗原主要侵染免疫器官（法氏囊,胸腺,哈德氏腺及脾）和胃肠道器官（腺胃,肌胃及肠道）,推测这些器官是NGVEV进入机体后首先侵染靶部位并增殖子代病毒,之后子代病毒通过血液、淋巴液或组织液而释放到其他实质性组织,使得机体在感染后期呈现NGVEV广泛性侵染（除呼吸器官）。被NGVEV侵染的细胞数量随感染时间延长而增加,直到感染后15d。NGVEV侵染的细胞主要包括：各种淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、粘膜细胞、腺细胞等等。7.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致雏鹅宿主细胞凋亡的研究：通过光学显微镜及电子显微镜对人工感染雏鹅各个组织的宿主细胞观察发现,最先于NGVEV感染3d时在法氏囊中观察到呈凋亡变化的淋巴细胞,之后凋亡细胞广泛出现于免疫器官（法氏囊,胸腺及哈德氏腺）和消化器官（腺胃,肌胃,肠道及肝）,而气管和肺极少出现细胞凋亡变化。进一步用琼脂糖凝胶电泳和原位末端标记方法（TUNEL）对NGVEV感染宿主细胞核酸的降解情况进行了检测,发现被感染鹅的免疫器官和胃肠道均出现典型的不同倍数的180bp-200 bp的梯状条带,在经TUNEL染色的组织切片中观察到了棕色阳性信号的凋亡细胞。凋亡细胞的数量随感染时间延长而增多,于9d-12d达到最大值。8.雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对青年鹅的免疫原性研究及重组GoIL-2对疫苗的佐剂效应研究：不同剂量的NGVEV灭活疫苗均能显着提高免疫青年鹅的细胞免疫和体液免疫抗体水平,且抗体水平与免疫剂量有一定关系,NGVEV灭活疫苗以0.5 ml/只为最佳免疫剂量。单独使用GoIL-2可提高机体的细胞免疫水平,但是不能使机体产生特异性抗NGVEV抗体。添加不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗能极显着（P<0.01）或显着（P<0.05）提高被免疫鹅细胞免疫和体液水平,且抗体水平与GoIL-2剂量有一定关系,以1000 U/只为最佳剂量。研究表明,免疫后第28 d青年鹅的血清抗NGVEV的IgG水平、中和抗体水平及细胞免疫水平达到最高,且在免疫后第175 d都维持在一个较高的水平。9.雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对开产前种鹅的免疫效果评价：NGVEV灭活疫苗与添加GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫后5-6个月内对免疫种鹅所产后代产生确实的保护效果,其中以添加GoIL-2的灭活疫苗免疫种鹅所孵出的后代雏鹅的攻毒100%免疫保护效果更持久。另外,被免疫母鹅血清抗体水平、其所产蛋的卵黄抗体水平与后代雏鹅攻毒免疫保护效果呈现正相关性,因此建议通过对免疫鹅的卵黄抗体的监测来代替血清抗体的监测来对疫苗免疫效果的进行长期监控。
余华,叶健强,严玉宝,廖党金,胡娟[9]（2009）在《雏鹅新型病毒性肠炎病毒的诊断与防控研究》文中认为对近年来全国各省市出现的雏鹅新型病毒性肠炎病毒（New type gosling viralenteritis virus,NGVEV）流行病学、临床症状、病理组织结构、病原学、病毒的检测和诊断、免疫预防、临床预防和治疗等方面的研究情况进行了论述。该病是由腺病毒引起的一种尚未被认识的新病毒,目前仅有NGVEV高免血清的预防和治疗效果较好,其余药物和生物制剂都尚需要进一步研究和改良。这些研究结果可为进一步深入研究和开发有效的药物提供基础资料,进而可提高我国养鹅业的经济效益。
王克雄[10]（2009）在《鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中研究表明鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目动物的一种急性、热性及败血性传染病。其特征是流行广泛、传播迅速、发病和死亡率高。近年来在我国养鸭业较发达的地区发生流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。由于鸭瘟病毒的分子生物学研究比较滞后,目前还没有建立针对鸭瘟的敏感而有效的分子生物学诊断方法。而通过单克隆抗体技术对DEV主要的皮层蛋白VP22抗原表位进行研究,不仅有助于了解VP22抗原结构与功能的关系,而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等提供一定的参考依据。本试验在进行克隆并鉴定鸭肠炎病毒VP22（UL49）基因基础上,将已经构建好的重组表达质粒pET-30a-UL49转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果显示,表达的融合蛋白分子量约为36Ku,与预期的大小一致。重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。将重组蛋白纯化、复性后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定,最终获得4株能够稳定分泌抗DEV VP22蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B10、2G1、3F10和3G2。其单抗亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM。Western blot实验表明这4株MAbs不仅能与重组的DEV VP22蛋白发生反应,而且还能与DEV发生特异性反应,说明4株MAbs都能够识别天然构象的VP22蛋白。因此,这4株单克隆抗体可作为DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位研究的工具。为了进一步研究DEV VP22表位结构,首先设计了20个部分重叠且覆盖VP22全长的短肽融合蛋白,并在大肠杆菌BL21中进行了表达;然后利用肽扫描技术（Pepscan技术）对4株抗DEV VP22蛋白单克隆抗体中的一株2B10的抗原表位进行了精确定位,该表位位于VP22蛋白的200～206aa之间,其氨基酸序列为“ELSGQTP”。然后进一步通过间接ELISA鉴定,其结果与Western blot鉴定结果一致。本研究对进一步分析DEV VP22蛋白的结构与功能以及建立以表位为基础的疫苗和诊断方法具有重要的意义。
二、人工感染雏鹅新型病毒性肠炎病毒的形态发生及宿主细胞的超微结构变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人工感染雏鹅新型病毒性肠炎病毒的形态发生及宿主细胞的超微结构变化（论文提纲范文）
（1）水貂肠炎病毒NS1非结构蛋白调控细胞凋亡的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 水貂病毒性肠炎 |
| 1.1.1 水貂病毒性肠炎概述 |
| 1.1.2 水貂肠炎病毒病原学 |
| 1.1.3 水貂肠炎病毒的分子生物学特征 |
| 1.1.4 水貂肠炎病毒编码的蛋白及其功能 |
| 1.1.5 水貂肠炎病毒特异性受体 |
| 1.1.6 水貂肠炎病毒复制机制 |
| 1.1.7 水貂病毒性肠炎的诊断和防治 |
| 1.2 细胞凋亡 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 细胞凋亡与细胞坏死的区别 |
| 1.2.3 细胞凋亡的途径 |
| 1.2.4 病毒感染与细胞凋亡 |
| 1.2.5 细小病毒及其非结构蛋白NS1诱导细胞凋亡 |
| 第二章 水貂肠炎病毒诱导细胞凋亡 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物、细胞和毒种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 MEVB的扩增及其病毒滴度的测定 |
| 2.2.2 试验动物分组与攻毒试验 |
| 2.2.3 试验动物样品采集 |
| 2.2.4 MEV感染水貂后病理学变化 |
| 2.2.5 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.6 MEV感染F81细胞后对细胞增殖的影响 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MEV感染水貂病理变化 |
| 2.3.2 MEV诱导水貂体内不同组织细胞凋亡情况 |
| 2.3.3 MEV抑制F81细胞活性 |
| 2.3.4 MEV感染诱导F81细胞周期阻滞 |
| 2.3.5 MEV感染诱导F81细胞凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 水貂肠炎病毒NS1蛋白调控宿主细胞凋亡 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 提取病毒基因组 |
| 3.2.2 构建真核表达质粒 |
| 3.2.3 鉴定目的蛋白表达 |
| 3.2.4 不同蛋白对细胞生存状态的影响 |
| 3.2.5 流式细胞术检测细胞周期 |
| 3.2.6 流式细胞术检测不同蛋白诱导细胞凋亡情况 |
| 3.2.7 Hoechst染色 |
| 3.2.8 DNA Ladder检测 |
| 3.2.9 超微结构观察 |
| 3.2.10 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MEV NS1、NS2、VP1和VP2真核表达质粒构建 |
| 3.3.2 MEV NS1、NS2、VP1和VP2蛋白表达分析 |
| 3.3.3 MTT检测MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞活性的影响 |
| 3.3.4 LDH方法检测MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞毒性的影响 |
| 3.3.5 MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞周期的影响 |
| 3.3.6 MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞凋亡的影响 |
| 3.3.7 MEV NS2蛋白对细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 3.3.8 Hoechst染色 |
| 3.3.9 DNA片段化分析 |
| 3.3.10 电镜观察MEV NS1蛋白诱导细胞凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 水貂肠炎病毒NS1蛋白通过线粒体信号通路诱导细胞凋亡 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 细胞和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 构建p38 MAPK报告基因质粒 |
| 4.2.2 检测Caspase-3/9 活性 |
| 4.2.3 Western blot试验 |
| 4.2.4 细胞线粒体分离 |
| 4.2.5 检测线粒体膜电位变化 |
| 4.2.6 检测细胞内活性氧 |
| 4.2.7 检测线粒体通透性 |
| 4.2.8 双荧光素酶检测试验 |
| 4.2.9 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MEV NS1蛋白通过激活Caspase-9 引起细胞凋亡 |
| 4.3.2 MEV NS1蛋白对细胞内Caspase-9 和Caspase-3 活性的影响 |
| 4.3.3 MEV NS1蛋白通过线粒体介导的凋亡通路诱导细胞凋亡 |
| 4.3.4 MEV NS1蛋白诱导细胞线粒体膜电位消失 |
| 4.3.5 MEV NS1蛋白诱导细胞线粒体通透性转变孔开放 |
