一、产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究（论文文献综述）
苗飞,孟阳,王悦,袁春营,崔青曼[1]（2018）在《一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化》文中研究说明几丁质酶在降解几丁质和生物防治上具有重要作用。采用平板筛选法从对虾养殖池塘底泥中筛选几丁质酶产生菌株,以培养时间、培养温度和胶体几丁质含量为自变量,响应面法优化该菌株的产酶条件,建立二次回归方程。试验结果表明,通过菌株的菌落形态、亚显微形态特征和16S rDNA序列同源性分析,确定该菌株为蜂房芽孢杆菌。3个因素对菌株产酶的影响依次为培养时间>培养温度>胶体几丁质含量。菌株的最佳产酶的条件为:培养基中胶体几丁质含量1.62%,培养温度40℃,培养时间72h,在此条件下,菌株产生的几丁质酶活力为13.07U/mL。该研究为筛选菌株的进一步利用提供科学依据。
王美玲,耿丽丽,段江燕,张杰[2]（2017）在《拮抗核盘菌Bt菌株的筛选及抑菌活性研究》文中研究说明利用平板对峙试验从170株Bt菌株中筛选获得12株对核盘菌Sclerotinia sclerotiorum有抑菌活性的菌株,对其中4株活性较强的菌株进行抗病相关基因分析,发现菌株中都含有几丁质酶基因,测定4AP1菌株发酵液的几丁质酶活力为672.4U/mL。通过对4AP1菌株pH和温度敏感性的研究发现,4AP1菌株最高可耐受55℃高温及pH 12缓冲液的处理,抑菌活性与对照无显着差异。且该菌株抑菌谱较广,除核盘菌外,对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum等其他9种病原真菌均有抑制作用。本研究获得的4AP1菌株对核盘菌具有较强抑制作用,且耐热耐强碱环境,为构建杀虫抗病Bt工程菌提供了菌株资源。
程德勇[3]（2016）在《几丁质酶高产芽孢杆菌的筛选及基因克隆与表达》文中提出本研究从武汉土壤中筛选出了六株产几丁质酶的芽孢杆菌。通过16S rRNA基因分子鉴定,确定其中4株（D1,D2,D3和D4）为Paenibacillus illinoisensis,另外2株（CDY-607和W1）为解木聚糖类芽孢杆菌（Paenibacillus xylanilyticus）,以解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607为出发菌株获得研究结果如下:解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607几丁质酶发酵液最适反应温度为55℃,最适反应pH值为6.5和8.0,金属离子Fe2+对几丁质酶酶活力有促进作用。对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607产几丁质酶发酵培养基配方及培养条件进行优化,结果表明CDY-607产几丁质酶最佳发酵时间为96 h,最佳接种量为5%,最佳装瓶量为100 mL,最佳培养基pH值为6.5。产几丁质酶最适发酵培养基配方为胶体几丁质5 g/L,硫酸亚铁2 g/L,蛋白胨2 g/L,酵母膏5 g/L。在最适条件下测定的发酵液酶活力（49.26 mU/m L）是未优化发酵培养基发酵液酶活力（24.62 mU/m L）的2倍。在PCR扩增获得解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607几丁质酶基因部分保守片段后,通过Tail-PCR成功扩增出几丁质酶基因两侧DNA片段。拼接后发现几丁质酶基因长996 bp。该基因只含有一个第18糖苷酶家族催化结构域。编码该结构域的序列大小为912 bp,共304个氨基酸,预测编码的蛋白质分子量大小为33.42kDa。将该基因与载体p FLAG-CTS重组后于大肠杆菌DH5a中分泌表达,经IPTG诱导培养12 h后,采用DNS法测定培养液几丁质酶酶活力为17 mU/m L。此外,SDS-PAGE亦成功检测到分泌表达的几丁质酶,大小在33.4 kDa左右,与预测结果相符。
张圆,周国旺,李海涛,刘荣梅,赵一夔,高继国[4]（2015）在《苏云金芽胞杆菌chiA73基因的克隆、表达和酶活性分析》文中指出旨在对苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因进行分子鉴定和酶活测定,从产几丁质酶活力高的Bt DLD171菌株中提取基因组DNA,通过PCR法克隆得到几丁质酶chi A73基因（Gen Bank登录号为KJ508093）。结果显示,对chi A73基因进行表达,获得大小约74 k D的表达产物。用荧光底物对表达产物进行酶活测定,发现表达产物只能水解荧光底物4-甲基伞形酮几丁三糖[4-MU-（Glc NAc）3],而不能水解4-甲基伞形酮几丁单糖（4-MU-Glc NAc）。结果表明,Chi A73为一种内切几丁质酶,在p H值为8、温度为40℃时酶活性最高。
谢池楚[5]（2012）在《苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因调控元件的鉴定和功能分析》文中研究指明几丁质酶在工业、农业、医药及生物防治等方面具有重要的作用和应用价值。重要的生防细菌苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）也能产生几丁质酶。由于几丁质酶不但可以抑制真菌生长，还有明显的杀虫增效作用，不少国内外学者对Bt几丁质酶的应用及其编码基因进行了广泛研究。然而Bt几丁质酶的表达方式至今尚无定论，几丁质酶基因（chi）表达调节机理的研究几乎为零。本研究旨在确定Bt几丁质酶表达方式的基础上，研究该基因的遗传调控元件，从而为揭示几丁质酶基因表达调节机理提供理论依据。为了能够对Bt几丁质酶的表达方式有系统、全面的了解，采用DNS法检测了77株Bt菌在有或无诱导物培养基中的几丁质酶活力，发现不同Bt菌株之间酶活力差异非常大。