一、酿酒酵母细胞四种转化方法的比较（论文文献综述）
赵一瑾[1]（2021）在《代谢工程改造酿酒酵母生产萜类化合物》文中指出萜类化合物在食品、药品和化学品等多方面都具有较高的经济价值。通过从自然界中天然提取和化学法合成均不能满足日益增长的市场需求,而利用微生物细胞工厂生产萜类化合物则被认为是绿色且经济的途径。酿酒酵母因为具有生物安全性高、易于遗传操作和可利用廉价碳源等优势而成为合成萜类化合物的最有价值的一种宿主。目前,关于在酿酒酵母中异源合成萜类化合物的主要研究方向有以下几个方面:引入并过表达异源代谢途径酶;增加前体代谢物的供应;动态控制或删除竞争途径;筛选合适的发酵底物,降低合成成本。亲脂性的萜类化合物一般被认为是积累并包裹在脂滴（LD）中的,但是脂滴中各组分的代谢合成与萜类化合物的合成共用多种前体代谢物、ATP和NADPH,这使整个代谢网络变得复杂。所以,虽然在酿酒酵母中已有很多策略用于萜类化合物的异源合成,但其产量仍受到存储方式和代谢网络的复杂调控等多种因素的影响。因此,研究重新定向脂类代谢通量对增加萜类化合物的生物合成十分重要。在底物利用方面,SUC2基因编码的酿酒酵母蔗糖转化酶（Sc In V）能够水解蔗糖进入细胞参与多种生化反应,这使酿酒酵母能够利用廉价的蔗糖进行代谢发酵。为了更好的利用蔗糖发酵生产高价值的化合物,有必要对转化酶进行定点突变研究其突变体酶活性。本研究以酿酒酵母CEN.PK 113-5D菌株为宿主菌,通过引入并过表达β-胡萝卜素和α-葎草烯的异源合成途径,探究了脂类代谢通量扰动与不同萜类化合物合成的关系。通过对酿酒酵母中的蔗糖转化酶进行定点突变降低酶活性,研究了蔗糖转化酶活性对β-胡萝卜素积累和其他特性的影响,为在酿酒酵母中利用更为廉价的甘蔗糖蜜发酵生产高价值的化合物提供一定的参考。本论文的主要研究结果如下:1.为了表征酿酒酵母积累不同萜类化合物的能力,分别在酵母细胞中引入了β-胡萝卜素和α-葎草烯的异源合成途径。首先,通过采取基因组整合表达方式和强启动子实现crt YB基因、crt I基因、crt E基因和t HMG1基因的高表达,使构建的YZ03菌株可生产3.67 mg/g DCW的β-胡萝卜素。其次,通过采取强启动子并利用基因组整合方式表达ZSS1基因,并进一步过表达内源性的限速酶ERG20基因和动态调控竞争途径中的ERG9基因,使构建的ZH04菌株可生产93.94 mg/L的α-葎草烯。在酿酒酵母中成功构建了分别产生β-胡萝卜素和α-葎草烯的工程菌株。2.细胞的多种功能离不开脂类代谢网络的调控,我们表征了改造脂类代谢网络对不同萜类化合物合成的影响。通过在YZ03菌株基因组上整合一个额外的由强启动子控制表达的ARE1和ARE2可以产生5.67 mg/g DCWβ-胡萝卜素,比YZ03的产量提高了54%;在YZ03菌株中敲除磷脂酸磷酸酶基因（PAH1、DPP1和LPP1）也使β-胡萝卜素产量增加了2倍。结合上述两种策略更是将β-胡萝卜素的产量提高了2.4倍。结果表明,脂质代谢网络的改造与调控对于酿酒酵母中β-胡萝卜素的积累很重要。然而,在α-葎草烯生产菌株中过表达ARE1或删除磷脂酸磷酸酶基因导致其产量均有所下降。这表明针对不同的萜类化合物,其在酿酒酵母中的积累、存储与脂类代谢网络之间的关系十分复杂,不同萜类产物与脂类代谢的关系具有一定差异。虽然具体机理尚不清楚,但该工作也为研究改变脂质代谢网络与萜类化合物积累之间的关系提供了见解。3.酿酒酵母中内源的蔗糖转化酶使其利用蔗糖发酵成为可能。研究了在蔗糖条件下,降低蔗糖转化酶活性对β-胡萝卜素积累和其他特性的影响。通过设计具有不同标签并与Golden Gate克隆兼容的标准化载体,构建了几种含有不同标签的蛋白表达质粒,并在此基础上快速高效地完成蔗糖转化酶的定点诱变,加速了突变蛋白的表达。在高蔗糖条件下,SUC2Q148A和SUC2Q201V突变体具有较低的转化酶活性和增强的发酵能力,为菌株的筛选提供一定的参考。
董昌[2]（2021）在《酿酒酵母合成生物学新技术及中心代谢流重编程的研究》文中研究表明酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是目前研究最为透彻的模式真核生物,近几十年来极大地推动了分子生物学、代谢工程、基因组学和合成生物学等多个领域的发展。作为一种理想的微生物细胞工厂,酿酒酵母也被广泛应用于多种高附加值化合物的规模化生产。本论文主要以酿酒酵母为研究对象,探究发展了新型的代谢工程调控工具,并对酿酒酵母葡萄糖去阻遏效应调控靶点进行全基因组筛选。首先,通过优化CRISPR/Cas9系统,首次在酿酒酵母中利用单一的Cas9-VPR核酸酶实现了基因组多位点同时激活、抑制和编辑（CRISPR-ARE系统）。CRISPR-ARE系统介导的基因敲除效率接近100%,基因转录增强可达到3.8倍左右,基因抑制效率可达到60%以上。将CRISPR-ARE系统应用于代谢工程提升α-檀香烯产量时,同时完成了菌株中HMG1基因的激活、ERG9基因的抑制和UPC2基因的编辑。相比较于出发菌株,单步基因操作即实现了目标产物α-檀香烯产量2.66倍的提升。随后,通过敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧途径构建了丙酮酸脱羧酶敲除菌（Pdc菌株）,并在此基础上引入了细胞质定位的丙酮酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶菌株,PDH菌株）。本研究以这两个模型菌株出发进行了全基因组筛选来鉴定葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点。利用基于多功能CRISPR体系的可追踪全基因组进化技术MAGIC对酿酒酵母在全基因组水平进行了多模式代谢调控（基因激活、抑制和敲除）和筛选。第一轮全基因组规模筛选获得了 70个可以解除葡萄糖阻遏从而恢复Pdc菌株在葡萄糖培养基上生长的基因靶点;而后通过多轮的全基因组建库和高通量筛选的迭代进化,获得了大量的葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点并分别选择了 33个和34个靶点进行逆向代谢工程验证。经过三轮迭代进化,创建的工程菌株（Pdc-R3和PDH-R3）中的葡萄糖阻遏效应逐渐减弱,对葡萄糖的利用能力逐步提高,且具备较强的中间产物丙酮酸积累能力（超过3g/L）、目标产物R-BDO合成能力（超过5g/L）以及混合碳源的共利用能力,具有发展成为利用廉价混合碳源生产高附加值化合物的平台细胞工厂的潜力。最后,考虑到Pdc及其衍生菌株线粒体内增加的碳代谢流,将整个代谢途径共定位至线粒体的区室化工程具有潜在的代谢工程应用价值。多基因代谢途径共定位往往需要借助多个不同信号肽,因此本研究表征和构建了一系列的酿酒酵母线粒体定位信号肽,并探究其在实验室菌株和Pdc平台菌株中的代谢工程应用。通过生长补偿、荧光共聚焦等方式系统地表征了 18个并从中筛选出7个具备良好线粒体定位能力的线粒体定位信号肽。在代谢工程验证中,通过筛选获得的信号肽将完整的甲羟戊酸途径定位至线粒体后,α-檀香烯产量提升至对照菌株的4倍。将线粒体α-檀香烯途径应用于工程菌株PDH-R3中时,其α-檀香烯产量相较于野生型提升了约50%。本论文开发了一种酿酒酵母的代谢调控工具,可以便捷实现基因组多位点多模式协同调控;同时借助新型的CRISPR/Cas工具,对酿酒酵母全基因组进行多模式代谢调控（基因激活、抑制和敲除）,筛选葡萄糖去阻遏效应相关靶点并构建能够积累丙酮酸和乙酰辅酶A的平台菌株。本研究为全面解析葡萄糖阻遏效应的分子机制和构建高效酿酒酵母细胞工厂奠定了基础。
陈秉松[3]（2021）在《姜黄素及其类似物的糖基化衍生物的生物转化》文中认为姜黄是常用传统中药,收载于历版《中华人民共和国药典》中,其安全性好,药理作用广泛,在中国乃至亚洲地区有着广泛的应用历史。姜黄的主要成分为姜黄素（curcumin）,现代药理研究表明姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝、免疫调节等多方面的药理作用。但是极性小、不溶于水的性质,是姜黄素成药和临床应用的重要限制因素。由于其生物利用度低、吸收差,在体内的代谢产物主要为其Ⅱ相代谢产物葡萄糖醛酸化姜黄素,长久以来姜黄素的体内药效物质形式一直存在争论。因此探究比较姜黄素原型药物和葡萄糖醛酸化姜黄素的药理活性是确定姜黄素体内药效物质形式的重要环节。作为自然界中广泛存在的糖苷类化合物的生源合成途径,葡萄糖醛酸化和葡萄糖基化是增加母体化合物溶解度的有效方法。构建生物转化体系,对姜黄素进行葡萄糖醛酸化和葡萄糖基化生物转化,是研究姜黄素体内药效物质形式、改善理化性质、提高成药性的有效手段。本研究在大肠杆菌、酿酒酵母菌等工程菌中构建外源蛋白表达体系,构建了基于UGT1A8及UGT74An3的葡萄糖醛酸化、葡萄糖基化生物转化菌株,采用全细胞催化、无细胞体系催化等方法,研究姜黄素的葡萄糖醛酸化和葡萄糖基化生物转化条件。具体研究内容和结果如下:1.大肠杆菌中葡萄糖醛酸化体系的构建本章通过选择不同载体,构建葡萄糖醛酸转移酶和UDP葡萄糖脱氢酶表达体系;利用分子伴侣、麦芽糖结合蛋白等辅助手段,帮助亲脂性的人源葡萄糖醛酸转移酶UGT1A8表达、折叠;通过优化蛋白表达条件增加两种目的蛋白在大肠杆菌中的表达量;使用CRISPR-Cas9技术,无痕敲除大肠杆菌染色体上的UDP葡萄糖醛酸脱氢酶基因arn A,优化生物转化底物UDP葡萄糖醛酸的代谢流向,增加糖源供给;使用多种多酚类底物,探究UGT1A8底物谱;尝试多种生物转化条件,利用全细胞催化和无细胞体系催化底物进行葡萄糖醛酸化,排除溶剂、温度、金属离子、底物转运等条件对底物生物转化的影响。最终没有检测出葡萄糖醛酸化产物,可能是由于来源于真核生物、定位于内质网内腔的UGT1A8蛋白不能在缺少必要细胞器的原核生物中正确折叠。2.酿酒酵母中葡萄糖醛酸化体系的构建在酿酒酵母中构建葡萄糖醛酸转移酶和UDP葡萄糖脱氢酶表达体系,以解决真核来源的UGT1A8蛋白在原核生物中不能正确折叠的问题。利用自主复制型质粒,诱导目的蛋白表达,对姜黄素、四氢姜黄素、茜素、伞形酮、白藜芦醇、柚皮素、大黄素、大黄酸等多种底物进行葡萄糖醛酸化生物转化实验。最终检测出葡萄糖醛酸化茜素的产生,表明酵母葡萄糖醛酸化生物转化体系构建成功,但姜黄素的葡萄糖醛酸化产物在该生物转化体系中未检测到。3.葡萄糖基化姜黄素及其类似物的生物转化在大肠杆菌中构建葡萄糖基化生物转化体系,通过异源表达来自长春花的葡萄糖基转移酶,对姜黄素及其还原产物进行葡萄糖基化生物转化。本实验中首次发现酿酒酵母对四氢姜黄素的还原活性,利用酿酒酵母制备六氢姜黄素,为葡萄糖基化生物转化奠定物质基础。在本实验中首次分离并鉴定了葡萄糖基化四氢姜黄素和葡萄糖基化六氢姜黄素,成功制备葡萄糖基化姜黄素,发现构建的生物转化体系对二氢姜黄素、八氢姜黄素也具有葡萄糖基化催化活性。为解决姜黄素水溶性差的问题探索了新的方案,为提高姜黄素的生物利用度、研究葡萄糖基化类姜黄素的药理活性奠定了物质基础。结论:1.在酿酒酵母中异源表达人源葡萄糖醛酸转移酶UGT1A8和鼠源UDP-葡萄糖脱氢酶Ugd,检测到葡萄糖醛酸化茜素的生成,成功在酿酒酵母中构建葡萄糖醛酸化生物转化体系。2.在大肠杆菌中异源表达来自长春花的葡萄糖基转移酶,通过全细胞催化的生物转化,首次制备并分离鉴定葡萄糖基化四氢姜黄素和葡萄糖基化六氢姜黄素。