| 4.3.6 MEV NS1蛋白引起细胞内ROS的积累 |
| 4.3.7 MEV NS1蛋白抑制p38 MAPK和p53启动子表达 |
| 4.3.8 p38 MAPK和p53参与调控MEV NS1蛋白诱导细胞凋亡 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 引言 |
| 1 鸭瘟病毒分子生物学研究概况 |
| 1.1 鸭瘟病毒病原 |
| 1.2 鸭瘟病毒粒子形态结构 |
| 1.3 基因组结构 |
| 1.4 鸭瘟病毒编码蛋白 |
| 1.4.1 结构蛋白 |
| 1.4.2 非结构蛋白 |
| 1.5 鸭瘟病毒的复制周期 |
| 2 细菌人工染色体技术研究进展 |
| 2.1 细菌人工染色体技术 |
| 2.2 细菌人工染色体的修饰技术 |
| 2.2.1 Red/ET介导的同源重组 |
| 2.2.2 RecA蛋白介导的同源重组 |
| 2.2.3 Cre/LoxP介导的同源重组 |
| 2.2.4 Tn转座子介导的随机插入和突变技术 |
| 2.3 细菌人工染色体在疱疹病毒研究研究中的应用 |
| 3 疱疹病毒UL55基因及编码蛋白功能研究进展 |
| 3.1 疱疹病毒UL55基因及其编码蛋白的特点 |
| 3.1.1 UL55基因序列的特点 |
| 3.1.2 UL55基因的基因类型 |
| 3.1.3 UL55基因编码蛋白的类型 |
| 3.1.4 UL55编码蛋白的性质 |
| 3.2 疱疹病毒UL55编码蛋白的定位 |
| 3.2.1 UL55蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.2 UL55蛋白在病毒自身内的定位 |
| 3.3 疱疹病毒UL55蛋白的功能 |
| 3.3.1 UL55蛋白与病毒复制 |
| 3.3.2 UL55蛋白与转录调节 |
| 3.3.3. UL55蛋白与免疫 |
| 3.3.4 UL55同系物蛋白在DIPs感染中的作用 |
| 3.3.5. UL55蛋白与核基质(细胞核骨架)的作用 |
| 3.3.6 UL55蛋白与ICP35的关联 |
| 3.3.7 UL55缺失的影响 |
| 3.4 展望 |
| 4 本研究目的及意义 |
| 第二章 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 鸭瘟病毒中国强毒株基因组图谱构建 |
| 2.2 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 2.2.1 DPV CHv基因组基本特性分析 |
| 2.2.2 DPV CHv与参考鸭瘟毒株的同源性比较分析 |
| 2.3 DPV CHv基因组密码子使用模式分析 |
| 2.3.1 DPV CHv密码子使用分析 |
| 2.3.2 密码子参数之间的关联性分析 |
| 2.3.3 DPV CHv基因组密码子与大肠杆菌、酵母及人类密码子对比分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 鸭瘟病毒中国强毒株基因组图谱构建 |
| 3.2 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 3.2.1 DPV CHv基因组基本特性分析 |
| 3.2.2 DPV CHv与参考鸭瘟毒株的同源性比较分析 |
| 3.3 DPV CHv基因组密码子使用模式分析 |
| 3.3.1 DPV CHv密码子使用分析 |
| 3.3.2 密码子参数之间的关联性分析 |
| 3.3.3 DPV CHv基因组密码子与大肠杆菌、酵母及人类的密码子比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 4.2 DPV CHv基因组密码子使用模式分析 |
| 第三章 鸭瘟病毒中国强毒株UL55基因生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、鸭胚 |
| 1.2 菌株/载体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 试剂、材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV UL55基因T克隆 |
| 2.1.1 鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备 |
| 2.1.2 鸭瘟病毒的增殖 |
| 2.1.3 DPV DNA提取 |
| 2.1.4 UL55基因的PCR扩增 |
| 2.1.5 DH5α化学感受态细胞的制备 |
| 2.1.6 UL55基因的T克隆 |
| 2.1.7 UL55基因T克隆质粒pMD18T/UL55的提取 |
| 2.1.8 质粒PCR鉴定 |
| 2.1.9 酶切鉴定 |
| 2.2 DPV UL55基因核酸序列分子特性分析 |
| 2.2.1 开放性阅读框搜素及分子特性分析 |
| 2.2.2 基于UL55基因核苷酸序列的分子进化树分析 |
| 2.2.3 UL55基因密码子偏好性分析 |
| 2.3 DPV UL55基因编码蛋白分子特性分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL55基因分子克隆 |
| 3.1.1 DPV UL55基因的PCR |
| 3.1.2 DPV UL55基因T克隆pMD18-T/UL55的鉴定 |
| 3.2 DPV UL55基因核酸序列分子特性分析 |
| 3.2.1 开放性阅读框搜素及分子特性分析 |
| 3.2.2 基于UL55基因核苷酸序列的分子进化树分析 |
| 3.3 DPV UL55基因编码蛋白分子特性分析 |
| 3.3.1 DPV UL55基因编码蛋白基本特性分析 |
| 3.3.2 DPV UL55基因及同系物氨基酸序列比对 |
| 3.3.3 DPV UL55基因编码蛋白信号肽切割位点预测 |
| 3.3.4 DPV UL55编码蛋白跨膜区预测 |
| 3.3.5 DPV UL55编码蛋白亲疏水性分析 |
| 3.3.6 DPV UL55编码蛋白磷酸化位点预测 |
| 3.3.7 DPV UL55基因氨基酸序列N-糖基化位点预测 |
| 3.3.8 DPV UL55基因编码蛋白功能位点预测 |
| 3.3.9 DPV UL55基因编码蛋白抗原性分析 |
| 3.3.10 DPV UL55基因编码蛋白质的细胞内定位 |
| 3.3.11 DPV UL55基因氨基酸序列的二级结构预测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL55基因及编码蛋白基本特性分析 |
| 4.2 DPV UL55基因进化树分析 |
| 4.3 DPV UL55基因密码子偏好性分析 |
| 第四章 鸭瘟病毒UL55基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、鸭胚、试验动物 |
| 1.2 菌株、载体 |
| 1.3 试剂、材料 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 1.4.1 IPTG溶液 |
| 1.4.2 SDS-PAGE电泳相关溶液 |
| 1.4.3 Western-Blot相关溶液 |
| 1.4.4 蛋白纯化、复性试剂 |
| 1.4.5 抗体制备、纯化试剂 |
| 1.4.6 其他试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 原核表达质粒pET32a(+)/UL55的构建 |
| 2.1.1 pMD18-T/UL55及pET32a(+)的质粒提取及酶切 |
| 2.1.2 连接回收产物,构建pET-32a(+)/UL55重组表达质粒 |
| 2.1.3. DH5α化学感受态细胞的制备 |
| 2.1.4 重组表达质粒的转化 |
| 2.1.5 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 重组表达质粒pET32a(+)/UL55的诱导表达 |
| 2.2.1 重组表达质粒的提取 |
| 2.2.2 重组表达质粒转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3) |
| 2.2.3 重组质粒的诱导表达 |
| 2.2.4 重组质粒表达产物的可溶性分析 |
| 2.3 重组表达质粒pET32a(+)/UL55表达诱导条件的优化 |
| 2.3.1 诱导剂IPTG浓度优化 |
| 2.3.2 诱导时间优化 |
| 2.3.3 诱导温度优化 |
| 2.4 重组UL55蛋白的大量制备、纯化与复性 |
| 2.4.1 菌体的大量培养 |
| 2.4.2 重组UL55蛋白的包涵体洗涤法大量纯化 |
| 2.4.3 重组UL55蛋白的复性和检测 |
| 2.5 重组UL55蛋白与DPV全病毒抗血清的反应原性 |
| 2.5.1 兔抗DPV CHv IgG的纯化 |
| 2.5.2 重组UL55蛋白与DPV全病毒抗血清的免疫印(western-blot) |
| 2.6 兔抗UL55蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.6.1 重组UL55蛋白抗原的制备 |
| 2.6.2 免疫程序 |
| 2.6.3 琼扩测定兔抗UL55蛋白抗体效价 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 原核表达质粒pET-32a(+)/UL55的构建与鉴定 |
| 3.2 重组表达质粒pET3-2a(+)/UL55的诱导表达 |
| 3.3 重组质粒pET-32a(+)/UL55诱导表达条件的优化 |
| 3.4 重组UL55蛋白的纯化 |
| 3.5 重组UL55蛋白与DPV抗血清的反应原性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 UL55重组蛋白表达系统的选择 |
| 4.2 蛋白的表达和包涵体形成 |
| 4.3 蛋白的纯化、复性 |
| 4.4 兔抗多克隆抗体的制备和纯化 |
| 第五章 原核表达UL55蛋白作为抗原检测抗DPV血清的间接ELISA方法的建立及应用 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 蛋白 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 试剂、材料 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组UL55蛋白的原核表达蛋白、纯化及复性 |
| 2.2 基于重组UL55蛋白的间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.1 基于UL55重组蛋白的间接ELISA方法的基本程序 |
| 2.2.2 抗原和血清最佳稀释度的选择 |
| 2.2.3 酶标二抗最佳工作浓度优化 |
| 2.2.4 UL55-ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 2.2.5 UL55-ELISA敏感性试验 |
| 2.2.6 UL55-ELISA特异性试验 |
| 2.2.7 阻断试验 |
| 2.2.8 重复性试验 |
| 2.2.9 UL55-ELISA的应用 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 重组UL55蛋白包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2 酶标二抗最佳稀释度的确定 |
| 3.3 UL55-ELISA方法阴阳临界值的确定 |
| 3.4 UL55-ELISA敏感性试验 |
| 3.5 UL55-ELISA特异性试验 |
| 3.6 UL55-ELISA阻断试验 |
| 3.7 UL55-ELISA重复性试验 |