无几丁质诱导下，全部实验菌株都能或多或少产生几丁质酶，保持一定量的基础表达；添加诱导物之后，41%的菌株酶活力几乎没有变化，56%菌株有一定提高。在酶活力提高的菌株中，诱导效率存在很大差异，绝大部分菌株诱导效果不是很显着。在此研究基础上，考查了葡萄糖对酶活力的影响，以及葡萄糖抑制与几丁质诱导之间的关系。经统计分析发现，葡萄糖能够抑制几丁质的诱导作用，但是不能完全抑制Bt菌株几丁质酶的基础表达，Bt菌株并不完全遵循诱导型对葡萄糖敏感、组成型抗葡萄糖的规律。证明苏云金芽胞杆菌在几丁质酶诱导表达的调节方式上具有复杂的多态性。在所检测的菌株中，发现75号菌株（Bt75）几丁质酶诱导表达最为明显，诱导效率达9.7倍，选取这株菌用于研究几丁质酶基因的表达调节。为研究Bt几丁质酶基因表达调节的分子基础，需要构建一个研究启动子功能的载体工具。通过检测证明，Bt75菌株中无明显内源性的β-半乳糖苷酶活性，因此选择了嗜热脂肪地芽胞杆菌β-半乳糖苷酶基因bgaB作为报告基因，在穿梭载体pHT315的基础上构建芽胞杆菌启动子探测型载体。当把无启动子且经过修饰的bgaB基因连入pHT315构建成pHT-bgaB后，发现转化子表现出了明显的β-半乳糖苷酶活力，证明pHT315载体中存在未知的启动子而造成bgaB基因的表达。为了终止这一潜在启动子引起的转录通读，在bgaB基因上游又插入了大肠杆菌转录终止子rrnBT1T2序列，最终成功获得目的质粒pCB。含有质粒pCB的大肠杆菌和Bt75中都检测不出任何β-半乳糖苷酶活性。将Bt75菌株chiA、chiB基因调控区域连入载体pCB，获得的重组质粒电转化入原始菌株Bt75，得到的转化子中chiA、chiB基因启动子的诱导表达特性与原始菌株中几丁质酶的诱导合成特性一致。证明利用自行构建的启动子探测型载体pCB，完全可以开展本研究计划的后续所有工作。通过对chiA调控序列的一系列缺失突变对酶活力影响的分析，发现调控序列从5′端缺失到-116bp处或从3′端缺失到-42bp处时启动子仍然保持明显的活性，更多缺失却导致启动子活性丧失，且只含-116至-42bp的片段照常启动基因的表达，证实chiA结构基因ATG上游-116至-42bp位点之间长75bp的序列是chiA基因的核心启动子，-116bp处的所有上游序列和-21bp处的全部下游序列对于chiA基因的表达和调控是非必须的，实验结果与软件预测的启动子不吻合。研究发现和证实在核心启动子下游、-20bp处上游附近存在一个应答几丁质诱导的负调控位点，缺失或破坏这个位点导致chiA启动子由诱导型表达转变为组成型表达。另外，通过5′RACE技术，证实在chiA基因核心启动子内，结构基因ATG上游-46bp处的“A”碱基是chiA基因的转录起始位点，由此确定chiA基因启动子的-35区和-10区分别为“TTACAA”和“TATCAT”。通过对chiB调控序列的一系列缺失突变对酶活力影响的分析，结果显示调控序列从5′端缺失至-324bp处和从3′缺失至-41bp处时对启动子的活性和诱导表达特性没有任何影响。证明这些序列对于chiB基因的表达是非必须的。从5′端缺失至-232bp处或从3′端缺失至-121bp处时启动子活性降低，但仍然保持明显的活性，在此基础上继续缺失导致启动子活性完全丧失。而只含-232至-121bp的片段仍然保持一定的启动子活性。由此证实chiB结构基因ATG上游-232至-121bp位点之间的序列为基因的核心启动子，与chiA不同，其上游及下游序列对启动子的活性具有一定影响。同时证实chiB基因转录起始位点为结构基因ATG上游-132bp处的“C”碱基，chiB基因启动子的-35区和-10区序列分别为“TTTACA”和“TACGAT”。缺失分析还证明在chiB核心启动子下游、-97bp处上游附近存在一个应答几丁质诱导的负调控位点（dre），该位点是一段长16bp位于-112至-97bp之间具有部分反向重复特征的保守序列，缺失或部分缺失这个位点，导致原本是诱导型表达的chiB启动子转变为组成型表达。通过对dre位点中7个碱基进行定点置换后对酶表达方式影响的研究，所获得的20个突变中有14种突变导致chiB启动子由诱导型表达转变为组成型表达。证实dre位点参与了chiB基因诱导表达的调节，其中一些碱基对于dre位点行使功能起着至关重要的作用。Northern杂交分析也证实，dre位点中关键碱基置换后，明显提高chiB基因转录的mRNA量。这些结果证明dre位点在转录水平上调控chiB基因的表达。通过体外凝胶电泳迁移率变动分析也证实，Bt细胞中存在一种蛋白，在无诱导物的情况下能够结合包括chiB基因dre位点在内的调控区域，有诱导物存在时则脱离chiB调控区域。上述有关chiA、chiB基因表达调节关键遗传元件的研究结果，为最终提出Bt几丁质酶表达调控模型及机制提供了研究基础。此外，为了了解Bt几丁质酶基因表达的时间段，利用报告基因对chiA、chiB基因启动子在菌体不同培养时间段的活性进行了测定。结果显示在菌体的生长初期两个基因的启动子都没有任何活性，直至菌体生长到对数生长后期时才开始启动基因表达，此后，酶的合成量稳步上升，在稳定期时达到最大，稳定期后期之后，基因的表达量基本不再增加。发现几丁单糖（GlcNAc）不是Bt75菌株几丁质酶基因的有效诱导物。
沙莉,黄振吉,关雄[6]（2011）在《不同氮源对苏云金芽胞杆菌产几丁质酶的影响》文中研究表明研究了不同氮源对苏云金芽胞杆菌（Bt）BRC-HZP7菌株产几丁质酶活力的影响.结果表明:在不添加几丁质的LB培养基和牛肉膏培养基中,菌株都能合成几丁质酶,最高酶活力分别为1368.72、103.39 U;在含2%（质量分数）几丁质的产酶培养基中添加酪蛋白,能有效提高产酶活力,最高酶活力为563.57 U;在产酶培养基中分别添加质量分数为1%的谷氨酰胺、天门冬酰胺、脯氨酸、甲硫氨酸4种氨基酸,产酶活力与对照组相比都大大下降,最高酶活力较对照分别下降了32.5%、33.7%、80.6%、82.6%,故推断氨基酸可抑制Bt合成几丁质酶.