宋哲玮[4]（2020）在《酱香型白酒核心酿造菌群及群体代谢机制的研究》文中研究指明酱香型白酒发酵过程是一个人工干预下的半开放式传统固态发酵过程,其复杂的微生物群落除了受到环境微生物、原料、环境温度、环境湿度等外源因素的影响,还受到群落自身群落演替、代谢产物变化、自身生物热变化、含水量变化等内源发酵条件的影响。然而,目前对于如何判定发酵群落中核心功能菌群以及发酵条件如何影响群落结构和功能的相关研究还很缺乏。因此,本研究选择A、B两个厂区同时进行的典型酱香型白酒入池发酵过程,系统分析了入池发酵过程中发酵参数、微生物群落、关键代谢途径以及风味代谢产物的变化规律。主要研究内容如下:（1）本研究通过现代风味化学分析方法分析了不同发酵参数的变化规律,发现发酵温度以及乙醇含量的变化速率的趋势基本一致。入池发酵过程酒醅样品中的发酵温度变化速率随着发酵时间的进行呈现先下降后上升的趋势,而入池发酵过程中乙醇含量的变化速率都随着发酵时间的进行呈现先上升后下降的趋势。（2）本研究通过扩增子测序和宏转录组学测序技术联用的方法,解析了酱香型白酒入池发酵微生物群落的结构和功能,建立了在群落菌群演替和功能转变过程中判定核心功能微生物的方法。研究中发现酱香型白酒入池发酵群落中核心功能微生物是库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）以及乳酸杆菌（Lactobacillus spp.）。在入池发酵阶段,库德里阿兹威氏毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、拜耳接合酵母和乳酸杆菌分别大量表达了丙酮酸代谢中关于产乙醇、乙酸和产乳酸的相关酶,说明四种酵母在发酵前期是核心产乙醇功能酵母,乳酸杆菌在发酵后期是核心产乳酸功能细菌。（3）本研究通过宏转录组学以及模拟发酵实验联用的方法,发现入池发酵群落中粟酒裂殖通过高表达乙醇脱氢酶adh P和yia Y的方法适应高温发酵条件,维持了酱香型白酒的正常产酒。研究中分析了样品中库德里阿兹威氏毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母以及拜耳接合酵母这四种核心功能酵母的乙醇脱氢酶AKR1A1,ADH5,adh P和yia Y表达变化情况。在发酵第15天,B厂区样品中的粟酒裂殖酵母adh P和yia Y得到了高表达,而这两种酶在A厂区样品中表达量很少。通过模拟发酵实验发现,混合培养发酵中粟酒裂殖酵母C-11的乙醇脱氢酶adh P（平均5.93,log2 fold change）和yia Y（平均4.21,log2 fold change）的表达水平高于单独培养发酵的表达水平（分别为平均1.69和平均3.02,log2 fold change）。（4）本研究通过宏转录组学以及模拟发酵实验联用的方法,发现入池发酵群落中粟酒裂殖酵母通过甲羟戊酸途径转化乙酸,降低群落中的乙酸含量。研究中分析了样品中四种核心功能酵母库德里阿兹威氏毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母以及拜耳接合酵母产乙酸相关酶ADH5、ACH1、ACS2、HXT1、VMA7、ATF1、ACCAT1、HMGCS1以及HMGCR1的表达水平（fragments per kilobase per million,FPKM）。在降解乙酸的甲羟戊酸途径中,与其他三种核心功能酵母库德里阿兹威氏毕赤酵母、酿酒酵母以及拜耳接合酵母的HMGCS1（分别为平均0.30、0.12以及0.75 FPKM）和HMGCR1（分别为平均0.03、0.08以及0.09 FPKM）表达量相比,粟酒裂殖酵母具有更高的HMGCS1（平均6.99 FPKM）和HMGCR1表达量（平均1.04 FPKM）。通过模拟发酵实验发现,粟酒裂殖酵母C-11的微生物生物量在试验组(含有10 g·L-1乙酸)和对照组（无添加）之间显示出显着的差异。此外,在模拟发酵实验中,试验组的乙酸含量呈下降趋势,最低为6.40±0.18 g·L-1,甲羟戊酸含量从发酵的36 h到60 h有着显着的上升趋势（曼-惠特尼U检验,p<0.001）。与乙酸降解途径的相关酶ACS2、ACCAT1、HMGCS1以及HMGCR1的表达水平都有了明显的上调（曼-惠特尼U检验,p<0.01）。（5）本研究发现在受到高温发酵和乙酸积累影响的入池发酵过程中,群落中粟酒裂殖酵母能够通过提高丙酸和丁酸代谢关键酶的表达水平从而提高相关醇酸的含量,促进群落中其他挥发性风味代谢产物的生成。不同厂区发酵酒醅样品中,有较大差异的醇酸类挥发性组分有16种,包括1-丁醇、丙酸、丁酸等关键挥发性风味代谢产物。此外,在B厂区的发酵酒醅样品中,库德里阿兹威氏毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母以及拜耳接合酵母能够通过提高丙酸和丁酸代谢途径中的关键酶从而提高丙醇、丁醇以及丙酸、丁酸的含量,从而促进风味代谢产物的生成。通过模拟发酵实验发现,试验组（不含有粟酒裂殖酵母C-11）中乙醇含量最高为26.49±0.32 g·L-1,对照组（含有粟酒裂殖酵母C-11）中乙醇含量最高为29.36±0.31 g·L-1。此外,本研究还发现除了乙醇和乙酸外,有较大差异的醇酸类挥发性组分有5种,包括1-丁醇、戊酸、壬酸、己酸、2-甲基丙酸和庚酸。本研究加深了生产者对于酱香型白酒入池发酵过程中群体代谢机制的认识,为科学有效地、全面系统地提升发酵过程稳定性、可控性打下了坚实的基础,提高了生产者预判和调节发酵过程的能力。
汪志明[5]（2020）在《酿酒酵母产番茄红素的产业化关键技术研究》文中认为番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,具有抗氧化、防癌抗癌、防老抗衰和预防心血管疾病等功效,具有广阔的应用前景。当前番茄红素的大规模应用仍面临产能、资源、环境、技术和成本等诸多限制,高效绿色番茄红素产业化技术的研究成为突破番茄红素市场应用瓶颈关键所在。本研究以实验室前期构建的番茄红素生产菌种酿酒酵母Sy BESc14D14为基础,通过发酵过程操作变量、状态变量及代谢调控的关联研究,成功将番茄红素在50L发酵罐上的产量从2.57g/L提升到7.01g/L,并开发了番茄红素提取精制及水和菌渣资源的循环利用技术,最终在12m3发酵罐上成功实现产业化,制备得到纯度为96.94%的番茄红素产品并完成产品的应用研究。通过对发酵过程中氧供应、接种比例、pH、碳氮源补加策略、多级发酵等操作过程变量与细胞生理变量的相关分析,确定了最优溶氧控制、pH控制和碳氮源的补加调控等关键调控因素,并依此开发发酵罐培养策略,在50L发酵罐上番茄红素产量从2.57g/L提高到5.20g/L。结合发酵过程控制、代谢及产量变化分析,发现甘氨酸、谷氨酸、柠檬酸、乙酸对番茄红素产量影响显着,以此为基础开发复合添加策略,将番茄红素产量提高至7.01g/L。同时,本文还完成了菌体预处理和提取技术工艺的开发。首先通过喷雾干燥获得富含番茄红素的干菌体产品。然后基于菌体中番茄红素残留率,综合比较了多种破壁方式的效果,结果表明研磨法与酶解法对酵母细胞破壁效果最佳。番茄红素最佳萃取溶剂用量为细胞干重的50倍,在以上破壁和提取工艺条件下,番茄红素萃取收率达90.7%。番茄红素结晶纯化最佳工艺为:结晶温度4℃、在50℃乙醇洗涤3次,结晶纯化收率达95.42%。番茄红素晶体纯度为96.94%,总收率达86.5%。在酶解法破壁基础上开发了番茄红素发酵自循环绿色生产技术,通过离心技术在线分离番茄红素及破壁菌体,并将发酵水资源和破壁菌体循环利用于下一阶段的发酵生产,结合基料补偿策略,在70L发酵罐上完成连续3次自循环生产,番茄红素平均产量达到5.88g/L,比起始批次高22.25%。基于实验室工艺进行经济性分析发现,自循环到第4次时,单位产品成本下降幅度最大,比起始批次下降了29.6%,此时化学需氧量排放量降低了64.0%。该技术为未来绿色生产提供了技术基础。最终,该发酵工艺在12m3发酵规模上实现了成功放大,番茄红素最终产量稳定达到5.2 g/L。利用菌体喷雾干燥工艺,制得粒径均匀的番茄红素微胶囊菌粉产品。这些菌粉产品在蛋鸡上进行了产品应用验证,结果表明饲料中添加150mg/kg番茄红素微胶囊菌粉对于鸡蛋的着色和品质改善具有较好的效果。
刘金蓉[6]（2020）在《小檗碱对两种重要植物病原真菌的抑制作用及其烟剂的研制》文中研究说明苹果轮纹病与桃褐腐病分别是由子囊真菌Botryosphaeria dothidea和Monilinia fructicola引起的重要病害,对农业造成重大经济损失。小檗碱作为植物源杀菌剂,应用前景十分广阔。本文围绕小檗碱及其复配剂的药效评价、小檗碱作用靶标的探究及小檗碱烟剂的研制三个方面开展实验,研究小檗碱对苹果轮纹病菌和桃褐腐病菌的抑制作用,并研制小檗碱新剂型。1.小檗碱、405-1、405-2、腐霉利、苯醚甲环唑抑制苹果轮纹病菌的EC50 值分别为 8.85 μg/mL、5.45 μg/mL、2.42 μg/mL、0.55 μg/mL、0.086μg/mL;抑制桃褐腐病菌的EC50值分别为8μg/mL、1.35 μg/mL、0.59μg/mL、0.35 μg/mL、0.0635 μg/mL。对苹果轮纹病菌,当小檗碱与 405-1复配比为5:1时,产生增效作用;对桃褐腐病菌,当小檗碱与405-2复配比为5:1时,产生增效作用。2.发现烯醇化酶可能为小檗碱抑制桃褐腐病菌的作用靶标,克隆得到烯醇化酶基因,该基因编码序列（CDS）全长1317 bp,是一个完整的ORF,编码438个氨基酸。成功构建重组大肠杆菌pET-28a-ENO/BL21,其表达条带的大小与预测的分子质量相符。3.成功构建重组毕赤酵母pPIC9K-ENO/GS115及丝状真菌表达载体,为验证烯醇化酶是否为小檗碱抑制桃褐腐病菌的作用靶标奠定了基础。4.首次研制出小檗碱烟剂,其组成（%）为:10%小檗碱原药,30%燃料A,45%助燃剂B,10%发烟剂C,5%降温剂D。按烟剂产品标准HG-T2467.19-2003测定了小檗碱烟剂的各项理化指标。
游艳芝[7]（2020）在《多糖原料高效预处理转化和功能产品联产过程及机理》文中研究说明工业固体渣甘蔗渣和油茶壳等富含丰富的纤维素和半纤维多糖,是转化能源和制备功能产品的理想原料。但因木质素障碍,大部分多糖原料未能得到工业规模的高值化利用。本文以甘蔗渣和油茶壳为研究对象,比较了不同预处理方法对原料结构组成和转化的影响,一方面通过物料的生物转化深入研究预处理方式对甘蔗渣纤维素和半纤维素酶解、发酵转化乙醇过程影响,实现高底物浓度发酵;另一方面通过预处理促进甘蔗渣和油茶壳半纤维素转化功能性低聚木糖（DP 2-5）,阐述半纤维催化降解机理,并首次利用油茶壳预处理残渣直接进行活性炭联产,以期实现油茶壳高值化利用。主要结论如下:蒸汽爆破预处理可显着提高半纤维素溶出率,破坏木质素致密结构,提高底物可及性,增加酶水解效率。蒸汽爆破预处理甘蔗渣酶水解72 h,葡萄糖得率随酶用量增加而提高,当酶用量为30 FPU/g-纤维素时,葡萄糖得率为74.99%（原料甘蔗渣,17.13%）。无患子果皮中含有的表面活性剂可降低体系表面张力,稳定酶活性,减少酶使用量。当酶用量为10 FPU/g-纤维素、无患子果皮浓度为1.2 g/L时,葡萄糖得率提高到80.99%,是未添加无患子果皮体系葡萄糖得率的2.22倍。比较了不同预处理方式对甘蔗渣转化乙醇的影响。稀酸浸渍的蒸汽爆破和稀酸浸渍的低压蒸汽爆破预处理甘蔗渣半纤维素降解率分别为100%和88.25%,乙醇得率分别提高至理论得率的93.19%和92.20%,同时生成较多乙酸。Soda绿液-乙醇和Soda绿液-过氧化氢预处理甘蔗渣木质素脱除率分别为81.59%和33.01%,Soda绿液-乙醇预处理甘蔗渣乙醇得率为72.58%,预处理产生的活性木质素使得体系还原电势降低,产生较多甘油;Soda绿液-过氧化氢预处理甘蔗渣因高酵母死亡率（>60%）导致乳酸含量最高,乙醇得率仅与原料相当（～20%）。通过混菌（共）发酵和增加底物浓度可提高发酵液中的乙醇浓度。Soda绿液-乙醇预处理在脱除木质素同时对纤维素和半纤维素具有很高的保留率。以该预处理甘蔗渣为底物,采用不同质量配比的普通酵母（CSC）和戊糖酵母（TSC）进行混菌（共）发酵实验。结果表明,相比单独CSC发酵,CSC与TSC协同作用可提高总糖利用率,实现高底物浓度发酵,提高了乙醇浓度。当以Soda绿液用量1.5 m L/g-绝干底物预处理甘蔗渣为底物、CSC与TSC菌种质量配比为1:2（w/w）时,5%（w/v）底物浓度得到乙醇浓度为23.22 g/L,明显优于仅有CSC菌种的发酵过程（70.15%）,继续增加底物浓度至10%,乙醇浓度提高至42.53 g/L;当CSC与TSC的质量配比为1:3、底物浓度15%,获得最高乙醇浓度为68.24 g/L,乙醇浓度得到大幅度提高,可有效降低乙醇蒸馏成本。研究比较了甘蔗渣木质素含量对不同发酵体系中乙醇转化的影响。以过氧化氢-乙酸预处理甘蔗渣为底物,在去离子水（DW）和柠檬酸钠缓冲溶液（SCS）体系中分别进行共发酵实验,SCS体系能降低预处理甘蔗渣在发酵过程中残余糖含量。DW体系可使低残余木质素含量（2.88%）甘蔗渣有效转化为乙醇（得率92.10%）。SCS体系和吐温80都能促进较高残余木质素含量（16.44%）甘蔗渣的发酵反应。DW体系可降低甘油浓度,SCS体系可降低乙酸浓度。过氧化氢-乙酸预处理可提高甘蔗渣碱提木聚糖酶水解得率。当木聚糖酶用量为4 mg/m L时,80℃预处理甘蔗渣碱提木聚糖酶水解2 h,低聚木糖得率为41.38%,其中X2和X3得率分别为17.68%和4.45%。氯化锌既可作为油茶壳预处理催化剂,又可用作制备油茶壳活性炭的活化剂。无机盐Zn Cl2水溶液的Lewis酸和Br?nsted特性以及水自电离产生的水合氢离子作用可有效催化油茶壳半纤维素降解成低聚木糖。条件优化结果表明,当Zn Cl2浓度为0.5%（w/w）,在170℃预处理30 min,低聚木糖最高得率为61.38%,其中X2和X3得率分别为16.94%和18.42%;预处理固体残渣富含纤维素和木质素（含碳量高达75%）,直接进行活性炭联产,经2.2 M Zn Cl2活化得到的活性炭最大碘吸附值和比表面积分别为5623.94 mg/g和1244.46 m2/g,达到商业活性炭质量指标。