| 3.8 UL55-ELISA与中和试验、DPV-ELISA对临床样本检测的比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 包被抗原和血清对间接ELISA的影响 |
| 4.2 酶标二抗对间接ELISA的影响 |
| 4.3 pUL55-ELISA方法的条件优化 |
| 4.4 基于UL55重组蛋白的间接ELISA方法与诊断标准方法的比较 |
| 第六章 鸭瘟病毒UL55基因转录、表达时相分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 试剂、材料 |
| 1.6 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV体外感染宿主细胞UL55基因转录时相分析 |
| 2.1.1 质粒模板的制备 |
| 2.1.2 引物特异性检测 |
| 2.1.3 定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.1.4 RNA提取和cDNA合成 |
| 2.1.5 样品的定量检测 |
| 2.1.6 药物抑制试验 |
| 2.2 DPV体外感染宿主细胞UL55基因表达时相分析 |
| 2.2.1 DEF制备与病毒增殖 |
| 2.2.2 细胞蛋白的提取 |
| 2.2.3 SDS-PAGE |
| 2.2.4 Western-blot分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV体外感染宿主细胞UL55基因转录时相分析 |
| 3.1.1 引物特异性检测 |
| 3.1.2 标准曲线的建立 |
| 3.1.3 RNA纯度及完整性检测 |
| 3.1.4 样品的定量检测 |
| 3.1.5 药物抑制试验 |
| 3.2 Western-blot分析DPV体外感染宿主细胞UL55基因表达时相 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL55基因转录时相分析 |
| 4.2 DPV UL55基因在感染宿主细胞中的表达时相分析 |
| 第七章 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚/试验动物/血清 |
| 1.2 菌株/载体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 血清 |
| 1.5 试剂、材料 |
| 1.6 主要溶液的配制 |
| 1.7 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒转移载体构建 |
| 2.1.1 EGFP绿色荧光蛋白表达盒的克隆 |
| 2.1.2 DPV CHv TK区域左右侧同源臂的克隆 |
| 2.1.3 重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建 |
| 2.2 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的构建 |
| 2.2.1 转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的提取 |
| 2.2.2 转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11与DPV DNA共转染 |
| 2.2.3 重组病毒DPV CHv-BAC-G的初步筛选、富集和纯化 |
| 2.2.4 重组病毒DPV CHv-BAC-G的鉴定 |
| 2.3 重组鸭瘟病毒电转化克隆的获取 |
| 2.3.1 大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 DPV CHv-BAC-G环化基因组DNA的提取 |
| 2.3.3 电击转化筛选重组BAC克隆 |
| 2.3.4 BAC转化子的鉴定 |
| 2.3.4.1 菌落PCR |
| 2.4 重组DPV全基因组感染性克隆的拯救 |
| 2.4.1 转染用pBAC-DPV的提取 |
| 2.4.2 将pBAC-DPV转染进DEF |
| 2.4.3 拯救DPV全基因组感染性克隆 |
| 2.4.4 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的鉴定 |
| 2.5 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的体内外生物学特性分析 |
| 2.5.1 病毒定量(TCID50测定) |
| 2.5.2 空斑试验 |
| 2.5.3 一步生长曲线 |
| 2.5.4 DPV CHv和DPV Chv-BAC-G对鸭的致病性比较 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒转移载体构建 |
| 3.1.1 EGFP表达盒的扩增、克隆 |
| 3.1.2 DPV左右同源臂的克隆 |
| 3.1.3 重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建 |
| 3.2 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的构建 |
| 3.2.1 重组病毒的初步筛选和纯化 |
| 3.2.2 重组病毒的鉴定 |
| 3.3 重组鸭瘟病毒电转化克隆子的获取 |
| 3.4 重组DPV全基因组感染性克隆的拯救 |
| 3.4.1 拯救重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.4.2 拯救病毒的IFA鉴定 |
| 3.5 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的体内外生物学特性分析 |
| 3.5.1 空斑试验 |
| 3.5.2 一步生长曲线测定 |
| 3.5.3 DPV CHv和DPV CHv-BAC-G对鸭的致病性比较 |
| 4 讨论 |
| 第八章 重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体内外生物学特性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚 |
| 1.2 菌株/载体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 血清 |
| 1.5 试剂、材料 |
| 1.6 主要溶液的配制 |
| 1.7 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 第一轮RED重组敲除UL55基因 |
| 2.1.1 同源打靶片段的扩增、回收 |
| 2.1.2 将pKD46转化至包含DPV CHv-BAC-G感染性克隆的DH10B中 |
| 2.1.3 包含pKD46和DPV CHv-BAC-G感染性克隆的DH10B电转感受态细胞的制备 |
| 2.1.4 电转化将线性打靶片段转入表达RED重组酶基因的菌株 |
| 2.2 第二轮RED重组去除Kana抗性基因 |
| 2.2.1 去除kana抗性基因 |
| 2.2.2 第二轮RED重组鉴定 |
| 2.3 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-GAUL55 |
| 2.3.1 中量提取DPV CHv-BAC-GAUL55质粒 |
| 2.3.2 拯救DPV CHv-BAC-GAUL55病毒 |
| 2.3.4 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-GAUL55的鉴定 |
| 2.4 DPV CHv-BAC-GAUL55R回复突变构建 |
| 2.4.1 UL55-Kana线性打靶片段的获取 |
| 2.4.2 第一轮RED重组(将UL55-Kana重组到DPV CHv-BAC-G△UL55基因组) |
| 2.4.3 第二轮RED重组(去除Kana) |
| 2.4.4 RFLP分析 |
| 2.4.5 DPV CHv-BAC-GAUL55/R的拯救及拯救病毒的鉴定 |
| 2.5 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G△UL55、DPV CHv-BAC-GAUL55/R的体外生物学特性分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 第一轮RED重组敲除UL55基因 |
| 3.1.1 同源打靶片段的扩增 |
| 3.1.2 转化pKD46的克隆子鉴定 |
| 3.1.3 UL55基因缺失第一轮RED重组鉴定 |
| 3.2 第二轮RED重组去除Kana抗性基因 |
| 3.3 UL55基因缺失株DPV CHv-BAC-G△UL55的拯救 |
| 3.4 DPV CHv-BAC-GAUL55R回复突变构建 |
| 3.4.1 UL55-Kana线性打靶片段的获取 |
| 3.4.2 构建DPV CHv-BAC-G△UL55R回复株第一轮RED重组鉴定 |
| 3.4.3 构建DPV CHv-BAC-GAUL55R回复株第二轮RED重组鉴定 |
| 3.4.4 RFLP分析 |
| 3.4.5 DPV CHv-BAC-G△UL55R的拯救及拯救病毒的鉴定 |
| 3.5 DPV CHv-BAC-G△UL55、DPV CHv-BAC-GAUL55/R的体外生物学特性分析 |
| 3.5.1 空斑试验 |
| 3.5.2 一步生长曲线测定 |
| 4 讨论 |
| 第九章 DPV UL55基因在感染宿主细胞内的定位分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 试剂、材料 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位 |
| 2.1.1 间接免疫荧光检测DPV UL55蛋白的表达和亚细胞定位方法的建立 |
| 2.1.2 间接免疫荧光检测条件优化 |
| 2.1.3 间接免疫荧光检测UL55蛋白表达的结果判定 |
| 2.1.4 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞中的动态定位监测 |
| 2.2 与UL26.5的共定位情况分析 |
| 2.2.1 鼠抗UL55多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2 鼠抗UL55多克隆抗体和兔抗UL26.5多克隆抗体的纯化 |
| 2.2.3 UL55与UL26.5在DPV CHv感染宿主细胞内的共定位 |
| 2.2.4 UL55蛋白对UL26.5蛋白在细胞内定位的作用分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位分析 |
| 3.2 DPV UL55基因编码蛋白与UL26.5的共定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位分析 |
| 4.2 UL55蛋白与UL26.5蛋白的共定位分析 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
（3）鸭肠炎病毒UL15及UL41基因的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.1.1 病因学及流行病学 |
| 1.1.2 临床表现 |
| 1.1.3 病理病变 |
| 1.1.4 DVE 的诊断 |
| 1.1.5 鸭病毒性肠炎的防制 |
| 1.2 鸭肠炎病毒生物学特性 |
| 1.2.1 DEV 的分类学地位 |
| 1.2.2 形态特征 |
| 1.2.3 理化特性 |
| 1.2.4 培养特性 |
| 1.2.5 抗原性 |
| 1.2.6 DEV 的形态发生与细胞的超微结构变化 |
| 1.3 DEV 分子生物学研究进展 |
| 1.3.1 DEV 基因组序列的测定 |
| 1.3.2 DEV 基因组结构 |