沙莉[7]（2011）在《苏云金芽胞杆菌几丁质酶活性研究》文中提出几丁质是自然界储量第二的天然高聚物,几丁质酶是降解其的主要酶类。Bt是应用最成功的杀虫微生物,几丁质酶对Bt杀虫有增效作用。本研究以筛选到的具有较高几丁质水解能力的Bt菌株BRC-Bt1为试验材料,克隆表达该菌株的2个几丁质酶基因,对这2种几丁质酶的结构域组成、催化反应机制、表达调控以及水解产物的生物活性进行了系统研究。BRC-Bt1菌株的chi74基因和目前已发现的Bt 70kDa几丁质酶在核酸序列上高度同源,该酶属18家族几丁质酶,由信号肽、催化区、FN3和ChBD等4个结构域组成,理论分子量74kDa,pI5.77。chi74基因和GST融合在E. coli表达产物为胞内可溶性蛋白,含chi74基因的E. coli细胞能在胶体几丁质平板产生水解圈。以胶体几丁质为底物,Chi74蛋白最适反应温度60℃、pH5,在20-80℃和pH4-8都有活性。Na<sup>+、K<sup>+、NO3-、Cl-不影响该酶活性;Mg2+和SO42-对该酶有激活作用,其中6mmol/L浓度Mg2+提高酶活力约40%,而SO42-在0-3mmol/L浓度范围能提高酶活性,3mmol/L时,提高酶活力约20%,之后再增加浓度激活作用反而下降;Cu2+、Ag+都抑制酶活性。HPLC分析水解产物表明该酶能水解胶体几丁质形成GlcNAc、几丁二糖以及聚合度更高的几丁寡糖,随着反应时间的延长,GlcNAc占产物的比例不断提高。该酶为内切几丁质酶。构建chi74基因不同截短酶基因chiA、chiAF、chiAC,三个截短基因编码的蛋白产物理论分子量和pI分别为:54kDa、6.04,63kDa、6.07和66kDa、5.74。三个截短基因GST融合在E. coli细胞表达产物ChiA、ChiAF、ChiAC水解胶体几丁质的活性分别是野生酶的81%、72%、39%。3种截短酶最适反应温度都是60℃,且温度变化对酶活性的影响和Chi74类似。Mg2+能激活3种截短酶,且激活效率比Chi74高,6.0mmol/L的Mg2+对ChiA、ChiAF、ChiAC分别提高酶活力85%、62%、60%。低浓度的Ag+对3种截短酶活性抑制也比野生酶显着,500μmol/L的Ag+对ChiAC、ChiAF、ChiA等3种截短酶活力分别为70.0%、63.2%、55.0%。截短酶的水解产物HPLC结果表明,Chi74的C端不同片段缺失,胶体几丁质水解不彻底,产物中GlcNAc含量不高,而几丁寡糖含量高。截短酶与Chi74催化活性的差异,表明FN3和ChBD对Chi74水解胶体几丁质很重要。克隆chi36基因,推导蛋白分子量40kDa,pI6.52。该基因与Bt、Bc、Ba上发现的编码36kDa大小的几丁质酶基因同源性很高,而与chi74没有同源性。该酶也属于18家族几丁质酶,只有信号肽和催化区。chi36基因和GST融合表达产物,以胶体几丁质为底物,最适合反应温度55℃、pH5,在30-80℃、pH4-8都有活性。Na+、K+、Mg2+、NO3-、Cl-对该酶活性基本没有影响;低浓度的SO42-对该酶有激活作用;Cu2+、Fe3+、Ag+则抑制该酶活性。Chi36水解胶体几丁质产物HPLC结果表明:该酶是内切几丁质酶,产物中GlcNAc含量低,多种几丁寡糖含量较高。从水解产物可以看出,Chi36水解胶体几丁质的机制和Chi74不同,而且Chi36水解的效率也不如Chi74。等体积混合Chi36和Chi74,催化活性协同提高。用来自chi74的3个C端片段（ChBD、FN3、ChBD+FN3）添加到chi36基因的C端构建3种加长酶基因chi36F、chi36C、chi36FC,预测分子量分别为49kDa、52kDa、60kDa。加长酶基因和GST融合表达产物Chi36F、Chi36C、Chi36FC几丁质酶活性分别比野生Chi36提高7%、21%、33%,最适合反应温度仍是55℃。Ag+对3种加长酶活性抑制率比Chi36低,500μmol/L时,Chi36F、Chi36C、ChiFC加长酶活力分别保留为64.0%、66.0%、70.5%。加长酶水解胶体几丁质产物组成与Chi36类似,且产物中各个组分的浓度都提高,表明加长酶对底物的亲和力增强,进一步说明ChBD、FN3在催化反应中发挥作用,且ChBD比FN3更重要。分别克隆6株Bt菌株chi74和chi36基因上游序列,序列功能分析结果表明,这两个基因都是独立表达的,且两个基因在Bt基因组距离很远。两个基因上游的启动子没有同源性,表明Bt的两个几丁质酶基因的表达调控方式不同。chi74和chi36基因启动子分析结果表明:chi74基因上游有多个潜在启动子,且不同菌株这些启动子的同源性较高,而在chi36上游发现的启动子较少,且菌株间的差异较大。6个菌株都在基因上游发现CAP/CRP位点、NIT-2等多种转录因子结合位点。产几丁质酶培养基和LB培养的BRC-Bt1菌株发酵液上清对香蕉炭疽菌生长有抑制作用,且产酶培养基上清的抑制率更高,抑制率分别为42.8%、27.4%。产酶培养基发酵的上清还能抑制稻瘟病菌丝生长和孢子萌发。E. coli表达的Chi74和Chi36蛋白混合,分别以浓度10mg/mL和5mg/mL作用于松材线虫,24h死亡率分别为87.5%、54.5%。以胶体几丁质为底物,混合酶解反应不同时间的产物对松材线虫的致死情况差异较大,其中酶解8h的产物对松材线虫的毒杀作用最好,平均死亡率为100%。1h、3h的水解产物处理松材线虫的死亡率分别为23.8%、69.3%,而处理时间长达24h的产物对线虫几乎没有毒杀作用,致死率仅为8.4%。此外,酶解产物对肝癌细胞SMMC-7721的生长有抑制作用,IC50为69μg/ml,而对正常肝细胞活性无影响。
张婷婷[8]（2011）在《海洋虾壳的放线菌分离鉴定筛选及抑菌活性物质提取》文中研究表明本研究从海产虾壳上分离放线菌并进行产几丁质酶、蛋白酶菌株及拮抗菌株的筛选,最终筛选得到两株有较强抑真菌活性的菌株T0907-15和T0907-107,并对其进行种的鉴定。选取菌株T0907-107进行所产抑菌活性物质的理化性质、发酵培养基、发酵培养条件的优化及抑菌活性物质浸提方法的研究,主要结果如下:1、通过对海产虾壳前处理,利用选择性培养基进行放线菌的分离,根据放线菌菌落基内菌丝、气生菌丝颜色和可溶性色素有或无等特征,对分离的放线菌进行初步归类,排除重复的菌株后,编号登记,从海产虾壳中共分离到167株放线菌。2、通过平板透明圈筛选法,获得的放线菌进行产几丁质酶和产蛋白酶的菌株筛选;拮抗菌株采用平板对峙法初筛和发酵液杯碟法复筛,筛选到两株对多种植物病原真菌有较强拮抗作用的菌株（T0907-15和T0907-107）。基于其形态特征、培养性状及生理生化特征及16S rDNA序列的聚类结果分析,将2菌株分别归属于链霉菌淡紫灰类群的链素淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae streptinus）和轮生类群的藤黄轮丝链霉菌（Streptomyces luteoverticillatus）。3、对拮抗菌株T0907-107所产抑菌活性物质进行分离并测定其理化性质,结果表明,该活性物质对多种病原真菌具有抑制作用,显示较广的抗菌谱,是一类耐热（60℃处理90 min）、耐酸碱（pH值2 11）、稳定性强（自然光照射20 h及紫外光照射60 min后仍具一定稳定性）、贮藏性好的非蛋白质类的强极性的物质。4、通过单因素试验和正交试验,对菌株T00907-107的发酵培养基和培养条件进行优化,确定了拮抗菌株T0907-107液体发酵培养基配方及适宜培养条件。其中,培养基各组分的最佳配比为:蔗糖1.0 %,黄豆粉1.0 %;发酵条件为:初始pH值7.0,温度30℃,发酵时间84 156 h,接种量（体积分数）2 %,装液量（200 250 mL）/ 500 mL。5、根据“相似相溶”的原理,结合活性物质的生物活性测定和紫外分光光度计测定法,优化了拮抗菌株T0907-107液体发酵菌丝体所产活性物质的浸提技术,并采用溶媒提取法,初步摸索出了一条适合拮抗菌株T0907-107所产抑菌活性物质的浸膏的制备方法。
唐勇军,卢向阳,邹俊,田云[9]（2011）在《抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究》文中进行了进一步梳理稻瘟病具有传染快、危害大等特点,其微生物防治具有良好的发展前景.本实验采用以稻瘟病细胞壁为筛选培养基来筛选抗稻瘟病的几丁质酶产生菌,并对筛选到的优良菌株进行产酶条件优化.实验结果表明,从不同来源的土壤和植物器官中分离得到16株能检测到几丁质酶活性的几丁质酶产生菌,其中以H3和H9的产酶能力最强,具有良好的开发价值.