李益民[8]（2020）在《重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽》文中研究指明丙谷二肽（L-Alanyl-L-glutamine,Ala-Gln）具有溶解度高、热稳定性好及分解速率快等优势,已经成为一种替代谷氨酰胺（L-Glutamine,Gln）的新型营养补充剂,被广泛应用于食品、保健品和医药等领域。α-氨基酸酯酰基转移酶（α-amino acid ester acyl transferase,Aet）能以丙氨酸甲酯盐酸盐（L-alanine methyl ester hydrochloride,AlaOMe）和Gln为底物直接合成Ala-Gln,基于表达Aet的微生物合成法因其原料廉价易得、反应步骤少、反应条件温和、环境污染小且副产物少,可以作为工业化生产Ala-Gln的新方法。然而,Aet催化合成Ala-Gln过程存在反应时间长和底物转化率低等问题,限制了其在Ala-Gln工业化生产中的应用。本论文的研究工作构建了异源表达Sphingobacterium siyangensis来源Aet（SsAet）的重组大肠杆菌和重组酿酒酵母,通过菌体的重复利用及絮凝自固定化技术,解决了上述问题,为实现Ala-Gln安全、绿色且高效生产奠定了基础。取得的主要研究结果如下:首先,构建异源表达SsAet的重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln。以最常用的表达型宿主 BL21（DE3）,构建了重组大肠杆菌 BL21（DE3）-pET29a-SsAET（BPA）,发现 BPA表达了大量的包涵体,影响了其催化活性。通过更换有助于蛋白二硫键形成的宿主,提高蛋白的溶解性,其中Origami 2（DE3）-pET29a-SsAET（OPA）的SsAet可溶表达量最高,且催化活性是BPA的1.4倍。进一步优化了 OPA的诱导条件和全细胞催化合成Ala-Gln的反应条件,确定了最佳的诱导条件:温度16℃、诱导OD620=0.25、诱导时间12h及IPTG浓度0.6 mmol/L;最佳的反应条件:温度25℃、pH值8.5、反应溶液硼酸盐缓冲液及底物摩尔配比AlaOMe/Gln=1/2。在最优条件下,以OPA作为合成Ala-Gln的全细胞催化剂,反应过程最短可在5 min内完成,获得最高的底物转化率为94%,而比生产强度可高达1.78 g/L·min-1·OD620-1,是目前国内外文献中报道的最高水平。除此之外,OPA具有良好的重复利用性,经五个循环批次反应仍能维持80%以上的催化活性,实现了循环高效合成Ala-Gln。但是,在相同的细胞浓度和反应时间内,OPA全细胞的催化效率比裂解液降低了 21%,发现了物质扩散阻力的存在。其次,构建表面展示SsAet的重组酿酒酵母。为了克服物质扩散阻力和大肠杆菌表达系统潜在的生物安全问题,以生物安全性的酿酒酵母作为表达宿主,将SsAet以N端和C端锚定两种方式展示在酵母细胞表面,通过免疫荧光实验,证明了 SsAet已成功固定在酵母细胞壁上;综合比较菌株生长情况和催化活性,选择N端锚定作为SsAet在酵母表面展示的方法。在此基础上,通过密码子优化提高了 SsAet表达量,发现经密码子优化的EBY100-pYD1-SsAETs（EPagaAs）在20 min时Ala-Gln合成量是未经密码子优化菌株的1.7倍;反应终点从40 min缩短至30 min,生产效率提高了 33%。但是,EPagaAs合成Ala-Gln的反应时间长,且底物转化率仅为OPA的58%,推测酵母表达系统中蛋白翻译后修饰可能影响了 SsAet的催化活性。然后,针对上述问题,研究了蛋白翻译后修饰对SsAet的影响。以糖基化程度低的毕赤酵母为表达宿主,通过密码子优化,提高蛋白表达量和催化效率,构建了分泌表达SsAet的重组毕赤酵母GS115-pPIC9-SsAETP（GPAP）。以GPAP为研究对象,对重组毕赤酵母的诱导条件和合成Ala-Gln的反应条件进行了优化,确定了最佳的诱导温度为26℃、诱导时间为3d及甲醇补加量（v/v）为1.5%;最佳的反应温度为28℃、反应pH值为8.5、反应底物为AlaOMe及底物摩尔配比AlaOMe/Gln为2/1。在最优条件下,GPAP的底物转化率仅为OPA的71%左右,再次验证了蛋白后修饰作用对SsAet催化活性的影响。在此基础上,构建了胞内和分泌表达SsAet的重组毕赤酵母,发现胞内表达SsAet重组菌株的催化活性明显高于分泌表达的,其中胞内表达且去掉内源信号肽的菌株KM71-pPIC3.5K-SAETP1800（KP3.5KAP1800）合成Ala-Gln的底物转化率最高为80%,能达到OPA的90%左右,比分泌表达的对比菌株提高了 41%,阐述了胞内表达SsAet和去掉内源信号肽是提高酵母表达系统中SsAet催化活性的有效方法。通过SDS-PAGE和Western blotting发现了分泌型SsAet分子量的增加;通过去糖基化酶的切除,证明了分泌型SsAet中糖基化修饰的存在;通过LC-MS证明了糖基化修饰发生在第442位Asn残基上;通过圆二色光谱仪鉴定了胞内和分泌型SsAet的二级结构,发现了两者的显着性差异,证明了糖基化修饰是影响SsAet结构和催化活性的重要因素。最后,基于上述研究结果,构建了自固定化重组酿酒酵母高效合成Ala-Gln。使用高拷贝数质粒构建了胞内表达SsAet且去掉内源信号肽的EBY100-pRS424-SsAETs1800（EP424AS1800）。通过培养和反应条件的优化,EP424AS1800能在5 min内获得高达74%的底物转化率,是表面展示重组菌EPagaAs的1.44倍,能达到OPA的83%以上;反应时间比EPagaAs缩短了 80%以上,生产效率提高了 5倍;比生产强度高达1.28 g/L·min·1·OD600-1。通过导入絮凝基因FLOI,得到了毫米级絮凝颗粒且催化活性不受影响的EP424As1800-FLOI,实现了其在反应器内的自固定化。EP424AS1800-FLO1经过十次循环催化反应后仍能保持稳定的催化活性,实现了连续高效合成Ala-Gln。本论文的研究为Ala-Gln安全、绿色且高效的工业化生产奠定了基础。
许航博[9]（2020）在《沿面放电等离子体主要活性成分分析及其对酵母细胞杀灭机理研究》文中提出因具有低温、高效、环保、安全、便携等特点,大气压低温等离子体受到了越来越多的关注。人们发现其在杀菌、肿瘤治疗、食品安全、环境保护等领域有很好的应用前景。尽管大气压低温等离子体对各种微生物的有效杀灭效果已经毋庸置疑,但是由于等离子体发生装置的多样性、等离子体组分的复杂性及各种细胞不同的生物响应,其对微生物的杀灭机理仍需深入探讨。沿面放电（Surface micro-discharge,SMD）等离子体装置因其能够较容易地产生大面积、宏观均匀的等离子体,在生物医学领域具有巨大的发展潜力和广阔的市场潜能。但是SMD等离子体主要活性成分的产生、分布特性以及杀菌机理仍不清楚。因此本论文研究了SMD等离子体在气相、组织相以及液相主要抗菌活性物质的产生方式以及其传输方式,并以真核模式生物酿酒酵母为实验对象,重点研究了氦气放电情况下产生的主要活性氧氮（RONS）及其对酵母细胞的损伤效应与作用机理。本论文主要包括以下三个部分:（1）对比研究氦气和空气下SMD等离子体产生的主要杀菌成分:本研究采用特异性化学探针以及琼脂糖凝胶组织模型对氦气和空气SMD等离子体在组织模型表面产生的主要RONS成分的组成、二维分布特性及其对酵母的杀菌效果进行了比较研究。结果发现,不同的工作气体,氦气和空气SMD等离子体表现出不一样的RONS形成方式,进而表现出不同的抗菌效果。在氦气SMD等离子体下主要产生羟基自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）,他们主要分布在每个六边形微放电单元的中间部位,并且其浓度随着辐照距离（1,2,3,5,10 mm）的增加而减少。而在空气SMD等离子体下主要产生臭氧（O3）、亚硝酸根（NO2ˉ）以及过氧亚硝酸根/过氧亚硝酸（OONOˉ/ONOOH）,他们基本能分布到整个组织模型表面。更为重要的是,氦气SMD等离子体在组织表面产生的·OH主要来自于等离子体传输,而空气SMD等离子体是通过紫外线在组织表面光解水分子产生的in situ·OH。此外,在该等离子体-组织相互作用系统中,氦气和空气SMD等离子体的主要抗菌成分分别为·OH和O3,并且空气SMD等离子体对酵母细胞具有更强的杀菌能力。（2）探究在氦气条件下SMD等离子体对酵母的失活机理,深入研究了氦气SMD等离子体产生的羟基自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）、以及电化学特性,氧化还原电势（ORP）和p H在导致酵母细胞失活中的作用:通过上一部分研究,我们发现·OH和H2O2主要在3 mm的辐照距离内产生。因此,我们进一步探究在1,2和3 mm辐照距离下,氦气SMD等离子体对酵母菌的杀灭效应。我们除了对组织模型表面·OH和H2O2产生以及分布情况进行调查外,还检测了组织表面微环境中的电化学参数。通过皮尔森相关性分析证明,·OH在杀灭酵母细胞中起主要作用,这与第一部分研究结果相一致。进一步地,我们利用·OH的特异性清除剂D-甘露醇（D-mannitol,D-man）和p H缓冲剂-磷酸缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）探究了等离子体产生的·OH和低p H对酵母细胞活性、细胞膜完整性以及胞内活性氧和p H的影响。结果表明D-man能保护细胞膜的完整性以及阻止胞内活性氧增加和p H下降,进而显着提高酵母细胞的存活率。而PBS只能轻微减轻等离子体导致的酵母细胞损伤。综合来说,等离子体产生的·OH通过破坏酵母细胞膜完整性以及导致胞内活性氧累积与p H下降,最终导致酵母细胞死亡。（3）SMD等离子体与液体反应系统（SMD plasma-liquid interaction system）中产生的主要活性成分及其导致酵母细胞失活机理:在这一部分,我们从亚细胞水平更为系统地研究了氦气SMD等离子体对液体环境中酵母细胞胞内多组分的影响,并通过特异性化学探针与相应的清除剂研究了氦气SMD等离子体在溶液中产生的主要活性成分及其在酵母杀灭过程中的贡献与特异性攻击靶标。研究结果表明氦气SMD等离子体能够破坏酵母的细胞膜系统、胞内氧化还原平衡、酸碱平衡、钙离子与钾离子平衡、能量代谢系统与蛋白质、脂质、DNA分子等胞内大分子物质结构,从而导致酵母细胞死亡。在·OH、单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2ˉ）、H2O2、p H五种活性成分中,·OH和1O2对溶液中酵母灭活的贡献最大。其中·OH主要攻击细胞膜系统,导致细胞遭受氧化压力;1O2主要攻击胞内线粒体膜,导致能量代谢紊乱;溶液中的较低的p H可以破坏胞内酸碱平衡,从而降低细胞膜电位;而O2ˉ主要作为1O2的前体发挥作用,H2O2对酵母灭活的贡献较小。以上研究结果揭示了沿面放电等离子体在组织相、液相中产生的主要活性成分及其对酵母细胞的杀灭机理,对沿面放电等离子体在皮肤与水体杀菌领域的应用具有重要指导意义。
叶广英[10]（2019）在《菊叶薯蓣皂苷与淀粉利用研究》文中研究说明菊叶薯蓣（Dioscorea composita Hemsl.）,原产于墨西哥,是美洲生产薯蓣皂素的重要植物资源。1978年引种到我国,规模化种植表明,菊叶薯蓣的皂苷成分稳定,且皂苷和淀粉的含量高,产量高,种植优势明显,综合利用价值高。当前,菊叶薯蓣的利用研究还处于空白阶段,生产中主要借鉴黄姜生产薯蓣皂素的方式,产品单一、工艺落后、污染严重,制约产业发展。本文从资源高效利用的角度出发,对菊叶薯蓣甾体皂苷和淀粉资源的利用进行系统研究。通过甾体皂苷制备薯蓣皂苷和薯蓣皂素,淀粉制备生物乙醇,提高综合利用效率,为推动其产业化发展提供技术和理论支持。本文分离鉴定出4种主要甾体皂苷成分,分别为薯蓣皂苷（Dioscin）;甲基原薯蓣皂苷（25-O-Protodioscin）;皂苷Pb（asperin）和原皂苷Pb（Asperoside）。针对甾体皂苷紫外响应值低的问题,建立了四种甾体皂苷的检测方法。经过测定,干物质中薯蓣皂苷、皂苷Pb、甲基原薯蓣皂苷和原皂苷Pb的含量分别为61.14 mg/g、39.89 mg/g、4.46 mg/g和0.84 mg/g。四种甾体皂苷的总含量为106.40 mg/g,其中薯蓣皂苷含量最高（占总皂苷57.50%）,可用于生产薯蓣皂苷。为制备薯蓣皂苷,通过Box-Behnken响应曲面分析法优化微波辅助提取总皂苷工艺,最佳条件下的理论皂苷得率为8.93 mg/g,与实际提取得率8.82±0.04 mg/g接近。选用大孔吸附树脂纯化薯蓣皂苷,经比较,AB-8为最佳大孔吸附树脂填料。热力学分析表明AB-8对薯蓣皂苷的吸附为自发放热过程,纯化过程需要合理控制温度。动力学表明AB-8对薯蓣皂苷的吸附符合单分子层的物理吸附模型,吸附和解析速率较快,能够满足生产要求。薯蓣皂素的理论含量为46.2 mg/g,经自然发酵处理,水解产率提高到86.5%。通过分析自然发酵中皂苷的变化,认为呋甾烷含量降低、螺甾烷含量升高是提高水解得率的原因。自然发酵不可控制因素较多,影响薯蓣皂素品质的稳定性。结合降低污染的需求,依据糖苷键水解机理,采用预水解方法改进当前薯蓣皂素水解方法,水解得率提高1.51 mg/g;同时,可水解92.0%的淀粉,经固液分离后,降低40.0%的酸耗,单位原料产生的化学需氧量（COD）由828.63 mg/g降低到215.71 mg/g,减少74.04%。菊叶薯蓣含有多种生物活性物质,其对酵母发酵产乙醇影响是未知的。酵母直接发酵表明菊叶薯蓣存在抑制酵母发酵的活性物质。通过成分分离和活性追踪,确定抑制酵母的成分EA30207为1,3-二-（2-羟基-4-甲氧基苯基）丙烷。以筛选的敏感酵母Saccharomyces cerevisiae C2为测定菌株,最大半效应浓度(EC50)为33.2μM/L;添加抑制物培养酵母,结果表明抑制作用发生在调整期,且是不可逆的。分析对酵母细胞周期的影响,发现抑制作用主要发生在细胞间期的G1期,说明抑制物影响酵母菌的正常代谢。为满足当前生产需求,将菊叶薯蓣提取皂苷后的残渣与甘蔗渣混合进行高浓度乙醇的发酵,通过分批进料和添加0.1%（w/v）的吐温80,固体负载量可达34%,乙醇浓度可达82.83 g/L。本文分析了菊叶薯蓣中的甾体皂苷成分,薯蓣皂苷为含量最高的甾体皂苷;优化了微波辅助皂苷的工艺,并分析了大孔树脂吸附薯蓣皂苷的热力学和动力学,为菊叶薯蓣制备薯蓣皂苷提供理论基础。通过预水解处理,降低了薯蓣皂素生产的酸耗和有机物排放,有助于清洁生产。确定了抑制酵母生长的化合物,为直接发酵产乙醇的进一步研究提供基础;优化了菊叶薯蓣提取渣和甘蔗渣的高负荷混合发酵产乙醇工艺,为菊叶薯蓣发酵产生物乙醇提供技术基础。综上所述,通过对皂苷资源和淀粉资源利用的研究,为大规模种植的菊叶薯蓣产业化提供了一定的技术和理论支持。