| 1.4 α-疱疹病毒的复制 |
| 1.4.1 病毒吸附并进入宿主细胞 |
| 1.4.2 脱去外膜的衣壳进入细胞核 |
| 1.4.3 重塑宿主细胞核 |
| 1.4.4 病毒基因表达 |
| 1.4.5 病毒DNA 复制 |
| 1.4.6 病毒衣壳包装 |
| 1.4.7 病毒子释放 |
| 1.5 UL15 的基因结构及编码蛋白功能 |
| 1.6 病毒宿主关闭蛋白(UL41)的功能 |
| 1.6.1 疱疹病毒诱导宿主关闭的一般特征 |
| 1.6.2 VHS 的作用机理 |
| 1.6.3 VHS 的生物学功能 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 第二章 鸭肠炎病毒UL15 基因及其编码蛋白的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 试剂盒、限制性酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 DEV 在CEF 上的增殖及滴度测定 |
| 2.1.7 DEV 病毒的纯化 |
| 2.1.8 CEF 总RNA 的提取 |
| 2.1.9 RT-PCR 法扩增UL15 基因编码序列 |
| 2.1.10 UL15 基因剪切位点的确定 |
| 2.1.11 地高辛标记的Northern blot 探针的制备 |
| 2.1.12 探针标记效率的测定 |
| 2.1.13 RNA 的变性电泳及转膜 |
| 2.1.14 RNA 的固定及Northern 杂交 |
| 2.1.15 DEV 感染CEF 细胞mRNA 的纯化 |
| 2.1.16 5′-cDNA 末端快速扩增(5′-RACE) |
| 2.1.17 3′-cDNA 末端快速扩增(3′-RACE) |
| 2.1.18 DEV UL15 基因的序列分析 |
| 2.1.19 pET-UL15C~(232) 原核载体的构建 |
| 2.1.20 6×His-UL15C~(232) 融合蛋白在 E.coli 中的表达及纯化 |
| 2.1.21 兔抗 6×His-UL15C~(232) 抗血清的制备 |
| 2.1.22 Western blot |
| 2.1.23 UL15 基因表达时相分析 |
| 2.1.24 UL15 真核表达质粒的构建及中量提取 |
| 2.1.25 UL15 在CEF 细胞上的瞬时表达 |
| 2.1.26 UL15 基因产物在CEF 细胞中的定位 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 DEV 病毒的增殖与纯化结果 |
| 2.2.2 UL15 RT-PCR 扩增结果 |
| 2.2.3 UL15 Northen 探针的标记结果 |
| 2.2.4 UL15 Northern blot 结果 |
| 2.2.5 UL15 基因剪切位点的确定 |
| 2.2.6 UL15 基因末端序列的扩增结果 |
| 2.2.7 UL15 基因的序列分析结果 |
| 2.2.8 6×His-UL15C~(232) 融合蛋白抗血清的制备 |
| 2.2.9 Western blot 检测感染细胞内UL15 蛋白的表达 |
| 2.2.10 UL15 基因的表达时相结果 |
| 2.2.11 病毒粒子与兔抗UL15C~(232) 抗血清的反应性 |
| 2.2.12 UL15 基因在CEF 中的瞬时表达 |
| 2.2.13 UL15 表达产物在CEF 中的亚细胞定位 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 DEV UL15 基因结构 |
| 2.3.2 UL15.5 基因的序列分析 |
| 2.3.3 DEV UL15 可能的功能 |
| 2.3.4 DEV 的分类地位-基于UL15 氨基酸序列的分析 |
| 2.3.5 UL15C~(232) 的原核表达 |
| 2.3.6 UL15 的表达时序性 |
| 2.3.7 UL15 在病毒粒子中的存在性 |
| 2.3.8 UL15 在感染细胞中的亚细胞定位 |
| 第三章 鸭肠炎病毒UL41 基因及其编码蛋白的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒与细胞 |
| 3.1.2 质粒与菌种 |
| 3.1.3 试剂盒、限制性酶类及主要生化试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.1.6 DEV UL41 的序列分析 |
| 3.1.7 PCR法扩增UL41及US3基因序列 |
| 3.1.8 UL41 蛋白的原核表达 |
| 3.1.9 可溶性MBP-VHS 融合蛋白的纯化 |
| 3.1.10 VHS 底物RNA 的制备 |
| 3.1.11 RNA 的提取及电泳 |
| 3.1.12 体外VHS 活性检测 |
| 3.1.13 兔抗GST-UL41 抗血清的制备 |
| 3.1.14 Western blot |
| 3.1.15 UL41 基因表达时相分析 |
| 3.1.16 UL41 真核表达质粒的构建及中量提取 |
| 3.1.17 UL41 在CEF 细胞上的瞬时表达 |
| 3.1.18 UL41 基因产物在CEF 细胞中的定位 |
| 3.1.19 UL41 的定点突变 |
| 3.1.20 瞬时表达UL41 的VHS 活性检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 UL41 序列分析结果 |
| 3.2.2 UL41 及US3的PCR结果 |
| 3.2.3 UL41 的原核表达 |
| 3.2.4 UL41 的纯化 |
| 3.2.5 US3 体外转录物的制备 |
| 3.2.6 UL41 的体外VHS 活性检测 |
| 3.2.7 兔抗DEV UL41 血清的反应性 |
| 3.2.8 UL41 在DEV 感染的CEF 中的表达 |
| 3.2.9 UL41 基因的表达时相结果 |
| 3.2.10 Western blot 检测DEV 病毒粒子中的UL41 |
| 3.2.11 UL41 在感染细胞中的亚细胞定位 |
| 3.2.12 UL41 的瞬时表达及其VHS 活性的测定 |
| 3.2.13 UL41 突变体表达载体的构建及瞬时表达 |
| 3.2.14 定点突变的UL41 VHS 活性检测 |
| 3.2.15 保守性氨基酸位点的功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 DEV UL41 的序列分析 |
| 3.3.2 DEV 的分类地位-基于UL41 的分析 |
| 3.3.3 UL41 的可溶性表达及纯化 |
| 3.3.4 UL41 表达的时序性 |
| 3.3.5 UL41 是病毒粒子的组成部分 |
| 3.3.6 UL41 在感染细胞中的分布 |
| 3.3.7 UL41 的VHS 活性 |
| 3.3.8 VHS 活性的关键位点 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律（论文提纲范文）
| 本论文的创新性研究工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文中常用英文缩写词汇含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 历史与分布 |
| 2 病原特征 |
| 3 DPV对组织器官的侵染和增殖规律 |
| 4 鸭瘟疫苗 |
| 4.1 鸭瘟传统疫苗 |
| 4.2 基因疫苗 |
| 5 基因疫苗的常用免疫佐剂 |
| 6 基因疫苗检测方法 |
| 7 本课题的研究目的和内容 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 鸭瘟病毒的纯化、负染超微结构观察及兔抗DPV高免血清的制备和纯化 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸭胚 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.4.1 病毒增殖的试剂配制 |
| 1.4.2 病毒纯化的试剂配制 |
| 1.4.3 电镜观察的试剂配制 |
| 1.4.4 病毒含量测定的试剂配制 |
| 1.4.5 琼脂板的制备 |
| 1.4.6 兔抗DPV IgG提纯的试剂配制 |
| 1.4.7 SDS-PAGE试剂的配制 |
| 1.4.8 考马斯亮兰染色系统 |
| 1.4.9 其他试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒增殖 |
| 2.2 病毒纯化 |
| 2.3 电镜观察 |
| 2.4 病毒含量测定 |
| 2.5 兔抗DPV高免血清的制备 |
| 2.5.1 DPV免疫抗原的制备 |
| 2.5.2 试验兔的免疫程序 |
| 2.5.3 兔抗DPV抗体效价的检测 |
| 2.6 兔抗DPV IgG提取和纯化 |
| 2.6.1 饱和硫酸铵粗提兔抗DPV IgG |
| 2.6.2 兔抗DPV IgG纯化 |
| 2.6.3 兔抗DPV IgG纯度的检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 病毒增殖和纯化 |
| 3.2 病毒粒子的超微结构观察 |
| 3.3 病毒含量的测定 |
| 3.4 抗体效价检测 |
| 3.5 兔抗DPV IgG提取和纯化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于DPV病毒的纯化 |
| 4.2 关于DPV病毒粒子的大小和形态 |
| 4.3 兔抗DPV IgG的制备和纯化 |
| 5 小结 |
| 第二章 间接免疫组化检测DPV gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 质粒与毒株 |
| 1.2 试验动物与免疫组织材料 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.3.1 组织固定液 |
| 1.3.2 苏木素染色剂 |
| 1.3.3 免疫组化染色试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物免疫与组织采样 |
| 2.2 组织样品的处理 |
| 2.3 间接免疫组化检测DPV gC抗原方法的建立和优化 |
| 2.3.1 间接免疫组化检测DPV gC抗原方法的优化 |
| 2.3.2 间接免疫组化检测DPV gC抗原方法的建立 |
| 2.3.3 判断标准 |
| 2.3.4 特异性试验 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 间接免疫组化检测DPV gC抗原方法的建立和优化 |
| 3.1.1 间接免疫组化检测DPV gC抗原方法的优化 |
| 3.1.2 特异性实验 |
| 3.2 基因枪轰击不同剂量的pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 3.3 肌肉注射不同剂量的pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律. |
| 3.4 不同免疫途径免疫脂质体/DNA基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 3.5 不同免疫途径免疫壳聚糖/DNA基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 3.6 鸭瘟弱毒疫苗在雏鸭体内的增殖和分布规律 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间接免疫组化染色检测pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 4.2 不同免疫途径对pcDNA-DPV-gC的抗原表达时相和分布规律的影响 |