李世俊[10]（2009）在《L03菌株种类鉴定及其几丁质酶分离纯化与性质研究》文中研究指明几丁质酶可以降解真菌细胞壁,从而抑制真菌生长,因此能分泌几丁质酶的微生物可以作为生防菌加以研究利用。由作者筛选的L03菌株能分泌几丁质酶,其活性为0.702U/mL。经16SrDNA序列测序与Blast比对,该菌株与中华根瘤菌属等属的细菌相似性达99%;与近似种比较试验显示,L03菌株的生理生化性状与中华根瘤菌属细菌相似,认为L03菌株为中华根瘤菌属细菌（Sinorhizobium sp.）。L03菌株分泌的几丁质酶能够用90%饱和浓度的硫酸铵沉淀,沉淀物经脱盐后得到粗酶液。粗酶液先进行Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow疏水层析,分离出7个蛋白峰,其中仅峰4具几丁质酶活性;将峰4蛋白再经DEAE-Sephrose Fast Flow离子交换层析得到7个蛋白峰,其中峰4-5蛋白能降解几丁质;峰4-5蛋白经Sephadex G-75凝胶过滤后有3个峰,峰4-5-1具有酶活性。因此峰1蛋白为L03菌株产生的几丁质酶蛋白。收集几丁质酶蛋白,对其进行SDS-PAGE电泳,得出该蛋白的分子量为41.3kDa。L03菌株几丁质酶水解几丁质的最适温度为4045℃,水解反应体系的最适pH为6。几丁质酶在一定环境条件下的稳定性测定结果表明,酶液在40℃以下温度处理1h,酶解性质稳定,各处理酶活性基本相似,但50℃处理1h后活性明显下降;酶液在pH58条件下处理1h,活性基本不变。几丁质酶对一些金属离子敏感,表现在反应体系中加入金属离子后酶活性显着降低,如Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+。但另一些金属离子,对酶活性显着提高,如Mg2+、Ba2+等。L03菌株几丁质酶对多种重要植物病原真菌的细胞壁有明显的降解作用,如水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme）、小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata）等。用酶液处理病菌后,一般能使菌丝出现细胞壁模糊、颜色变淡现象,甚至还能导致菌丝细胞畸形或菌丝完全崩解。对L03菌株产几丁质酶的条件进行了优化。用均匀设计法在5个因素6个水平上设计试验方案,试验数据用DPS软件分析,得出最佳的培养方法为:最佳碳源为7%胶体几丁质,最佳氮源为0.2%酵母浸出汁（培养基其他成分:0.15%NaNO3,0.05%MgSO4·7H2O,0.3%KH2PO4,0.015%FeSO4·7H2O）,培养液初始pH为7.0,培养温度为28℃,培养时间为7d。
二、产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究（论文提纲范文）
（1）一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要材料 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 几丁质酶产生菌株的筛选 |
| 1.2.2 几丁质酶活力的测定 |
| 1.2.3 菌株的鉴定 |
| 1.2.3. 1 菌株的形态学研究 |
| 1.2.3. 2 16SrDNA序列分析 |
| 1.2.4 响应面法优化菌株的产酶条件 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株的筛选与鉴定 |
| 2.2 菌株的产酶条件优化 |
| 2.2.1 响应面法的结果与分析 |
| 3 讨论 |
（2）拮抗核盘菌Bt菌株的筛选及抑菌活性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 对核盘菌具有抑菌活性Bt菌株的筛选 |
| 1.3 菌株中抑菌基因的检测 |
| 1.4 几丁质酶活力的测定 |
| 1.5 不同pH缓冲液及温度对4AP1菌株抑菌能力的影响 |
| 1.6 抑菌谱的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抗核盘菌Bt菌株的筛选 |
| 2.2 Bt菌株中抑菌相关基因检测及几丁质酶活力的测定 |
| 2.3 pH及温度对4AP1菌株抑菌能力的影响 |
| 2.4 4AP1菌株抑菌谱的测定 |
| 3 讨论 |
（3）几丁质酶高产芽孢杆菌的筛选及基因克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 几丁质 |
| 1.1.1 几丁质的结构与性质 |
| 1.1.2 几丁质及其衍生物的应用 |
| 1.2 几丁质酶 |
| 1.2.1 几丁质酶的来源 |
| 1.2.2 几丁质酶的分类 |
| 1.2.3 几丁质酶的结构 |
| 1.2.4 几丁质酶的性质 |
| 1.2.5 几丁质酶的应用 |
| 1.3 芽孢杆菌几丁质酶的研究进展 |
| 1.4 本研究的主要内容 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 具有固氮功能的高产几丁质酶芽孢杆菌的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 筛选产几丁质酶的芽孢杆菌 |
| 2.2.2 筛选产几丁质酶固氮的芽孢杆菌 |
| 2.2.3 菌种鉴定 |
| 2.2.4 固氮酶基因nifH的克隆 |
| 2.2.5 几丁质酶酶活力的测定 |
| 2.2.6 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 革兰氏染色 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 筛选产几丁质酶的芽孢杆菌结果 |
| 2.3.2 筛选产几丁质酶固氮的芽孢杆菌结果 |
| 2.3.3 菌种鉴定结果 |
| 2.3.4 固氮酶基因nifH的克隆结果 |
| 2.3.5 几丁质酶酶活力的测定结果 |
| 2.3.6 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 革兰氏染色结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶酶学特性初步研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶粗酶液获取 |
| 3.2.2 不同温度对几丁质酶酶活力的影响 |
| 3.2.3 不同pH值对几丁质酶酶活力的影响 |
| 3.2.4 不同底物浓度对几丁质酶酶活力的影响 |
| 3.2.5 不同金属离子对几丁质酶酶活力的影响 |
| 3.2.6 不同Fe2+离子浓度对几丁质酶酶活力的影响 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 不同温度对几丁质酶酶活力的影响结果 |
| 3.3.2 不同pH值对几丁质酶酶活力的影响结果 |
| 3.3.3 不同底物浓度对几丁质酶酶活力的影响结果 |
| 3.3.4 不同金属离子对几丁质酶酶活力的影响结果 |
| 3.3.5 不同Fe~(2+)离子浓度对几丁质酶酶活力的影响结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶发酵培养基配方及培养条件优化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 发酵时间对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.2.2 接种量对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.2.3 培养基pH值对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.2.4 装瓶量对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.2.5 碳源对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.2.6 氮源对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.2.7 金属离子对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.2.8 正交试验 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 发酵时间对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.3.2 接种量对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.3.3 培养基pH值对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.3.4 装瓶量对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.3.5 碳源对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.3.6 氮源对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.3.7 金属离子对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 产几丁质酶酶活力的影响 |