二、酿酒酵母细胞四种转化方法的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酿酒酵母细胞四种转化方法的比较（论文提纲范文）
（1）代谢工程改造酿酒酵母生产萜类化合物（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号和缩略词说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 酿酒酵母细胞工厂 |
| 1.1.1 酿酒酵母代谢工程 |
| 1.1.2 酿酒酵母合成生物学工具的应用 |
| 1.1.2.1 CRISPR-Cas9 技术在细胞工厂中的应用 |
| 1.1.2.2 单碱基编辑技术 |
| 1.1.2.3 重组蛋白表达技术 |
| 1.2 酿酒酵母中的脂类代谢和脂滴 |
| 1.2.1 脂类代谢 |
| 1.2.2 脂滴组分 |
| 1.3 萜类化合物 |
| 1.3.1 酿酒酵母的甲羟戊酸途径 |
| 1.3.2 萜类化合物在酿酒酵母中的合成 |
| 1.3.3 萜类化合物的存储和发酵培养 |
| 1.4 酿酒酵母的发酵底物 |
| 1.4.1 碳源的来源与应用 |
| 1.4.2 蔗糖转化酶 |
| 1.5 本论文研究背景、意义及内容 |
| 1.5.1 研究背景和意义 |
| 1.5.2 研究的主要内容 |
| 第二章 异源生物合成β-胡萝卜素的酵母工程菌株构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 菌株,质粒和引物 |
| 2.2.2 生化试剂与药品 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基和培养条件 |
| 2.3.2 PCR扩增基因片段 |
| 2.3.3 同源重组整合β-胡萝卜素合成途径 |
| 2.3.3.1 YZ01 菌株的构建 |
| 2.3.3.2 YZ02 菌株的构建 |
| 2.3.3.3 YZ03 菌株的构建 |
| 2.3.4 PCR扩增构建p2CRT质粒的基因片段 |
| 2.3.5 β-胡萝卜素的提取与定量分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 pMRI21-P_(TDH3)-P_(TEF1)质粒和pMRI31-P_(TDH3)-P_(TEF1)质粒的构建 |
| 2.4.2 酿酒酵母β-胡萝卜素合成途径的引入 |
| 2.4.3 产β-胡萝卜素的酵母工程菌株构建 |
| 2.4.4 高拷贝p2CRT质粒的构建 |
| 2.4.5 游离型质粒对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 脂类代谢途径改造对萜类化合物积累的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 菌株,质粒和引物 |
| 3.2.2 生化试剂与药品 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基和培养条件 |
| 3.3.2 CRISPR质粒的构建和供体的制备 |
| 3.3.3 酿酒酵母电转化与基因型验证 |
| 3.3.4 产α-葎草烯的异源代谢途径引入 |
| 3.3.5 强启动子表达限速酶基因 |
| 3.3.6 ERG1 启动子控制ERG9 基因的表达 |
| 3.3.7 β-胡萝卜素的提取和HPLC-UV定量分析 |
| 3.3.8 酵母细胞中β-胡萝卜素分布的显微镜观察 |
| 3.3.9 磷脂类的提取和LC-MS定量分析 |
| 3.3.10 α-葎草烯的定量分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重新定向脂类代谢网络影响β-胡萝卜素的积累 |
| 3.4.2 磷脂酸磷酸酶缺失增加了β-胡萝卜素的产生 |
| 3.4.3 甾醇酰基转移酶的过表达增加β-胡萝卜素的积累 |
| 3.4.4 组合多种策略进一步增加β-胡萝卜素的积累 |
| 3.4.5 α-葎草烯工程菌株的成功构建 |
| 3.4.6 工程改造α-葎草烯生产菌株的代谢网络 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 酿酒酵母中蔗糖转化酶突变体的构建与应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 菌株,质粒和引物 |
| 4.2.2 生化试剂与药品 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 培养基与培养条件 |
| 4.3.2 Golden Gate克隆反应系统和程序 |
| 4.3.3 质粒构建 |
| 4.3.4 重组蛋白的表达和纯化 |
| 4.3.5 酵母电转化与突变位点验证 |
| 4.3.6 突变体重组蛋白的动力学分析 |
| 4.3.7 突变体菌株的酶活力和发酵力测定 |
| 4.3.8 突变体菌株的β-胡萝卜素提取和HPLC-UV定量检测 |
| 4.3.9 突变体菌株中的乙醇测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蔗糖底物有利于增加β-胡萝卜素产量 |
| 4.4.2 ScInV重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.4.3 ScInV的结构分析 |
| 4.4.4 ScInV突变重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.4.5 ScInV突变体蛋白的动力学分析 |
| 4.4.6 酿酒酵母突变体重组菌株酶活力分析 |
| 4.4.7 ScInV活性对β-胡萝卜素积累的影响 |
| 4.4.8 酿酒酵母中ScInV突变体菌株的发酵力测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（2）酿酒酵母合成生物学新技术及中心代谢流重编程的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统的发展和应用 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统的发展 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统分类 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas系统衍生技术 |
| 1.2.4 多功能CRISPR/Cas系统 |
| 1.2.5 CRISPR/Cas系统在酿酒酵母中的研究进展 |
| 1.3 酿酒酵母葡萄糖去阻遏效应及丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株的研究进展 |
| 1.3.1 酿酒酵母葡萄糖阻遏效应 |
| 1.3.2 丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株简介 |
| 1.3.3 胞质乙酰辅酶A合成 |
| 1.3.4 丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株的改造和应用 |
| 1.4 酿酒酵母全基因组进化技术 |
| 1.4.1 传统全基因组进化技术 |
| 1.4.2 基于CRISPR/Cas系统的全基因组进化技术 |
| 1.5 本研究的基本思路及拟研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 原始菌株和质粒 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 试剂和试剂盒 |
| 2.4 培养基和抗生素 |
| 2.5 分子克隆实验方法 |
| 2.5.1 DNA扩增和后续处理 |
| 2.5.2 大肠杆菌转化 |
| 2.5.3 重组质粒的验证和提取 |
| 2.5.4 酿酒酵母的转化 |
| 2.5.5 酿酒酵母质粒的提取 |
| 2.6 菌体培养及分析检测方法 |
| 2.6.1 菌株培养条件 |
| 2.6.2 细胞密度和生长速度测定 |
| 第三章 利用单Cas9-VPR核酸酶实现基因组多位点同时激活、抑制和编辑 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基和培养条件 |
| 3.2.3 质粒构建 |
| 3.2.4 菌株构建 |
| 3.2.5 荧光强度检测 |
| 3.2.6 RT-PCR方法 |
| 3.2.7 檀香烯发酵和检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CRISPR-ARE系统的设计 |
| 3.3.2 CRISPR-ARE系统在双荧光报告菌株中的验证 |
| 3.3.3 基于Ⅲ型启动子的CRISPR-ARE的系统优化 |
| 3.3.4 CRISPR-ARE系统应用于代谢工程提升檀香烯产量 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 酿酒酵母Pdc平台菌株和衍生PDH菌株构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基和培养条件 |
| 4.2.3 质粒构建 |
| 4.2.4 菌株构建 |
| 4.2.5 生长分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Pdc菌株的构建 |
| 4.3.2 PDH菌株的构建 |
| 4.3.3 平台菌株的初步表征 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全基因组规模筛选葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 培养基和培养条件 |
| 5.2.3 质粒构建 |
| 5.2.4 菌株构建 |
| 5.2.5 菌株生长表征 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 第一轮全基因组筛选 |
| 5.3.2 第二轮全基因组筛选 |
| 5.3.3 第三轮全基因组筛选 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 丙酮酸和乙酰辅酶A高产酿酒酵母平台菌株的表征 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株和质粒 |
| 6.2.2 培养基和培养条件 |
| 6.2.3 菌株构建 |
| 6.2.4 丙酮酸和2,3-丁二醇检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 平台菌株中丙酮酸的积累 |
| 6.3.2 平台菌株应用于2,3-丁二醇的合成 |
| 6.3.3 平台菌株碳源共利用 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 酿酒酵母线粒体定位信号肽表征及在平台细胞中的应用 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌株和质粒 |
| 7.2.2 培养基和培养条件 |
| 7.2.3 质粒构建 |
| 7.2.4 菌株构建 |
| 7.2.5 荧光共聚焦 |
| 7.2.6 檀香烯发酵和检测 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 信号肽的选择和克隆 |
| 7.3.2 基于生长回补的信号肽活性表征 |
| 7.3.3 基于荧光共聚焦的线粒体信号肽特异性表征 |
| 7.3.4 线粒体信号肽应用于线粒体内檀香烯的合成 |
| 7.3.5 Pdc-R3和PDH-R3菌株中线粒体信号肽檀香烯途径的应用 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 第三章中使用的引物 |
| 附录Ⅱ 第四章中使用的引物 |
| 附录Ⅲ 第五章中使用的引物 |
| 附录Ⅳ 第七章中使用的引物 |
| 附录Ⅴ 第二轮全基因组筛选选定靶点 |
| 附录Ⅵ 第三轮全基因组筛选选定靶点 |
| 作者简历 |