| 4.3 不同免疫剂量对pcDNA-DPV-gC的抗原表达时相和分布规律的影响 |
| 4.4 不同免疫佐剂对pcDNA-DPV-gC的抗原表达时相和分布规律的影响 |
| 4.5 pcDNA-DPV-gC基因疫苗的抗原表达和DPV弱毒疫苗增殖和分布规律的比较. |
| 5 小结 |
| 第三章 间接免疫荧光检测DPV gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 1.试验材料 |
| 1.1 质粒与毒株 |
| 1.2 试验动物与免疫组织材料 |
| 1.3 主要试剂及配制方法 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物免疫与组织采样 |
| 2.2 组织样品的处理 |
| 2.3 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV gC抗原方法的建立和优化 |
| 2.3.1 间接免疫荧光检测优化条件的筛选 |
| 2.3.2 间接免疫荧光的染色程序 |
| 2.3.3 判断标准 |
| 2.3.4 特异性试验 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 间接免疫荧光检测DPV gC抗原方法的建立和优化 |
| 3.1.1 间接免疫荧光检测DPV gC抗原方法的优化 |
| 3.1.2 特异性实验 |
| 3.2 基因枪轰击不同剂量的pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 3.3 肌肉注射不同剂量的pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律. |
| 3.4 不同免疫途径免疫脂质体/DNA基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 3.5 不同免疫途径免疫壳聚糖/DNA基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 3.6 鸭瘟弱毒疫苗在雏鸭体内的增殖和分布规律 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间接免疫荧光方法检测pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律 |
| 4.2 鸭瘟基因疫苗研究意义和展望 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（5）鸭病毒性肿头出血症病毒强毒生物学特性（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 鸭重要病毒性疾病病原生物学特性研究进展 |
| 1 鸭病毒性肠炎病毒 |
| 1.1 研究历史 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 分布及形态学 |
| 1.4 实验室宿主系统 |
| 1.5 抵抗力 |
| 1.6 细胞凋亡 |
| 2 鸭肝炎病毒 |
| 2.1 研究历史 |
| 2.2 病原学 |
| 2.3 实验室宿主系统 |
| 2.4 抵抗力 |
| 2.5 细胞凋亡 |
| 3 鸭流感病毒 |
| 3.1 研究历史 |
| 3.2 病原学 |
| 3.3 形态学 |
| 3.4 实验室宿主系统 |
| 3.5 抵抗力 |
| 3.6 细胞凋亡 |
| 4 鸭病毒性肿头出血症病毒 |
| 4.1 研究历史 |
| 4.2 病原学 |
| 4.3 实验室宿主系统 |
| 4.4 抵抗力 |
| 4.5 细胞凋亡 |
| 4.6 流行特点 |
| 4.7 临床症状及剖检变化 |
| 4.8 诊断 |
| 4.9 防治措施 |
| 第二章 病毒感染与宿主细胞凋亡研究进展 |
| 1 细胞凋亡概述 |
| 2 病毒感染和细胞凋亡 |
| 3 呼肠孤病毒感染与细胞凋亡 |
| 4 细胞凋亡检测方法 |
| 4.1 形态学检测 |
| 4.2 DNA片段化检测 |
| 4.3 流式细胞分析检测 |
| 4.4 线粒体膜通透性检测法 |
| 5 结语 |
| 第三章 鸭病毒性肿头出血症病毒强毒适应鸭胚成纤维细胞及增殖特性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验设计 |
| 2.2 DSHDV人工感染鸭试验 |
| 2.3 从病死鸭实质性器官中分离病毒 |
| 2.4 分离毒在鸭胚上传代 |
| 2.5 鸭胚原代成纤维细胞的制备 |
| 2.6 病毒液接种到DEF上的方法 |
| 2.7 病毒适应在DEF上生长的方法 |
| 2.8 DSHDV在DEF上的增殖特性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV的人工感染鸭实验 |
| 3.2 组织分离毒接种鸭胚绒毛尿囊腔传代 |
| 3.3 DEF的制备 |
| 3.4 组织分离毒直接接种DEF |
| 3.5 鸭胚绒毛尿囊液接种DEF |
| 3.6 适应了DEF的DSHDV的病变特征 |
| 3.7 DSHDV在DEF上的增殖特性测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DSHDV的人工感染鸭实验 |
| 4.2 DSHDV对DEF细胞的适应 |
| 4.3 DSHDV在DEF细胞中的增殖规律 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第四章 鸭病毒性肿头出血症病毒强毒在鸭胚成纤维细胞上的形态发生学和宿主细胞超微结构病变研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代单层鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2 采样时间点的选择 |
| 2.3 电镜样品的采集方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV病毒粒子在DEF中的形态特征 |
| 3.2 DHSDV在DEF中形态发生学的研究 |
| 3.3 DSHDV感染的DEF细胞的超微结构变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DSHDV的形态特征 |
| 4.2 DSHDV形态发生学特征 |
| 4.3 DSHDV感染DEF细胞的病变特点 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 鸭病毒性肿头出血症病毒强毒致鸭胚成纤维细胞凋亡的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 HE染色法检测细胞凋亡 |
| 2.2 DNA梯带法检测细胞凋亡 |
| 2.3 电子显微镜观察法检测细胞凋亡 |
| 2.4 流式细胞技术法 |
| 2.5 荧光显微镜观察法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HE染色法检测DSHDV致DEF细胞凋亡 |
| 3.2 DNA Ladder检测DSHDV致DEF细胞凋亡 |
| 3.3 电子显微镜观察法检测DSHDV致DEF细胞凋亡 |
| 3.4 流式细胞仪检测DSHDV致DEF细胞凋亡 |
| 3.5 荧光显微镜观察法检测DSHDV致DEF细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于呼肠孤病毒致细胞凋亡 |
| 4.2 关于细胞凋亡的检测方法 |
| 4.3 关于细胞凋亡与病毒增殖的关系 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第六章 鸭病毒性肿头出血症病毒提纯和形态观察 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒增殖 |
| 2.2 病毒提纯方法 |
| 2.3 电镜观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 聚乙二醇沉淀法纯化结果 |
| 3.2 蔗糖垫底超速离心结果 |
| 3.3 CsCl不连续密度梯度离心结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于DSHDV的提纯 |
| 4.2 关于DSHDV病毒的负染形态观察 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第七章 鸭病毒性肿头出血症病毒强毒结构蛋白分析 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSHDV病毒增殖及纯化 |
| 2.2 病毒含量测定 |
| 2.3 病毒结构蛋白分析 |
| 2.4 兔抗DSHDV高免血清制备方法 |
| 2.5 免疫印迹检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV强毒成熟病毒粒子SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.2 兔抗DSHDVIgG的制备 |
| 3.3 Western Blotting免疫印迹结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DSHDV结构蛋白的研究 |
| 4.2 兔抗DSHDVIgG的纯化 |
| 4.3 DSHDV免疫原性相关蛋白的研究 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性 |
| 1 概况 |
| 2 鸭病毒性传染病流行特点 |
| 3 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性 |
| 3.1 鸭病毒性肠炎病原的感染特性 |
| 3.2 鸭病毒性肝炎病原的感染特性 |
| 3.3 鸭流感病原的感染特性 |
| 3.4 鸭病毒性肿头出血症病原的感染特性 |
| 4 存在的问题和研究方向 |
| 第二章 免疫酶技术在病毒病研究中的应用 |
| 1 免疫酶技术基本原理 |
| 2 免疫酶技术发展简史 |
| 3 酶标技术的研究进展 |
| 3.1 标记酶的特点 |
| 3.2 标记酶的种类 |
| 3.3 标记酶底物的种类 |
| 3.4 酶标记技术的种类 |
| 4 免疫酶技术的研究就进展 |
| 4.1 免疫酶组化技术研究进展 |
| 4.2 免疫酶测定法的研究进展 |
| 5 免疫酶组化在病毒病研究中的应用 |
| 5.1 免疫酶组化技术在家畜病毒病研究中的应用 |
| 5.2 免疫酶组化技术在家禽病毒病研究中的应用 |
| 6 酶联免疫吸附测定法在病毒病研究中的应用 |
| 6.1 ELISA在家畜病毒病研究中的应用 |
| 6.2 ELISA在家禽病毒病研究中的应用 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 DSHDV强毒人工感染鸭实验模型构建及组织病理学发展规律研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验鸭分组及人工感染 |
| 2.2 临床症状及病理剖检 |
| 2.3 病理切片的制备和观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 剖检变化 |
| 3.3 组织病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DVSHD病理学模型构建及其特征 |
| 4.2 DVSHD与鸭常见传染病的临床症状及剖检变化的异同 |
| 4.3 DVSHD与鸭常见传染病的组织学变化的异同 |
| 4.4 病理学变化的特征及意义 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第四章 DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 人工复制病例 |