| 4.3.8 正交试验结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因克隆 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 基因组DNA提取 |
| 5.2.2 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因部分保守片段PCR扩增 |
| 5.2.3 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因部分保守片段测序 |
| 5.2.4 Tail-PCR扩增解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因部分保守片段两侧翼未知序列 |
| 5.2.5 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因上中下游三段序列拼接及几丁质酶基因分析 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因部分保守片段PCR扩增结果 |
| 5.3.2 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因部分保守片段测序结果 |
| 5.3.3 Tail-PCR扩增解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因部分保守片段两侧翼未知序列结果 |
| 5.3.4 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因上中下游三段序列拼接及几丁质酶基因分析结果 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因于大肠杆菌DH5a中分泌表达 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌株与载体质粒 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因于大肠杆菌DH5a中分泌表达 |
| 6.2.2 SDS-PAGE检测分泌表达的几丁质酶 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607 几丁质酶基因于大肠杆菌DH5a中分泌表达结果 |
| 6.3.2 SDS-PAGE检测分泌表达的几丁质酶结果 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（4）苏云金芽胞杆菌chiA73基因的克隆、表达和酶活性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 晶体形态观察 |
| 2.2 几丁质酶基因chi A73的克隆和序列分析 |
| 2.3 几丁质酶Chi A73蛋白结构分析 |
| 2.4 chi A73在大肠杆菌中的表达 |
| 2.5 原菌发酵液与表达蛋白Chi A73的活性检测 |
| 2.6 p H值和温度对几丁质酶Chi A73活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因调控元件的鉴定和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 几丁质酶及其应用 |
| 1.1.1 几丁质 |
| 1.1.2 几丁质酶 |
| 1.1.3 几丁质酶的应用 |
| 第二节 细菌几丁质酶及其基因 |
| 1.2.1 产几丁质酶的细菌种类 |
| 1.2.2 细菌几丁质酶 |
| 1.2.3 细菌几丁质酶基因 |
| 第三节 细菌几丁质酶基因的表达调控 |
| 1.3.1 细菌中几丁质水解产物转运系统及其调控 |
| 1.3.2 细菌 chi 基因调控序列的分子特征 |
| 1.3.3 细菌 chi 基因的调控蛋白及双组份调节系统 |
| 第四节 细菌基因转录调控研究的一般方法 |
| 1.4.1 转录融合方法 |
| 1.4.2 常用的报告基因 |
| 1.4.3 启动子探测型载体 |
| 第五节 苏云金芽胞杆菌几丁质酶及其基因的研究 |
| 1.5.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.5.2 苏云金芽胞杆菌几丁质酶 |
| 1.5.3 苏云金芽胞杆菌 chi 基因 |
| 1.5.4 苏云金芽胞杆菌 chi 基因的表达调控 |
| 第六节 研究的目的、意义及其主要研究内容 |
| 1.6.1 目的和意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 Bt 几丁质酶合成调节的多态现象 |
| 第一节 实验材料、仪器和试剂 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基（g/L） |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂、酶和试剂盒 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 胶体几丁质的制备 |
| 2.2.2 几丁质酶活力的测定 |
| 2.2.3 Bt 几丁质酶基因诱导表达类型的调查 |
| 2.2.4 葡萄糖对几丁质酶活力影响的测定 |
| 2.2.5 Bt 菌 total DNA 的提取 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.2.7 Bt 几丁质酶基因的克隆 |
| 2.2.8 转化子的验证 |
| 2.2.9 DNA 序列的测定与分析 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 2.3.1 77 株 Bt 在有或无诱导物培养时几丁质酶活力调查 |
| 2.3.2 诱导前后 77 株 Bt 菌几丁质酶活力的分布统计 |
| 2.3.3 几丁质诱导效率的统计分析 |
| 2.3.4 葡萄糖对 Bt 几丁质酶表达的影响 |
| 2.3.5 不同表达类型菌株 chi 基因调节区域差异分析 |
| 第四节 本章小结 |
| 第三章 芽胞杆菌基因启动子探测型载体的构建 |
| 第一节 实验材料、仪器和试剂 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 培养基（g/L） |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂、酶和试剂盒 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 PCR 扩增 |
| 3.2.2 感受态细胞的制备和电转化 |
| 3.2.3 菌体 DNA 模板的制作 |
| 3.2.4 β-半乳糖苷酶酶活力测定 |
| 3.2.5 DNA 片段酶切、纯化回收及连接 |
| 3.2.6 其它实验方法 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 3.3.1 启动子探测型穿梭载体 pCB 的构建策略 |