（3）姜黄素及其类似物的糖基化衍生物的生物转化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 大肠杆菌中葡萄糖醛酸化姜黄素的生物转化研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.2.1 实验试剂 |
| 1.2.2 培养基及溶液配制 |
| 1.2.3 实验仪器 |
| 1.2.4 实验菌株 |
| 1.2.5 实验载体 |
| 1.2.6 实验引物 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 大肠杆菌的培养和菌种保存 |
| 1.3.2 载体质粒的克隆与转化 |
| 1.3.3 克隆基因的表达和目的蛋白的分析 |
| 1.3.4 大肠杆菌基因敲除 |
| 1.3.5 全细胞生物转化及产物的提取、分析、分离 |
| 1.3.6 无细胞体系催化葡萄糖醛酸化 |
| 1.3.7 目的基因表达体系的构建 |
| 1.3.8 目的基因表达条件的优化 |
| 1.3.9 利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌arn A基因 |
| 1.3.10 姜黄素及多种酚类化合物葡萄糖醛酸化生物转化实验 |
| 1.4 结果与讨论 |
| 1.4.1 外源基因的密码子优化 |
| 1.4.2 目的基因表达载体的构建 |
| 1.4.3 目的基因表达条件的优化 |
| 1.4.4 arnA缺陷型工程菌的构建 |
| 1.4.5 姜黄素及多种酚类化合物葡萄糖醛酸化生物转化 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 酿酒酵母中葡萄糖醛酸化姜黄素的生物转化研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 培养基及溶液配制 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验菌株 |
| 2.2.5 实验载体 |
| 2.2.6 实验引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 酿酒酵母的培养和菌种保存 |
| 2.3.2 酿酒酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 酿酒酵母感受态细胞的转化 |
| 2.3.4 目的基因表达体系的构建 |
| 2.3.5 酿酒酵母的外源蛋白表达 |
| 2.3.6 全细胞催化葡萄糖醛酸化生物转化实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 外源基因的密码子优化 |
| 2.4.2 目的基因表达体系的构建 |
| 2.4.3 酵母工程菌中姜黄素及多种酚类化合物葡萄糖醛酸化生物转化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 葡萄糖基化类姜黄素的生物转化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 培养基及溶液配制 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验菌株 |
| 3.2.5 实验载体 |
| 3.2.6 实验引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 大肠杆菌的培养和菌种保存 |
| 3.3.2 目的基因表达体系的构建 |
| 3.3.3 目的基因表达条件的优化 |
| 3.3.4 微生物发酵法制备六氢姜黄素 |
| 3.3.5 葡萄糖基化生物转化实验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 外源基因的密码子优化 |
| 3.4.2 构建重组质粒 |
| 3.4.3 蛋白表达及条件优化 |
| 3.4.4 微生物发酵法制备六氢姜黄素 |
| 3.4.5 生物转化制备葡萄糖基类姜黄素 |
| 3.4.6 化合物结构解析 |
| 3.4.7 葡萄糖基化二氢、八氢姜黄素的发现 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述:天然产物葡萄糖醛酸化和葡萄糖基化产物的制备 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）酱香型白酒核心酿造菌群及群体代谢机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 酱香型白酒概述 |
| 1.1.1 酱香型白酒发酵特征 |
| 1.1.2 酱香型白酒入池发酵过程中代谢产物及群落的研究 |
| 1.2 国内外发酵食品的相关研究进展 |
| 1.2.1 传统发酵食品中对于核心功能微生物判定方法的研究 |
| 1.2.2 发酵微生物群落对于发酵条件变化响应机制的研究 |
| 1.2.3 传统发酵食品群落中微生物与群落之间相互关系的研究 |
| 1.3 本课题研究内容与意义 |
| 1.3.1 本研究立项依据及存在的关键科学问题 |
| 1.3.2 本论文的主要研究内容及技术路线 |
| 第二章 酱香型白酒入池发酵过程中理化参数和代谢产物的变化规律 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器、试剂及分析软件 |
| 2.2.2 样品采集 |
| 2.2.3 理化参数分析 |
| 2.2.4 代谢产物分析 |
| 2.2.5 数据统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 发酵过程中理化参数分析 |
| 2.3.2 发酵过程中主要代谢产物生成的变化规律 |
| 2.3.3 发酵过程中挥发性组分变化规律 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 入池发酵过程中核心功能菌群的判定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器、试剂及分析软件 |
| 3.2.2 样品采集 |
| 3.2.3 样品基因组提取 |
| 3.2.4 扩增子高通量测序 |
| 3.2.5 扩增子数据分析 |
| 3.2.6 样品转录组提取 |
| 3.2.7 宏转录组高通量测序 |
| 3.2.8 宏转录数据分析 |
| 3.2.9 数据统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 发酵群落的多样性分析 |
| 3.3.2 发酵群落的菌群演替规律 |
| 3.3.3 核心产醇酸功能酵母的判定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 核心产酒菌群对入池高温发酵适应机制的解析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要仪器、试剂及分析软件 |
| 4.2.2 样品采集 |
| 4.2.3 样品转录组提取 |
| 4.2.4 宏转录组高通量测序 |
| 4.2.5 宏转录组测序数据分析 |
| 4.2.6 可培养验证实验 |
| 4.2.7 数据统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 高温发酵是影响酱香型白酒入池发酵的关键因素 |
| 4.3.2 群落中核心产酒酵母乙醇脱氢酶对于高温发酵的响应 |
| 4.3.3 高温发酵条件下群落中核心产酒酵母维持乙醇正常生产的代谢机制 |
| 4.3.4 高温发酵条件对于核心产酒酵母风味代谢产物生成的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 核心降酸菌群对于乙酸胁迫调节机制的解析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器、试剂及分析软件 |
| 5.2.2 样品采集 |
| 5.2.4 样品转录组提取 |
| 5.2.5 宏转录组高通量测序与数据分析 |
| 5.2.6 可培养验证实验 |
| 5.2.7 数据统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 乙酸积累对于酱香型白酒入池发酵微生物群落的影响 |
| 5.3.2 群落中核心降酸酵母对于乙酸积累的反应机制 |
| 5.3.3 群落中核心降酸酵母降解乙酸的代谢机制 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 群落受到发酵参数变化影响下醇酸类挥发性风味代谢产物的生成规律 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要仪器、试剂及分析软件 |
| 6.2.2 样品采集 |
| 6.2.3 代谢产物分析 |
| 6.2.4 样品转录组提取 |
| 6.2.5 宏转录组高通量测序及数据分析 |
| 6.2.6 可培养验证实验 |
| 6.2.7 数据统计学分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 内源发酵参数影响下群落生成酸醇类挥发性风味代谢产物的差异 |
| 6.3.2 微生物群落关于丙酸和丁酸代谢途径相关酶的表达情况 |
| 6.3.3 内源发酵参数影响下群落中核心产醇酵母生成风味代谢产物的规律 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者攻读博士学位期间发表的文章 |
| 附表 |
（5）酿酒酵母产番茄红素的产业化关键技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 番茄红素简介 |
| 1.1.1 类胡萝卜素 |
| 1.1.2 番茄红素 |
| 1.1.3 番茄红素的生理功能 |
| 1.2 番茄红素生产方法 |
| 1.2.1 番茄红素现有生产方法 |
| 1.2.2 番茄红素生产未来技术发展趋势 |
| 1.3 番茄红素商业化概述 |
| 1.3.1 市场情况 |
| 1.3.2 中试放大研究进展 |
| 1.3.3 法规情况 |
| 1.3.4 专利分析 |
| 1.4 研究内容及意义 |
| 第2章 酿酒酵母产番茄红素的发酵工艺构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 摇瓶培养 |
| 2.3.2 发酵罐培养 |
| 2.3.3 检测分析方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 氧供应对酿酒酵母合成番茄红素的影响 |
| 2.4.2 接种比例对酿酒酵母合成番茄红素的影响 |
| 2.4.3 pH对酿酒酵母合成番茄红素的影响 |
| 2.4.4 不同氮源对酿酒酵母合成番茄红素的影响 |
| 2.4.5 葡萄糖补加策略对酿酒酵母合成番茄红素的影响 |
| 2.4.6 葡萄糖和氮源组合添加对酿酒酵母合成番茄红素的影响 |
| 2.4.7 多级发酵对酿酒酵母合成番茄红素的影响 |
| 2.4.8 发酵工艺在50L罐上的验证 |
| 2.4.9 发酵培养基优化 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 酿酒酵母产番茄红素代谢组学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 代谢样品选择 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.2.4 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 试剂准备 |
| 3.3.2 反复冻融法 |
| 3.3.3 玻璃匀浆器处理 |
| 3.3.4 快速研磨仪处理 |
| 3.3.5 代谢物衍生化及检测方法 |
| 3.3.6 数据分析方法 |
| 3.3.7 发酵罐培养 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 胞外代谢物去除方法比较研究 |
| 3.4.2 代谢物鉴定分析及不同预处理方法提取效果 |
| 3.4.3 不同溶解氧对酵母代谢水平的影响 |
| 3.4.4 不同溶解氧对酵母代谢的PCA分析 |
| 3.4.5 关键代谢物在酿酒酵母生产番茄红素中的作用研究 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 番茄红素提取工艺构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌粉制备研究 |
| 4.3.2 菌体破壁技术研究 |
| 4.3.3 番茄红素提取 |
| 4.3.4 番茄红素结晶纯化 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 菌粉制备工艺研究 |
| 4.4.2 细胞破壁技术研究 |
| 4.4.3 提取工艺研究 |