| 2.2 透射电镜样品制备及观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV的形态特征 |
| 3.2 DSHDV分布及形态发生特点 |
| 3.3 宿主细胞的超微结构变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DSHDV病毒粒子在感染鸭体内形态特征与形态发生学过程 |
| 4.2 DSHDV致感染鸭的超微结构变化及意义 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 DSHDV强毒人工感染鸭和鸭胚致宿主细胞凋亡研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸭胚的人工感染 |
| 2.2 实验鸭的人工感染及样品的采集 |
| 2.3 HE染色法观察 |
| 2.4 透射电镜法观察 |
| 2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV在鸭胚上的培养特性 |
| 3.2 DSHDV致鸭胚宿主细胞凋亡的观察 |
| 3.3 DSHDV致鸭宿主细胞凋亡的观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞凋亡的基本特征 |
| 4.2 细胞凋亡的检测方法 |
| 4.3 DSHDV感染与宿主细胞凋亡 |
| 4.4 DSHDV致宿主细胞凋亡的规律 |
| 4.5 DSHDV致宿主细胞凋亡机制的探讨 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第六章 免疫组化检测DSHDV方法的建立和在检测病毒侵染规律研究中的应用 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.5 主要仪器及设备 |
| 1.6 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 人工复制病例 |
| 2.2 实验鸭的人工感染及样品采集 |
| 2.3 兔抗DSHDV高免血清IgG的提取和纯化 |
| 2.4 载玻片和盖玻片的处理 |
| 2.5 免疫组化检测材料的固定、包埋和切片 |
| 2.6 免疫组化检测鸭病毒性肿头出血症病毒方法的建立及优化 |
| 2.7 间接免疫酶法检测DSHDV在鸭体中的侵染规律 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔抗DSHDV高免血清效价及IgG纯化 |
| 3.2 免疫组化SP染色方法的建立和优化 |
| 3.3 特异性实验结果 |
| 3.4 重复性和稳定性实验结果 |
| 3.5 间接免疫酶法检测组织中DSHDV在鸭体中的侵染规律 |
| 4 讨论 |
| 4.1 检测DSHDV抗原的间接免疫酶法的建立与优化 |
| 4.2 DSHDV抗原的定位和DSHDV的侵染规律 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第七章 间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原的制备与纯化 |
| 2.2 鸭病毒性肿头出血症阳性、阴性血清的制备 |
| 2.3 间接ELISA的基本操作程序 |
| 2.4 间接ELISA最佳工作条件的确定 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 临床血清样品的检测 |
| 2.9 免疫鸭特异性抗体的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒抗原的含量和阳性血清效价 |
| 3.2 间接ELISA法最佳工作条件的选择 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.4 敏感性试验 |
| 3.5 重复性试验 |
| 3.6 临床血清样品的检测结果 |
| 3.7 免疫鸭特异性抗体的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间接ELISA技术参数的选择 |
| 4.2 间接ELISA特异性和敏感性 |
| 4.3 间接ELISA试验质量控制 |
| 4.4 间接ELISA在临床上的应用 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）鸭肠炎病毒US2蛋白细胞定位及感染相关功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.1.1 临床症状与病理剖检 |
| 1.1.2 诊断 |
| 1.1.3 鸭病毒性肠炎的防治 |
| 1.1.4 存在的问题及防治措施 |
| 1.2 鸭肠炎病毒研究进展 |
| 1.2.1 鸭肠炎病毒的生物学特性 |
| 1.2.2 鸭肠炎病毒的复制 |
| 1.2.3 鸭肠炎病毒的分子生物学特性 |
| 1.3 疱疹病毒US2蛋白的特性、功能及应用 |
| 1.3.1 疱疹病毒US2蛋白的特性 |
| 1.3.2 疱疹病毒US2蛋白的生物学功能 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 毒株、菌株、细胞和载体 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.1.6 主要试验器材及仪器设备 |
| 2.2 鸭肠炎病毒的增殖与提纯 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 病毒的提纯 |
| 2.2.3 电镜观察 |
| 2.3 鸭肠炎病毒us2基因的克隆 |
| 2.3.1 DEV基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 us2基因的扩增 |
| 2.3.3 PCR产物的克隆与转化 |
| 2.3.4 重组阳性质粒的筛选与鉴定 |
| 2.3.5 鸭肠炎病毒us2基因及其编码蛋白的生物信息学分析 |
| 2.4 鸭肠炎病毒US2蛋白的原核表达与鉴定 |
| 2.4.1 us2基因表达载体的构建及鉴定 |
| 2.4.2 目的基因的诱导表达及纯化 |
| 2.4.3 表达产物的Western blot分析 |
| 2.5 兔抗US2蛋白高免血清的制备及鉴定 |
| 2.5.1 多克隆抗体的制备 |
| 2.5.2 多克隆抗体效价测定 |
| 2.5.3 兔抗US2血清反应性的鉴定 |
| 2.6 鸭肠炎病毒US2蛋白细胞定位的研究 |
| 2.7 鸭肠炎病毒US2蛋白感染相关功能的研究 |
| 2.7.1 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒吸附的影响 |
| 2.7.2 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒侵入的影响 |
| 2.7.3 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒细胞与细胞间传播的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 超离粗纯鸭肠炎病毒的电镜结果 |
| 3.2 鸭肠炎病毒us2基因的克隆 |
| 3.2.1 鸭肠炎病毒us2基因的扩增 |
| 3.2.2 重组克隆载体的鉴定 |
| 3.3 鸭肠炎病毒us2基因及其编码产物的生物信息学分析 |
| 3.3.1 us2基因及其编码产物的同源性分析 |
| 3.3.2 US2蛋白的结构预测与功能性基序分析 |
| 3.3.3 US2蛋白的抗原性分析 |
| 3.4 鸭肠炎病毒US2蛋白的原核表达与鉴定 |
| 3.4.1 重组表达载体的构建及鉴定 |
| 3.4.2 目的基因的诱导表达及纯化 |
| 3.4.3 表达产物的抗原性分析 |
| 3.5 兔抗US2蛋白高免血清的制备及鉴定 |
| 3.5.1 多抗血清效价测定 |
| 3.5.2 兔抗US2血清反应原性的鉴定 |
| 3.6 鸭肠炎病毒US2蛋白的定位 |
| 3.7 鸭肠炎病毒US2蛋白的感染相关功能研究 |
| 3.7.1 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒吸附的影响 |
| 3.7.2 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒侵入的影响 |
| 3.7.3 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒细胞与细胞间传播的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DEV us2基因编码产物的生物信息学分析 |
| 4.2 鸭肠炎病毒粒子的初步纯化 |
| 4.3 DEV us2基因表达、纯化及多抗血清的制备 |
| 4.4 鸭肠炎病毒US2蛋白定位的研究 |
| 4.5 鸭肠炎病毒US2蛋白感染相关功能的研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 禽腺病毒的研究进展 |
| 1 腺病毒的概况 |
| 1.1 腺病毒的分类 |
| 1.2 腺病毒的特点 |
| 1.3 腺病毒的感染及复制 |
| 2 禽腺病毒的概况 |
| 2.1 禽腺病毒的分类 |
| 2.1.1 Ⅰ群禽腺病毒 |
| 2.1.2 Ⅱ群禽腺病毒 |
| 2.1.3 Ⅲ群禽腺病毒 |
| 2.2 禽腺病毒的形态结构及形态发生特点 |
| 2.3 禽腺病毒的浮力密度 |
| 2.4 禽腺病毒的体外培养 |
| 2.5 禽腺病毒的致病机理 |
| 2.6 禽腺病毒的诊断方法 |
| 2.7 腺病毒感染 |
| 2.7.1 鹅的疑是腺病毒性肝炎 |
| 2.7.2 鹅的腺病毒感染 |
| 3 雏鹅新型病毒性肠炎的研究概况 |
| 3.1 雏鹅新型病毒性肠炎概述 |
| 3.2 雏鹅新型病毒性肠炎病毒病原学 |
| 3.3 雏鹅新型病毒性肠炎流行情况 |
| 3.4 雏鹅新型病毒性肠炎临床症状 |
| 3.5 雏鹅新型病毒性肠炎病理变化 |
| 3.5.1 眼观变化 |
| 3.5.2 组织学变化 |
| 3.6 雏鹅新型病毒性肠炎实验室诊断 |
| 3.6.1 病毒的分离和鉴定 |
| 3.6.2 电镜检测技术 |
| 3.6.3 血清学诊断 |
| 3.7 防治措施 |
| 3.7.1 疫苗免疫 |
| 3.7.2 高免血清防治 |
| 3.7.3 不从疫区引进雏鹅和种鹅 |
| 3.7.4 加强饲养管理 |
| 第二章 腺病毒感染与宿主细胞凋亡研究进展 |
| 1 细胞凋亡概况 |
| 2 病毒感染与细胞凋亡关系 |
| 3 腺病毒诱导细胞凋亡的发现 |
| 4 腺病毒感染与细胞凋亡的作用机制 |
| 4.1 EIA |
| 4.2 EIB |
| 4.2.1 E1B-19K |
| 4.2.2 E1B-55K |
| 4.3 E3 |
| 4.3.1 E3区域编码的三个蛋白对细胞凋亡的阻遏作用 |
| 4.3.2 E3区域编码的ADP蛋白的致细胞凋亡作用 |
| 4.4 E4 |
| 4.4.1 E4-ORF6 |
| 4.4.2 E4-ORF4 |
| 5 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 NGVEV-CN强毒在感染鸭胚体内的形态发生学以及宿主细胞超微病理学研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV适应鸭胚 |
| 2.2 鸭胚的人工感染NGVEV试验 |
| 2.3 透射电镜样品制备及观察 |
| 2.3.1 透射电镜样品的制备具体步骤操作 |
| 2.3.2 超薄切片和染色 |
| 2.3.3 透射电镜观察和记录 |
| 3 结果 |
| 3.1 NGVEV在鸭胚中的传代情况 |