| 3.3.2 pMD19-bgaB 载体的构建 |
| 3.3.3 pHT-bgaB 载体的构建 |
| 3.3.4 pHT-bgaB 载体特性的验证 |
| 3.3.5 载体 pCB 的构建及酶切位点验证 |
| 3.3.6 pCB 载体期待特性的验证 |
| 第四节 本章小结 |
| 第四章 chiA 基因调控元件的鉴定和功能分析 |
| 第一节 实验材料、仪器和试剂 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 试剂、酶及试剂盒 |
| 第二节 实验方法 |
| 4.2.1 PCR 扩增 |
| 4.2.2 DNA 片段酶切、纯化回收及连接 |
| 4.2.3 Bt75(pCB-75A)生长曲线及酶活动力曲线的绘制 |
| 4.2.4 检测几丁单糖（GlcNAc）对 chiA 启动子活性的影响 |
| 4.2.5 5′RACE 方法确定 chiA 转录起始位点 |
| 4.2.6 DNA 序列的测定与分析 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 4.3.1 重组载体 pCB-75A 的构建 |
| 4.3.2 原始菌株 Bt75 中 chiA 启动子的活性检测 |
| 4.3.3 chiA 启动子区域缺失及重要功能区域分析 |
| 4.3.4 chiA 基因转录起始位点的确定 |
| 4.3.5 chiA 调空序列中遗传元件及调控模式分析 |
| 第四节 本章小结 |
| 第五章 chiB 基因调控元件的鉴定和功能分析 |
| 第一节 实验材料、仪器和试剂 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 试剂、酶及试剂盒 |
| 第二节 实验方法 |
| 5.2.1 PCR 扩增 |
| 5.2.2 Bt75(pCB-75B)生长曲线及酶活动力曲线的绘制 |
| 5.2.3 检测几丁单糖（GlcNAc）对 chiB 启动子活性的影响 |
| 5.2.4 Northern 印迹分析 |
| 5.2.5 凝胶电泳迁移率变动分析 |
| 5.2.6 DNA 序列的测定与分析 |
| 5.2.7 利用 5′RACE 方法确定 chiB 转录起始位点 |
| 5.2.8 其它实验方法 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组载体 pCB-75B 的构建 |
| 5.3.2 chiB 启动子在 Bt75 中表达特性的研究 |
| 5.3.3 chiB 启动子区域缺失及重要功能区域分析 |
| 5.3.4 dre 中关键碱基决定 chiB 基因表达类型 |
| 5.3.5 chiB 基因转录起始位点的确定 |
| 5.3.6 chiB 调空序列中遗传元件及调控模式分析 |
| 第四节 本章小结 |
| 第六章 结论、创新点与展望 |
| 第一节 研究结论 |
| 6.1.1 Bt 菌在几丁质酶合成的调节方式上具有多态性 |
| 6.1.2 成功构建一个启动子探测型穿梭载体 pCB |
| 6.1.3 确定 chiA 调控序列中的核心启动子等多个调控元件 |
| 6.1.4 确定 chiB 调控序列中的 dre 位点等多个调控元件 |
| 6.1.5 确定了 chiA、chiB 基因表达的时段 |
| 6.1.6 证明几丁单糖不是 chiA、chiB 基因的有效诱导物 |
| 第二节 创新点 |
| 第三节 研究展望 |
| 6.3.1 Bt 几丁质酶基因中应答诱导调控位点的精确定位 |
| 6.3.2 应答诱导的负调控位点中关键碱基的确定 |
| 6.3.3 Bt 中几丁质酶基因调控因子的寻找 |
| 6.3.4 Bt 几丁质酶基因应答分解代谢调控蛋白机理的研究 |
| 6.3.5 Bt 几丁质酶基因表达调控机制的确定 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）不同氮源对苏云金芽胞杆菌产几丁质酶的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 培养条件 |
| 1.3 细菌浓度的检测 |
| 1.4 胶体几丁质的制备 |
| 1.5 几丁质酶活力检测方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BRC-HZP7水解胶体几丁质平板 |
| 2.2 LB培养基的产酶活力 |
| 2.3 牛肉膏培养基的产酶活力 |
| 2.4 酪蛋白对酶合成的影响 |
| 2.5 氨基酸对酶合成的影响 |
| 3 讨论 |
（7）苏云金芽胞杆菌几丁质酶活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌 |
| 1.2 几丁质 |
| 1.3 几丁质酶 |
| 1.3.1 微生物来源的几丁质酶 |
| 1.3.2 几丁质酶的结构域 |
| 1.3.3 几丁质酶的空间结构 |
| 1.4 微生物几丁质降解系统 |
| 1.4.1 Serratia marcescens 几丁质降解系统 |
| 1.4.2 Bacillus circulans WL-12 几丁质降解系统 |
| 1.5 几丁质酶的生物活性应用 |
| 1.5.1 真菌病害防治 |
| 1.5.2 害虫防治 |
| 1.5.3 医疗卫生 |
| 1.5.4 几丁寡糖的生物活性 |
| 1.6 苏云金芽孢杆菌几丁质酶 |
| 1.6.1 几丁质酶的基因克隆和酶学特征 |
| 1.6.2 几丁质酶对Bt 杀虫的作用 |
| 1.6.3 Bt 几丁质酶的抑菌作用 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Bt 菌株的生理生化实验 |
| 2.2.2 Bt 总DNA 的提取 |
| 2.2.3 PCR 扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 PCR 产物的回收 |
| 2.2.6 克隆重组质粒的构建 |
| 2.2.7 E.coli 感受态制备 |
| 2.2.8 转化和筛选 |
| 2.2.9 质粒提取 |
| 2.2.10 DNA 测序 |
| 2.2.11 生物信息学分析软件 |
| 2.2.12 切胶回收 |
| 2.2.13 去磷酸化处理 |
| 2.2.14 表达重组质粒的构建 |
| 2.2.15 目的蛋白的诱导 |
| 2.2.16 细胞破碎 |
| 2.2.17 蛋白浓度的测定 |
| 2.2.18 表达蛋白的 SDS-PAGE 检测 |
| 2.2.19 胶体几丁质的制备 |
| 2.2.20 几丁质酶活性检测 |
| 2.2.21 酶学特性分析 |
| 2.2.22 水解产物的HPLC 分析 |
| 2.2.23 抑菌实验 |
| 2.2.24 线虫生测 |
| 2.2.25 抗肿瘤试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Bt 几丁质酶基因chi74 的克隆表达和活性分析 |
| 3.1.1 BRC-Bt1 菌株几丁质酶活性筛选 |
| 3.1.2 几丁质酶基因chi74 的克隆 |
| 3.1.3 生物信息学分析 |
| 3.1.4 Chi74 蛋白的融合表达 |
| 3.1.5 影响几丁质酶 Chi74 催化活性的因素 |
| 3.1.6 酶解产物的 HPLC 分析 |
| 3.2 Bt 几丁质酶基因chi74 的分段表达 |
| 3.2.1 不同截短chi74 基因的构建 |
| 3.2.2 不同截短chi74 基因的融合表达 |
| 3.2.3 不同截短基因产物的活性分析 |
| 3.2.4 水解产物的 HPLC 分析 |
| 3.3 Bt 几丁质酶基因chi36 的克隆表达和活性分析 |
| 3.3.1 几丁质酶基因chi36 的克隆 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.3.3 融合蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 影响几丁质酶 Chi36 催化活性的因素 |
| 3.3.5 几丁质酶 Chi36 水解产物分析 |
| 3.3.6 Chi36 蛋白与 Chi74 蛋白混合的协同酶解分析 |
| 3.4 Bt 几丁质酶基因chi36 的改造 |
| 3.4.1 FN3 区片的克隆 |
| 3.4.2 FC 区的克隆 |