| 4.4.4 结晶工艺研究 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 番茄红素循环生产体系构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 主要实验仪器 |
| 5.2.3 主要实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 种子及摇瓶培养 |
| 5.3.2 发酵罐培养 |
| 5.3.3 酶解及资源回收方法 |
| 5.3.4 实验设计 |
| 5.3.5 检测分析方法 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 番茄红素后处理过程产生的废弃物及产品 |
| 5.4.2 不同比例发酵上清液替代对番茄红素生产的影响 |
| 5.4.3 尿嘧啶、D-半乳糖添加量对番茄红素生产的影响 |
| 5.4.4 不同来源的菌渣及发酵上清液替代对番茄红素生产的影响 |
| 5.4.5 发酵上清液循环次数及D-半乳糖补加对番茄红素产量的影响 |
| 5.4.6 全循环体系设计 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 番茄红素产业化研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 菌株 |
| 6.2.2 主要实验仪器 |
| 6.2.3 主要实验试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 中试方法 |
| 6.3.2 番茄红素应用研究 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 番茄红素发酵产业化研究 |
| 6.4.2 番茄红素应用研究 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）小檗碱对两种重要植物病原真菌的抑制作用及其烟剂的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苹果轮纹病概述 |
| 1.1.1 苹果轮纹病与病原真菌 |
| 1.1.2 侵染过程 |
| 1.1.3 苹果轮纹病的防治 |
| 1.2 桃褐腐病概述 |
| 1.2.1 桃褐腐病与病原真菌 |
| 1.2.2 桃褐腐病的综合防治 |
| 1.3 小檗碱 |
| 1.3.1 小檗碱简介 |
| 1.3.2 小檗碱抗菌作用研究现状 |
| 1.4 化学杀菌剂 |
| 1.4.1 二甲酰亚胺类杀菌剂(DCFs) |
| 1.4.2 甾醇脱甲基酶抑制剂(DMIs) |
| 1.4.3 苯并咪唑类杀菌剂(MBCs) |
| 1.4.4 二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂(DTCs) |
| 1.5 复配杀菌剂及共毒因子法 |
| 1.5.1 复配杀菌剂 |
| 1.5.2 共毒因子法 |
| 1.6 药物亲和反应的靶点稳定性(DARTS)技术 |
| 1.7 异源蛋白表达系统 |
| 1.7.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.7.2 酿酒酵母表达系统 |
| 1.7.3 毕赤酵母表达系统 |
| 1.8 烟剂 |
| 1.9 课题背景及研究意义 |
| 第二章 小檗碱与传统化学杀菌剂对两种植物病原真菌的药效比较 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 供试菌株及药剂 |
| 2.2.2 供试试剂及设备 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小檗碱与其他四种杀菌剂对苹果轮纹病菌的毒力测定 |
| 2.3.2 小檗碱与其他四种杀菌剂对桃褐腐病菌的毒力测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 小檗碱与其他四种杀菌剂对苹果轮纹病菌的毒力测定结果 |
| 2.4.2 小檗碱与其他四种杀菌剂对桃褐腐病菌的毒力测定结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小檗碱与其他四种杀菌剂复配效果评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小檗碱分别与其他四种杀菌剂复配对苹果轮纹病菌的药效评价 |
| 3.3.2 小檗碱分别与其他四种杀菌剂复配对桃褐腐病菌的药效评价 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 小檗碱分别与其他四种杀菌剂复配对苹果轮纹病菌的药效评价结果 |
| 3.4.2 小檗碱分别与其他四种杀菌剂复配对桃褐腐病菌的药效评价结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 小檗碱抑制两种植物病原真菌的作用靶标探究及靶标基因克隆 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 供试菌株及药剂 |
| 4.2.2 供试试剂及设备 |
| 4.2.3 溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 DARTS技术探究小檗碱抑制桃褐腐病菌和苹果轮纹病菌的作用靶标 |
| 4.3.2 桃褐腐病菌烯醇化酶基因的克隆 |
| 4.3.2.1 总RNA提取 |
| 4.3.2.2 cDNA第一链合成 |
| 4.3.2.3 TA克隆 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 DARTS实验结果 |
| 4.4.2 桃褐腐病菌总RNA提取结果 |
| 4.4.3 桃褐腐病菌烯醇化酶基因的克隆 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 桃褐腐病菌烯醇化酶基因的生物信息学分析及表达验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 供试菌株 |
| 5.2.2 供试试剂及设备 |
| 5.2.3 培养基的配制 |
| 5.2.4 溶液的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 烯醇化酶基因的生物信息学分析 |
| 5.3.2 烯醇化酶基因在大肠杆菌中的表达验证 |
| 5.3.2.1 PCR扩增目的基因 |
| 5.3.2.2 质粒提取 |
| 5.3.2.3 酶切回收 |
| 5.3.2.4 连接、热转化、菌落PCR验证与测序 |
| 5.3.2.5 重组大肠杆菌的摇瓶发酵 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 烯醇化酶基因序列分析 |
| 5.4.1.1 序列相似性比对及系统进化树构建 |
| 5.4.1.2 酶切图谱分析 |
| 5.4.2 烯醇化酶基因编码蛋白的序列分析 |
| 5.4.2.1 理化性质与亲疏水性分析 |
| 5.4.2.2 信号肽与跨膜区预测 |
| 5.4.2.3 亚细胞定位与结构位点分析 |
| 5.4.2.4 二级结构预测 |
| 5.4.2.5 卷曲螺旋域分析 |
| 5.4.2.6 三级结构预测 |
| 5.4.3 烯醇化酶基因在大肠杆菌中的表达验证 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 小檗碱抑制桃褐腐病菌的作用靶标的初步验证 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 供试菌株及药剂 |
| 6.2.2 供试试剂及设备 |
| 6.2.3 培养基的配制 |
| 6.2.4 溶液的配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 桃褐腐病菌烯醇化酶基因在酿酒酵母中的重组表达 |
| 6.3.1.1 重组质粒pY26-ENO的构建 |
| 6.3.1.2 重组酿酒酵母pY26-ENO/CEN.PK 113-11C的构建 |
| 6.3.1.3 重组酿酒酵母的摇瓶发酵 |
| 6.3.2 桃褐腐病菌烯醇化酶基因在毕赤酵母中的重组表达 |
| 6.3.2.1 重组质粒pPIC9K-ENO的构建 |
| 6.3.2.2 重组毕赤酵母pPIC9K-ENO/GS115的构建 |
| 6.3.2.3 重组毕赤酵母的摇瓶发酵 |
| 6.3.3 DARTS技术验证小檗碱抑制桃褐腐病菌的作用靶标 |
| 6.3.4 农杆菌介导转化载体的改造 |
| 6.3.4.1 靶标基因的替换 |
| 6.3.4.2 抗性基因的替换 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 桃褐腐病菌烯醇化酶基因在酿酒酵母中的重组表达 |
| 6.4.2 桃褐腐病菌烯醇化酶基因在毕赤酵母中的重组表达 |
| 6.4.3 丝状真菌表达载体的构建 |
| 6.4.3.1 重组质粒pCAMBIA2300-ENO的构建 |
| 6.4.3.2 重组质粒pCAMBIA2300-ENO-HPH的构建 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 小檗碱烟剂的研制 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.2.1 供试药剂 |
| 7.2.2 供试试剂及设备 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 烟剂配方筛选 |
| 7.3.1.1 供热剂的筛选 |
| 7.3.1.2 主剂的筛选 |
| 7.3.1.3 烟中小檗碱含量及成烟率的测定 |
| 7.3.2 烟剂理化指标测定 |
| 7.3.2.1 干燥减量的测定 |
| 7.3.2.2 pH值的测定 |
| 7.3.2.3 自燃温度的测定 |
| 7.3.2.4 点燃试验和燃烧发烟时间的测定 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 烟剂配方筛选结果 |
| 7.4.1.1 供热剂的筛选结果 |
| 7.4.1.2 主剂的筛选结果 |
| 7.4.1.3 烟中小檗碱含量及成烟率的测定结果 |
| 7.4.1.4 小檗碱烟剂配方 |
| 7.4.2 烟剂理化指标测定结果 |
| 7.4.2.1 干燥减量的测定结果 |
| 7.4.2.2 pH值的测定结果 |
| 7.4.2.3 自燃温度的测定结果 |
| 7.4.2.4 点燃试验和燃烧发烟时间的测定结果 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 供试试剂 |
| 附录2 供试设备 |
| 附录3 生物统计机率值换算表 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（7）多糖原料高效预处理转化和功能产品联产过程及机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 生物乙醇发展历程 |
| 1.2.1 合成气转化乙醇技术 |
| 1.2.2 生物法转化乙醇技术 |
| 1.2.3 纤维多糖原料水解生产生物乙醇的挑战 |
| 1.3 低聚木糖理化性质及应用 |
| 1.4 纤维多糖原料种类多样性 |
| 1.4.1 主要纤维多糖原料化学组成 |
| 1.4.2 甘蔗渣资源 |
| 1.4.3 油茶壳资源 |
| 1.5 纤维多糖原料结构复杂性 |
| 1.6 原料预处理技术 |
| 1.6.1 物理预处理技术 |
| 1.6.2 水热/化学预处理技术 |
| 1.6.3 生物预处理技术 |
| 1.6.4 多种工艺耦合预处理技术 |
| 1.7 纤维素酶水解 |
| 1.7.1 水解酶分类 |
| 1.7.2 纤维素酶作用机理 |
| 1.7.3 纤维素酶水解影响因素 |
| 1.8 生物乙醇发酵工艺 |
| 1.8.1 发酵工艺分类 |
| 1.8.2 己糖和戊糖共发酵 |
| 1.8.3 高底物浓度发酵 |
| 1.9 研究意义和主要内容 |
| 1.9.1 研究目的及意义 |
| 1.9.2 研究的主要内容 |
| 2 蒸汽爆破预处理甘蔗渣酶解工艺优化研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 实验仪器设备和试剂 |
| 2.2.3 蒸汽爆破预处理 |
| 2.2.4 甘蔗渣酶水解实验 |
| 2.2.5 分析方法 |
| 2.2.6 酶水解液表面张力的测定 |
| 2.2.7 蒸汽爆破预处理前后甘蔗渣结构表征 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 酶用量对甘蔗渣酶水解效率的影响 |
| 2.3.2 无患子果皮用量对蒸汽爆破预处理甘蔗渣酶水解效率的影响 |
| 2.3.3 酶和无患子果皮用量对初始酶解速率的影响 |