| 3.2 感染鸭胚眼观病理变化及电镜下NGVEV颗粒的形态特征 |
| 3.3 NGVEV病毒粒子在感染鸭胚体内的分布及其形态发生特点 |
| 3.4 感染鸭胚宿主的超微结构变化 |
| 3.4.1 尿囊膜 |
| 3.4.2 肝 |
| 3.4.3 肌胃 |
| 3.4.4 肠道 |
| 3.4.5 心 |
| 3.4.6 脑 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV鹅胚尿囊液在鸭胚的适应 |
| 4.2 NGVEV病毒粒子在感染鸭胚中的形态特征和形态发生过程 |
| 4.3 NGVEV感染鸭胚的主要靶器官和靶细胞器 |
| 4.4 人工感染NGVEV雏鹅和鸭胚的宿主细胞超微结构病变的比较 |
| 5 小结 |
| 第四章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株适应鸭胚成纤维细胞及其体外培养的增殖特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 单层鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2 NGVEV在原代鸭胚成纤维细胞上的适应 |
| 2.3 NGVEV-CN细胞毒在DEF上增殖研究 |
| 2.3.1 不同代次NGVEV细胞毒的病毒滴度测定 |
| 2.3.2 F_5代NGVEV细胞毒在不同感染时间的病毒滴度测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 NGVE-CN在原代鸭胚成纤维细胞上的适应情况 |
| 3.2 NGVEV-CN细胞毒在DEF细胞的增殖情况 |
| 3.2.1 不同传代次数的NGVE-CN细胞毒的TCID_(50)测定 |
| 3.2.2 F_5代不同感染时间点的NGVEV-CN细胞毒TCID_(50)测定 |
| 3.3 被NGVEV感染的DEF细胞的细胞病变特征 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV对DEF细胞的适应 |
| 4.2 NGVEV-CN细胞毒的释放 |
| 4.3 NGVEV在DEF细胞的增殖规律 |
| 5 小结 |
| 第五章 NGVEV-CN强毒株在鸭胚成纤维细胞上的形态发生学和宿主细胞超微结构病变研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 透射电子显微镜观察样品制备相关试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代单层鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2 NGVEV感染DEF细胞及采样 |
| 2.3 透射电镜样品准备及操作方法 |
| 2.3.1 透射电镜样品制备的具体步骤 |
| 2.3.2 超薄切片和染色 |
| 2.3.3 观察和记录 |
| 3 结果 |
| 3.1 电镜下NGVEV病毒粒子的确认和形态特征 |
| 3.2 NGVEV在感染细胞内的形态发生过程 |
| 3.3 NGVEV的胞浆包涵体结构 |
| 3.4 被NGVEV感染的DEF细胞的超微结构变化 |
| 3.4.1 线粒体的固缩变化 |
| 3.4.2 细胞浆中不规则的电子致密物质 |
| 3.4.3 细胞浆的粗面内质网扩张 |
| 3.4.4 细胞浆内空泡的形成 |
| 3.5 NGVEV致DEF细胞凋亡现象 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV在DEF细胞中的形态特征和形态发生过程 |
| 4.2 NGVEV的胞浆包涵体结构 |
| 4.3 NGVEV致DEF细胞线粒体的固缩和异常聚集变化 |
| 5 小结 |
| 第六章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致鸭胚成纤维细胞凋亡的相关研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 光学显微镜观察细胞凋亡的相关试剂 |
| 1.3.3 透射电子显微镜观察细胞凋亡的相关试剂 |
| 1.3.4 DNA提取及电泳试剂 |
| 1.3.5 Annexin V-FITC/PI双标记试剂盒 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸭胚成纤维细胞体外培养 |
| 2.2 光学显微镜观察 |
| 2.3 透射电镜观察 |
| 2.3.1 制样 |
| 2.3.2 超薄切片和染色 |
| 2.3.3 观察和记录 |
| 2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.5 Annexin V-FITC/PI双标记的流式细胞仪检测 |
| 2.6 Annexin V-FITC/PI双标记的荧光显微镜观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 HE染色法的光镜观察 |
| 3.2 透射电子显微镜观察 |
| 3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.4 Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测 |
| 3.5 Annexin V-FITC/PI双标记的荧光显微镜观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV致DEF细胞凋亡 |
| 4.2 NGVEV致DEF细胞凋亡的形态学观察 |
| 4.3 细胞凋亡与细胞病变的关系 |
| 4.4 NGVEV致DEF细胞凋亡的意义 |
| 5 小结 |
| 第七章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒的提纯、负染超微结构观察和兔抗NGVEV高免血清IgG的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 CsCl密度梯度离心相关试剂配制 |
| 1.3.3 负染电镜相关试剂 |
| 1.3.4 SDS-PAGE试剂的配制 |
| 1.3.5 马斯亮兰染色的配制 |
| 1.3.6 琼脂板的制备 |
| 1.3.7 抗原制备及抗体纯化的相关试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒增殖 |
| 2.1.1 经鸭胚尿囊腔增殖 |
| 2.1.2 经体外培养的鸭胚成纤维细胞增殖 |
| 2.2 NGVEV的提纯方法 |
| 2.2.1 沉淀法纯化病毒 |
| 2.2.2 差速离心法纯化病毒 |
| 2.2.3 CsCl密度梯度和等密度超速离心纯化病毒 |
| 2.3 应用透射电镜对NGVEV超微结构进行负染观察 |
| 2.4 兔抗NGVEV高免血清的制备 |
| 2.4.1 病毒蛋白含量的测定(Bradford法) |
| 2.4.2 差速离心法纯化病毒 |
| 2.4.3 NGVEV免疫抗原的制备 |
| 2.4.4 抗体效价的检测 |
| 2.4.5 兔抗NGVEV血清IgG的提取和纯化 |
| 2.4.6 兔抗NGVEV血清IgG蛋白含量的测定 |
| 2.4.7 兔抗NGVEV血清IgG纯度的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 NGVEV在鸭胚及DEF细胞的增殖情况 |
| 3.2 不同纯化方法的结果 |
| 3.2.1 沉淀法纯化病毒 |
| 3.2.2 差速离心法纯化病毒 |
| 3.2.3 CsCl不连续密度梯度和等密度超速离心纯化病毒 |
| 3.3 兔抗NGVEV高免血清的制备 |
| 3.3.1 免疫兔子的抗原的浓度 |
| 3.3.2 抗体效价检测 |
| 3.3.3 兔抗NGVEV血清IgG的纯化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于NGVEV的提纯 |
| 4.2 完整NGVEV粒子与不完整NGVEV粒子 |
| 4.3 兔抗NGVEV高免血清IgG的纯化 |
| 5 小结 |
| 第八章 利用免疫组化SP法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 组织固定液 |
| 1.3.2 脱水剂 |
| 1.3.3 组织包埋剂 |
| 1.3.4 APES粘片剂 |
| 1.3.5 苏木素染染色剂 |
| 1.3.6 免疫组化染色试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV的增殖及兔抗NGVEV的IgG制备 |
| 2.2 病理模型的构建 |
| 2.3 人工感染NGVEV雏鹅的组织材料的采集 |
| 2.4 载玻片和盖玻片的处理 |
| 2.5 免疫组化检测材料的固定、包埋和切片 |
| 2.6 免疫组化检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒方法的建立及优化 |
| 2.6.1 免疫组化SP法检测NGVEV方法的条件优化 |
| 2.6.2 特异性试验 |
| 2.6.3 重复性和稳定性实验 |
| 2.6.4 免疫组化SP法染色程序 |
| 2.6.5 结果的判定 |
| 3 结果 |
| 3.1 雏鹅人工急性感染NGVE-CN强毒的临床症状 |
| 3.2 雏鹅人工急性感染NGVE-CN强毒的大体病变 |
| 3.3 免疫组化SP染色方法的建立和优化 |
| 3.4 特异性实验结果 |
| 3.5 重复性和稳定性实验结果 |
| 3.6 应用免疫组织化学SP法检测NGVEV在感染鹅各组织中的定位及动态分布 |
| 3.6.1 NGVEV在感染雏鹅的免疫器官的定位及动态分布 |
| 3.6.2 NGVEV在感染雏鹅的消化器官的定位及动态分布 |
| 3.6.3 NGVEV在感染雏鹅的其他器官的定位及动态分布 |
| 3.7 应用免疫组织化学SP法检测NGVEV在死亡鹅组织中的定位及动态分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫组织化学染色法检测NGVEV的建立与优化 |
| 4.2 NGVEV侵染鹅免疫器官的意义 |
| 4.3 NGVEV侵染鹅消化器官的意义 |
| 5 小结 |
| 第九章 利用免疫荧光抗体法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 免疫荧光染色试剂 |
| 1.3.2 称染试剂 |
| 1.3.3 其余试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV的增殖及兔抗NGVEV的IgG制备 |
| 2.2 病理模型的构建 |
| 2.3 人工感染NGVEV雏鹅的组织材料的采集 |
| 2.4 载玻片和盖玻片的处理 |
| 2.5 间接免疫荧光检测材料的固定、包埋和切片 |
| 2.6 间接免疫荧光检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒方法的建立及优化 |
| 2.6.1 间接免疫荧光检测NGVEV条件的优化 |
| 2.6.2 特异性试验 |
| 2.6.3 间接免疫荧光法检测石蜡切片中NGVEV的染色程序 |
| 2.6.4 免疫荧光染色结果判定 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫荧光染色方法的建立和优化结果 |
| 3.2 特异性实验结果 |
| 3.3 应用间接免疫荧光检测NGVEV在感染鹅组织中的定位及动态分布 |
| 3.4 应用间接免疫荧光检测NGVEV在死亡鹅组织中的定位及动态分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于荧光抗体技术的应用和优化 |
| 4.2 免疫荧光法和免疫组化SP法检测NGVEV的比较 |
| 4.3 NGVEV的组织嗜性及分布规律 |