| 3.4.3 不同加长chi36 基因的构建 |
| 3.4.4 不同加长chi36 基因的表达 |
| 3.4.5 不同加长酶产物的活性分析 |
| 3.4.6 水解产物的 HPLC 分析 |
| 3.5 几丁质酶基因chi74 和chi36 上游调控序列的分析 |
| 3.5.1 6株Bt的生理生化特性 |
| 3.5.2 6 株Bt 菌株在LB 培养基的产几丁质酶情况 |
| 3.5.3 chi74 基因上游调控序列分析 |
| 3.5.4 chi36 基因上游调控序列分析 |
| 3.6 几丁质酶的生物活性 |
| 3.6.1 BRC-Bt1不同培养条件发酵液对香蕉炭疽的作用 |
| 3.6.2 BRC-Bt1 发酵上清对稻瘟病菌的作用 |
| 3.6.3 Bt 对松材线虫的生测 |
| 3.6.4 Bt 几丁质酶水解产物的抑癌活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Bt 几丁质酶Chi74 的催化特性 |
| 4.2 Chi74 不同截短酶的催化特性 |
| 4.3 Bt 几丁质酶Chi36 的催化特性 |
| 4.4 不同Chi36 加长酶的催化特性 |
| 4.5 Bt 几丁质酶基因的转录调控 |
| 4.6 Bt 几丁质酶及其酶解产物的生物活性 |
| 参考文献 |
| 附录 1 chi74 基因测序结果 |
| 附录 2 chi36 基因测序结果 |
| 附录 3 chi74 基因上游测序结果 |
| 附录 4 chi36 基因上游测序结果 |
| 附录5 博士研究生期间发表及投稿的论文 |
| 致谢 |
（8）海洋虾壳的放线菌分离鉴定筛选及抑菌活性物质提取（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 放线菌简介 |
| 1.1 放线菌的基本特点、研究进展 |
| 1.2 放线菌的分布 |
| 2 放线菌的分离 |
| 2.1 放线菌分离的一般预处理方法 |
| 2.2 放线菌分离的特殊预处理方法 |
| 3 目的放线菌的筛选 |
| 3.1 产酶放线菌菌株的筛选 |
| 3.2 拮抗放线菌的筛选方法 |
| 4 放线菌分类鉴定技术 |
| 4.1 传统的鉴定方法 |
| 4.2 多相分类 |
| 4.3 链霉菌的鉴定 |
| 5 放线菌发酵工艺研究 |
| 6 抑菌活性物质提取的研究 |
| 7 本课题的立题依据及意义 |
| 第二章 海产虾壳上放线菌的分离技术 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品预处理对可培养放线菌分离结果的影响 |
| 2.2 样品二次热处理对可培养放线菌分离结果的影响 |
| 2.3 不同盐度对可培养放线菌分离结果的影响 |
| 2.4 化学方法对可培养放线菌分离结果的影响 |
| 2.5 不同无菌水对可培养放线菌分离计数结果的影响 |
| 2.6 不同培养基对放线菌分离的结果 |
| 2.7 放线菌菌株的初步归类 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 海洋虾壳上放线菌分离的热处理 |
| 3.2 海洋虾壳上放线菌分离的化学方法 |
| 3.3 高盐度培养基对海洋虾壳上放线菌分离的影响 |
| 第三章 放线菌优良菌株的筛选 |
| 一、放线菌产酶菌株筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 平板透明圈筛选结果 |
| 2.2 产酶放线菌菌株的类群初步鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 二、拮抗放线菌菌株筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 放线菌菌株平板对峙法的筛选结果 |
| 2.2 牛津杯法复筛结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 拮抗放线菌菌株的初筛 |
| 3.2 拮抗放线菌菌株的复筛 |
| 第四章 拮抗放线菌T0907-15、T0907-107 种的鉴定及抑菌活性测定 |
| 一、拮抗放线菌种类鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 放线菌菌株的形态特征 |
| 2.2 放线菌菌株的培养特征 |
| 2.3 拮抗放线菌的生理生化特征 |
| 2.4 菌株耐受性试验 |
| 2.5 放线菌基因组总DNA 的提取 |
| 2.6 16S rDNA 碱基序列测定 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 多相分类法的应用 |
| 3.2 溶菌酶-SDS 法的联用提取放线菌的总DNA |
| 二、抑菌活性测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 发酵液活性物质极性的判断 |
| 2.2 抑菌活性的测定 |
| 2.3 抑菌活性物质的稳定性试验 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 拮抗放线菌T0907-107 的抑菌谱 |
| 3.2 拮抗放线菌T0907-107 的抑菌活性及稳定性 |
| 3.3 拮抗放线菌T0907-107 的应用 |
| 第五章 拮抗放线菌T0907-107 发酵工艺研究与抑菌活性物质提取制备 |
| 一、发酵工艺研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 培养基优化 |
| 2.2 培养条件的优化 |
| 2.3 液体发酵培养基及培养条件优化结果 |
| 2.4 菌株T0907-107 的液体发酵扩大培养 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 发酵培养基对菌体生长及活性物质的产生的影响 |
| 3.2 发酵条件对菌体生长及活性物质的生产的影响 |
| 3.3 菌株液体发酵的扩大培养 |
| 二、拮抗菌株T0907-107 抑菌活性物质的提取及浸膏的制备 |
| （一） 分光光度测定法检测抑菌活性物质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抑菌活性物质的紫外吸收光谱及紫外测定结果 |
| 2.2 抑菌活性物质的最大吸收值与浓度的关系 |
| 3 小结与讨论 |
| （二） 抑菌活性物质的提取及浸膏的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 浸取溶剂的选择 |
| 2.2 浸取溶剂浓度对浸提影响 |
| 2.3 浸取液体积对浸提的影响 |
| 2.4 浸取时间对浸提的影响 |
| 2.5 菌体3 次浸取的效果 |
| 2.6 抑菌活性物质浸膏的制备 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 放线菌所产代谢产物的溶媒提取法 |
| 3.2 活性物质提取的动态过程 |
| 第六章 总结与展望 |
| 1 结论 |
| 1.1 虾壳上放线菌的分离 |
| 1.2 虾壳上放线菌的产酶菌株的筛选 |
| 1.3 虾壳上拮抗菌株的筛选及鉴定 |
| 1.4 拮抗菌株T0907-107 所产活性物质的抑菌活性及理化性质研究 |
| 1.5 拮抗菌株T0907-107 液体发酵培养基及培养条件的初步研究 |
| 1.6 拮抗菌株T0907-107 产活性物质的提取工艺研究及浸膏的制备 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究（论文提纲范文）
| 1 实验部分 |
| 1.1 细粉几丁质的制备 |
| 1.2 胶体几丁质的制备 |
| 1.3 稻瘟病病原菌细胞壁悬浮物制备及菌株筛选 |
| 1.4 几丁质酶活性测定 |
| 1.5 菌种最适产酶条件的研究方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 几丁质酶产生菌菌种的筛选 |
| 2.2 菌落形态观察 |
| 2.2.1 H3菌落的观察 |
| 2.2.2 H9菌落的观察 |
| 2.3 菌种产酶条件的研究 |
| 2.3.1 最适培养时间 |
| 2.3.2 最适温度条件 |
| 2.3.3 最适pH |
| 2.3.4 最适氮源 |
| 2.3.5 最适碳源 |
| 3 讨 论 |