| 2.3.4 酶水解液表面张力的测定 |
| 2.3.5 蒸汽爆破预处理前后甘蔗渣结构表征 |
| 2.4 小结 |
| 3 不同预处理甘蔗渣发酵产生物乙醇及副产物对比研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与技术 |
| 3.2.1 实验原料与试剂 |
| 3.2.2 稀酸预浸渍的蒸汽爆破预处理 |
| 3.2.3 甘蔗渣Soda绿液耦合预处理实验 |
| 3.2.4 干酵母活化 |
| 3.2.5 同步糖化发酵实验 |
| 3.2.6 分析技术 |
| 3.2.7 预处理前后甘蔗渣结构表征 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 预处理技术对甘蔗渣化学成分的影响 |
| 3.3.2 预处理技术对甘蔗渣发酵过程乙醇含量影响。 |
| 3.3.3 预处理甘蔗渣发酵过程酵母细胞增殖规律分析 |
| 3.3.4 预处理甘蔗渣发酵过程副产物形成规律分析 |
| 3.3.5 预处理技术对甘蔗渣形貌结构影响 |
| 3.4 小结 |
| 4 SODA绿液-乙醇预处理甘蔗渣高底物浓度混菌共发酵研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验原料与试剂 |
| 4.2.2 甘蔗渣Soda绿液-乙醇预处理实验 |
| 4.2.3 干酵母活化 |
| 4.2.4 不同菌种质量配比和底物浓度的同步糖化共发酵实验 |
| 4.2.5 分析方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 Soda绿液-乙醇预处理条件对甘蔗渣化学成分的影响 |
| 4.3.2 Soda绿液-乙醇预处理对甘蔗渣共发酵过程影响 |
| 4.3.3 Soda绿液-乙醇预处理和底物浓度对甘蔗渣共发酵过程的影响 |
| 4.3.4 不同菌种质量配比对甘蔗渣共发酵过程影响 |
| 4.3.5 高底物浓度对Soda绿液-乙醇预处理甘蔗渣共发酵过程影响 |
| 4.3.6 Soda绿液-乙醇预处理甘蔗渣共发酵过程质量衡算 |
| 4.4 小结 |
| 5 过氧化氢-乙酸预处理甘蔗渣联产生物乙醇和低聚木糖 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验方法与试剂 |
| 5.2.2 甘蔗渣过氧化氢-乙酸预处理实验 |
| 5.2.3 过氧化氢-乙酸预处理甘蔗渣不同体系发酵实验 |
| 5.2.4 过氧化氢-乙酸预处理甘蔗渣酶解产低聚木糖实验 |
| 5.2.5 分析方法 |
| 5.2.6 过氧化氢-乙酸预处理前后甘蔗渣结构表征 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 过氧化氢-乙酸预处理对甘蔗渣化学组成和酶解性能影响 |
| 5.3.2 过氧化氢-乙酸预处理对DW和SCS发酵体系的影响 |
| 5.3.3 吐温80对DW和SCS发酵体系的影响 |
| 5.3.4 过氧化氢-乙酸预处理对DW和SCS发酵体系中副产物影响 |
| 5.3.5 过氧化氢-乙酸预处理对不同体系发酵性能对比分析 |
| 5.3.6 过氧化氢-乙酸预处理对甘蔗渣碱提木聚糖酶解性能影响 |
| 5.3.7 过氧化氢-乙酸预处理前后甘蔗渣结晶度及形貌变化观察 |
| 5.4 小结 |
| 6 氯化锌催化/活化预处理油茶壳联产低聚木糖和活性炭 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 实验原料与试剂 |
| 6.2.2 氯化锌催化预处理实验 |
| 6.2.3 预处理固体残渣制备活性炭 |
| 6.2.4 分析方法 |
| 6.2.5 样品活性炭吸附性能测定及结构表征 |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.3.1 氯化锌催化半纤维素降解机理 |
| 6.3.2 预处理温度对油茶壳半纤维素降解影响 |
| 6.3.3 预处理温度和反应时间对油茶壳半纤维素降解影响 |
| 6.3.4 预处理温度和氯化锌浓度对油茶壳半纤维素降解影响 |
| 6.3.5 预处理固体残渣联产活性炭 |
| 6.3.6 油茶果综合利用评估 |
| 6.4 小结 |
| 7 结论与创新点 |
| 7.1 本文的主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 下一步工作建议 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（8）重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 L-谷氨酰胺 |
| 1.1.1 理化性质 |
| 1.1.2 代谢及生理功能 |
| 1.1.3 局限性及替代物 |
| 1.2 丙谷二肽 |
| 1.2.1 理化性质及应用优势 |
| 1.2.2 合成方法及研究进展 |
| 1.2.3 检测方法 |
| 1.3 异源表达系统介绍 |
| 1.3.1 大肠杆菌原核表达系统 |
| 1.3.2 酿酒酵母真核表达系统 |
| 1.3.3 毕赤酵母真核表达系统 |
| 1.4 糖基化修饰 |
| 1.4.1 N-糖基化修饰 |
| 1.4.2 O-糖基化修饰 |
| 1.5 本文主要研究思路 |
| 1.5.1 选题背景及存在问题 |
| 1.5.2 研究内容及技术路线 |
| 2 异源表达SsAet重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和溶液 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 分子操作技术 |
| 2.2.6 分析验证方法 |
| 2.2.7 异源表达SsAet重组大肠杆菌的构建 |
| 2.2.8 异源表达SsAet重组大肠杆菌诱导条件的优化 |
| 2.2.9 全细胞催化合成Ala-Gln反应条件的优化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Ala-Gln定性定量方法的确立 |
| 2.3.2 异源表达SsAet重组大肠杆菌的表征 |
| 2.3.3 可溶性表达SsAet重组大肠杆菌的构建及筛选 |
| 2.3.4 OPA催化方式及催化活性差异性的分析 |
| 2.3.5 OPA诱导条件和全细胞催化反应条件的优化 |
| 2.3.6 循环利用OPA全细胞合成Ala-Gln |
| 2.4 本章小结 |
| 3 表面展示SsAet重组酿酒酵母合成Ala-Gln |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和溶液 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.2.5 分子操作技术 |
| 3.2.6 分析验证方法 |
| 3.2.7 表面展示SsAet重组酿酒酵母的构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 表面展示方式对SsAet催化活性的影响 |
| 3.3.2 密码子优化对SsAet催化活性的影响 |
| 3.3.3 表面展示SsAet重组酿酒酵母的絮凝化 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 糖基化修饰对SsAet结构和催化活性的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和溶液 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 分子操作技术 |
| 4.2.6 分析验证方法 |
| 4.2.7 异源表达SsAet重组毕赤酵母的构建 |
| 4.2.8 产酶条件和催化反应条件的优化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 异源表达SsAet重组毕赤酵母的表征 |
| 4.3.2 糖基化修饰对SsAet催化活性的影响 |
| 4.3.3 糖基化修饰的鉴定及对SsAet结构的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 胞内表达SsAet重组酿酒酵母的自固定化及高效合成Ala-Gln |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基和溶液 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.2.5 分子操作技术 |
| 5.2.6 分析验证方法 |
| 5.2.7 胞内表达SsAet重组酵母的构建 |
| 5.2.8 胞内表达SsAet重组酵母培养条件的优化 |
| 5.2.9 胞内表达SsAet重组酵母全细胞催化反应条件的优化 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 胞内表达SsAet重组酵母的催化活性 |
| 5.3.2 胞内表达SsAet重组酵母的条件优化 |
| 5.3.3 胞内表达SsAet重组酵母的自固定化及重复利用 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（9）沿面放电等离子体主要活性成分分析及其对酵母细胞杀灭机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 大气压低温等离子体技术及其在生物医学领域的应用 |
| 1.1.1 等离子体概念及其发展 |
| 1.1.2 等离子体技术生物医学应用 |
| 1.1.2.1 大气压低温等离子体杀菌方式分类 |
| 1.1.2.2 大气压低温等离子体对附着于培养板上的细菌、真菌、生物膜的杀灭效应 |
| 1.1.2.3 大气压低温等离子体对医疗器械以及医用生物材料的杀菌作用 |
| 1.1.2.4 大气压低温等离子体在口腔医学领域的应用 |
| 1.1.2.5 大气压低温等离子体在皮肤病治疗中的应用 |
| 1.1.2.6 大气压低温等离子体在食品及包装材料表面的杀菌应用 |
| 1.1.2.7 大气压低温等离子体在植物杀菌上的应用 |
| 1.1.2.8 大气压低温等离子体对水体中微生物的杀灭作用 |
| 1.1.2.9 大气压低温等离子体活化水对微生物的杀灭效应 |
| 1.1.2.10 大气压低温等离子体应用于空气杀菌净化 |
| 1.1.2.11 大气压低温等离子体应用于诱变育种 |
| 1.1.2.12 大气压低温等离子体对肿瘤细胞的杀灭 |
| 1.2 大气压低温等离子体中的活性成分研究 |
| 1.2.1 大气压低温等离子体主要成分 |
| 1.2.1.1 大气压低温等离子体中常见的ROS/RNS |
| 1.2.1.2 带电粒子与电场 |
| 1.2.1.3 紫外线(Ultraviolet,UV) |
| 1.2.2 大气压低温等离子体源分类 |
| 1.2.3 FE-DBD装置产生的活性物质研究 |
| 1.2.3.1 FE-DBD装置产生的气相活性物质 |
| 1.2.3.2 FE-DBD等离子体与液体相互作用后产生的活性物质 |
| 1.2.4 大气压低温等离子体射流装置产生的活性物质研究 |
| 1.2.4.1 大气压低温等离子体射流产生的气相活性物质研究 |
| 1.2.4.2 等离子体射流与液体相互作用后产生的活性物质研究 |
| 1.2.4.3 屏蔽气体对等离子体射流产生的活性物质影响 |
| 1.2.4.4 等离子体射流处理水体后产生的液相活性物质研究 |
| 1.2.4.5 等离子体射流产生的活性物质在组织中的传输能力研究 |
| 1.2.5 沿面介质阻挡放电等离子体装置产生的活性物质研究 |
| 1.2.5.1 沿面介质阻挡放电等离子体产生的气相活性物质研究 |
| 1.2.5.2 沿面介质阻挡放电等离子体处理水体后产生的液相活性物质研究 |
| 1.3 大气压低温等离子体的细胞损伤机理研究 |
| 1.3.1 细胞氧化应激与凋亡 |
| 1.3.2 细胞膜损伤 |
| 1.3.3 细胞物理性损伤 |
| 1.3.4 细胞大分子物质损伤的分子动力学模拟 |
| 1.4 真菌酵母 |
| 1.4.1 酵母细胞特性 |
| 1.4.2 大气压低温等离子体对酿酒酵母细胞的作用研究 |
| 1.5 本论文研究目的与内容 |
| 参考文献 |
| 2 沿面放电等离子体主要活性氧氮成分在组织模型上的产生分布及对酵母细胞杀灭效果研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 沿面放电等离子体装置及放电特性 |
| 2.2.2 二维组织模型构建 |
| 2.2.3 发射光谱诊断激发态活性成分 |
| 2.2.4 臭氧检测装置 |
| 2.2.5 放电区域相对湿度检测 |
| 2.2.6 组织模型表面温度检测 |
| 2.2.7 主要活性氧氮成分在组织模型上的二维分布及相对含量检测 |
| 2.2.7.1 羟基自由基的检测 |
| 2.2.7.2 臭氧检测 |
| 2.2.7.3 过氧化氢检测 |