| 4.4 其他腺病毒的感染和组织嗜性 |
| 5 小结 |
| 第十章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致雏鹅宿主细胞凋亡的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 光学显微镜观察细胞凋亡的相关试剂 |
| 1.3.2 透射电子显微镜观察细胞凋亡的试剂 |
| 1.3.3 DNA提取及电泳试剂 |
| 1.3.4 TUNEL法检测相关试剂 |
| 1.3.5 其它常规试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验鹅的人工感染及组织样品的采集 |
| 2.2 HE染色的光学显微镜观察 |
| 2.3 透射电子显微镜观察 |
| 2.4 琼脂糖凝胶电泳检测宿主细胞DNA Ladder |
| 2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3 结果 |
| 3.1 HE染色的可见光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化 |
| 3.2 透射电子显微镜观察凋亡细胞的超微形态学变化 |
| 3.3 DNA Ladder检测 |
| 3.4 TUNEL法检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞凋亡的检测方法 |
| 4.2 NGVEV感染与宿主鹅的细胞凋亡 |
| 5 小结 |
| 第十一章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对青年鹅的免疫原性研究及重组GOIL-2对疫苗的佐剂效应研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及佐剂 |
| 1.2 试验青年鹅及鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 MTT相关溶液的配制 |
| 1.3.2 ELISA相关溶液的配制 |
| 1.3.3 中和实验相关试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV灭活疫苗的制备 |
| 2.2 28日龄青年鹅的分组免疫程序及血样采集 |
| 2.3 细胞免疫水平检测 |
| 2.3.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.3.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.3.3 样品检测及数据处理 |
| 2.4 体液免疫水平检测 |
| 2.4.1 间接ELISA实验 |
| 2.4.2 中和抗体水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 被疫苗免疫青年鹅的健康状况 |
| 3.2 NGVEV强毒株的TCID_(50)测定 |
| 3.3 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.4 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 3.5 疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5.1 不同剂量的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5.2 辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5.3 NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果的比较 |
| 3.6 被疫苗免疫青年鹅的血清IgG水平检测结果 |
| 3.6.1 不同剂量的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV的IgG水平的检测结果 |
| 3.6.2 辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV-IgG水平的检测结果 |
| 3.6.3 NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV的IgG水平的检测结果的比较 |
| 3.7 被疫苗免疫的青年鹅中和抗体水平的检测结果 |
| 3.7.1 不同剂量NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果 |
| 3.7.2 辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果 |
| 3.7.3 NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2 NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV灭活疫苗对青年鹅的细胞免疫效果 |
| 4.2 NGVEV灭活疫苗对青年鹅的体液免疫效果 |
| 4.3 GoIL-2对疫苗诱导的细胞免疫及体液免疫反应的影响 |
| 5 小结 |
| 第十二章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗在开产前种鹅的免疫效果评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及佐剂 |
| 1.2 试验种鹅 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 开产前鹅的分组免疫程序及样品的采集 |
| 2.2 卵黄的收集及处理方法 |
| 2.3 细胞免疫水平检测 |
| 2.4 体液免疫水平检测 |
| 2.5 后代雏鹅的攻毒免疫保护力测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 被免疫种鹅的健康状况 |
| 3.2 被免疫种鹅的淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.3 被免疫种鹅的血清IgG水平检测结果 |
| 3.4 被免疫种鹅的血清中和抗体水平检测结果 |
| 3.5 被免疫种鹅的卵黄抗NGVEV的IgG水平检测结果 |
| 3.6 被免疫种鹅的卵黄中和抗体水平的检测结果 |
| 3.7 被免疫种鹅的后代雏鹅攻毒保护实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间以第一作者身份发表的论文 |
| 攻读博士学位期间以非第一作者身份发表的论文 |
（9）雏鹅新型病毒性肠炎病毒的诊断与防控研究（论文提纲范文）
| 1 雏鹅新型病毒性肠炎的流行病学、临床症状、病理剖检和病理组织超微结构 |
| 1.1 流行病学 |
| 1.2 临床症状 |
| 1.3 病理剖检 |
| 1.4 病理组织超微结构 |
| 2 病原学研究 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 病毒检测和诊断 |
| 2.3 病毒的提纯、核酸类型及结构蛋白质分析 |
| 2.4 病原的培养及增殖特性研究 |
| 3 免疫预防研究 |
| 4 临床预防和治疗研究 |
| 4.1 临床预防研究 |
| 4.2 治疗研究 |
| 4.2.1 高免血清与高免卵黄抗体治疗 |
| 4.2.2 中草药和现代生物制剂治疗 |
（10）鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.2 鸭肠炎病毒简介 |
| 1.3 鸭肠炎病毒的装配方式 |
| 1.4 鸭肠炎病毒分子生物学研究 |
| 1.5 鸭病毒性肠炎的诊断 |
| 1.5.1 综合分析流行病学、临床症状和病理变化 |
| 1.5.2 病毒的分离和鉴定 |
| 1.5.3 血清学方法 |
| 1.5.4 分子生物学方法 |
| 1.6 鸭病毒性肠炎的防治 |
| 1.6.1 预防 |
| 1.6.2 治疗 |
| 1.7 鸭病毒性肠炎存在的问题与展望 |
| 1.7.1 鸭病毒性肠炎流行病学的问题与变化 |
| 1.7.2 病理变化的非典型化 |
| 1.7.3 疫苗保护效果的变化 |
| 1.7.4 “新型鸭病毒性肠炎”的提出 |
| 1.8 疱疹病毒概述 |
| 1.8.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.8.2 疱疹病毒形态结构 |
| 1.8.3 疱疹病毒基因组结构 |
| 1.8.4 疱疹病毒主要结构蛋白 |
| 1.8.5 疱疹病毒VP22 蛋白研究进展 |
| 1.9 B 细胞抗原表位的筛选 |
| 1.9.1 抗原表位概述 |
| 1.9.2 B 细胞抗原表位的研究方法 |
| 第二章 鸭肠炎病毒VP22 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白VP22 的表达及纯化 |
| 2.2 重组蛋白的Western blot 分析 |
| 2.3 ELISA 筛选方法的建立 |
| 2.4 细胞融合率 |
| 2.5 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.6 腹水效价的测定 |
| 2.7 杂交瘤细胞染色体分析 |
| 2.8 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.9 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 鸭肠炎病毒VP22 蛋白B 细胞线性表位的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 VP22 表位预测 |
| 2.2 UL49 基因的分段克隆、表达与鉴定 |
| 2.3 单克隆抗体2B10 抗原表位的初步分析与鉴定 |
| 2.4 单克隆抗体2B10 抗原表位分析与定位 |
| 2.5 ELISA 鉴定抗原表位 |
| 2.6 抗原表位与DEV 阳性血清的反应性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、人工感染雏鹅新型病毒性肠炎病毒的形态发生及宿主细胞的超微结构变化（论文参考文献）
- [1]水貂肠炎病毒NS1非结构蛋白调控细胞凋亡的分子机制[D]. 林鹏. 中国农业科学院, 2019(08)
- [2]鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究[D]. 吴英. 四川农业大学, 2015(12)
- [3]鸭肠炎病毒UL15及UL41基因的鉴定[D]. 朱洪伟. 中国农业科学院, 2011(10)
- [4]鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律[D]. 沈福晓. 四川农业大学, 2010(04)
- [5]鸭病毒性肿头出血症病毒强毒生物学特性[D]. 张娜. 四川农业大学, 2010(12)
- [6]鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究[D]. 李传峰. 四川农业大学, 2010(12)
- [7]鸭肠炎病毒US2蛋白细胞定位及感染相关功能的研究[D]. 刘晓玫. 东北农业大学, 2010(07)
- [8]雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究[D]. 陈舜. 四川农业大学, 2009(05)
- [9]雏鹅新型病毒性肠炎病毒的诊断与防控研究[J]. 余华,叶健强,严玉宝,廖党金,胡娟. 四川动物, 2009(04)
- [10]鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 王克雄. 甘肃农业大学, 2009(06)