（10）L03菌株种类鉴定及其几丁质酶分离纯化与性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 植物病害生物防治研究进展 |
| 1.2 微生物几丁质酶 |
| 1.2.1 微生物产几丁质酶的研究概况 |
| 1.2.1.1 产几丁质酶微生物种类 |
| 1.2.1.2 产几丁质酶微生物的生态分布 |
| 1.2.2 产几丁质酶菌株的筛选与测定 |
| 1.2.3 微生物产酶特点 |
| 1.2.3.1 多样性 |
| 1.2.3.2 诱导性 |
| 1.2.3.3 分泌性 |
| 1.2.3.4 分子生物学特点 |
| 1.2.4 几丁质酶类型 |
| 1.2.5 几丁质酶性质 |
| 1.2.5.1 几丁质酶分子量 |
| 1.2.5.2 几丁质酶等电点 |
| 1.2.5.3 几丁质酶对酸碱的适应性 |
| 1.2.5.4 几丁质酶水解反应温度 |
| 1.2.5.5 几丁质酶对金属离子的敏感性 |
| 1.2.6 几丁质酶催化机理 |
| 1.2.7 提高菌株产酶能力的方法 |
| 1.3 几丁质酶的应用 |
| 1.3.1 对植物真菌病害的防治 |
| 1.3.2 对植物线虫病害的防治 |
| 1.3.3 对植物有害昆虫的防治 |
| 1.3.4 在转基因育种中的应用 |
| 1.3.5 几丁质酶在其他领域中的应用 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 产几丁质酶菌株的筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 土样采集 |
| 2.1.2 培养基制备 |
| 2.1.2.1 胶体几丁质制备 |
| 2.1.2.2 几丁质培养基制备 |
| 2.1.2.3 其他培养基 |
| 2.1.3 各种溶液、缓冲液配制 |
| 2.1.4 产酶菌株筛选方法 |
| 2.1.5 几丁质酶活力测定方法 |
| 2.1.5.1 菌株培养和粗酶液提取 |
| 2.1.5.2 标准曲线制定 |
| 2.1.5.3 二硝基水杨酸方法测定酶活性 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 产酶菌株数量 |
| 2.2.2 几丁质酶活性 |
| 2.2.2.1 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线 |
| 2.2.2.2 几丁质酶活性测定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 产几丁质酶菌株的鉴定 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 培养基 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 各种溶液及其配置方法 |
| 3.1.4 形态及生理生化特征 |
| 3.1.4.1 培养特征观察 |
| 3.1.4.2 菌体形态 |
| 3.1.4.3 革兰氏染色反应 |
| 3.1.4.4 生理生化性状测定 |
| 3.1.5 分子生物学方法鉴定 |
| 3.1.5.1 CTAB 法提取细菌总基因组DNA |
| 3.1.5.2 16SrDNA 扩增及测序 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 菌体形态 |
| 3.2.2 菌落形态 |
| 3.2.3 生理生化反应 |
| 3.2.4 16SrDNA 序列分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 L03 菌株几丁质酶分离纯化及性质研究 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 实验试剂与溶液配制 |
| 4.1.2 粗酶液提取方法 |
| 4.1.3 酶液纯化方法 |
| 4.1.3.1 Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow 疏水层析 |
| 4.1.3.2 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析 |
| 4.1.3.3 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 |
| 4.1.4 几丁质酶蛋白分子量测定 |
| 4.1.5 酶学性质试验 |
| 4.1.5.1 酶反应的最适温度和热稳定性 |
| 4.1.5.2 酶反应的最适pH 和酸碱稳定性 |
| 4.1.5.3 金属离子对酶活性的影响 |
| 4.1.6 几丁质酶对病原真菌细胞壁的降解作用 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 粗酶液提取 |
| 4.2.2 几丁质酶的纯化 |
| 4.2.2.1 Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow 疏水层析 |
| 4.2.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析 |
| 4.2.2.3 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 |
| 4.2.3 几丁质酶分子量 |
| 4.2.4 L03 菌株几丁质酶酶学性质 |
| 4.2.4.1 酶反应的最适温度和热稳定性 |
| 4.2.4.2 酶反应的最适pH 和对酸碱的稳定性 |
| 4.2.4.3 金属离子对酶活性的影响 |
| 4.2.5 几丁质酶对病原真菌细胞壁的降解作用 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 L03 菌株产几丁质酶条件研究 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 发酵培养基 |
| 5.1.2 细菌生长量与几丁质酶活性的关系测定 |
| 5.1.3 最适碳源的测定 |
| 5.1.4 最适氮源的测定 |
| 5.1.5 产酶培养条件的优化试验 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 细菌生长量与酶活性的关系 |
| 5.2.2 产酶最适碳源种类 |
| 5.2.3 产酶最适氮源种类 |
| 5.2.4 产酶培养条件的优化 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表 |
四、产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究（论文参考文献）
- [1]一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化[J]. 苗飞,孟阳,王悦,袁春营,崔青曼. 水产科学, 2018(02)
- [2]拮抗核盘菌Bt菌株的筛选及抑菌活性研究[J]. 王美玲,耿丽丽,段江燕,张杰. 植物保护, 2017(06)
- [3]几丁质酶高产芽孢杆菌的筛选及基因克隆与表达[D]. 程德勇. 武汉轻工大学, 2016(06)
- [4]苏云金芽胞杆菌chiA73基因的克隆、表达和酶活性分析[J]. 张圆,周国旺,李海涛,刘荣梅,赵一夔,高继国. 生物技术通报, 2015(08)
- [5]苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因调控元件的鉴定和功能分析[D]. 谢池楚. 南开大学, 2012(08)
- [6]不同氮源对苏云金芽胞杆菌产几丁质酶的影响[J]. 沙莉,黄振吉,关雄. 福建农林大学学报(自然科学版), 2011(04)
- [7]苏云金芽胞杆菌几丁质酶活性研究[D]. 沙莉. 福建农林大学, 2011(11)
- [8]海洋虾壳的放线菌分离鉴定筛选及抑菌活性物质提取[D]. 张婷婷. 福建农林大学, 2011(11)
- [9]抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究[J]. 唐勇军,卢向阳,邹俊,田云. 湖南工程学院学报(自然科学版), 2011(01)
- [10]L03菌株种类鉴定及其几丁质酶分离纯化与性质研究[D]. 李世俊. 扬州大学, 2009(12)