| 2.2.7.4 亚硝酸根检测 |
| 2.2.7.5 过氧亚硝酸根及过氧亚硝酸检测 |
| 2.2.8 抗菌活性分析 |
| 2.2.8.1 实验菌种 |
| 2.2.8.2 实验培养基 |
| 2.2.8.3 酵母菌株的培养 |
| 2.2.8.4 沿面放电等离子体处理被酵母细胞接种后的组织模型 |
| 2.2.8.5 酵母平板计数以及菌落分布 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 组织模型辐照过程中放电区域相对湿度变化结果 |
| 2.3.2 发射光谱诊断激发态活性成分结果 |
| 2.3.3 羟基自由基在组织模型上的二维分布及相对含量检测结果 |
| 2.3.4 气相以及组织模型上臭氧检测结果 |
| 2.3.5 过氧化氢、亚硝酸根以及过氧亚硝酸根/过氧亚硝酸在组织模型上的二维分布及相对含量检测结果 |
| 2.3.6 酵母平板菌落计数及菌落分布检测结果 |
| 2.3.7 皮尔森相关性系数分析关键杀菌活性成分 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 3 沿面放电等离子体中的羟基自由基、过氧化氢、氧化还原电势以及pH对组织模型表面酵母细胞的杀灭机理研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 沿面放电等离子体装置及等离子体处理设计 |
| 3.2.2 酵母菌的培养以及处理前准备 |
| 3.2.3 发射光谱诊断活性物质 |
| 3.2.4 等离子体反应腔室中的相对湿度检测 |
| 3.2.5 组织模型表面微环境的物理化学特性检测 |
| 3.2.5.1 羟基自由基的二维分布及相对浓度检测 |
| 3.2.5.2 过氧化氢浓度检测 |
| 3.2.5.3 pH和ORP检测 |
| 3.2.6 微生物分析 |
| 3.2.6.1 酵母平板菌落计数及菌落分布检测 |
| 3.2.6.2 酵母细胞活性及细胞膜完整性检测 |
| 3.2.6.3 酵母细胞胞内活性氧检测 |
| 3.2.6.4 酵母细胞胞内pH检测 |
| 3.2.6.5 酵母细胞脂质过氧化检测 |
| 3.2.7 实验数据统计学分析 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 发射光谱诊断结果 |
| 3.3.2 羟基自由基在组织模型上的二维分布及相对浓度检测结果 |
| 3.3.3 组织模型表面微环境的过氧化氢,pH以及ORP检测结果 |
| 3.3.4 等离子体对酵母细胞的杀灭效率及主要杀菌因子分析 |
| 3.3.5 等离子体对酵母细胞活性及细胞膜完整性的影响 |
| 3.3.6 等离子体对酵母细胞胞内活性氧的影响 |
| 3.3.7 等离子体对酵母细胞胞内pH及脂质过氧化的影响 |
| 3.3.8 酵母胞内pH与胞内活性氧之间的关系 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 4 沿面放电等离子体在溶液中产生的主要活性氧成分及其对酵母亚细胞损伤机理探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及方法 |
| 4.2.1 沿面放电等离子体与液体反应系统 |
| 4.2.2 等离子体处理后溶液的物理化学特性检测 |
| 4.2.2.1 pH和ORP检测 |
| 4.2.2.2 羟基自由基、单线态氧、超氧阴离子及过氧化氢浓度检测 |
| 4.2.2.3 清除剂实验设计 |
| 4.2.3 酵母细胞的培养以及样品的处理 |
| 4.2.4 微生物学分析 |
| 4.2.4.1 酵母平板菌落计数检测 |
| 4.2.4.2 酵母细胞形态的扫描电镜检测 |
| 4.2.4.3 利用流式细胞仪对酵母细胞FSC-SSC的统计分析 |
| 4.2.4.4 酵母细胞红绿荧光死活检测 |
| 4.2.4.5 酵母细胞凋亡率检测 |
| 4.2.4.6 酵母细胞胞内活性氧检测 |
| 4.2.4.7 酵母细胞胞内过氧化氢检测 |
| 4.2.4.8 酵母细胞胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽检测 |
| 4.2.4.9 酵母细胞线粒体膜电势检测 |
| 4.2.4.10 酵母细胞胞内钙离子检测 |
| 4.2.4.11 酵母细胞胞内ATP水平检测 |
| 4.2.4.12 酵母细胞胞内pH检测 |
| 4.2.4.13 酵母细胞膜电势检测 |
| 4.2.4.14 酵母细胞胞内钾离子泄露量检测 |
| 4.2.4.15 酵母细胞胞内蛋白泄露量检测 |
| 4.2.4.16 酵母细胞脂质过氧化检测 |
| 4.2.4.17 酵母细胞表面生物大分子的傅里叶红外光谱检测 |
| 4.2.4.18 酵母细胞胞内DNA分子的流式细胞仪检测 |
| 4.2.5 实验数据统计学分析 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 等离子体处理后溶液中的物理化学特性检测结果 |
| 4.3.2 等离子体对酵母细胞形态的影响 |
| 4.3.3 等离子体对酵母细胞存活率及凋亡率的影响 |
| 4.3.4 等离子体对酵母细胞胞内氧化还原系统的影响 |
| 4.3.4.1 酵母细胞胞内活性氧和过氧化氢检测结果 |
| 4.3.4.2 酵母细胞胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽检测结果 |
| 4.3.5 等离子体对酵母细胞胞内能量代谢系统的影响 |
| 4.3.6 等离子体对酵母细胞胞内 p H,钾离子泄露以及细胞膜电势的影响 |
| 4.3.7 等离子体对酵母细胞大分子物质结构的影响 |
| 4.3.8 沿面放电等离子体与液体反应体系中酵母的亚细胞损伤机理推测 |
| 4.3.8.1 皮尔森相关性系数分析等离子体对酵母细胞胞内主要组分的影响 |
| 4.3.8.2 等离子体主要活性成分在酵母杀灭细胞过程中的贡献及特异性攻击靶标分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 本论文主要结论 |
| 5.2 本论文创新点 |
| 5.3 未来工作展望 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（10）菊叶薯蓣皂苷与淀粉利用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 菊叶薯蓣 |
| 1.1.1 薯蓣属植物 |
| 1.1.2 菊叶薯蓣植物学特性和化学成分 |
| 1.1.3 菊叶薯蓣的资源化开发 |
| 1.2 甾体皂苷 |
| 1.2.1 结构、分类和理化性质 |
| 1.2.2 生物活性 |
| 1.2.3 检测和结构分析 |
| 1.2.4 甾体皂苷的提取 |
| 1.2.5 薯蓣皂苷 |
| 1.3 薯蓣皂素 |
| 1.3.1 结构和性质 |
| 1.3.2 检测分析 |
| 1.3.3 生物活性 |
| 1.3.4 清洁生产 |
| 1.3.5 提高水解得率的研究 |
| 1.4 非粮生物乙醇 |
| 1.4.1 生物质能源 |
| 1.4.2 非粮燃料乙醇 |
| 1.4.3 非粮燃料乙醇现状 |
| 1.4.4 木质纤维乙醇与一代乙醇的整合 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 第二章 菊叶薯蓣甾体皂苷成分分析和鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 甾体皂苷的提取和分离 |
| 2.2.2 测定方法的建立 |
| 2.2.3 含量测定 |
| 2.3 菊叶薯蓣甾体皂苷分析 |
| 2.3.1 概述 |
| 2.3.2 化合物的结构 |
| 2.3.3 甾体皂苷结构解析 |
| 2.4 四种甾体皂苷的测定 |
| 2.4.1 流动相优化 |
| 2.4.2 梯度洗脱 |
| 2.4.3 方法学研究 |
| 2.5 甾体皂苷含量分析 |
| 2.5.1 醇提物含量 |
| 2.5.2 含量测定 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 薯蓣皂苷的提取分离纯化 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 高氯酸显色法测定总皂苷 |
| 3.2.2 薯蓣皂苷的HPLC测定 |
| 3.2.3 大孔树脂的活化 |
| 3.2.4 大孔树脂的静态吸附和解吸 |
| 3.2.5 吸附热力学和动力学测定 |
| 3.3 微波辅助提取总皂苷 |
| 3.3.1 总皂苷含量测定 |
| 3.3.2 提取单因素分析 |
| 3.3.3 响应面优化 |
| 3.4 大孔吸附树脂吸附薯蓣皂苷的热力学和动力学分析 |
| 3.4.1 树脂的筛选 |
| 3.4.2 静态吸附热力学和动力学 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 菊叶薯蓣皂素制备技术 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 本实验所用仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 薯蓣皂素的酸水解 |
| 4.2.2 自然发酵 |
| 4.2.3 预处理 |
| 4.2.4 薯蓣皂素的测定 |
| 4.2.5 甾体皂苷的测定 |
| 4.2.6 重铬酸钾法测定化学需氧量 |
| 4.2.7 计算 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 薯蓣皂素的标准曲线 |
| 4.3.2 化学成分分析 |
| 4.3.3 优化酸水解条件 |
| 4.3.4 优化自然发酵条件 |
| 4.3.5 自然发酵中甾体皂苷的变化 |
| 4.3.6 水解方法的改进 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 菊叶薯蓣酵母抑制因子分析及机理探讨 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 菊叶薯蓣的糖化液化 |
| 5.3.2 酵母菌的活化和发酵 |
| 5.3.3 抑制物的提取和分离 |
| 5.3.4 抑制物酵母抑制机理分析 |
| 5.4 抑制物化学成分分析 |
| 5.4.1 初步分析 |
| 5.4.2 抑制物的分离和追踪 |
| 5.4.3 抑制物鉴定 |
| 5.5 抑制机理分析 |
| 5.5.1 敏感酵母菌株筛选 |
| 5.5.2 抑制物的抑制作用分析 |
| 5.5.3 对酵母细胞周期的影响 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 薯蓣渣-蔗渣混合发酵乙醇技术 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 碱法预处理甘蔗渣 |
| 6.2.3 菊叶薯蓣提取渣的预糖化 |
| 6.2.4 同步糖化发酵 |
| 6.2.5 检测 |
| 6.2.6 数据统计分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 原料的化学组成 |
| 6.3.2 不同混合比例的SSF |
| 6.3.3 不同负荷混合的SSF |
| 6.3.4 高负荷混合的SSF |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新之处 |
| 7.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读博士期间发表论文和参加的科研项目 |
| 附录B 化合物核磁图谱 |
四、酿酒酵母细胞四种转化方法的比较（论文参考文献）
- [1]代谢工程改造酿酒酵母生产萜类化合物[D]. 赵一瑾. 北京化工大学, 2021(02)
- [2]酿酒酵母合成生物学新技术及中心代谢流重编程的研究[D]. 董昌. 浙江大学, 2021(01)
- [3]姜黄素及其类似物的糖基化衍生物的生物转化[D]. 陈秉松. 天津中医药大学, 2021
- [4]酱香型白酒核心酿造菌群及群体代谢机制的研究[D]. 宋哲玮. 江南大学, 2020(02)
- [5]酿酒酵母产番茄红素的产业化关键技术研究[D]. 汪志明. 天津大学, 2020(01)
- [6]小檗碱对两种重要植物病原真菌的抑制作用及其烟剂的研制[D]. 刘金蓉. 北京化工大学, 2020(02)
- [7]多糖原料高效预处理转化和功能产品联产过程及机理[D]. 游艳芝. 北京林业大学, 2020
- [8]重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽[D]. 李益民. 大连理工大学, 2020(07)
- [9]沿面放电等离子体主要活性成分分析及其对酵母细胞杀灭机理研究[D]. 许航博. 郑州大学, 2020(02)
- [10]菊叶薯蓣皂苷与淀粉利用研究[D]. 叶广英. 华南农业大学, 2019